Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование крупноблочной фрагментации ДНК в препаратах клеточных ядер

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование крупноблочной фрагментации ДНК в препаратах клеточных ядер"

і о ФЕВ «97

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Дослідження крупноблокової фрагментації ДНК в препаратах клітинних ядер

03.00.03 - молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

УДК 575.113/577.21

На правах рукопису

АНДРЄЄВ Ігор Олегович

Київ-1997

Дисертація є рукописом.

Роботу виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

НДУКОВІ КЕРІВНИКИ: доктор біологічних наук,

професор

ВАКунах

кандидат біологічних наук

В.Т.Солов’ян

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ: доктор біологічних наук,

професор

С.М.Храпунов

кандидат біо логічних наук В.І.Пріма

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України

Захист дисертації відбудется '¿V Ьі-С/£СО 1997 року о Л? годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.86.01 в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України (252143, м.Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розіслано '/£* 199?року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Останнім часом проводяться інтенсивні дослідженій структурно-функціональної організації хроматину в клітинному ядрі. Ми зацікавилися, чи не буде можливим застосувати для дослідження вищих рівнів укладки хроматину нещодавно розроблений метод гель-електрофорезу в імпульсному електричному полі що дозволяс фракціонувати молекули ДНК значно більшого розміру, ніж звичайний електрофорез, подібно до того, як останній більше 20 років тому було використано для дослідження нуклеосомного рівня організації хроматину. Відправним пунктом дім досліджень послужило виявлення в нашій лабораторії явища дискретної крупноблокошї фрагментації ядерної ДНК, що спостерігається при фракціонуванні в імпульсному гель-електрофорезі препаратів інтактних ядер, заплавлених в агарозу і лізованих білковими денатурантами.

Мета та задачі роботи. Метою даної роботи було дослідження природи крупноблоково! фрагментації ДНК що спостерігаеться при обробці препаратів ізольованих ядер білок-денатуруючими агентами, а також з'ясування ролі ендогенних ядерних нуклеаз (зокрема, ДНК-топоізомерази П типу) в цьому процесі.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися задачі:

1. Вивчення характеру фрагментації ядерної ДНК та встановлення відповідності високомолекулярних фрагментів структурним доменам хроматину.

2. Дослідження ролі ДНК-топоізомерази її в процесі розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти.

3. Вивчення властивостей комплексу топоізомераза Н*ДНК, функціонуючого в клітинно му ядрі.

4. Дослідження характеру крупноблоково! фрагментації ядерної ДНК в рослинних тканинах, різних за своїми фізіологічними показниками.

Наукова новизна та практичне значення роботи. Показано, що обробка препаратів інтактних ядер рослин білок-денатуруючими агентами приводить до появи дискретних високомолекулярних фрагментів ДНК розміром 60-100 т.п.н. Встановлено, що розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти має універсальний характер і відбувається внаслідок вирізання структурних доменів хроматину асоційованою з ядерним матриксом нуклеазою з властивостями, подібними до ДНК-топоізомерази П.

Вперше досліджені властивості комплексу топоізомераза ІІ*ДНК, функціонуючого в препаратах ізольованих клітинних ядер. Показано, що то-поізомераза Л здатна здійснювати повний цикл реакцій розщеллення/ре -літування

структурних доменів ядерної ДНК Встановлено взаємозв'язок між характером крупноблокоюі фрагментації ядерно! ДНК та фізіологічними показниками клітин, що свідчить про функціональне значення процесу розщеплення ядерної ДНК на висо-комолекулярні фрагменти.

Підхід, використаний для досліджень, може бути застосований для виділення та охарактеризування цілісних доменів ядерної ДНК Дана методика може також використовуватись для вивчення функціонування ДНК*топоізомеразного комплексу в препаратах ізольованих ядер.

Положення, які виносяться на захист:

1. Крупноблокова фрагментація ядерної ДНК, що спостерігається при обробці препаратів ізольованих ядер б їло к - денатуруючими агентами, відбувається внаслідок розщеплення ДНК в періодично розташованих місцях. Фрагменти, які утворюються при цьому, є віддзеркаленням існуючих в ядрі структурних елементів хроматину, а саме петлевих доменів.

2. Утворення високомолекулярних фрагментів ядерної ДНК є результатом ферментативного розщеплення ДНК, яке здійснюється матрикс-асоційованою нуклеазою з властивостями, подібними до ДНК-топоізомерази П.

3. Ядерна ДНК входить до складу комплексу топоізомераза П*ДНК який здатний ефективно здійснювати повний цикл реакцій розщеплення/з'єднання ДНК Властивості цього комплексу близькі до властивостей комплексу топоізомераза П»ДНК, дослідженого в модельних умовах in vitro, але мають також істотні відмінності від останнього.

4. Характер розщеплення ядерно! ДНК на високомолекулярні фрагмента

пов'язаний з фізіологічними показниками клітини, такими як проліферативна активність та ступінь диференціювання. .

Апробація роботи. Результати роботи були представлені на 4-му Міжнародному конгресі по молекулярній біології рослин (Амстердам, Нідерланди, 19-24 червня 1994), І Міжнародному семінарі по ядерному матриксу (Вроцлав, Польща, 21-23 червня 1994), VI Європейському конгресі по клітинній біології (Прага, Чехія, 26 червня - 1 липш 1994), на Міжнародному симпозіумі по біотехнології та генній інженерії рослин (Київ, 3-6 жовтня 1994), а також обговорювались на наукових семінарах від ділу генетики клітинних популяцій.

Публікації. На тему дисертації опубліковано 9 робіт.

літературного огляду, опису матеріалів та методів дослідження, результатів

Дисертація складається із вступу,

дослідження, підсумків, висновків та списку використаної літератури із 299 посилань. Роботу викладено на 140 сторінках друкованого тексту, вона містить 20 рисунків. -

ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для досліджень використовували тканини проростків кукурудзи, гороху, Crépis capillaris, а також листя дорослих рослин; культивовані рослинні культури тканин, культивовані клітини людини, печінку пацюка.

Ядра виділяли відповідно до процедури, описаної Смітом та Березнеєм (Snüth, Berezney, 1982), модифікованої нами. Тканини гомогенізували на льодовій бані в охолодженому буфері для ізоляції (Буфер А) (50 мМ Tris- НС1, pH 8.0; 0.1 мМ EDTA

0.3 М манітол; 0.1% BSA (фракція V); ОД мМ PMSF), вміщуючому 10 мМ ЕДТА (Е-буфер, Е-ядра ) або 5 мМ МдСІг (Mg-буфер, Мд-ядра), або 5 мМ СаСІг (Са-буфер, Са-ядра). Гомогенат фільтрували через 4 шари марлі, після цього ядра відмивали двічі центрифугуванням (1000g, 15 хв.). Осад гомогенізували в тому ж буфері, нашаровували на 2.2 М сахарозу, приготовану на буфері Д і центрифугували 2 години при 80.000д. Після цього, осад гомогенізували в буфері А і змішували з рівним об'ємом 196 легкоплавкої агарози при 37°С. Суспензію ядер заливали в форми для застигання шаром товщиною 1.5-2 мм, і охолоджували. Після застигання препарати заплавлених в агарозу ядер використовували для подальших досліджень. МдЕ-(СаЕ-) ядра отримували додаванням до суспензії ядер, виділених в буфері з іонами Mg24" (Саг+), ЕДТА до кінцевої концентрації 10 мМ перед заллавленням в агарозу.

Лізис препаратів проводили в буфері (10 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 10 мМ EDTA; 1% ДсИа або саркозшіат натрію) на протязі 1-24 годин при 55°С. В деяких випадках в буфер для лізису додавали Протеїназу К до кінцевої концентрації 200 мкг/мл.

Дегістонізовані ядра одержували шляхом обробки заплавлених в агарозу ядер буфером для екстракції (20 мМ Tiis-HCl, pH 8.0; 0.1 мМ EDTA; 2М NaCI; ІмМ PMSF). Екстракцію проводили при 4°С 3 рази по 30 хв. Після цього ядра відмивали при 4°С 3 рази по 2S хв. буфером для розщеплення.

Для дослідження високомолекулярного розщеплення ядерної ДНК препарати заплавлених в агарозу ядер інкубували в буфері для розщеплення (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 10 мМ МдСІг; 50 мМ NaCI; 0.1 мМ ЕДТД 1 мМ PMSF) 20 хв. при 30°С. В окремих випадках в буфер для розщеплення додавали тенілозид (VM26) - інгібітор топоізомерази П, який стабілізує комплекс ДНК*топоізомераза П в розщепленому

стані, або модифікували іншим чином, як вказано у підписах до рисунку. Після інкубації зразки обробляли буфером для лізису і фракціонували за допомогою FIGE.

Препарати заплавлених в агарозу ядер фракціонували за допомогою імпульсного гель—електрофорезу в інвертуючому полі (FIGE) в буфері О.ВхТБЕ (Маниатис и др., 1984). Електрофорез проводили в 1% агарозі при напрузі 8S V18-22 год., при постійному інтервалі пульсації в режимі 24 сек. “вперед"/8 сек. '‘назад.

Для оцінки кількості нерозщепленої ДНК препарати заплавлених в агарозу ядер виймали з лунок гелю, розплавляли агарозу при 65°С і обробляли суспензію протеїназою К (200 мкг/мл) б присутності 1% ДсЫа 2 години при 55°С, після чого аналізували за допомогою звичайного гель-електрофорезу в 1% агарозі 2 години при напрузі 120V.

Для дослідження асоціації білків з кінцями високомолекулярних фрагментів ядерної ДНК лізовані ядерні препарати фракціонували в FIGE в стандартних умовах. Після цього вирізали ділянки гелю, з фрагментами ДНК розміром 50 т.п.н. Далі їх відмивали в ІхТЕ (3x20 хв., 4°С) тав нуклеазному буфері (Ехо-Ш або Х-Ехо) (1x20 хв., 4°С). Нуклеазну обробку проводили в свіжому буфері при концентрації нуклеази 10 units/ці, 30 хв., при 37°С. Після цього зразки ДНК рефракціонували за допомогою звичайного гель-електрофорезу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

1. Дослідження причин утворення високомолскуляршіх фрагментів ядерної ДНК.

На Рис.1 представлений типовий набір високо молекулярних фрагментів, які утворюються при фракціонуванні в імпульсному гель-електрофорезі в інвертуючому полі зразків заплавлених в агарозу ядер, що були лізовані flcNa. Як видно, крупноблокова фрагментація ядерної ДНК має впорядкований характер, при цьому утворюються дві групи дискретних фрагментів розміром 50 т.п.н. та 300 т.п.н. Така впорядкованість розпаду свідчить про періодичність розташування місць розщеплення ДНК

Результати подальших досліджень показали однотиповість впорядкованого крупноблокового розщеплення ядерної ДНК різних представників еукаріот, як рослин так і тварин (Рис. 2). Така подібність розпаду ядерної ДНК віддалених об’єктів свідчить про універсальність періодичності розташування місць розривів, утворення яких веде до формування високомолекулярних фрагментів ядерної ДНК.

Результати фракціонування препаратів ядер та нуклеоїдів (дегістонізованих ядер) (Рис.З) показують, що видалення шляхом екстракції 2М NaCl більшої частини

М 1

Т.ПЛІ.

300-

50-

Рис.І. Фракціонування лізованих препаратів вдер за допомогою імпульсного гель-електрофорезу в інвертованому електричному полі. Детекція високомолекулярних фрагментів ядерної ДНК.

Заплавлені в агарозу ядра з проростків Crépis capillaiis оброблялись 1% саркозилатом натрія і фракціонувалися за допомогою F1GE в стандартному режимі (24 сек - "ішеред78 сек - "назад"). М - маркер молекулярно! ваги - олігомери фагу X.

Рис.2. Високомолекулярні фрагменти, які утворюються при фракціонуванні лізованих препаратів ядер різних представників еукарют. Однотипність розпаду ядерної ДНК 1 - Печінка пацюка; 2,3 - Лист інтактної рослини Rauwolfia serpentina та Nicotiana tahacum (відповідно); 4,5 - Культивовані клітини та лист інтактної рослини Crépis capiüaris, М - олігомери фагу X.

м

т.ллі

50-

-',1 ,Д-- л і с* X f « *£*. к

Рис. 3. Характер фрагментації ДНК в препаратах заплавлених в агарозу ядер (1), та нуклеоїдів (2,3).

Ядра з кореня проростеш кукурудзи (1); нуклеоїди, які були одержані екстракцією заплавлених в агарозу ядер 2М NaCl, (2); та нуклеоїди, одержані за стандартною процедурою і заплавлега після цього в 1% агарозу, (3); обробляли 1% flcNa і фракціонували за допомогою FIGE,

ядерних білків не веде до зміни впорядкованого характеру крупноблокового розщеплення ядерної ДІЇК. Впорядкованість розпаду ДНК обумовлена таким чином певними рисами (а саме, періодичністю) упаковки хроматину, а не наявністю білків, зв'язаних з ДНК.

Результати електронно-мікроскопічних досліджень препаратів депстошзованих ядер показали, що останні складаються з скелетної білкової структури, що має назву ядерний матрикс або остов (scaffold), до якої прикріплюються петлі ДНК, так звані петлеві домени ядерної ДНК, середній розмір яких складає -50 т.п.н. (McCready еі аі, 1980; Vogelstein е{ аі, 1980; Stoilov et al,, 1988). Спираючись на ці дані, ми припустили, що високомолекулярні фрагменти розміром 50-100 т.п.н. представляють собою петлеві домени хроматину.

Наш висновок підтверджується також результатами спільних досліджень проведених нашою лабораторією та лабораторією Кембриджського університету, що показали на прикладі гену шіастоциашну гороху розташування місць розщеплення ядерної ДНК на високомолскулярні фрагменти в точках прикріплення ДНК до ядерного матриксу (Solovyan, Gray, in preparation).

Що стосується полоси розміром 300 т.п.н., то, як показали результати фракціонування ядерної ДНК з застосуванням різних режимів імпульсного гель-електрофорезу в інвертованому полі (FIGE) та ортогонального електрофорезу (OFAGE) в імпульсному електричному полі, останні представляють собою зону компресії в режимі FIGE, що використовувався нами звичайно, і складаються з гетерогенної суміші молекул ДНК з розміром від 300 до 103 т.п.н. і більше. Крім того,

як показали дослідження дана група фрагментів здатна при різного роду (як фізичних так і хімічних) обробках розпадатися впорядковано до базових фрагментів розміром 50-100 т.п.н. Це дозволяє розглядати їх як асоїцати петлених доменів ядерної ДНК, або структурні елементи хроматину більш високого рівня,

Таким чином, на основі викладених даних можна зробити висновок про те, що високомолекулярні фрагмента представляють собою продукт розщеплення ядерної ДНК на пєтлеві домени хроматину.

2. Дослідження механізмів утворення впсокомолекулярішх фрагментів ядерної ДНК

Як можна бачити з результатів, наведених на Рис.4, виділення ядер в присутності іонів магнію веде до підсилення крупноблокової фрагментації ядерної ДНК, що може виражатися в збільшенні кількості розщепленої ДНК без зміни характеру розпаду, додатковому розщепленні фрагментів розміром 300 т.п.н. до фрагментів розміром 50-100 т.п.н., а також, в рідкісних випадках, коли фрагментована ДНК не спостерігається, виділення ядер в присутності іонів Мд2+ веде до формування типового набору високомолекугарних фрагментів Мд— залежність процесу кругагоблокового розщеплення ядерної ДНК свідчить про його ферментативну природу.

М 1 2 1 2 1 2

т.п.н. 300 -50 - P%SSc" ' * * -■** ІІІ1ІІІВ

А Б В

Рис.4. Залежність характеру крупноблокової фрагментації ядерної ДНК рослин від дивалентних катіонів.

Ядра з кореня проростків кукурудзи (ДБ) та культури клітин Ciepis capillaris (В) виділяли в буфері А, вміщуючому 10 мМ ЕДТА (Е-ядра) (1) або 5 мМ МдСІг (Мд-ядра) (2), заплавляли в агарозу і обробляли 1% ДсИа. Лізоваш препарати фракціонували за допомогою FIGE в стандартних умовах. М - олігомери фагу X.

Рис.5. Умови утворення дискретних фрагментів ядерної ДНК. Залежність появи дискретних фрагментів ДНК від обробки препаратів білок-денатуруючими агентами.

А Заплавлені в агарозу ядра культивованих клітин Crépis capülans фракціонували в FIGE (1), або обробляли 1% flcNa (2); 200 мкг/мл ПрК (3), і потім фракціонували. Б. З заплавлених в агарозу ядер, які були одержані з тканин проростків гороху 1,4 - кінчик кореня, 2,5 - корінь з видаленою меристемою, 3,6 -верхова брунька, - шляхом екстракції 2М NaCl (див. Матеріали та методи) були одержані препарати нуклеоїдів, які потім або фракціонували одразу (1-3) або фракціонували в FIGE після лізису 1% flCNa (4-6).

Іншою рисою цього процесу е його сувора залежність від обробки препаратів детергентами (ш flcNa) або протеіназою. Як видно з Рис.5, у відсутність білкового лізису утворення фрагментів не спостерігається навіть в препаратах дегістонізованих ядер. Така особливість крупноблокової фрагментації ядерної ДНК дозволяє припустити участь в цьому процесі ДНК-топоізомерази П, необхідною умовою утворення продукту розщеплення якої є денатурація ферменту, що скріплює ДНК у місці розриву (Sander, Hsieh, 1983; Liu et al., 1983; Osheroff, Zecheidrich, 1987).

Рис.6, Відновлення розривів ДНК в препаратах заплавлених в агарозу ядер.

Заплавлені в агарозу ядра кореня проростків кукурудзи, виділені в Мд~ буфері, шкубували в буфері для розщеплення 20 хв. при 0°С (1), або 30°С (2-4), після чого додавали 2М NaCl до кінцевої концентрації 250 тМ (3). На дор.4 препарати ядер, які шкубували е буфері для розщеплення з 250 мМ NaCl. Після інкубації ядра обробляли 1% Дс№ і фракціонували в FIGE. Верхня панель -розщеплена ядерна ДНК; нижня панель -ДНК, яка залишилася на старті геля.

На користь цього свідчить той факт, що в умовах, які стимулюють реакцію ре-літування топоізомерази П (а саме, при підвищенні в інкубаційній суміші концентрації солі (Osheroff, Zecheidncli, 1987)), відбувається відновлення утворених раніше розривів ДНК, що виражається як у відновленні початкового характеру розщеплення ядерної ДНК, так і в збільшеній кількості нерозщепленої ДНК, що залишилася на старті гелю (Рис.6). З іншого боку, в присутності іонів Мд2+, але при підвищеній концентрації com в буфері, не відбувається розщеплення ядерної ДІЖ.

Іншим доказом участі ДНК—топоізомерази П в крупноблоковій фрагментації ядерної ДНК є підсилення розщеплення ДНК в препаратах ядер, оброблених теніпозидом (VM26) - речовиною, яка специфічно збільшус ефективність реакції розщеплення ДНК, опосередкованої топоізомеразою П (Liu, 1989). Помітно, що в присутності тенілозиду збільшується кількість розщепленої ДНК (порівняти ДНК, що лишилася на старті гелю), а також відбувається розщеплення фрагментів розміром 300 т.п.н. (Рис.7).

Нами також показана присутність білків, зв'язаних з 5'- рсінцями високомолекулярних фрагментів ядерної ДНК. Як можна бачити з результатів, представлених на Рис.8, фрагменти розміром 50 т.п.н. деградують при обробці X— екзонуклеазою, дія якої специфічна до З1-кінців фрагментів ДНК, але стійкі до

---------Mg------------------

0° 30° 30° No

n'o30” 12 3 4

T.II.II.

30050 -

обробки Ехо-Ш нуклеазою, яка взаємодіє з 5'-кінцями молекул ДНК. Однак, стійкість до дії останньої може бути усунута попередньою обробкою зразків протеїназою К

Т.П.ІІ.

300-

50-

Рис.7. Вплив теніпозиду (VM-26) на високомолекупярну фрагментацію ядерної ДНК Посилення розщеплення ДНК.

Препарати заплавлених в агарозу ядер кореня проростків кукурудзи, які виділяли в Мд—буфері, шкубували 20 хв. при 30°С в буфері для розщеплення без

(1) або в присутності 75 мкм теніпозиду (VM-26) (2). Після інкубації ядра обробляли 1% flcNa і фракціонували в FIGE. Верхня панель - розщеплена ядерна ДНК; нижня панель — ДНК, яка залишилася на старті геля.

Ехо-Ш - +

А—Ехо - +

РгК+Д-Ехо

- +

1 2 З

Рис. 8. Дослідження асоціації білків з високомолекулярними фрагментами ДНК Доказ захищеності 5і—кінців високомолекулярних фрагментів ДНК

Препарати заплавлених в агарозу ядер кореня проростків кукурудзи фракціонували в FIGE. Ділянки гелю, вміщуючі фрагменти ДНК розміром 50-100 т.п.н. вирізали і обробляли нуклеазою ЕхоШ-нуклеазою (1), Я-нуклеазою (2,3), або проводили попередню депротеїнізацію ДНК-фрагментів протеїназою К (3). Після нуклеазної обробки ДНК фракціонували в звичайному гель-електрофорезі.

Таким чином, виявлені нами властивості крупноблоково! фрагментації, а саме: залежність утворення фрагментів від білкового лізису, ре-лігування розривів ДНК в специфічних умовах, стимуляція розщеплення в присутності інгібітору ДНК— топоізомерази П — теніпозиду (VM26), наявність білок-асоційованих розривів, -свідчать про участь ДНК—топоізомерази П, або подібного до неї ферменту, в процесі високомолекулярного розщеплення ядерної ДНК Цей висновок узгоджується з літературними даними про те, що топоізомераза II є основним компонентом ядерного матриксу (Berios et al., 1985; Berrios, Fisher, 1988), її кількість складає приблизно 3-4 молекули на петлю середнім розміром 70 т.п.н. (Gasser et al.,1989), вона має численні сайти зв'язування в точках прикріплення ДНК до ядерного матриксу (Adachi et al., 1989; Poljak, Kas, 1995).

3. Дослідження властивостей ядерного комплексу топоізомераза II* ДНК.

З представлених нами даних слідує також висновок про те, що петлеві домени хроматину є складовою частиною ядерного ДНК*топоізомеразного комплексу, основною властивістю якого є здатність до здійснення реакцій розщеплення/з'єднання ДНК Властивості цього комплексу, як можна бачити, подібні до властивостей комплексу топоізомераза П*ДНК, який був досліджений in vitro з використанням очищеного ферменту та плазмідної ДНК (Sander, Hsieh, 1983; Liu et al, 1983; Osheroff, Zecheidrich, 1987; OsherofI, 1989). З іншого боку, поглиблене дослідження процесу крупиоблокової фрагментації ядерної ДНК показало, що існують певні риси властиві лише для комплексу топоізомераза П*ядерна ДНК. Зокрема, це ефект ЕДТА на характер крупноблокової фрагментації ядерної ДНК

На відміну від умов in vitro виділення ядер (або їх інкубація) в присутності ЕДТА не веде до відновлення розривів ДНК (див. Рис.4), Це означає нездатність комплексу топоізомераза П*ДНК до дисоціації при зв'язуванні ЕДТА іонів Мд2+ в інкубаційному середовищі, як це відбувається в умовах in vitro. Більше того, як можна бачити з наведених результатів (Рис. 9), обробка ядер ЕДТА після інкубації в присутності іонів Мд2+ веде до посилення крупноблокової фрагментації. Зростання рівня розщеплення ядерної ДНК що обумовлене впливом ЕДТА ще більше проявляється в ядрах, які були оброблені ЕДТА перед заплавленням в агарозу (MgE-ядра). Крім того, нами показано, що обробка ядер ЕДТА усуває інгібуючий вплив підвищених концентрацій солі на реакцію розщеплення ДНК при подальшій інкубації в присутності іонів Мд2+ (порівняти Рис.6 та 10), а також заважає реакції літування ДНК при підвищених концентраціях NaCl. Останнє дозволяє припустити,

що гад впливом ЕДТА фермент втрачає здатність до здійснення повного циклу розщеплення/літування ДНК, і переважаючою стає реакція розщеплення.

Рис.9. Особливості поведінки

ядерного ДНК-топоізомеразно-го комплексу. Залежне від ЕДТА посилення розщеплення ДНК в Mg- та МдЕ-ядрах.

Ядра з кореня проростків

кукурудзи виділяли в Mg-буфері

(Mg-ядра) (1) і обробляли 10 мМ

ЕДТД щоб отримати МдЕ-ядра

(2). Зразки шкубували в буфері для

розщеплення, вміщуючому іони £ І

МсГ , на холоду (А) та при 30°С (Б,В). Після інкубації ядра обробляли 10 мМ ЕДТА (В), лізирували і фракціонували в F1GE. Верхня панель - розщеплена ядерна ДНК; нижня панель - ДНК, яка залишилася на старті геля.

Подібна поведінка комплексу топоізомераза II*ДНК в умовах т vitro, відмічена лише для комплексу, функціонуючого в присутності іонів Са2+. Замша магнію на кальцій в інкубаційному середовищі в модельних умовах веде до стабілізації комплексу, що виражається в нездатності ферменту звільнитися з ДНК. Обробка такого комплексу ЕДТА веде до формування значної кількості розщепленої ДНК (Osheroff, Zecheidiich, 1987), ало подальша інкубація обробленого ЕДТА комплексу в присутності іонів Mg21 повертає ферменту здатність до здійснення літування ДНК. Подібне явище збільшення кількості розривш при обробці ядерних препаратів ЕДТД здається, спостерігаємо і ми, але в присутності іонів магнію. Така

поведінка ядерного комплексу може бути обумовлена перманентним існуванням у

складі ядерного матриксу, тобто його початковою стабілізацією.

Для подальшого дослідження функціонування ядерного комплексу топоізомераза Н*ДНК ми дослідили його поведінку в присутності іонш кальцію. Як

можна бачити з даних, наведених на Рис. 11, вплив ЕДТА на крупноблокове розщеплення ядерної ДНК в Са-ядрах виявився подібним до такого в Мд-ядрах: інкубація Са-ядер з іонами кальцію при 0°С веде до крупноблокової фрагментації такої ж інтенсивності, як і при інкубації тих же ядер в присутності ЕДТА. З іншого боку, обробка ЕДТА Са-ядер після інкубації в присутності іонів кальцію при 30°С приводила до посилення розщеплення ДНК, як це має місце в системі in vitro, або в Mg-ядрах. Однак, інкубація СаЕ-ядер в присутності іонів Мд2+ на відміну від умов in vitro не веде до літування ДНК. Це друга важлива відмінність ядерного ДНК*топоізомеразного комплексу подібність його поведінки в присутності іонів магнію та кальцію.

Рис. 10. ЕДТА-залежна модифікація

комплексу ДНК*топоізомераза П.

Втрата здатності до здійснення

реакції з'єднання ДНК в препаратах,

оброблених ЕДТА

А - Ядра, виділені в Mg— буфері (Mg-ядра), інкубували в буфері ТОР при 30°С 20 хв. (1,2). Після цього в буфер додавали ЕДТА до кінц. конц. 23 мМ (2), інкубація 20 хв. 30°С, лізирували і фракціонували в FIGE.

Б — Mg-ядра інкубували в буфері ТОР в присутності 250 мМ NaCl при 30°С 20 хв. Після цього в інкубаційне середовище додавали ЕДТА до кінц. конц. 20 мМ (4,5) і інкубували 20 хв. при 30°С; після цього додавали МдСІг до кінцевої концентрації 20 мМ (5) і обробляли 20 хв. при 30°С. Оброблені препарати лізирували і фракціонували в FIGE. Верхня панель - розщеплена ядерна ДНК; нижня панель - ДНК яка залишилася на старті геля.

Крім того, ми знайшли, що в Са-ядрах на відміну від Мд-ядер спостерігається також ДсЫа-незалажне крупноблокове розщеплення ядерної ДНК (Рис. 12). Цікаво, що властивості останнього в значній мірі відрізняються від властивостей ДсИа-залежно! фрагментації в Са-ядрах, і на відміну від них нагадують утворення продукту розщеплення в умовах in vitro: обробка ядер ЕДТА на

- МдЗО°- — Mq.30°—« і і і Е No No Но

А Б

холоду веде до Дс№-незалежного формування фрагменту розміром ЗО т.п.н. (Рис,12, Б), інкубація СаЕ-ядер в присутності іонів магнно веде до відновлення розривів і відповідно до зменшення кількості розщепленої ДНК (Рис. 12, Б). Існування двох різних механізмів формування високомолекулярних фрагментів в Са-ядрах, а саме ДсНа—незалежного та Дс№-залежного, може бути обумовлене існуванням в клітинному ядрі функціонально різних форм ДНК*топоізомеразного комплексу.

ядра Со Со/Е Со СаІЕ Со Сч СоІЕ

•—о*—■ ■— зо’—' 30“ '-М9,30'-

інкубація ^

1 2 3 4 5 6 7

Т.ГІ.Н. І

300-І 50 -І

А Б В

Рис. 11. Вплив ЕДТА на вксокомолекулярну фрагментацію в Са-ядрах.

А Ядра, виділені в Са-буфері інкубували на холоду в присутності іонів Са^+(Са-ядра,1) або ЕДТА (СаЕ-ядра,2). Б. Ті ж ядра інкубували 10 хв. при 30°С (3,4). Після інкубації іони Са2+ заміщали на ЕДТА (5) и продовжували інкубацію ще 10 хв. В. Зразки Са— (6) та СаЕ- (7) ядер інкубували 10 хв. при З0°С в присутності іонів Mÿ+. Далі препарати ядер обробляли flcNa та фракціонували в FIGE. Верхня панель

- розщеплена ядерна ДНК; нижня панель - ДНК, яка залишилася на старті геля.

12 1 2 12 1__2 J_2

50-

A Б В Г Д

Рис. 12 Перетворення ДсИа—залежних і ДсШ-незалежних продуктш розщеплення комплексу топоізомераза П*ДНК в Са - ядрах.

А Ядра, виділені в Са-буфері (Са-ядра), заплавляли в агарозу і фракціонували в FIGE. Б. Са-ядра обробляли ЕДТА перед заплавленням в агарозу (Са/Е-ядра). В. Са/Е-ядра інкубували в присутності юнш М^+ перед фракціонуванням, (Са/Е/Мд)-ядра. Г. Са/Е-ядра обробляли 250 мМ NaCl з послщуючою інкубацією в присутності іонів Mg^fCa/E/Na/Mg-aflpa). Д. Після інкубації в присутності іонів Мд2* Са/Е№/Мд-ядра оброблялись ЕДТА з послщуючим фракціонуванням в FIGE (Ca/E/Na/Mg/E-ядра). Інкубація ядер на кожному зтапі проводилась 20 хв. при 20°С. 1 та 2 - відповідно необроблені та оброблені flcNa ядра. Розмір фрагментів - вт.п.н.

4. Дослідження функціонального знамення крутюблокошії фрагментації ядерної

Нами також було встановлено залежність ефективності крупноблокового розщеплення ядерної ДНК вщ фізіологічного стану досліджуваного об'єкту. Як видно з даних на Рис. 13, характер фрагментації відрізняється в препаратах ізольованих ядер, одержаних з функціонально різних тканин одних і тих ж об'єкта: для клітин, що не діляться, властиве посилене розщеплення ядерної ДНК в порінянні з проліферуючкми клітинами. Різниця в ефективності розщеплення ядерної ДНК в функціонально різних типах тканин зберігається також і в препаратах нуклеоїдів (Рис.КДБ), що свідчить про можливість обумовленості такої різниці відмінностями в характері упаковки ДНК в різних за фізіологічними показниками клітинах, або неоднаковою ефективністю нукпеази, що здійснює розщеплення ДНК. Таким

днк.

ферментом, як свідчать дані про ДсЫа-залежність крупноблокової фрагментації у всіх препаратах (Рис,14,В) є або матрикс-асоційована (така, що не екстрагується обробкою 2М №С1) топоізомераза П, або подібна до неї нуклеаза.

Рис. 13 Залежність характеру високомолекулярного розщепленім ДНК від фізіологічних показників клітини. Фракціонування в FIGE лізированих препаратів заплавлєних в агарозу ядер, виділених з рослинних тканин з різною проліферативною активністю та рівнем диференціювання.

А. Характер високомолекулярної фрагментації ядерної ДНК в тканинах проростків кукурудзи: 1 - апікальна меристема кореня; 2 - тканини кореня з видаленою апікальною частиною. Б. Характер високомолекулярної фрагментації ядерної ДНК в тканинах Crépis capillarís: 1 - 7-добові проростки; 2 - мезофільш тканини листа. В. Характер високомолекулярної фрагментації ядерної ДНК в тканинах Rauwolña serpentina: 1 - лист інтактної рослини, 2 - культивовані клітини. Розмір фрагментів — в т.п.п.

Таким чином, з одержаних нами даних можна зробити висновок, що ефективність крупноблокового розщеплення ядерної ДНК, в якому приймає участь асоційована з ядерним матриксом топоізомераза II, обумовлена певним чином фізіологічним станом клітини. Цей висновок може означати, що зміни функціонального стану клітини супроводжуються змінами стану петлевих доменів хроматину, в яких приймає участь ДНК-топоізомераза П. Це узгоджується з даними

про важливе значення цього ферменту в багатьох процесах метаболізму ядерної ДНК і може бути підтвердженням гіпотези, що активно розробляється останнім часом рядом вчених, і згідно якої структурні домени хроматину є також функціональними одиницями геному, в межах яких розгортаються основні події пов'язані з реплікацією та транскрипцією.

т.п.н.

300-

50-

12 3 4

* » ■***■*• м*

іііа

Ь* і.

1 2 3 4 1 2 3 4

А

Б

В

Рис. 14 Збереження характеру крулноблокового розщеплення ДНК в препаратах ядер та нуклеоїдів Сдегістонізованихядер) різних тканин проростків кукурудзи.

А Ядра з апікальної меристеми кореня СІ) та кореня з видаленою апікальною частиною (2) 4-добових проростків кукурудзи; з кореня (3) та листа (4) 11—добових проростків кукурудзи виділяли за стандартною процедурою, обробляли flcNa та фракціонували в FIGE. Б. З ядер (див. А) шляхом дегістонізації 2М NaCl отримували препарати нуклеоїдів, обробляли їх ДсИа та фракціонували як і раніше. В. Фракціонування препаратів нуклеоїдів, необроблених лізуючими агентами.

ВИСНОВКИ

1. Крупноблокова фрагментація ядерної ДНК, що спостерігається при обробці ядер білок-денатуруючими агентами, є результатом впорядкованого розщеплення ядерної ДНК на структурні домени хроматину,

2. Характерні властивості крупноблокової фрагментації ядерної ДНК а саме: Дс№-залежність утворення розривів; літування розривів в специфічних умовах; посилення фрагментації в препаратах, що були оброблені специфічним інгібітором топоізомерази П теніпозидом (УМ-26); наявність білок-асоційованих розривів, —

комолекулярних фрагментів ядерно! ДНК.

3. Петлеві домени хроматину входять до складу функціонуючого комплексу топоізомераза П*ядерна ДНК, який реально існує in vivo, здатний здійснювати повний цикл реакцій розщеплення/з'єднання ДНК, і властивості якого подібні до властивостей комплексу, дослідженого in vitro з використанням плазмідної ДНК та очищеного ферменту.

4. В характері функціонування ядерного ДНК*топоізомеразного комплексу існують певні відмінності в порівнянні з комплексом, що був досліджений in vitro. Основні з них: нездатність комплексу дисоціювати та його модифікація під дією ЕДТА, яка веде до порушення здійснення ферментом реакції ре-лігування ДНК подібна поведінка в присутності іонів магнію та кальцію.

5. Характер крупноблокової фрагментації ядерної ДНК що залежить від ефективністі розщеплення ДНК асоційованою з ядерним матриксом топоізомеразою П, обумовлюється фізіологічним станом клітин.

ПЕРЕЛІК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ НА ГЕМУ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. В.Т.Соловьян, И.О.Андреев, В АКунах. Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Дискретные фрагменты ДНК и уровни структурной организации хроматина// Молекулярная биология, 1991.-25, №6.— С.1483-1491.

2. В.Т.Соловьян, И.О.Андреев, В АКунах. Функциональная организация ядерной ДНК растений. I. Данные в пользу существования ДНК-топоизомеразного комплекса //Молекулярная биология.-1993.-27, №6.-С.1245-1251.

3. В.Т.Соловьян, И.ОАндреев, ВАКунах. Функциональная организация ядерной ДНК растений. П. Особенности поведения комплекса ДНК-топоизомераза П в препаратах изолированных ядер //Молекулярная биология.-1993.-27, №6.-С.1252-1260.

4. Соловьян В.Т., Андреев И.О., КунахВА Фракционирование ДНК эукариот с помощью пульсирующего гель-электрофореза. Интерпретация организации ядерной ДНК как составной части комплекса топоизомеразаД/ДНК // Биополимеры и клетка, —1993.-9, Na 5.-C.44-S1.

5. Соловьян В.Т., Андреев И.О., Кунах В.А Фракционирование ДНК эукариот с помощью пульсирующего гель—электрофореза. Особенности поведения комплекса топоизомераза П/ДНК в изолировадных ядрах // Биополимеры и клетка. -1993.-9, Na6.-C.50-56.

6. Solovyan V.T., Andreyev I.O. Structural domains of plant nuclear DNA as constitutive component of topoisomerase П/DNA complex /Abstr. of IVth European Cell Biology Congress, Prague, june 26-july 1 1994// Cell Biolintem.-1994.-18, №5.-P.507.

7. Solovyan V.T., Andreyev I.O. An ordered fragmentation of plant nuclear DNA and its relationship with physiological state of the cells / Abstracts of Intern. Symp. Plant Biotechnology and Genetic Engineering, Kiev, October 3-6,1994, P.154

8. Solovyan V.T., Andreev I. O. Structural domains of plant nuclear DNA as a constitutive component of topoisomerase П/DNA complex // Acta Biochim. Polonica. -1995. - 42. -P.201-204.

9. Solovyan V.T., Andreev I.O. Physiological significance of nuclear DNA domain disintegration: evidence for non -random DNA-domain cleavage // Биополимеры и клетка, 1995.—11, №5.-C.51-55.

АНОТАЦ1Я

Андреев И.О. Исследование крупноблочной фрагментации ДНК в препаратах клеточных ядер.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1996.

Проведено исследование свойств процесса крупноблочной фрагментации ядерной ДНК, наблюдающейся при лизисе препаратов заплавленных в агарозу ядер и клеток эукариот белковыми денатурантами или протеиназой. Показано, что образование высокомолекулярных фрагментов размером 50-100 т.п.н. происходит за счет расщепления хроматина на петлевые домены. Характерные черты этого процесса, а именно: строгая зависимость образования высокомолекулярных фрагментов от белковых денатурантов, наличие белок-ассоциированных разрывов ДНК, зависимость характера фрагментации от специфического ингибитора топо-изомеразы П тенипозида и сохранение упорядоченной фрагментации ядерной ДНК в нуклеоидах, - свидетельствуют о участии в нем ДНК-топоизомеразы П, ассоциированной с ядерным матриксом. Показано, что двуцепочечные разрывы ядерной ДНК приводящие к появлению высокомолекулярных фрагментов, могут быть восстановлены в условиях, специфически стимулирующих зависимое от топоизомеразы П лигирование расщепленной ДНК Полученные данные свидетельствуют, что петлевые домены хроматина являются составной частью ядерного комплекса топо-изомераза П*ДНК основным свойством которого является способность к осуществлению реакции расщепления/лигирования ДНК Показано, что по своим свойствам

комплекс ДНКтопоизомераза II, функционирующий в препаратах изолированных ядер, напоминает аналогичный комплекс, исследованный в условиях in vitro, однако обладает некоторыми лишь ему присущими особенностями, одной из которых является его неспособность к диссоциации. Установлено зависимость крупноблочной фрагментации ядерной ДНК от функционального состояния изучаемых клеток, что предполагает возможное физиологическое значение этого явления.

Andreev I.O. The investigations of the high molecular weight fragmentation in cell nuclei preparations.

Thesis for seeking of scientific degree of candidate of biological sciences on speciality 03.00.03 - molecular biology, Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1996.

The properties of nuclear DNA fragmentation into high molecular weight (HMW) DNA fragments, observed in isolated nuclei upon Iheir treatment with protein-denaturing agents or proteinase have been earned out. It has been shown that the formation of HMW-DNA fragments sized 50-100 kb occurs as a result of excision of chromatin loop domains. The characteristic properties of HMW-DNA cleavage, namely, SDS-dependent formation of HMW-DNA fragments, occurrence of protein- associated DNA breaks, the sensitivity of the fragmentation pattern to the specific topoisomerase П poison teniposide and remaining of an ordered DNA fragmentation in nucleoids (histone-depleted nuclei) suggest the involvement of scaffold-associated DNA-topoisomerase II in ordered disintegration of nuclear DNA It is revealed that the ds- DNA breaks leading to the formation of HMW-DNA fragments may be re-ligated under conditions that specifically favour topoisomerase П-dependent rejoining reaction. The results obtained indicate that chromatin loop domains are involved m functional complex topoisomerase II*nuclear DNA the basic property of which is its ability to cleavage/reunion reaction. It has been shown, that the complex DNA*topoisomerase П in isolated nuclei possesses the properties similar to those described for in vitro established DNA*topoisomerase II complex. At the same time the nuclear DNA*topoisomeraseII complex has been shown to possess its own specific traits, one of them includes its inability to dissociation. It has been demonstrated also that the pattern of HMW-DNA fragmentation depends on a functional status of the cells, thus indicating a possible physiological value nuclear DNA disintegration into HMW-DNA fragments.

Ключові слова: ядерна ДНК, високомолекулярні фрагмента ДНК, ДНК-топоізомераза П, петлеві домени хроматину.