Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование кинетики активации и агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетики активации и агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния"



^ £ ПиН 1 САШСГ-ШГГЕРЧУРГСКИЙ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УШ1ВВРСИТ1ТГ

На правах рутоцвса

МИНДУКШЕВ

Игорь Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ АКТИВАЦИИ И АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ МЕТОДОМ МАЛОУГЛОПОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ.

03.00.02 - Ь'исфпика

Л г о р е ф е р а т

диссертации н.» соискание ученой степени кпндината биологических наук

Санкг Пекрбур 1996

Рабата ошолисиа в лзбораторш сравнительной <Кшолош;1 дькакдо Ииепиута еволюциавюй физиолога и биохимии км. И.М.Ссчсиова РАМ

1 (цучиыо ру 1са о одитех иг

кандидат мадшрюшх наук Э. Ф. Деркачсв. доктор биологшешш наук А. И. Кризчвнко

Официальные оппснзмты:

доктор биологических наук Ф.Г.Грибакш

доетср биологм'-зссгюх нор О.Е.Лебедев

Ведупая организация: Институт биофизики клетки РАН (г.Пущино)

Защита состоится "_" 1990 гада в 16 «шесп

на заседании Специалгаиромажот Совета Д.063.57.50 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора бнологичзск»« паук в Сонкт-Патербургасом государственном университете (159034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7Д, вуд.ЗВ )

С диссертацией мешю ознакомится в библиотеке им. А.М.Горького Сашст-Пегербургскогр государственного университета.

Аоирзферзт разослан "_"_ 1936 года.

Ученый секретарь Специализированного соор"э кандидат биологических наук

З.И.Крутецкая

/Маулпьшсчи npaflmpu. Тромбйцшы - ода i га иакв ш шучмамк оЭына-.! но исспедовшЕэо г»г/1р«:спотсчной с .'шллзвцми. Имеется носколыгэ причин notiiJiueiiHoro niTipüca исследсватолсЯ к этому объекту: 1) этапы акгооащз! »пряду с fiitow«.«i"uvia!M проявлением псрг -лельна i%:s¡ot морфологический згаизалет реализации, 2) оЗллио рецепторов, ti таскэ ycWRtTfUHUx систем (Ca., П/Л1Ф и ЦГША и не гг.) пот;гшелшой (ьСразоппша ткл".бо;я на £'раш\онозйД utciumj) rt отрицательной (оЗразооанко КО) обратной евши, 3) простота млодикд «цделеннп saifcTc.í га rpowi и регистрация конечной рвакции - сгреггцш. Не удиьителько, что зтат объект используется как спецрашстоии фундгмгнтспьных, ток м прикладных наук (на трег.йоцигах проводится несколько десятков тысяч фарг.»-ислытшиП в год).

Несмотря на простоту it удо5с-чэ метода исследования erperayut, предложенного Барном (Born G.V.R. 1s>52) в ставшего рутинным, лояс'.гась потребность п матодчх, которые прздостпвляпи возможность исследовать «siw.y парциальных рвшуЛ процесса - отдельны« етад««| ©стааацш! н агрегацию.

Процесс«-.грзг.-.и4ий тромиоцитоз по,. власнием сгонистоз рггкцклекпючаа) свткывгиие г,геиис1а с рецептором, активиста тромбоцитов (chapa '. tvin^n) u cwctqühho crpenuçi>o. Морфологическим зк апепенюм акте пгячвгея сфергаацин клетки (переход "диск-шарж") с последующим обрезовэдпза псевдокод" ui (гизреход "шарик-ежик*) (Sless W. 1989). Косвенные пропащ свндетельствугт о том, что дпп эффективного стогизтвенип клеток, ведущего к образованию димероа, '¡tot одима ста.дил образовании псевдоподии, а то вреып ¡гак пиро^од "диск-шарик" ни достаточен для запуски arpeianmi. Следовательно, увеличение [Ca'1], и сферизация клетки не язляется достаточны?,« условием для оСраэозгнля псевдоподии h агрегации. Не ясна роль одр чалша как агониста а егсции. ß отличие от агонистов, повышающих онуфиипоточ.чи'1 кальций, адренллш может быть фамором агрегации только нп фон». поьышенноп» £Са2<|. и состоявшегося перехода •диск-шарик'. Ont положения, в силу их pamiw. 1 трактовки и литератур« (Flflures W.rt.13B6, Lanza F.1935, Milien J.G. 1984, Sisas IV. 1989), треЗ/ют прямого акспершотапшого исследования.

Теоретически очевидно, что скорость агрегации (образованна длт/зрез) является фунщпан вероятности столкновения активированных тромбоцитов, которая определяется концентрацией клеток и скоростью пореиешивзн'ил, п .шо: ' зффе .ивностыо взаимодействия - прочностью слипания после соударения, зависящего от концентрации двухвалентных катионов (Ca, Mg) и рМ (Frojmnvic M. Г Л., 1982) ы солевсй среде при низкой концентрации фибриногена. Ни&аиркся данные в литературе по зтш вопросам являются, I) основном, качественными т.к. известен 4>акт слияния и наппавленнослъ действия.

Цель я задача_исстюдозания. Целью настоящей райоты нанялась

разработка нового метода одновременной регистрации актизацнонных стадий и агрегации па основании саеторассеиапющих характеристик суспензии тромбоцитов, исследование laineтичеекмх особенностей рктизации и сгрегацни и пос.роение матекмтическ« модели агрегац^ пюмбоцито^.

8 конкренн ; задаче исследования входили: 1. ймбор длапазона утлоп сканирования сипела светорассеяния, в »втором преиглутцественно гтрояргтнтотск актм-^цмонь.йО или шрстациянные процессы Возможная нормировка cm налов.

2 Опредит-пие факюрпн иеронгностн й эффективности взаимодействия хне'^к хнцсш'- -чрн клегок, скорости оборотов мешалки, конце!«рац'«1 ионов к .и.ция я гррдо) Оцениг« шнетиж • ¡ ;ix юнетанг трег^ции фомЫцисп

3. Опр.едепзние условий среды и состояния laioioit дня пролз»ешл агрсгзциожю» спосг,0'")сгм адреналина Иселсдолонио солсктнпмости пдрснорацспгора •1. Оподслсшз оет-шн ЕСу для АД& (концснградш медиатора, ийоОхп^пмал для дйст!!)чь(11!Л половины м0(<сииг!ль»'ого аффекта) п, jqeccoD сфершац',-,п и с$р^зсзйи.1я пссадоподий тромОоцитоз.

6. Псстрссние мэтеглптмческоМ модели огрсгаццоняой кинетики при дсйсткпг АДФ № «)c«ooo.mi'h шатооа эшкри» wora данных по хинетше штаюцц» и агрггации

Нг.уч;т новизна. Разработан иос^й истод д,,я непрерывной л о&чюрдогнизй регистрации ш:тио*цга и агрегации тромбоцитов.

Олрод.лслы дпл АДФ РС;з зг.ки- "мости дооо-отает в процее гл сч'ф'/зсцля Ii образования псевдоподии тртоощиаа. Похюено приблимскид ECso сфсриззции тот: к величине Ко (константа диссоциации модизтор-рецептср). Сдснач с.нагеа пммохзюго отличия констгнт, попуч&емш из вфспиуюнноЯ t'üit?»;,®, соус- оленнон кинегочшелми особенностями процесса.

Показана, что о условиях спонтанной сфершоции кпеточ при реализации Со*'ЛМа*-йОмснз и шшсссй срадо (140 mM KCl) адреналин вызызаат афзгащиго тромбоцитоа кролика, которая сплзйпа с сспсхтивным оозбуядашеи ,ii-ajnnci «рецептора.

Дт.кп количественная оценка факторов, (концентрация ютэток, скорость oOcpoit-D ucujsri;:it, внеклеточной концентрации покоа кальцин) о5успаз»иза:ощш скорость агрегаций» тромбоцитсо. Представлена их функциональная пзаииссогаь.

Дано матсмаг"<ошк> списав» мшегики з.^егацин тромбецнтоа «р» действии АДО в сопсеой среде и условиях турбулентного движения жидкости.

tto.'-i-HO-PogicnwcKoe значение работы. Новый метод и возмюяюгть контроля условий ср.ды, концентрации itnstox, массой.реиосных характеристик могут стать основой для разработки егрггомэтроз нового класса, дающих количествен, ./с. оценку функциональной активности тромбоцитов. Полученные результаты позволяют выработать стратенио исследования механизма действия ф.арм-грспйрчтоа, с выяапекисм *шшег " действия препаратов но тромбоциты. Представлен, .^о результаты расширяют представления о механизмах „.г/тргтслеточной сигнализации в процессам трансфорыз'-чи тромбоците.!.

АлпэВацая ю- -'оты. Результат.- диссертационной работы были доложены на конференции 'ИонныИ транспорт и регуляция функций клеток* (С -Г!атерСург,1994), на заседании секции 'Экологической физиологии" ИЭФБ им И.М.Сеченова РАН. (С,-Петербург, 25.01 96), на С.-Петербургском наяном обществе патофизиологов (3 01.96) и на l(XI) Международном совещании по „лолкзционней физиологии (2$ 04 1936)

Структура ■• оОьом диссортмуи Диссертация состоит из следующих разделов: введения, ойзора литературы, описвн-,я материалов и методов исследования, »«ломания резулычтоз и их обсуждения, выьодов и списка цитированной литературы эботз изложена на 101 странице, включая 31 рисунок и библиографию, содержащую 73 оточостоонныд-и 120 зарубежных ксточииков

Положения, которые выносятся па занатту

1. Предложен новый г->соб исследования октиооции и агретции тромбоцитов.

2. Реакция агрегации о солевой среде относительно концентрации тромбоцитов является кинетикой второго порядка и зависит от условии среды

3. Сферизация тромбоцитов кролика лшзана с пошшсниги [Са"],, спишамо проходит и KCI-греде, ¡л только после се прохождения адреналин гзы^ьчмет ot' азовяшге псевдсподш приучзс.ии «2-адранирсцепторп.

4. Сфер^ация при делстпин АДФ определяется голы» гьрмон-реце|uopiтым завис, л, а образована» псевдоподии и последуй |ап ефешция опредаглош! состояние/.« трсийациюо г. усгоэииш внашей среды.

Кинетическую исследования активации и -«-ротации позволяю i прсдстаатъ штештичсскоп мидель агрегации, в рамках которой рассмотрвно влияние процесса перехода imsiux а пнги&ировашюа состоите на агрйгацлон.чуш кин.-ллку.

Материалы и лгтоды мссладоэгжш. Объектом нссийдо« гния являлись тромбоциты самцов кроликов p.Shinshila Средний üec кроликов был 2,1 i 0,3 кг. Испопвзсзалн кегозь^а кровь из уха взятую с антикоагулкнтс» • (а соошошенли 5:1). В качестве анлисоагулшта использовался 3,2% рас тор цитрата натрия, рН раствора б 0. С< лащетятуга тромбоцитами плазму {PRP4 получали цеитчифугирозамийм кроаи в тече.ни.е 10 мин при 150д. В предстаплонлых скспершенга.ч р-Ч плпзтлы находился а области 7,2-7,0.

Для' проведения светорассеивающих характерно í¡«< суслшдаи ромбоцптоз ci. дала ерппшг-ьная установка. Источит: света - лазер Ш1ГН-204 (1 мВт) с длиной волк . 632,8 ми. Г установке предусмотрены воздо:»1огтм сканирован«! по углу светорассеянии в диапазон« 0-20 фндуссв, a при фиксированном угле - осуществление выборе т 0 да 1SQ фадусов, с paípim:;=nnr:M углов при 0,4 фадусном отличии. Эксперименты проводились в кк-асча с оптической /ynii.ort пути (толщина iac еты) 20 мм, с термостатнроо; нем почетна, камеры. Объем коавгы - 10 мл. Специальная комструщия м;:шап"Ч (цилиндрический волчок) обеспечивает гот.киенность и muipoiniocn» тдродимаг.шчзскогп турбулентного режима при отсутствии нзрушениг« фс:з сустшдаи (образованна пузырей). Контроль оборотов волчка осуществлялся с

использованием час-тогометра Ф5035, флуктуации частоты оЗоротов была не больше 4% oí устаниолшного значоннл. Постоянство значения рН среды (7.3) ' зстчгапссь внесением в среду 10 • 20 п>М Трие-НС1-буфера. Величина концентрации ионоз калт • ил в среде (CaJ,j5 устанавливалась ензеениви в сроду 50 тпМ раствора СаСЬ. Следует отметить, что в силу разбазлания PRP в 30 и болов раз величина [Cü;*]c, может быть рассчитана из этой добавт (отклснын-к; и г расс-шть» семой величины составляет не больше |5 рМ)

Концентрация тнютпк о обогащенной ллазмо определялись мш-росюиадчсстиад методом (и камер« Гориеиа) Ни основании этих данник я данных, получежих при фотографировании PRP при длине волны 600 ¡tu о 5 мы ктовите (Doiit, 13G2), и по величине начальной интенсивности 4 фэдоспол.' сил юла были i строены 1;?)л..оропг)чт".1э фафики, иотг-^ьте позволь и быстро омредо'ипь ьонцинрацию ите 'iK н каждом эксперимент«.

Разработка метода одтювргм« ícsí ретистратит актизгщни и афеыниш трслЗс-цнтев. Ilnji)4f.;mif! !'ил!1Ч"'лвенны)( оценок методом малоутового светорассеяния пдаииж > юлмт при уст вил одиот.рашотп рассеяния Кршвриил тшлнлчния I» ъоьралхип |)пгп1'чисп нпаттетс отполешь от »»».•' «н-л< rip'H'np'iiuiHiiii-i.nriH miuí-|;i ивлос" ,т:ге)т;|нп| свсна и криц-нш1 -■ ьчi i п.щ

Зкл;ог.дзс51 иитснсгаисста сватсргссеяная от шгцснтрацг* иигулшшровакных uiaroic - упш рсшстроцт! '¡-15 ¡радусой в 20 см иоазто в солевой сред (140 ir.M Naul, рН 7.0 Трис-буфьр, f"a3'lo-0.6mM) в диапггззшг концентрация кпетзк до to' mítn ясл/гегся линей¡юн (при Ос-ыией ¡поточиост а.азывшогсп аффекты мюга-ратаго рассеяния, si зовисимость тсэяет линей!¡ып характер). Б дпэтозоне 10* + 10' ш'глп и проводились все ®ксперимгнты.

.Необходимо получ;нь кош. ,aciao!..iyio оцет?/ кседого из состояний в цепоччо (icsk-цнй. Для тромбоцитов ташк состояний «г тыре: дпекопиднь'й трсмбсцлг (диск). сфорнзосгиныЯ ("шарик"). тромбоцит с пс№дсппдня.\п1 C&xv:*) и "легочный егрстат (первоначально димер). Для этих соыояипЯ г.;сладог12ГС»иг индпкглриссы о ушах 1 - 15 грпдусоу. Пп/инсатри^ы спаюра;мпй1Я имеют Олткии к йкспоненциальному екду харзктвр, »t пекгпшепи ■ гяспочсмты но зависит oí |'.0"цеи грации клеток.

(¡a р;-;.1 представлена логарифмическая зависимость интеноисиости са*зтсргссеаа& w от угла регистрации для момог.хроо (дисков), пип/чет«.« пр» внесении PRP s сол&оу» сред/: 140 гаМ HaCI, рН-7.8 трпс-буфер, CoCf2=0.6 ¡'¿Л н доядомеров (получениях при агрегации, оызважой 0.G рМ ЛДФ).

6l //ti (отп.сь)

k Dim г 0,4-5 (1/гргд.)

3

ь mar,. J,24 (1 /град.) ""^-.-Я

■J

угол (фЙД )

Рис.I Угловая функция имтемсшюст сазторассаянип ('/> I) для монсмероо и лиморов (сгрзгетоз). Показатель зипоиеиты димвров (kjm) ~ в 2 раза больше экспоненты мономоров (k.-мД Кснцаитрацил клеток 2 10 е кп/мл.

Полнота димеризации контролировалась следующими условиями. 1)&~реггц.ед (реги'^и'руомая о Л градусном утло) имеет быстрый (около 5 мин.) ггепоискц»аль»(ый характер и лри выгоде на плато не имеет обратимого характера (т я. дезагрегации и образование агоегатоа с большим числом клеток ко нз'пюдзешп, оба эти пр| есс.а вызь'вьгот уменьшение сигнала), 2}прн выходе на плато добаокя (3 цМ) адреналина не вызывает изменения сигнала ( все клетей афишированы) Видно, что в диапазоне углов Ь - 6 градусов наблюдается инпергл-.я сигнала у-^бным дпя ртистрации атрчгационного процесса является угол около 4 , что дает пеиичину отношения интенсипнос.теи гиетирлгееяния от димерпа и от мономеров у около 3 ; 4 Эта величина удоЬиа дпя оцннчи полноты агрегации

Сравнение индикатрисе нешс тированных клеток (дисков) и сферизооанных, получянных а КС!-среде, показало, что их индагатриссы совпадают малых углах (3-8 гэдусоо) и расходятся о больших углах (9-15 градусов). Тромбоциты с псевдоподияии ("емт!"4 т.е. способные к вфв'вции после пне.' спи. кальция кз сроду, и иэачтипироагнныо (дне I) дают соппадаюирк» индмкэтри-хи и отличзются только флуктуацией сигнала. Угол скопо 12 гоадусов был использован для исследовании активации.

Р ГС Р A D Р

Рис 2 Динамика изменения светорассеяния суспензии тромбощтгоа ь солевой ерэдв: 140 mM ÍJsCI, 12 mM трие-CI буфер (рН 7.8); при действии 0,6 ;iM АД© о дзух угг • t рзгиетрагу«! 4 и 12 градусов. Агрегация вызывается добавкой о ерзду 0,8 mM CeCI?, Концентрация клеток в среда при внесении обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) 2 10е кл/мп. Опрадвланио константы К = V,/A = 0.J <1/мкя.)

Из-за разбавления PRP агрегация но проходит о солевой среде без 1ег"Н!!я сс'бодного кальция в сроду, что позволяет nposecm независимое исследование активации v агрегации (рис.2). Видно, что в отсутствии агрегации динамика сигнала в угла 12 градусов имеет двухфазный характер, и, вероятно, отражает два реакции: сферизоцию клепал и образование псев/'.чподий, тогда как агрегация (как образование димероз) регистрируется в обоих углр- причем наблюдается инвертировании сигнала а 12-ти градусном угла при сохранении временных показателей о обоих углах регистрации.

Исследование агрегации тромбоцитов в солевой среде при т тбупеитиом пото •» жидкости.

Следует от.- атить рг^пичия в условиях проведения агрегации в наших исследованиях и в обогащенной плазме. Необходимость разОавленип PRP в 30 и Солее раз (для исключения многодетного светорассеяния) призрит к различию в шрегации клеток. При традиционном методе соетопропускания концентрация ионов кальция в среде очень низка (30 пМ), в наших условиях агрегац, i может проходить только о условиях достаточной концентрации кальция (( ,иjkoii к 1 гтм) (такая конценграци*, свободного кальция в . ,<Р просто невозможна г к прияоднт к образпр,е|.чо сгустк и выпадению фибрина) Поэтому

относительно внешнего кальция наши условия являются приближенными к условием in vivo.

Ь солевой среде (140 г-ад MsCI, pH 7.8 Трие-буфер, [Ca"], -1тУ при концентрации тромбоцитов около 10е кл/мл.) агрегация, регистрируемая по светорассеянию в 4 градусном угле, носит однофазный характер во всем диапазоне концонтрации АДФ. Такой характер дает возможность хзраетеризовать «фагацию двумя величинам: и гальш скоростью ефегации (V„) и начальной концентрацией клеток (пропорциональной начальному сишалу* N0.

Рмс.З Графическое определение порядка реакции агрегации по концентрами тромбоцитов (п=2) при разных оборота мешалки (1-750 об/мин, 2-450 об/мки/. Агрегация, вызвана АДФ (O.fi jjM). '", - начальная скорость афвгации. - концентрация тромбоцитов.

Скорость реакции (афе^ции) определяется вероятностью и эффективностью столкновения клеток. Представляется очевидным, что »-фазоаанш димероз, по отношению к концентрации клеток, является реакцией второго порядка.

Экспериментальное подтверэдение этого положения представлено на рис.3, где представлена графическое определение порядка реакции ^фегации относительно концентрации клеток (Nc) п, л разнь значениях оборотов мешалки ("огда афегация вызвана насыщаемой дозой АДФ (0.6 рМ». т.к. скорость ектмаации не является лимитирующей (т.к. активац ; протекает за несколько секунд, а время а,; егации сущесть -нно выше - минуть'' то константа второго порядка к,у реакции и характеризует агрегацию (образование димеров). Величина ка, . пропорциональна V„ / N0 2 и зависит от вероятности столкновения и зффективности соударения, г тому влияние скорости оборотов мешапки (W) . раетор вероятности столкновения) и: нцентрации ионов кальция в сре~е ([Саг+]0) (фактор эффективности соударения) на агрегацию оценивалось относительно величины Vn/Nt,".

На рис.4 представлена в дойных обратных координата* зависимость величины Vi, / N02 от кои . нтрации ионов кальция в среде ((Ca3*)?) при разных оборотах мешалки. Константа полунасыщения концентрации свободного кальция в среде (Ко5) графически определяется ~ 0,25 mM (0,24i 0,7 mM по 5 животным).

Зависимость ее /чины Vn/N0J от скорости оборотов мешалки (W) при рачных конценфаципх кальция в среде определяем степенной зависимостью с показателем <1, но в широчом интервале хорошо апроксимируется линейной функ- 1ВЙ.

Рне 4 Зависимость в двойных обратных координатах константы второго порядка erperatym V„ / М ') от концентрации коков кальция а срэдв при разной скорости оборатоа мзшали» (Afíís • 0,6 рМ).

Уравнение максимальной (начальной) ск тосто афегзции е солевой среде при максимальной активации тромбоцитов в условиях развитой турбулентности имеет еид:

= Comí- -V- • w■ ККг (2)

" пталс fv-ca . i

О 5 I 'о

Из уравнения видно, что между факторами, определяющими скорость агрегации (клечочность, кальций, бороты мешалки), существует зпределангаь зквквалент! гость, и их можно вэаимозаменять.

Сферпзацил тромбоцитов.

Сферизацил тромбоцитов под воздействием агонистоз является очень быстрым процессом (время реакции около секунды). Имеются данные утверждающие, что она сопровождается как увеличением объема клаш1, тах и 'стечением коэффициента преломления (что экспериментально нсблюдсотся о фззо-контрастнои микроск' лии как просветление внутриклеточного объема клетки) (Frojmovis M.M.(1S82)). Последний процесс явно связан с изменением цитоскелетной архитектуры (Jennings L К. et al. (1931)).

Обе эти величины - и объем клетки, и коэффициент преломлег-ч сильно изменяют светорэссеиеаюи^ сигнал. В работах Born G.V.R. (1970) и Livne А. с сотр. (1987) показано, чти активация при действии ЛДФ протекает без увеличат« объема клетки. Первичное повышение сигнала в 12-ти фадусном угле, индентифий^рооанное кск сфериззция клеток, мы тают® связываем с изменением созфф,' ^ента прелом,iопии, г силу следующих batnoa:

1) Динамика лову "-опия изгнала является быстрий (секунды) и маловероятно, что га .акое короткое сремя иинный поток r клетку (Na* и CI ) может обеспечим,

значительное повышение объема.

2) При замене ионов Na' на хошн в изотонической холин-хлоридноп среде динамика сигнала при действии ДДФ (0,6 цМ) в точности соответствует динамике а тшрчеЕ ,1 среде

3, Кслрдовйшп »«wwaipncc моношроэ . димеров показали, что при >оеллченни объема, сганеп в ушах регистрации >• i.ite 10 ф- 'усов, должен уменьшиться, а а

шпых углах (< 7 градусов) увеличиваться. В нашем спучзг юзедениз сигнала протио'толокно.

Все сильные егонисты г езыэают увеличений [Са2\ поэтому, естес тюнно Cuno предположить взаимосвязь ontv ?сшго поведения <> 12-ui градусном угла с факторами, повышающими внутриклеточный кальций: при действии агонистоз (АДФ),. при действия кальциевых ионофороз и при излечении ионного состава Среды. И АДФ (наномопярныа ко. ^еятрг.. ,лп) и ионошцкн (Са-ионофср) (при 0,2 цМ) вызывают увеличение 1<г, т.е. сферизг'шя клетки fles? твительно связана с повышением внутриклеточной концентрации свободного кальция ([Са7*],).

Рис.5 Деионсгр&^я Na0, Св<, и ¿<p зависимого элактрогенного входа Са, запускающего сфвркзвци» тромСскртоа (Co373Na' - обманз).

Для многих клеток показано, что о гипотонической среде они набухают по осмотичаскс »механизму, а затем восстанавливают начальный объем (RVD). Этот механизм включоат выход 1С* и С) за счет активации К* и СГ -каналов кальцием, пат которого при набухании нарастает. Этот механизм выражен у тромбоцитов (Itvns А. (19г ')), Действительно оказало^, что |уи гипотонии (~115шМ NaCl или /олин-Сi) происходит реакция спонтанной активации (образование "шар' ча").

Сферизацию клеток наблюдали так же при пол, .jií замена ионов натрия калиевыми'в наш».и среде (рис.5). Направленность сита ) "активации", сходна с той, которая имеется под влиянием сильных агомистоо в Na-среде. Сигнал достигает того жв уровня, однако скорость увеличения этого сигнала на порядок медленнее скорости, реакции t зываемой атомистами (ti/з - мин., по сравнению \\п сек. В присутствии агонистов) (р ;,5). Как видно из рисунка в-Ча*-среде спонтанной астие^ции но наблюдается, а в К'-среде наблюдается спонтанная первая стадия активации (сферизация).

В присутствии ЭДТА(1 тМ) в Kwi среде перехода не наблюдается (или он очень медленный) (рис.5), "■'означит, что, во-первых, [СагЧ, действительно растет в К'-среде, во-вторых, что Са"' не освобождается из внутреннего депо, а "натекает" из наоужной среды Причиной этого "натекания" Са7' могло Оы быть потенциал-зависимое открывани" Са-канапов. однако замена в средо ионов калия на натриаыо при сохранении тоничности среды (рис.6) показала, что появление в средо небольших доз Na' (30 - 40mM) достаточно для того, чтобы прекратить спонтанную активацию на фоне расчагною потенциала, близкою к нулю, т е Ма-компинента в "чатекании" Са"' в клетку существенна и определявicm мембранным

У

градиентом Ма* {линейная зависимость от ''Д!1:Г]). Действительно, замена натрия хопйном во-первых, но изменила ЛДФ-иидуЧРР<>в°нной активами (стоот на АДФ практически на отличается от представленного на рис.2), оо-зторых, нп лро'.тзошло спонтанной активации (роста сигнала активации, как это нпйп'одзотсп в К-среде) и, в-третьих, и это естественно, отсутствовала реакция нл здренешин так жо, как в Ма-среде. Наиболее вкрплтнюм продета1 яетсп механизм, обусловленный 3? "УСя -обменом. Для его реализации, обоспо1'!ша:о1цсй вход Саг< в обигн на На* необходимо сильно '.снизить градиент Мао/Мй). 3 обычной Мп-среде этот ф" \iienT близок к 15 ( 150 / 10 Ыа,), з К-средо - 0,5

среда, по оси ординат отклонение I1' через 5 ».¡гнут посла помещения клеток я сряду.

Эти факты изволили заточить, что спонтанна.1 сфгризация в КС1-среде связана с повышением [Саг+], и проходит в при участии эляктроганного Ca?73Na* -обченника. Таким образом, независимо от способа еоедешш п тромбоциты кальния (Са^/Из*- обмен в К*-среда; при осм'тнческом нзбухасии; через Са-ионофчры иономицин, А237(Са<Н-обмен); при действии агснистов) возникает довольно устойчивое состояние (особенно о 1С .оедв) «нгтшгции • сферизацил клетки (образование "шарика").

Определение места действия ад, м»?пниа п активации т. »мфвцчтеп.

В литературе нет единого мнения об участии адреналина о мрс.ацич тромбоцитов. Твердо установлен лишь фа;а усиления (повышении эффективности) адреналином де" лвип сильных агонис - >о агрегации (Lanza F (1985), Milton J С (1984)), как-будто отрицающий его способность самого пызыпать агрегацию С друи-1 стороны имеются данные об отнесении ь^ронапинз к категории слабых агонистоэ (Figures W.R.(1936), StsrrrouJi V. (1993)), т.е. его свойства we агониста не отрицаются, хотя и подчеркивается их малая выраженность.

О наших экспе-чментах на тромбоцитах кр< ■ •та адреналин самостоятельно в Na среде не вызывает агрегацию в дозах до 20 рМ, но всегда усиливает действие сильны» агонис топ Естественные желанием было получить "состояние"

■ (■оыбоцшой, при котором адреналин бы действовал в качестье агониста .чретации, проанализировать зто "состояние" ; использовать его для оценок ■■пасса адренорецелтора фарм-сред вами.

^ аяренаш-ш 2.50¿M)

PHP

Iй

ЮЛ 80%

V V

J

I4

Тмин

Рис.7 Действие адреналина на образование псоедоподйй и агрсгщуш посла . сферъшщии тром&оциггов в KCI-срада.

В калиевой среде спонтанная сферизация тромбоцитов вызвана повышением (Ca3'),. В натриевой среде внесение адреналина не приводит к повышению атиаационного сигнала, т.е. не вызывает сфаршацию кле.ок (рис.7). Последнее согласуется со сложившимся мнением, что адреналин не способен активировать повышение кальция в тромбоцитах. Как видно из рис. 7 в NaCi-средэ адреналин на вызыаает активации и arps. .,ции, в KCl- с,. зде после прохождения спонтанной первой стадии ек шации (сфартоации) адреналин вызывает образованна "е«ша" и агрегацию, (т.е. активирует ll-стадию активации).

Эти да,.ныв позволяют заключит, что повышение [Ca54]; вызывает первую стадию акт. .ацию 1,..омбоцитоо (сферизацию), но не является достаточным условием для прохождения всех зтапоа активами, более того, что лииитмрующзй стадией в активации шляется гадмя образования псевдоподии ("еиата"), контролируемая внутриклеточными сигнальными системами (цЗДЛФ?). Именно на этой стадии реализуется влияние адреналина. Сильные атомисты пфагации сами способны реализовыаать оба стадии активации, возможно, через угнетение оденилатциклазы (Siess W. (1989))

Получив фиксированное (достаточно устойчивое) состояние начальной актнгацш) тромбоцитов в IC-среде (устойчивый "шарик"), был о проведано кинетические исследование второй стадии активации (формирование 'ежика') в присутствии адреналина и адреноблокагоров (по отклонению величины интенсивности светорассеяния Д!) Графическая обработка результатов этих экспериментов проводилась методом Вульфа (зависимость Ai от АР S), что позволило оценить параметры по сеязывоншо адреналина и блокирования сшеизакип ошотанисшми - иокимбином («п-йдреноблокагор) и лропранополом (ß-«дь-ноблокаюр) сходные с данными, п-. ученными радиолшандныи методом (анализ г<ч Скэлирду) (Byiutiil Г) В (1У94) (рис В)

Л I (отн.ед.)

Кп1(адреналина) - 1,5 цМ К^иохтшбина) - 50 пМ

А 1та.ч Кг(пропраиолола)- 3 цМ

А 1тах /К

т

\ А I / [адреп.] (отп.ед./ пМ)

0,01 0,02

0,03

0,04

0,0Г

0.06

Рис.8 Грефический анализ ларамзтров связывания адреналина (прямая 1) и блокирования связывания пропрамололом • при концентрации [8рРЛ] (прямая 2) и иохкмбииом - при концентрациях: [0,24 цМ] (кривея 3) и [2,4цМ] (кривая 4), По оси абсцисс - отношение й!" и концентрации адранялкна, по оси ординат - ¿1,г. Вычислэнныо значения Км|ЕС5с) для адреналина и значения К, для Рлокаторов представлены на графике.

Для обоих блокаторс видно, что тип ингиОировония - конкурентный, а вычисленные значения для адреналина - Км (ЕС«) ~ 1,5 рМ, для иохимбкна - К, -50пМ, для пропранолола - К, - 3 рМ, т.е. селективность иохимбика (ау арренобпокаторв) на два птпдка выше ггопранолола (р. адреноблокатора). Значение К| для иохимбина соответствует величина кс (Авдонин П.В. (1994)), и это соответствие указывает на то, что осг^вным щовнорецептором в тромбоцитах кролика является о.гвдренорецептор, характерной особенностью которого является сопряженность с СЗгбелком, вызывоющим угн "ение аденипатци-спазы.

Кинетика активации н агрегации при иизких дозах АДФ.

Сферизация регистрируется как повышение интенси мости светорассеяния в 12-ти фадусном уле. Низкие дозы АДФ (десятки нзномолей) вызывают только первоначальное повышение сигнала, т.е. только сфере, ацига -ромбоцитоп. Поэтому исследования концентрационной зависимое™ агониста (АДФ) на процесс сферизации клетки были сделаны на основе анализа величины отклонения сигнала в ответ на добавку АД' (•-чс.9). Полумаксимат ный эффект действия АДФ ь сферизации клетей (ЕС50) равен 44+9 пМ (по 6 животные). Эта величина соотносится с константой диссоциации комплекса рецепгор-пигоид Ко. (МасГаг1апе О Е. (1ГГ2).

При титровании АДФ (в наномолярной области концентраций АДФ), после повышение инте/ ивности светорассеяния в 12-ти фядусн^м угле (сферизация), при дальнейшем повышении концентрации агониста наблюдается уменьшена интенсивности (образование псевдоподий и афегация) (рис.10). Т.е. вторая точка приложения сильного агониста (инл^бировзние а/. нилатци'.'лазы) требует несколько большую величину Оцениваемая величина ЕСг0 процесса образования

псевдоподии приближается к минимяпг'ой величине -100 пМ (109+26 пМ го Л

излвошым) при последующей агрегации (когда (Cobj.-0,6 т,\л> и сильна увеличивается в отсутствии агрегоциеннего процасс

AL^

PRP -i- Г1

J'lfV

¡г-w----

l

i И

AI

2 мин.

0,12

0.0a

0,04

ECso=40nWI

1/ДГ

y

1/JADPJ (1/nM)

—i---——4

-0,1

-0,03

0,05

0,1

I

Рис.9 Сфвршецнл 1рсм5сцитоз вызванная низкими дозами АДФ (пМ), регистрируемая по изменению игтенсивности саэторассиялия в 12 [радуемом угла (стрелками показано ьиасонмо а fiuCI-сроду PRP и АДФ). Показана графичзекзя оценка ВСя в обригнш координатах доза- эффект.

ADP (пМ) 60

(сф&ри зашш) 35 z>o

ТА

12 I ! 480

FC50-40nM

ш псевиоподяй)

"не. 10 Сферизкцмя и последующей образование вызванная повешением коицотрации АДФ. I шревенив тронбоцигоа проводится б НаС1-срвда в отсутсвин агрегации (6 i добавления кальция). Вносимая концентрация АДФ указана около стрелою

Такой сдвиг в концентрациях предполагает неустойчивость состояния тромбоцитов с псеодоподиями Действигально, а отсутствии агрегации кинетическое поведение сю. ana после деисшия промежуточных , э АДФ (Ü,"U0,5 рМ) неустойчиво. Найпюдоятся медленное обращение сигнала с увеличением амплитуды фпюкгупц.гй Нопчлпя амплитуда coomeim ,ет ду оиидным тромбоцитам,

положение которых более хаотично в тдрод!якшмческом тюточе, в onr.wa oí актиг>грог".11ИЫх (сфермпзонньтх).

Поэтому í.«03' но прядполокмп., что:

Состояние ipo;,i5oti,«Toa с псащсаор,\\гл'л является нсустсй'нап ut, г а. пост образования пссвдрподгЛ ¡тетке п «оропатй лрсмвнг/m rprr-*cin* представляются до о ласможпэсти: клч образовать агрегат (/)'"-icp), в ют>рвм "закрепляется'' с«тс гостопние, или порейгк к состоянию трамбоцтол, котсрзо пй оптически о свойством близко к inr/одиг «у, но не способно к pen.'i. и стттмци» на действие «типе (это состояние мы будем называть ингибирсаг-'я«>.7»).

Для сведения этого положения имеются основания. М.чпеетш чга реализация цГГИФ-сишгпытй системы подавляет сгрегащто •1ро»л0«\итг.*» (действие митропруссидз), но, с другой стороны показано, что по гремя íarmrtniys» уровень цГМФ увеличивается (Чирков 10.10. 1391), т.е. регулятогнее дейстои* цГМФ-систгмы осуществляется по принципу ''отрицательной обратной çf»w\

Для сценок величины ECr-j дейстгия АДФ в apcrni и мы испепь-ппягм гначекия начальной скорости афешцчи (vn). Величина ECso оцмкттгеь «о графи«,х>п в двойных обратных координптах (1/ V„ от 14ADPI и п Xmwimf коор/шнзтпх (lo(V,r9v/Vn - 1) от -In^-JP]). Бнш »1рео«л«ны исеп?дое?гс?я по т величины ЕСео (?.7 местных) при рэзиш значениях [Ca'4' ]0, W и th. Oiyarwoc»'»»« величина ЕСи находится о «щроком диапазона 0,03-1,2 jtM, а Bemnw« Kc»ts»s"iiw Хилпа - i? диапазоне 0,5 *■ 2,5. Причем проявляется закономерность: - Усггсптга скорости шрсгсции (при увеличении ({Ca" J6 , W, Н6) приеодит к уиетмю-чтп величины ЕСм (и константы ,,иппа (п)). Существование "стс'говсй* поокцни (птргквл в шгкбировзнное состояние) в общем ктлгралыюм афегоционнем »»рсидгл« предсказывает такой сдвиг, но оценка его влияния требует математическою моделиропш |ия.

Мятомамтскяп модгл«. активации и arpm't^H трпуЗециттп грог 'к*

Представленные эксперимент; -ты-гые данные по aw эционныч процессам и по димгртпции в наи»« методниеемх услогиях позволяют pnca.wtptinnth ni регациончыи пр (,есс п рамках следующей схемы (рис. 11) Исходный экспериментальные данные и принимаемые поло^оенил

1) рорпяп стдия октиовцпи тромбоцитов (сфертеция тромбоцитов) (1 ррятня гю гхймп) ''°р»хпд диск "шарик" - при ; йствии АДФ лрлячтел быстрым пронес сом ft", они m сч^унды) с ■ константа диссоциации медиатор-рпцрптпр (V. ) Д11« АРР оцеч<ЧЧ1'МЫИ около 4В "М

<о -1- О

IV !'i

f 1

Рис 11 Обобщенная схеме вфогпции в условиях ртПввлтния nmwH

а г- сгодй.0 шюаю гаадуцкровоа КС1-сридой, шпоюлшйсксй Ыаи-средаи, Са-иан.;фораг,1!1 и сильными агонистгл«!.

2) Втирая стадия йкткяацн» тромвацитов (образоаенио псевдппади«)(11-р-йгщ-ля по схем о) - переход •шорйх"-"е>ю1к" - юхе является (по срздпыиьо с шследующнш процессами) быстрой (1)/2 около 5 секунд), требует доОааочных доз АПН кз -ношению к сферизвции и „.очгег быть представлена уравнением-

л^лг.-----^—Р)

.Хм+Ело/']

(да Ыр - кои'цанграцмя "ежг'ов" (клеток с ггевдоподиямч),

ЕС») - до:;а АОР оызыиающая 50% оЗраэонажи. ежикои", для АОР оцапыоаешя окопе ,1 рМ.

Зга стадия индуцируется (в сгличие от первой) адреналином.

Ь) Состоя.'киз "юпи " нзлязтея неустойчивым, и клешей в этом состоянии »яш образуют а1 регаты (если для этого есть необходимые условия), или израходпг в г;нгнбироп? чое состоя!из. Переход из "ежиков* к иншбироианному «шнояншо (с "убранными" лсевдоподйямм) (ГУ-реакцчя по схема) манат предъявить рс&кцисй первого порядка с константой скорости - !<| (мин.)-1.

4) Кинетики агрегации (Ш-реакция по схеме) в солевой среде при турбулгншом потоке жидкости является кинетикой второго порядка унюкшелжо начальной концентрации клеток К , а константа скорости 1\ех зависит о1 старости оборотов мешалки V/ и концзнтрегм ионов кальция в среде и представляется уравнениями (1) и (2). Начальные условия Т.к. первые два реакции (сферизация и оораззвание леевдеподии) проходят згючитсльно быстра© по- падующих (»{•{»изоийниа дил*.ероа и "уборка" ¡тсевдолодий), то мт-.аго при насыщающей к.>нце;| трацш» АОР лринадь, что все клетки перешли в состояние *еяаша* при иршкты, близком к нуп:о.

1 »гда кии пме-гкйз урезания в дифференцпльной форме имеют след. вид*

¿¿V

сЮ

ш

где Ь - ¡сонн,£.|Нраци<< димерои,

вспн при 1-0 • Ир « Но, ю решения отих уравнений иыггот следующий вид

.............- - (е)

(. I /-Д1 -ехр (~к,1 )) 1"(1 + г(1 '"ЧЧ А-/ _))

2 1 ечр( )) г

, Л о-А,. . бдерилюрпял величина, отражающая соотношение скорости к.

¡¡.и иЬ|)11Т'.1Ьн>1Ие димврчв и "уПорт"« 'вдоиодии (моотм быть преде гшшегм

1 ■•;;п1|м!1|1:ни',п 1 1 от» рет-цпи)

Кшштка сфегадш (сбрсзсеошш дпмсроп) (кэ урашег.ил 7) п? е/улрлгг'Ю на рис. 1п~ и ркс.120. Но рис. 12а пр-'гдстплеиэ с/нзпяо шрсгпцш при гемгненпн гансшнш пкгибкровония, рис. 126 прядставляог ювтгеу пр.чпп'и »--и изменении когстзнты второго порядки агрегацич.

20/Мо п0 = А 40е (от/глл) 20/! Ь (¡0 = 4 ' Ю6 (ПГ'-П)

г 1<еу = 2 ¡0 '[г.№Н.(кл'?дл}Г'' 1 к> = 0,:г (гл<ш.)-' к„=2 10"'

с.е - К, = 0,02 о.а^

0.0 "К,*= 0,2 Об

о * / 0.4 ~КеТ=2 10"'

- 07 / 0,2

г . !С, -- 2

п) 2 4 в , в 1(гм ) П) 1 2 3 « 5 Л ( (т—п

Р|'е.12а И рИ0.12б КИМСТГГЭ ВГреГРЦ"!! ТРС'.ЙОЦЧТОЗ ПрвДСТРПЛЧП'ПЯ ур!»н?»«л (') при кочегачга тгг" 1ро!птя К, (при постоянстве Мо и - »ю»я«?я

(рис.») я при »пмзнз;««* я»ретя"иетчюа конетоитм второго порядка И« (при пездктгт? и К, - яачгния уконнн) (ряс.б). По оси пбсцисс - врочл, по оси ордамст - пс/!'«»'.':1з 2б.'%. Стр-Г"£,!01П1ЕЯ СТ1?П21!Ь /ДООрЮиЧрп КЛЗТЭК (ЮГД0 ЭТО ВСЛГ-Г-ИП ДОСШ—ОГ СД1?Я".{и - .«'К

яи»т« переходят п лкмзршоятюа состояние),

..р

Характер кртоых показывает, что чспользоэзииэ ra4ioni-.ii г

количественной оценка дейетпкя сгонпстсз 'и антагонистов требуот осторояног« подхода. Представлен) ы . модельные кривые на яэлпгагсл сч.-спонгнтп'п (п г чипм случае ими опрскснгдаруются), и концентрецнонныз сцснчи т оеиопа1г.я1 нпч-г." рон скорости и пмптпу/\ы д~:от нессвпэдаючрта результаты. Болзе тего, стгчггмтсп понятом "фаиома влияния условий внешней среди 1« 'уаствктелыюсть деГжтсит ягонистсв. Ксч-пьютернь'й рналмз модели показал, что тлшз пчр-\',п?рн с:;стр»ч-' ко:; Мо, V/ и ГСо7*], (как га?.*еиен«з к,гг) и состоянии иге ток <кгк гсзмзнс!»» ноня'от оцениваемые величины ЕС» и константы Хклла пр! фяфотюскоА «ч^яг* р обратных координата: н а Хштлоаском графика. Агрегацртонгую киношку в сц^н^у. можно использовать только при условии:!^*' Я0 » !'ч , т.о. ш, ,.1 скорость пгрс»<>цмп является достаточно Быстрой.

Концентрация дилгероп достигаетпаке- уялыюй оппитнч (Пт 1 при I « и из (11) рыражг тел след. уравнением:

г

(3)

Представленная зависимость величины 20т» "'о. отга)«тго(Ц5п максимально .жную степень днмармзации клеток (когда эта езлпчнна доелияэ' единицы вес клетки переходят в димпризованногг состояние) от 1д(г), гмоет в-оОразннй ред (?фф«?кт кооперативности), тс. существует 17"тп,ескап величина г. нижч которой ре! цип агрегации практически отсутсгт-уят. Так при г=0,1 могут образоваться меньше 5"11 димэров от максимально возможного, что практически

¡и; -¡¿¡гпузуйтср, ь г.чшершенталиьк услсамя;;. Т.е. относительно начальной каьципрацни кпегск ыюкнз представить устайиз по критической концентрации шатслс нлл-се которого агрегац*^ невозможна:

Мта -

К я

Когда шинмплыгая вепдевша Ц оценивается близкой к 0,2 (мня)1 (т.е. 1|д - 3,5 р.ын.), а максимальная ветчина 1<гх достигав- величины 210"7 (иаи.кп/ал)В этик условия» шншаль'"1Я кг>нцентрациг троцооцитоо, при коюрой созмоялш сграгация, шеат величину: {^ты ^'Ю41 кп/ш.

Таким образом, испол«зовиние метода мапоуг.оаогосветорассеяния с оценке шрегацкснксй актпаности тромбоцитов ограничено когщеитрзцисм¡.чым диапазоном > клеточноаи: ю5 ; 10 кл/ип, где ттгли порог определяется неаозмс»шостыо лр. :ол'дон14я агрегации, а верхний порог определяется появлением эффектов многократного рассегш. .

Вызоди.

1. На основании исследований индикатрисс светорассеяния суспензии •фсыйоц:,шш разработан метод одновременной регистрации активации и сфагацли клеток'. Показано, что в 4 градусном секторе утла изменение интенсивности сигнала определяйся тог ,ко агрегацией ¡слеток, а в 12 градусном секторе 1гла регистрируются обе фази актизацш (сферизгцип и образование псеадоподий) и агрегация.

?. (¡оказано, чго кмнапка агрегации относительно начальной концентрации клзток йзпйвшн реакцией Н порядка. Зевисимссть константы скороеп агрегации ¡41,; от старост оборотов мгшалки шает линейный характер, а от концентрации изнсы кальция о сридо - вид кривой с насыщением с константой полунасыщспия равной 0,25 шМ. Показано, что измзьз.ш скорости а; легации (при изменения ¡Са3*Ь . V«' и N.. приводит к I енгмию оцениваемых взличин ЕС5о агрегации (по АДЗ») и константы Хплла.

3. Сфс,-.шащ!я тромбоцитов вызнается повышением (Са2>]| под влиянием шошкпш (1)я ~1 сек., шш проходит спонтанно в |(С1-среде. при участии зисктрсгснного Са3* /ЗМа" - обыошшка 0ш~1?.?!т.). сферизации для АДФ - «ШлЭД, что близко к Ко - связывания АДФ с рецептором, ЕС« образования псевдоподии дгт АДФ ~ 100 пМ.

4. Показано, что адреналин не действует на исходные тромбоциты (диски), но шншируег сфйризовенныв клетки, вызывая образование псевдоподии при участия

'«г-адренорзцшнора (К| для иохимбина ~ 50 лМ, гпя гцюпрачолола - 3 /¡М).

5. Преде)салена ыатеыагическая модель агрегации Показано, что характер в-шешки агрегатут гмределяется отношением скоростей двух процессов:

Зрвзоааниам дшеров и переходом тромбоцитов в ингибирсаанное состояние, и это определяет изменение величины ЕС50 (по АДФ) и константы Хилла Онр ^лен нижний предел концентрации тромбоцитов дня прохождения атриации

Список рзВст, олубмикосанных по теме дисмрчациг, 1 ОВ , Дергаче» <)> Кривченко АН однофазная шнетига агрегации

грогйзцигое (.ролика в цх*»« сид^мсап^и , ..пьций, при амиеации яц.юяции АДФ и 1ф1* о!су (вин «яраничепш м«»т"чс:|>ен'ч.| ( 1уп1П I ¡тилопп ' 3' 1)1 с;з8?

2. Миндршев И.В., Дерклчеа Э.Ф. Крисчеико Л.И. Оценка iraiici'nuiM iwiwih Möcconcp"Moca при егрегсцртп тромЕЬцтпо кролика в сродо, седсрятацо« кпп.цгА и (1595) ЦитологияТ.37. N,1, СЗОЗ.

3. Деркачсп Э.Ф., Мгаодукшеч ÜB., Кртачшга ЛИ. Пиши та NO in т-игиш;; трвгацпи тоомбоцитоз i.-pmnwa в средз, содгрэдцзй капыуй! // (1995) Циюлтип Т.37. N.4,0371-372

Л. Деркачсп Э.Ф., ! «едушюп И.В., КриачотоЛ.И. Вгаадпю веирсгв, деПгтвутирт па поверхность кпотск, на гагату .трегацпн трсмЯоцитоо it лист п гррдп, содержаще1'1 v.nr ци£1. //(1995) Цитология Т.37. N.4, СЗТ2.

5. Деркачеп З.Ф., Мплдукшво ИП., Кривчсико А.И. Кинетика изменении ферм тромбоцитов з процесса шппгтции. // Тез. дот. I(XI) Международного сппрмршт по апопюциоиноП физиологии. С.-ИетерОург, (1MS) 0(53 <И.

I ; '. Í

l-.'v~?5 PTíl ГК Cir-iTEo • .aroiriml ли.,:-:-;