Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной активности F0F1-АТФазы морской бактерии Vibrio alginolyticus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональной активности F0F1-АТФазы морской бактерии Vibrio alginolyticus"

ПОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ "УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический Факультет

на правах рукописи

КРАСНОСЕЛЬСКАЯ ИРИНА АРТУРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ F^-АТФАЗЫ ' МОРСКОЙ- БАКТЕРИИ' V-ibrio Alffinolyi: icus

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание /ценой степени кандидата биологических наук Посква - 1991

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ Фиэико -химической биологии им. А.Н. Белозерского ИГУ им. (1.В.Ломоносова.

Havчный руководитель: академик АН СССР, профессор В.П. Скупачев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Р.А" Звягильская кандидат химических наук ШлА. 'Гритшвич

Ведущая организация: Институт'биофизики АН СССР г. Лувмно

Запита состоится " 2 " 1992. года в /'С^ часов

на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119 899, Москва,. Ленинские горы». Биологический Факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического Факультета МГУ.

Автореферат разослан " 6 " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, ■ кандидат биологических наук ¿-¿Ьуда-б^СЧ (8.Н. Лейкин

ОБИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Мембранные аденозинтрмфосфатазы <АТФазы> являются клшчевыми Ферментами энергетического метаболизма всех живых кпвток. В последние десятилетия в лабораториях всего мира активно изучаются структура, биохимические свойства и механизм действия различных АТФаз. Изучение бактериальны* АТФаз представляет особый интерес. Относительная простота организации прокариотических клеток с одной стороны, и исключительное разнообразие их физиологии с другой представляют .широкие возможности для изучения основный закономерностей строения, и функционирования Ферментов энергетического метаболизма.

Мембранные АТФазы осуществляют взаимное превращение дву;< основных Форм энергии в живых клетках - энергии макроэргической связи АТФ и трансмембранного электрохимического градирнта ионов. D большинстве клеток энергетические потребности обеспечиваются трансмембранным градиентом протонов U^H*") . В.П. Скулачев предположил, что бактерии, обитагацие в »елочной сррде при повышенной концентрации солей, например Vibrio alginalyt¡cus могут иметь энергетику иного типа: в этом случае место амН* занимает трансмембранный градиент ионов натрия <й><Ыа+) (Сг.улачрв, 1985)!

У Vibrio alginolyt ¡cus обнаружен генератор йцИя* в дыхательной цепи - Ыз*--транспортирукщая МАВН:;;инон-редуктаза [Tokuda and Unemota.,19S2). Л^Ыз+ используется для транспорта субстратов в клетки tTokada et al.jlVRZ] и обеспечивает движение Бактерий (Dibrav et ni.,i?S4). Как показано в нашей лаборатории, синтез АТФ В СБЧ Vibrio ¿lginolytícus может .проис;;одить при

создании искусственного трамсмембранного градиента концентрации На+, причем этот процесс устойчив к действию; протонного разобщителя и подавляется натриевым ионофором моненсином [Dibrov at al,19833. Однако в мембранных препаратах Vibrio alginolyticus был обнаружен АТФ-зависимый транспорт протона ISmirnova et al 1988!

Целью данной работы являлась изучение ■ транспортной специфичности АТФазы Vibrio alginojytictis. Для этого определены кинетические параметры взаимодействия АТФазы и некоторых им. ибиторов F0 канала, выделен и очищен FqFj-комппвкс , встроен в лилосомы и изморен АТР-зависимый транспорт протонов и ионов натрия

Научная новизна работы. В ходе работы впервые выделен й очив.ен F0Fj-KOMnneKC из vibrio alginolyticus. По данным электрофореза он содержит субъединицы с молекулярной массой 58, 55, 38, 25, 23, 17 и 14 кДа. Дополнены данные по ингибиторному анализу Фермента.

Показано, что протеолипосомы, содержание 'FgFj-АТФазу из Vibrio al ffir/ol yt icus способны накапливать протон в процессе гидролиза АТР, процесс чувствителен к ингибиторам FQ канала (DCCD, вентурицидин, тРифенилолово), эффект снимается протонными разобщителями. Тот же препарат протеолипосом не накапливал Ыа+.

Практическое значение работы. Полученные результаты дают новую информацию о фермента» энергетического метаболизма бактерий и могут быть использованы при дальнейших исследования« в области биоэнергетики. Они подтверждают универсальные принципы организации АТФаз различных организмов. Разработанная методика получения F0Fj-комплекса из Vibrio ¿lairwlyt icus не трудоемка и отличается простотой, что позволяет использовать Фермент в качестве дешевой модели дпч исследований механизма синтеза АТР и АТР-зависимогс

транспорта протонов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на теоретическом семинаре лаборатории биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ИГУ им. И.В. Ломоносова.(Москва, 1989, 1990, 1991).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 3 работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы в двух глава«, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использована культура Vibrio aJginalyt¡cus, штамм 138-2, предоставленная Х.Токудой (Шиба, Япония).

Опыты проводились на препарата:« суббактериапьных частиц (СБЧ), выделенных по методике Дмитриева (1938), на очинённом F0Fj-комплексе. В последнем случае АГФазу экстрагировали из СБЧ в среде, содержащей 0,57. тритон ХЮО, 10мГ1 MgS04 и 10 мМ трис-mes рН 8.0. Фракционировали полизтилеигпикопем-6000. Фракцию 11-14"/. (вес/вес) подвергали гельфильтрации на Тойо-Пирле WH-60. Все операции проводились при 0-45С.

Получение протеолипоссм, содержащих F'0F1 комплекс.

Азопектин суспендировали в среде, содержащей Юти трицин-кон рН 8.0, 2.5 mM MgSO^, 0.05 гп|Ч ЗДТЛ, 2 т(1 ДИТМ.ОТреиТОП И либо 0.25 М K2S04 пибо 0.25 М Na_,S04. Концентрация лилида мг/мл.

Затем обрабатывали ультразвуком С ЗхЗОсек з'под азотом при -<5°С, г суспензии пипосом добавляли очищенную ЙТРазу, так что на 1иг 6eni-.¿,

приходилось зо - 40 мг липида, а концентрация тритона X—100 не превышала 0.0017%. Инкубировали 15мин при комнатной, температуре, опускали в жидкий азот на 40 секунд, затем размораживали при о°с. Протеолипосомы осаждали центрифугированием при 220 ооод в течение 40 минут.

АТФазную активность измеряли при 28°С в среде, содержащей

100 м/1 Трис-МЕЭ, рН 7.6, 2 , 10 тМ МаБ04 и 2 том АТФ, по выделению неорганического Фосфата или с помощью сопряженной А!Ф-регенерирукицей системы на основе лактатдегидрогеназы и лируваткиназы., Оосфат определили по методу Лин и Моралес сип Мога1еь 1977 3.

Измерение Н* - транспортной активности.

Протеолипосомы суспендировали в среде, содержащей ю rali трицин КОН, рН 8.о,о.ЗюМ вапиномицмн, 1 цМ акридиновый оранжевый, 2 тМ АТР и либо 0.25М Na^S04, либо 6.25 м KoS04. Реакцию начинали, добавкой 10 mM MbSD4. Тушение Флуоресценции, соответствующее закислению среды внутри СБЧ, регистрировали на спектрофлюориметре MPF-4 "Hitachi", длина волны возбуждения. 493мм, эмиссия - 530нм.

Измерение транспорта Na*. Измерение транспорта Na+ проводилось с использованием В

среду измерения, содержавшую 10 м(1 трицин-КОН, рН 8,0, 5 мМ MgS04, 0,25м K2S04, 0,3 мкМ валиномицин, 1, 2 или 10 мМ Na2S04,

TJ А

13-30 мкИ ["NaJ-NaCi , 10 dpm/мп, добавляли протеолипосомы и инкубировали при 0°С 1 ч. Реакцию начинали в объеме 100 мкп добавлени&м 2 мМ АТР. Для удаления внешнего Na реакционную» смесь быстро пропускали через .колонку с Дауэкс-50 WX 4 в К+-форме объемом 0,8 мл. Эпицию проводили 0,5 мл 0,5(1 сахарозы, содержащей 10. мИ Трицин-КОН, рН 8,0. Затем измеряли радиоактивность злюата на

жидкостном сцинтилпяционном счетчике.

Электрофорез в присутствии додеципсульфата натрия (ДДС-Na) проводил« по методу Лэнмпи tLaemli 19703 в 14: полмакриламидном геле.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури CLowry, 19511.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 1. Влияние ингибиторов Р0~комплекса на АТФазнуга активность СБЧ Vibrio alginalyt ¿cus

Ранее в нашей лаборатории было показано, что СБЧ .Vibrio alginolyticus обладают специфической АТФ -гидролазной активность» , связанной с мембранным Ферментом

*FQFjTHna IDmitriev et al 19SS1.

Водорастворимый компонент Фермента был

выделен и очищен , была определена последовательность N концевых- аминокислот мажорных субъединиц t Dmitriev et al 1989 3. Полученные данные указывали на то, что существует только один тип Фермента, специфически гидролизуюаего АТР.

Катализирует ли обе реакции, АТР-зависимый £Г*-транспорг и АТР-зависимый Ыа+-траиспорт, один Фермент или это два разных Фермента, обладающих Fj-комплексами со сходной структурой и свойствами, но различающихся по F^-каналам? Возможно ли переключение ионнной специфичности F^-канала АТРазного комплекса vibrio aigínolyt¡cusí Или ъ процессе работы фермента перекачивается тот мои, концентрация которого в данной ситуации выше, возможны пи конкурентные взаимоотношения ионов?

Чтобы выявить возможную неоднородность ^-каналов, мы проследили кинетику действия ВССП и влияние ионов натрия и рН на этот процесс. Мы выбрали ПССО.т.к. во всех изученных случаях этот ингибитор взаимодействует с суцественным' дпя транспорта протонов аминокислотным остатком Аер-61 <дпя Е.соИ), находящимся в составе протеолипида С. Вероятно, изменение ионной специфичности канапа должно было бы сказаться на реактивности этого остатка к ингибитору. Кроме того, варьирование концентрации ионов натрия или рН магпо бы изменять реактивность этой группы по разному,в зависимости от ионной специфичности канапа. Для снятия кинетики ингибиро-вания мембранной АТРазы СБЧ частицы инкубировали с разными концентрациями ВССП в среде, содержащей 30 мН НдЭ04, 307. зтиленгликопь и 30 вН НЕРЕЗ КОН рН7.6. Кинетика реакции подчиняется уравнению реакции 1го порядка, что указывает на то, что дпя инактивации Фермента необходимо, чтобы модифицировался котя бы один- аминокислотный остаток на молекулу Фермента и что все мишени . между сабой никак не различаются» Мы проверили, влияют ли ионы натрия на скорость модификации АТФазы ЯССО при рН 7.5. Никакого влияний обнаружено не было, при уменьшении концентрации прогонов до. рН 9.5 так жа не было обнаружено никакой разницы между средами с 35 ¿<Н Ыа+ и 30 шН На+. Как показано на рис. 1, на интервале рН от 5.5 до 10 скорость реакции меняется пропорционально концентрации протонированного карбоксила, отклонения от линейности графиков в координатах 1п 4^/7 не обнаружено.

Мы предположили, что , нам удасться выявить

неоднородность атакуемы;; мишеней для ингибиторов; действие которых обратима. Для этой цепи мы выбрали трифениполово и вентурицидин. Действии этих ингибиторов обращается разведением. Форма кривых зависимости активности Фермента от концентрации ингибитора как ТФО, так и вентурицидина, характерна дпя спучая, когда существенные для активности мишени однотипны <см. рис. 2,3). Полученные данные дополнили имеющиеся сведения о мембранной ATPase Vibrio alginolyticus [Dmitriev 1988,1989). Далее мы поставили перед собой .цель -- выделить и очистить эту АТРазу, а также изучить транспортную специфичность в более простой, чем целые клетки и СБЧ системе. Данные, полученные при анализа действия "ингибиторов Fq, мы использовали в качестве теста на целостность выделяемого FpFj-комлпекса.

2. Подбор условий экстракции F0F1KOMnneKca

Мы изучили влияние нескольких детергентов на F0Fj комплекс Vibrio alginolyticus. Наиболее удобным оказался тритон Г-100, т.к.детергент не снижает гидролазной актив-

• ности и сохраняет чувствительность комплекса к UCCD триФениполову, что является хорошим тестом на целостность Fg-Fj контакта, кроме того оказалось (рис. 4), чт) АТРаза с хорошей. ' избирательностью экстрагируется при невысоких концентрациях этого детергента. Оптимальная концентрация при 0°С составляет 0.5/. тритона Х-.ЮО.

8 11 йитачщшн.»*

1 2

трииншшао. ми

Рисунок 1. Зависимость константы скорости ингибирования АТФазного комплекса БССП от рН среды модификации. Среды модификации содержали 50 шИ три с 50 иН НЕБ 25 тМ САШ 30 тН Н§304 5 шН НаЗД 307. этиленгпикопь и разные количества КОН и СН3СООН в соответствии с указанным рН.

Рисунок 2. Зависимость активности мембранной АТФазы от концентрации трифенилолова <-•->. Ингибитор в среде измерения, состав см. раздел Методы. В среду дополнительно добавлен 1 вМ ДТТ <-■->. Концентрация белка 0.05 мг/мл.100/ соответствует 0.4 цмопь/мин мг. Рисунок 3. Зависимость активности мембранной АТФазы от концентрации вентурицидина. Концентрация белка 0.05 мг/мл. 100'/. соответствует 0.35 цмоль/мин мг. Ингибитор находится в среде измерения, состав см. раздел Методы.

3, Разработка метода очистки 3.1 Фракционирование комплекса.

Высаливание белков из растворов, ■, содержащих ■ детергент, часто не приводит к четкому разделению по фазам

(Р.Скоупс,1905), а использованиеорганических растворителей, таких как, например, ацетон создает опасность инактивации белка. Поэтому мы решили остановиться на фракционировании с помощью ПЗГ(см. рис. 5>. Для фракционирования использовали тритоновый экстракт ^^ комплекса из СБЧ (см.Методы >.

3.2 ХроматограФические методы очистки комплекса Для очистки АТРазного комплекса опробовали различные методы - ионообменную хроматографию на ДЕАЕ -СеФацеле, гидрофобную хроматографию на фенил и октил сеФарозе, гепьфильтрации, аФиннуга хроматографию на голубой сефарозе.

• Для гепьфильтрации мы выбрали сорбент Тойо-пирл

Н¥-60. Это новый сорбент на основе полиэтипеноксида, обладающий высокой жесткостью, что позволяет проводить хроматографию • при высокой скорости элгеции.

Кривая злюции для гепьфильтрации препарата, полученного путем фракционирования ПЭГ 6000 < 11 - 14 У. фракции; показана на рис. 6.

На этой стадии нет потерь активности; удельная активность, измеренная в присутствии 1 вМ ДТТ, составляет 2.5 ^оль/мин омг, без ДТТ - 1.3ммопь/мин»мг, чувствительность к ТФО - 90'/..

• В результате мы остановились на методике, включающей стадии экстракции тритоном, ПЭГ 6000 -фракционирования и гепьфильтрации на Тойо-лирле Ш-60. Характеристики препаратов . АТФазы на различных стадия* выделения по этой методике приведены в таблице 1.

(14 М 1.0 1.2

1ТШ5И ЫОО],Х

8 10 15 20 (ПЗГ ©Ю0],Х

Рисунок 4 . Зависимость величины удельной активности (-о-) АТРазы В': тритоновых экстрактах суббактермапьных частиц от концентрации детергента, (-ш-)показан процент Фермента, перешедшего в раствор;, в зависимости от концентрации тритона £-100.<-о-) - процент нечувствительной к трифенилолову активности экстрактов. Среда экстракции содержала ЗОшН N§304, ЗОйМ НЕРЕЭ КОН рН 7.6 и разные концентрации тритона Х-100, белок 10мг/мл, 0°С, ЗОмин. Рисунок 5. Показано разделение АТФазного комплекса по Фазам в зависимости от концентрации полиэтилен гликоля 6000. А - разделение белка тритонового экстракта (-А-)-бвпок в растворе, (-в-)-в осадке. 5-изме-нение удельной активности АТРазы в растворе (-А-) и в ПЭГ-осадке (-е-К тритоновому экстракту СБЧ добавляли указанные концентрации ПЭГ (507. вис на вес расГеор) и инкубирсвапи 1 час пни 0°С, ' центрифугировали <1000§, Юмин).

100 120 140 160 180 200 220 240

ОБ'ЕМ 3ЛОЦИИ, МЛ

Рисунок 6 Кривая зпюции для гепвФмпьтрации препарата ^o^i комплекса из 11-1 ПЭГ ¿000 Фрам.ции на Тойо-пирле HV-60. Объем Фракции 5 мл. Скорость 70 ил/час. Размер колонки 2.6x30см. Среде хроматографии содержала 0.5'/. тритон Х-100,- 10 мМ трис-MES рН 9.0, 10 гаМ Mg£04, 1 иН дмтиотрептол, 0.1 мМ фрнмп-метипсупьфонмп фторид. (-А-) АТР г'лдропазная активность. <--&-) AMP гидрола активность.

ТРИТОН ноцх

Рисунок 7. Влияние тритона Х-100 в измерительной кювете на активность АТРазного комп- . лекса. Для измерения использован препарат Фермента, очинённого по стандартной методике. Измерение проводилось в сопря-. жениой АТР - регенерирующей системе в присутствии 1 тМ ДТТ в стандартной среде (см. Методы)

га

БЫ

V 1 V с. 4 *

г"™"'1'

'.¿•¿.У-„ч А

-94 -67

-45

; -30

-20 -14.5

Рисунок. 8 ЗпектроФореграмма препаратов СБЧ (а),, тритонового экстракта <Ь>, 11-14 7. ПЭГ 6000 Фракции (с), очищенный по стандартной методике АТРагный комплекс <с1) и (е). Справа показано положение маркеров. ЗпектроФорез по методу Лэммли в 14'/. попиакри-ламидном геле. Белок 30, 15, 2, 1.3 и 6 ^г соответственно.

4. Некоторые свойства очищенного препарата Препараты очищенного по стандартной методике F^jFj комплекса в концентрации 5-10 мг/мл обладают активность» около 2.5 ммоль/мин«мг. Чувствительность к ТФО составляет 90'/.. Число оборотов Фермента зависит , от концентрации тритона Х-100 в среде измерения (см.рис. 7). Однако максимальной активностью фермент обладает в составе азолектиновы:; лилосом, она составляет 5 (имоль/миномг и полностью чувствительна к ТФО.

По данным электрофореза, очищенная АТРаза vibrío alginaiyticus' имеет ' типичную для F F, комплекса

субьединичную структуру.

Рисунок 9.Доля АТФазной активности, ассоциированной с липосомами, в зависимости от концентрации Ы^БО^ в среде изготовления лилосом (-•->. <-*-) указаны величины для лилосом, изготовленных в среде, где ионы натрия заменены на ионы калия. Состав среды и методику изготовления

о so ico »» за г»

.[Na^J.mM,*!«,®,).»* липосом см. Методы.

Полученный препарат ' содержит субъединицы с молекулярным весом, равным 58, 55, 38, 25, 23, 17 и 14 кДа, кроме того на Форезе видна примесь в районе 77 кДа (см.рис. 8). По данным Дмитриева и ' соавт (1989), получившим

препарат

очищенного

комплекса,

полипептиды

3, 23 сотьетствуют с< i¡ / ó субъединицам.

Таблица 1.Выделение АТФазного комплекса Vibrio alginoiyt icus.

--г- 1 1 1 удельная активность (цмоль/мин омг) белок (мг) активности

мембраны СБЧ 1 0^25 600 100

ГХ100 экстракт 1 i 0.73 30S 146

ПЭГ фракциони- 1 рование 11-14VC 1 1.6 39 41

гельФильтрация 1 2.5 24 40

5. Выбор метода изготовления пипосом. Подбор условий.

В качестве основы для изготовления лилосом мы решили выбрать методику замораживания - оттаивания. Эта, методика имеет ряд преимуществ. . Во-первых, она позволяет получить протеопипосомы, обладание наибольшим внутренним -объемом; во-вторых, известно, что Лаубингер и Димрот (1988) успешно применяли эту методику для' приготовления протеолипосом, содержащих FqFj - комплекс из Propionogeniuu »orfestu». В качестве липида мы выбрали азолектин.'

Однако мы сразу же столкнулись с тем, что эффективность встраивания препарата АТФазы из Vibrio aiginoJyticus крайне низка при невысокой ионной силе <см. рис. 9). Мы подобрали оптимальную концентрацию сульфата натрия для встраивания FüFj комплекса в липосомы и показали, что ^алогичный эффект дает и калиевая соль.

Увеличение числа циклов замораживания - оттаивания не привело к каким-либо изменениям, кроме увеличения процента скрытой АТФазной активности.

Важным условием целостности мембранны;,- структур в

лротеолмлосомал оказалось время оттаивания препаратов; так АТРазная активность протеолипосом, оттаивавши« при 20°С в течение 15 минут не стимУлироввпась разобщителем. Лроте-олипосомы не обладали способностью накапливать протоны в процессе гидролиза АТР. Огтаивание в течение 1 часа при 0°С, приводило к увеличению степени сопряженности пнпосом, АТРаза стимулировалась добавкой разобщителей в два раза и протеопипосомы накапливали протоны в присутствии АТР (см.

Рисунок 10.Влияние СССР и тритона Х-100 на скорость гидролиза АТР протеопипосо-мами со встроенным F0Fj -комплексом. СССР' тритон Х-100 добавляли по коду реакции.

Важным параметром, влияющим на проницаемость . пипосом, является количество тритона Х-100, попадающее при встраиваний с преператом F0Fj комплекса. Мы показали, что уменьшение содержания детергента начиная с 0,002'/. ив стадии замораживания - оттаивания при концентрации азолэктина 15 мг/мп не приводит к увеличению степени стимуляции гидролазной активности протеолипосом протонными

разобщитенями.

6. Определение ион-транспортной специфичности FqFj АТРазы в составе протеолипосом.

Дня изготовления протеолипосом использовали препарат

рис. 10). _____ j \ 3/nccv

Ц H№MUI(lw\.|

FqFj - комплекса, полученный по стандартной методике (см. Методы ). Атфазная активность стимулируется протонными разобщителями в среднем в 2 раза, тритоном Х-100 в четыре раза (см. рис. 10). Удельная активность препарата 5>лмоль/миномг, Протеолипосомы способны накапливать протоны при гидролизе АТР (см. рис. 11). Этот процесс наблюдали по поглощению Флюоресцентного красителя акридинового оранжевого. Транспорт Н*" стимулируется валиномицином и чувствителен к ПСОВ ( рис. 11), к трифенилолову и вентурицидину, причем действие трифенилолова на транспорт протона также обращается дитмотреитолом, как и в случае гидролиза АТР.

Рисунок 11.

Транспортная и

3 ни

энзимопогическая

активности

2 СССР

протеолилосом со встроенным АТФазным комплексом.

СОКф! фММММСМШ

iomu ujso, WmUUjSO,

А. Транспорт протонов - в ответ ма добавку 10 ИМ Н^04, в среде присутствуют 10 ИМ трицин КОН рН 8.0, 0.3 ®М валиноммцин, 1 >1И акридиновый оранжевый, 2 шН

АТР и 0.25 М Na2S04, в конце добавлен СССР. 2мМ. Нижняя кривая для FqFj протеолилосом, обработанных DCCD, 40мМ, 20 минут.

Б Гидролиз АТР в ответ на добавку

10 шИ Mgi304, в среде присут-:твумт 100 тМ трис-MES рН 8.0, 2 тМ АТР, АТР -

регенерирующая система, по ходу добавлены 2 мМ СССР, в конце добавлен Ю^хН ТФО. Ф - флуоресценция.

Лаубингер и Димрот <1989) обнаружили, что добавление 1 мМ ЫаС1 к протеолипосомам, содержащим очинённую АТРазу Ргор1опазепша вос/езШм, снимало накопление протонов, предположительно из-за конкурренцми Нз+-монов и протонов за ионный канал ЙТРвзы. Мы сравнили транспорт протонов в прптеолипосомах, содержа««;< 0,5И Иа+ <0,2511 На^О^ и в протеолипосомах, содержания 0,5М К+ (0,2511 К^О^ вместо На+

Рисунок 12 Изменение количества

* 22 4

Ыа в протеолипосомах, содержащих Г0Е1 АТРазу. ■ А - протеопипосомы предварительно уравновешены в среде измерения, содержащей 106 с!рп 22На+/мл В нулевой момент .времени добавлено 2 м(1 АТР. В - определение пассивной проницаемости протеолипосом для натрия. В нулевой момент времени протеопипосомы внесены з среду измерения, содержащую 106 фт. 22Мз+/мп. АТР не добавляли. Другие условия эксперимента в случаях А и Б одинаковы.

< 10 » 30 40 30 <0 екм, ж

Измерение проводилось в среде, содержащей таг.ум же кпнцрн ' рацию соответстг,уюаьго катиона. В'присутстеии 0,511 Е1з+

протонный транспорт протекал по меньшей мере столь же активно, как и в безнатриевой среде. Ингибирования протонного' транспорта также не наблюдалось, когда 50 мМ Ыз+ добавляли непосредственно в среду измерения, которая, как и протеопипосомы,- не содержала На+. Таким образам, нем не удапось обнаружить конкуренции протсюв и ионов Ка+ при измерении АТР-зависимого транспорта протонов в протеолипосомак, содержащих очищенную F0F1~ATPasy Vibrio algtnolyt icus.

Мы предприняли попытку обнаружить АТР-зависимый

тарнспорт На+-ионов в эти« протеолипосомак. Для этого мы «

О"? +

использовали На и методику быстрого удаления радиоактивного fía+ . из реакционной смеси с помощью ионообменника. Нам he удалось обнаружить АТР-зависимого накопления fía+ в протеолипосомак (рис. 12 А>, хотя в этик же препаратах наблюдался активный • АТР-зависимый транспорт протонов. Как показано в отдельном эксперименте, пассивная проницаемость протеолипосом для Ыа+ относительно невысока и, следовательно, диффузия На+ не будет маскировать активный транспорт, а чувствительность метода вполне Достаточна для того, чтобы обнаружить хотя бы незначительное увеличение содержания Ыа+ внутри протеопипасом (рис.12 Б). Эти данные позволяют утверждать, что выделенная АТРаза Vibrio alginolyticus не транспортирует Нз+-ионы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Перед началом нашей работы мы имели ряд указаний на

то, что специфическая АТФазная активность мембранный

препаратов Vibrio alginolyticus принадлежит Ферменту FqFj

типа, который, ло-ьидимому, обладает Н* мЫз+-

транспартирующей активностями, чувствителен к DCCD и

некоторым другим специфичным для F0Fj-AT®a3 ингибиторам

. Действительно, при добавлении лактата к клеткам Vibrio

alginolyticus, истощенным по эндогенным субстратам и АТР

происходило многократное увеличение содержания АТР в клетках

и стимуляция дыхания. ' Так как синтез АТР прекращался в

анаэробиозе и при добавлении ингибитора Ыа+ - зависимой

дыхательной цепи . 2- гептил-4-гмдрокси- хинопин-Н-оксида,

наблюдаемое увеличение содержания АТР в клетках очевидно

связано с окислительным ФосФорилированием. Обратный градиент

концентрации ионов На (внешняя . концентрация Ыа меньше

внутриклеточной) подавлял синтез АТР. Если., создавали

градиент концентрации ионов Ыа+ правильного направления

<Ша+] >(Ка+3 ), то наблюдаемый синтез АТР был внешн внутр '

устойчив к действию протонофора С1-ССР. Поненсин в присутствии протонофора полностью тормозил синтез АТР, но не вызывал никакого эффекта, если пртоноФор не добавлялся (Верховская и др. 1987а>.

Синтез АТР происходил ■ также при наложении искусственного градиента концентрации <Ыз+ и К* (1Нз+] > 1Ыа+) , 1К+} МК+] ). Синтез АТР,

*нутр' внешн внутр

индуцированный искуственными ионными градиентами, устойчив к

ортованадату и полностью подавляется- 50 мкИ DCCD и ■ 100 мкИ

ДЗС (Верховская и др. 1987Ь) .

По оценкам авторов порог величины ЛцНа для реакции ФосФорипировения но преьышает 0,25 В.

В опытах на СБЧ из Vibrio alдinoi/ticus обнаружен АТР-зависимий транспорт fía . Этот процесс стимулировался DCCE в низких концентрация«, в которым он, по видимому, оказывает сопрягающее действие, и блоккрсшапся ПССП в бопее высоких концентрация«, подавляющих АТРааную активность. Транспорт Нз+ стимулировался С1-С.СР и подавлялся моненсином. IDibrov et al, 1988].

В то же время И.Смирнова показала на СБЧ vibrio alainoiyt icus, что эпектрический потенциал, возникающий в ответ на добавку АТР полностью снимается протонным разобщителем, а присутствие fía+ tfe влияет на величину ответа. Кроме того, АТФ-зависимый транспорт Н* на СБЧ был ' измерен по тушению Флюоресценции акридинового оранжевого.

Б работе Цушия и сотр.* (1989), проведенной toa Vibrio parahaemoiyticus, получены указания на существование еще одного Фермента, синтезирующего' АТР' наряду с классической F^^-ATfasoft. Обнаруженный Фермент составлял половину от Суммарной АТФсинтазной' активности этой бактерии, отвечал за • СССР устойчивое ФосФорилирование. Мутантные клетки, обладающие только V/. АТРгидропазной активности, сиитезировали АТР в ответ на искусственно созданный градиент ионов На так же как кпетк.и дикого типа; Постулированная авторами На+ - АТФсинтаза не чувствительна, к DCCD и ответственна 5а 1'/. от суммарной АТР-гидролазной активности мембранных препаратов. V.parahaenolyticus. Последний Факт несколько настораживает и требует дополнительных исследований. Димрот и сотр. (1989), обнаружившие На-АТФазу

У Propionogen iua nodestuit показали, что этот фермент

принадлежит к F0Fj типу. Синтез АТР на fia градиенте и

транспорт На+ СБЧ Vibrio aiainolyticus чувствительны к DCCD и некоторым другим ингибиторам, характерным для АТРаз FQF, типа. Поэтому в нашей работе мы решили исследовать ионтран-спортную специфичность АТРазы F^Fj типа.

Бып выделен гомогенный препарат Fj-компоненты АТФазы и® Vibrio slginolytxcus, показано, что существует только один тип растворимой АТФазы. Кроме того, в геноме Vibrio alginaiyticus обнаружен лишь один оперон, кодирующий АТФазу F(.)F1 - типа, причем К-концевые аминокислотные последовательности главных субьединиц выделенной нами АТФазы совпали с теми, которые были предсказаны на основании последовательности ДНК соответствующим генов.

Иы попытались-выявить возможную неоднородность в популяции Ff) каналов, переключение специфичности с протона на натрий или существование 2 постоянно различны« Форм, обладающих

разной способностью транспортировать Eí^ и На"1", ., мы проанализироиапи дэйсбив таких F^-ингибиторов, как DCCD, вентурицидин и триФениполова. Поскольку действие использованных ингибиторов направлено на разные, но существенные для Ферментативной . активности мишени в Ff-компоненте, нам представилась весьма вероятной возможность выявить неоднородность реактивности хотя бы для одного какого-нибудь ингибитора. Однако полученные нами кривые кинетики связывания DCCD, кривые ¡взаимодействия вентурицидина и триФенинолова с мембранной АТФазой подчиняются простой скеме взаимодействия ингибитора с одним типом мишеней. Итак, мы получили еще одно указание на однородность мембранной АТФазЫ Vibrio alginolyt icus.

Затем мы экстрагировали F^Fj-комппекс из мембраны vibrio alginolyt icu¡¡, и произвели его очистку разными спосо-

бами. Окончательная методика включала. стадии экстракции тритоном-ХЮО, фракционирования ПЭГ 6000 и гельФильтрации.

Из таблицы 1 видно, что потери активности в результате выделения Фермента незначительны. Следует отметить, что в процессе разнообразных хроматографических разделений, центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и гельФильтрации мембранной Фракции белков Vibrio alginolyticus специфическая АТФазная активность, чувствительная к DCCD, триФенилопову, вентурицидину локализовалась в одном пике.

Число оборотов очищенной АТФазы в составе азолвктиновых пипосом, близкое к растворимой. АТФазе, чувствительность к ингибиторам указывают на ^.интактность получаемого препарата Фермента.

Нам удалось . показать способность FoFj-комппекса транспортировать протон, причем тцт же самый препарат пратеопипосом не транспортировал натрий.

Одновременно с нашей работой Крумкопьц и соавторы клонировали олерон АТРазы Vibrio alginolyticus в плазмиде £.col i. Таким образом АТРаза Vibrio alginolyticus была

экслрессирована в клетках E.coli, выделена и очищена по методике, принципиально отличной от разработанной нами.

Авторы не обнаружили АТР-зависимого транспорта натрия в протеолипосомах, содержания АТРазу, полученную таким путем, хотя эти протеопипосомы осуществляли АТР-зависимый транспорт протонов.

Возможно, Фермент, полученный нами и Фермент, полученный Кр 'мхольцем утеряли натриевую специфичность в

процессе выделения. Следует однако заметить, что Фрагмент ДНК Vibrio alginolyt ¿cus , использованный для клонирования и экспрессии АТРазы в клетках E.coli, содержал только структурные гены, но не ген I, функция которого неизвестна, также присутствумщий в АТРазном опероне. Кроме того в клеткам Vibrio alginolyt icus ^пТРаза могла бы

претерпевать какие-то посттрансляционные изменения, связанные с возникновением Na специфичности, которые естественно не происходят е клетках бактерии донора. Выделение АГРазы непосредственно из клеток Vibrio alginoi yt¿cus представляет, таким образом, более прямой подход к изучении ион-транспортной функции этого Фермента.

Ыа+-транспортмруктая F0F1-ATPasa пока. обнаружена лишь у анаэробной бактерии Fropionogeniua nadestuu. Принципиальное различие между энергетическими процессами у

Propionogcniu» modestuv И Vibrio alginolyt ¿cus СОСТОИТ В

том, что в последнем случае Функционируют по-видимому и протонный, и натриевый циклы, в то время как у Propionogeniuu мodestuu реализуется только натриевый цикл. В частности, Н*"-транспортная активность FqFj^-АТРэзы Propionogeniuu uodestua обнаруживается только в определенных искусственных условиях (низкие концентрации Ка+ в среде). Н^-транспортная активность АТРазы Vibrio alginolyt¿cus, вероятно, представляет Физиологическую Функцию, которая связана с протонным фосфорилированием.

ВЫВОДЫ

1. Мембранная АТФаза Vibrio alginolyt icus инг.ибируется DCC (константа скорости ингибирования 14-.6±0.ónM~1 омин~Ъ, вент

рицидином и -прифениполовом. Результаты изучения взаимодействия АТРазы Vibrio alginolyt ¡cus с ингибиторами ^-комплекса указывает на однородность молекул фермента по крайней мере в участке, ответственном за транапорт пионов.

2. Выделен и очищен АТФазный комплекс из Vibrio alginolyt¡cus. По данным SDS-фореза, препарат содержит субьединицы >с мопекуляр ным весом 58, 55, 38, 25, 23, 17, 14 кДа.

3. Протеолипосомы со встроенным FqFj-комплвксом обладают АТРазной активностью, составляющей 5 ¡имоль/миномг белка и транспортируют протон в процессе гидролиза АТР. Обе активности, гидролиз АТР и транспорт Н*, чувствительны к ДЦКД, вентурицидину и трифенилолову. ЭФФёкт АТРзависимого закиспения среды внутри протеолипосом снимается протонными -разобщителями (ХКФ, РФКФ).

4. Протеолипосомы, содержащие F0Fj-KOMnneKC Vibrio alginolyticus не способны активно транспортировать ионы На+. Конкуренции Н* и На в процессе АТРзависимого -транспорта Г не обнаружено.

■ СПИСОК РА60Т, ОЛУбЛИКОВАННЫх ПО ТЕПЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О.М.Дмитриев, 'СЛЫДанн, И.А.Красносельская, В.П.Скулачев. АТФаза из Vibrio -alginolyticus. Субьвдиничный состав, протонтранспортная активность. Сравнение .с F^F—АТФазой E.coli// Биохимия 1991, в печати.

2. G.Capozsa, 'O.'Yu.'Broitriev, I.A.Krasnoselskaya, S.Papa and V.P. Skulachev. The effect of F0 inhibitors on the Vibrio

alginolyticus membrane ATPase// FEES Lett 1991, 280, p274-276.

3. O.Yu.Bmitriev, I.A.Krasnoselskaya, S.Papa mrl y.p.

Skulachev. FqFj-ATPase fron. Vibrio Alginalyticus. Submit ^composition andiproton pimping activity// FEBS Lett 19 91, 2R5, p.273-276.