Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование филогенетических взаимоотношений диатомовых водорослей рода aulacoseira thwaites, доминирующих в экосистеме озера Байкал

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование филогенетических взаимоотношений диатомовых водорослей рода aulacoseira thwaites, доминирующих в экосистеме озера Байкал"

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВА Татьяна Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ДИАТОМОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ РОДА ЛиЬЛС08Е1КЛ THWAITES, ДОМИНИРУЮЩИХ В ЭКОСИСТЕМЕ

ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.00.16 - экология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в отделе ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Лихошвай Елена Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Челомина Галина Николаевна

кандидат биологических наук, Стоник Инна Валентиновна

Ведущее учреждение; Тихоокеанский научно-

исследовательский рыбохозяйственный центр

Защита состоится «18» июня 2004 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 212.056.02 при Дальневосточном государственном университете МО РФ по адресу: 690600, г. Владивосток, ул. Мордовцева, д. 12, к. 139.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного университета МО РФ.

Автореферат разослан «%> мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.В. Поддубный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Знания о процессах возникновения, вымирания и филогении диатомовых водорослей до недавнего времени основывались исключительно на сопоставлении морфологических признаков строения кремниевых панцирей у современных и ископаемых видов. Исследования молекулярной эволюции предоставляют дополнительную возможность использовать полученные результаты для моделирования механизмов специализации, выработанных близкородственными таксонами при освоении различных экологических ниш.

Одним из важных элементов флоры Байкала являются диатомовые водоросли рода Aulacoseira Thwaites, которые представлены как широко распространенными, так и эндемичными формами, причем последние - А. baicalensis (К. Meyer) Simonsen и A. skvortzowii Edlund, Stoermer et Taylor являются видами, доминирующими в фитопланктоне и донных отложениях озера. Попытка восстановления эволюционных связей рода Aulacoseira, представляет интерес как с точки зрения исследования закономерностей эволюции видов диатомовых водорослей, так и с позиции изучения этапов образования современного доминирующего в экосистеме озера Байкал комплекса видов рода Aulacoseira.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение истории формирования байкальской группы доминирующих видов рода Aulacoseira на основе сравнительного изучения изменчивости некоторых генов и морфологических признаков.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать микрометод отбора клеток одной видовой принадлежности из природных проб фитопланктона для выделения суммарной клеточной ДНК и последующего использования ее в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировании.

2. Выбрать молекулярные маркеры и праймеры для ПЦР, определить нук-леотидные последовательности амплифицированных участков ДНК, провести филогенетический анализ байкальских и внебайкальских представителей рода и оценить время их дивергенции.

3. Провести кладистический анализ признаков тонкого строения панцирей видов Aulacoseira и сопоставить полученные данные с результатами мо-лекулярно-филогенетического анализа.

4. Проследить изменения состояний морфологических признаков в ходе эволюции рода Aulacoseira и предложить гипотезу формирования байкальской группы видов, занимающих различные экологические ниши.

Научная новизна. Впервые для диатомовых водорослей проведен моле-кулярно-филогенетический анализ видов внутри одного рода. Впервые показано совпадение филогенетических гипотез, основанных на генетических и морфологических данных, и оценена роль признаков строения панцирей в эволюции видов рода Aulacoseira.

Теоретическая и практическая значимость. Приобретение знаний по эволюционной истории изучаемого рода, который в массе представлен как в фитопланктоне, так и в донных отложениях многих водоемов, в том числе озера Байкал, крайне важно для экологического мониторинга и построения точных палеоклиматических реконструкций. Метод отбора небольшого числа клеток из природных проб для выделения ДНК гарантированной видовой принадлежности, разработанный в ходе выполнения работы, позволяет амплифи-цировать различные гены и определять их последовательности. Это дает возможность исследовать разнообразие диатомовых водорослей из природных популяций, избегая трудоемкого кулътивирования. Пополнение банка данных последовательностей создает основу для конструирования идентификационных олигонуклеотидных проб (ДНКовых подписей), которые могут быть использованы для изучения видового разнообразия фитопланктона. Основные защищаемые положения:

1. Преимущества разработанной методики выделения ДНК из индивидуальных клеток диатомовых водорослей или из их небольшого числа, обеспечивающей, с одной стороны, амплификацию и секвенирование ядерных и хлоропластных генов, а с другой - однозначную идентификацию ультраструктурных и иных морфологических признаков.

2. Тесное генетическое и морфологическое родство доминирующих в экосистеме озера Байкал видов рода Aulacoseira и распространенного во всем Северном полушарии вида A. islandica (О. Mueller) Simonsen.

3. Информативность параллгльного молекулярно-филогенетического и морфолого-кладистического анализов для верификации филогенетических гипотез.

Апробация работы. Результаты работы доложены: на V-ой Школе диа-томологов стран СНГ «Диатомовые водоросли - индикаторы изменений окружающей среды и климата», 16-20 марта 1993 г. (Иркутск); на 13-ом Международном диатомовом симпозиуме, 1-7 сентября 1994 г. (Аквафреда ди Марра-тея, Италия); на 3-ем Международном симпозиуме "Видообразование древних озер" (SIAL- 3), 4 - 9 сент., 2002 г. (Иркутск).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

В диссертационную работу вошли исследования, поддержанные грантами MVH000 и MVH300; INTAS 93-36C4 и 93-3605-ext; РФФИ 94-0411005, 97-04-50225, 01-04-49470 и 01-04-48991; СО РАН 10.3.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 103 стр., состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы (181 источник, из них 126 на иностранных языках) и приложения; содержит 9 таблиц, 11 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА1.ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ

Описана экология видов рода Aulacoseira, обитающих в оз. Байкал. Приводятся известные результаты филогенетического анализа диатомовых водорослей на основе морфологических признаков, данные о пластичности их морфологии в ответ на изменчивость среды. Обсуждаются работы по изучению эволюции диатомовых водорослей с применением молекулярных методов исследований и возможные механизмы видообразования у диатомовых водорослей. Дан обзор палеонтологических данных об эволюции видов рода Aulacoseira в оз. Байкал. Описаны принципы методов филогенетического анализа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1» Материалы

Пробы весеннего фитопланктона из Южного Байкала, содержащие А. baicalensis и A. skvortzowii, из осеннего фитопланктона Чивыркуйского залива озера, а также Cyclotella baicalensis Skvortzow и С. minuta (Skvortzow) Antipova из весеннего и осеннего, соответственно, фитопланктона отбирались батометром и/или сетью Джеди с глубины 30-50 м. Лабораторные культуры A. baicalensis получены из ауксоспор весенней популяции вида из Южного Байкала, A. subarctica (О. Mueller) Haworth из озера Лох-Ней (Сев. Ирландия) д-ром К. Гибсоном (С. Gibson) и любезно им предоставлены

для исследований; виды A. islandica (оз. Виннипег, Канада) и A. nyassensis (О. Mueller) Simonsen (озеро Малави, Юго-Восточная Африка) получены от д-ра X. Клинг (Н. Kling). Все образцы были фиксированы 80% этанолом.

2.2. Выделение суммарной клеточной ДНК

Для выделения ДНК использовали метод (Doyle, Doyle, 1990), основанный на способности нуклеиновых кислот образовывать стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом (СТАВ) в растворе с высоким содержанием солей.

2.3. Амплификация и секвенирование полноразмерного гена 18S рРНК

Для амплификации и секвенирования полноразмерного гена малой субъединицы рРНК (рис. 1) использовали эукариотические праймеры, разработанные ранее (Elwood, Olsen, Sogin, 1985), приведенные в таблице 1.

Рис. 1. Схема секвенирования полноразмерного гена Ж рРНК. Высококонсервативные участки заштрихованы черным цветом. Стрелки и цифры указывают линейную длину молекулы в нуклеотидах.

Таблица 1. Названия и последовательности нуклеотидов праймеров для амплификации и секвенирования гена Ш рРНК.

1F CTGGTTGATCCTGCCAG

82F GAAACTGCGAATGGCTC

528F CGGTAATTCCAGCTCC

690F T/CAGAGGTGAAATTCT

1055F GGTGGTGCATGGCCG

1528R TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC

1400R ACGGGCGGTGTGTG/AC

1055R CGGCCATGCACCACC

690R AGAATTTCACCTCTG

536R GA/TATTACCGCGGCG/TGCTG

2.4. Выбор праймеров для амплификации и секвенирования фрагмента гена Rubisco

На основе сравнения свыше двух десятков последовательностей, взятых из банка EMBL и принадлежащих разным классам водорослей, мной были сконструированы праймеры, ограничивающие 3'- концевой фрагмент большой субъединицы, межгенный спейсер и 5'-участок малой субъединицы гена Rubisco: 5'GGTAAACCCCATAATTCCCAATA3' и

5'GGTACAGTTGTAGGTAAATTAG3' Длина фрагмента (около 570 пар оснований) позволяла определение нуклеотидной последовательности без использования внутренних праймеров. Амплификацию проводили в буфере (10 mM трис-НС1; 50 mM KCl; 0,2 mg/ml BSA; 3,5 - 4 mM MgCl2; по 10 pmol праймеров; по 0, 15 mM каждого dNTP; около 1 нг геномной ДНК на 25 мкл реакции) в условиях: 95°С - 5 мин, и 35 циклов по схеме: 94°С - 1 мин, 54°С - 1 мин, 72°С - 1 мин. Продукт ожидаемой длины очищали и концентрировали электро-элюцией. Прямое секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводили с помощью набора "fmol DNA Sequencing System" (Promega) с использованием (a-33P)dATP в режиме: 94°С - 40 сек., 50°С -30 сек., 72°С - 40 сек.

2.5. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей

Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы DIALIGN2 (Morgenshtern et al., 1999). Состав последовательностей ДНК и их выравненного набора оценивали программой MEGA 2 (Kumar et al.,

2001). Полученные последовательности сравнивали с опубликованными в GenBank гомологичными последовательностями: Aulacoseira ambigua (Grunow) Simonsen - X85404; A. distans (Ehrenberg) Simomsen - X85403; Odontella sinensis (Greville) Grunow - Y10570; Bacillariapaxillipher (O. Mueller) Hendey - M87325; Cylindortheca sp. - G336683; Detonula confervacea (Cleve) Gran - ABO 18006; Nichshtzchia apiculata (Gregory) Grunow - M87334; Skeletonema costatum (Greville) Cleve - X85395; Stephanopixes broshii Grunow - M87330; Thalassionema, nordenskioides (Grunow) Van Heurck - ABO 18007. Филогенетический анализ последовательностей проводили с использованием пакета филогенетических программ Phylip v.3.6a2 (Felsenstein, 1981, 1993), TREE-PUZZLE (Schmidt et al,

2002), PAUP v.4.0b (Swofford,1998). Графическое оформление древ выполняли программой Tree View (Page, 1996).

2.6. Кладистический анализ морфологических признаков

Анализировали 15 признаков детального строения панцирей, в основном, по данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (рис. 2). Градации, или состояния признаков, были предложены Е.В. Лихошвай и Р. Крауфордом.

Расстояния между состояниями признаков устанавливали по принципу: от простого к сложному. Состояния метрических и количественных признаков определяли путем грубого (широкого) ранжирования. Для 13 современных видов и внутривидовых таксонов на основе 15 признаков определяли максимально-экономное древо (пакет программ РАЦР у.4.0Ь4а) (8мэ0Ъгё, 1998). Состояния полиморфных признаков считались равновероятными. Каждому признаку поставлена в соответствие

Рис. 2. Общая схема строения створок Аи1асо.шга с указанием признаков (пр.) строения, которые учитывались при построении кладограмм: ё — диаметр створки, Ъ — высота створки (Ъ/ё — пр. 1); пр. 2 - направленность рядо.3 ареол на загибе створки; пр. 3 - поверхность загиба створки; пр. 4 - особенность строения ареол на границе лицевой части створки и ее загиба; пр. 5 -поддерживающие структуры велума; пр. 6 - мембрана (пластинка) велума; пр. 7 — размер кольцевидной диафрагмы; пр. 8 — строение кольцевидной диафрагмы; пр. 9 - идентичность или различие в форме соединительных и разделительных шипов; пр. 10 — соотношение количества рядов ареол на загибе створки к количеству шипов; пр. 11 — количество двугубых выростов на створке; пр. 12 - место расположения двугубых выростов; пр. 13 - форма двугубого выроста; пр. 14 - наружное отверстие двугубого выроста; пр. 15 (на рисунке не указан) - наличие покоящихся стадий.

матрица переходов между состояниями. Поиск наилучшего дерева проводили методом «ЬгапсЪ-апё-Ьъипб». Вымерший в позднем плейстоцене вид А. pseudoislandica Ьир1кта в( Ozъrmna был включен в анализ для проверки его сходства с предполагаемым предком. Аут-группой служил спорообразующий вид Рого5т glacialis (Огипъ-^ Лъег§еп8еп из семейства ТЬа1а88Ю81гасеае (УП-1агеа1, БгухеИ, 1990). Картирование признаков по ветвям полученного древа и восстановление предковых состояний проводили с помощью программы МсС1аёе (Маё^ъп, Маё^ъп, 2001).

Образцы природных пелагических популяций оз. Байкал, наряду с большим количеством клеток интересующего вида всегда содержат при-

<1

9 4 3 14 1МЗ 7,8

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КЛЕТОК

месь сопутствующих видов диатомовых и иных водорослей. Поскольку выполнение поставленных задач требовало анализа ДНК видов из природной среды, необходимо было иметь метод отбора клеток, гомогенных в видовом отношении. Под бинокулярной лупой из капли пробы фитопланктона с помощью стеклянной микропипетки (диаметром 30-50 мкм), отбирали отдельные клетки, отмывали их проводкой через 2-3 капли дистиллированной воды и переносили на силиконизированное покровное стекло, размещенное на предметном столике инвертированного микроскопа Axiovert 10 Zeiss. После испарения влаги, панцири перфорировали оттянутой стеклянной иглой с диаметром 3 мкм, управляемой микроманипулятором. Затем на поврежденные клетки наносили 1-2 мкл раствора с протеиназой К (0,5 мг/мл в буфере, содержащем 0,1% SDS или 0,1% Triton X-100; 10 мМ Tns-HCl, рН 7,5; 10 mM NaCl; 0,5 мМ ЭДТА). Каплю покрывали жидким парафином, покровное стекло с материалом переносили в чашку Петри и ин-кубаторовали 2 час при 60°С. Затем каплю разводили 250 нл 0,1% Triton Х-100 и 3 мкл полученного раствора переносили в пробирки, содержащие 15 мкл ПЦР-буфера.

Рис. 3. Перфорированные панцири А. яклоНхоомп СЭМ. Масштаб: А-Г - 10 мкм; Д-3 - 5 мкм.

Оставшиеся на покровном стекле панцири высушивали на воздухе, ос-

таток жидкого парафина удаляли трехкратным промыванием гексаном. После испарения гексана препарат на покровном стекле обрабатывали в течение 2 час при 75°С 30% перекисью водорода, отмывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе, напыляли золотом в вакуумной установке Balzers SCD 004 и исследовали в СЭМ Philips 525M. По рисунку 3 видно, что по оставшимся фрагментам панцирей можно наблюдать основные морфологические признаки створок и идентифицировать вид: шипы, лицевая часть и загиб створок сохраняются, можно определить их размеры и плотность расположения ареол.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДОМИНИРУЮЩИХ В ОЗ. БАЙКАЛ ВИДОВ РОДА AULACOSEIRA 4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерного ядерного гена малой субъединицы рРНК

Последовательности полноразмерного гена, кодирующего 18S рРНК, длиной около 1980 п.н. определены для Aulacoseird skvortzowii, A. baicalensis, A. islandica, A. subarctica, A. nyassensis. Полученные последовательности выравнивали по гомологичным последовательностям A. ambigua и A. distans, взятыми из GenBank, с использованием программы Dialign2 (Morgenshtern, 1999) и небольшой коррекцией вручную. Выравнивание консервативных участков гена было инвариантно. Выравнивание вариабельных районов потребовало введения одной групповой делеции (A. ambigua имеет вставку длиной 46 нуклеотидов, отсутствующую у остальных видов), а также одиночных вставок-делеций. В пределах сравниваемых видов диато-мей 159 положений оказались вариабельными, 30,4% - филогенетически информативны, то есть по этим положениям различались группы, насчитывающие от двух и более последовательностей. Соотношение транзиций к трансверсиям составило 1,2, что примерно соответствует ожидаемому значению для консервативного гена. Для филогенетического анализа определенных нами последовательностей использовали гомологичные гены диа-томей, определенные другими авторами и депонированные в GenBank.

Первичный анализ последовательностей 18S рДНК с помощью программы Neighbour (пакет филогенетических программ Phylip, v3.6a2) выявил существенные вариации скоростей накопления нуклеотидных замен в отдельных линиях анализируемых диатомовых водорослей, поэтому использовался метод максимального правдоподобия, который менее чувствителен к разбросу скоростей фиксации замен. На рисунке 4, А приведена филограм-

ма, построенная методом максимального правдоподобия, включающая только устойчивые ветвления, оцененные с помощью программы TREE-PUZZLE (Schmidt et al, 2002). Независимо от видов близкородственных таксонов диатомовых водорослей, , добавляемых в качестве аут-групп, все виды Aulacoseira достоверно образуют одну монофилетическую кладу. Внутри рода с 100%-ной поддержкой наблюдается дихотомия деления линии Aulacoseira: одна ветвь группирует A. distans, A. ambigua, A. nyassensis, в другой объединяются все байкальских виды и A. islandica из оз. Виннипег, а также A. subarctica из оз. Лох-Ней. Клада, содержащая эндемичные виды Aulacoseira из оз. Байкал и канадский вид A. islandica, несомненно имеет общего предка (100%-ной вероятностная поддержка), ближайшим родственником которой является A. subarctica. Положение этого вида в объединении с байкальской кладой, а не со второй группой - является главным топологическим отличием максимально-правдоподобных древ, построенных программами TREE-PUZZLE и DNAML (пакет программ Phylip v.3.6a2), соответственно. Аналогичные результаты были получены нами ранее, при анализе небольшого фрагмента гена 18S рРНК. Судя по полноразмерным последовательностям гена, байкальские виды и A. islandica, представляют группу близкородственных, недавно дивергировавщих видов.

4.2. Анализ последовательностей фрагмента гена Rubisco Нуклеотидные последовательности фрагмента хлоропластного гена Rubisco определяли для того же набора видов Aulacoseira, для которого расшифрованы последовательности 18S рДНК, но с одним дополнением -популяцией A. islandica (Chivyrkuy) из Чивыркуйского залива оз. Байкал. Фрагмент гена Rubisco, содержащий участок большой, малой субъединиц и межгенный спейсер выравнивали относительно гомологичных последовательностей диатомовых Detonula confervacea и Cylindrtheca sp, взятых из GenBank При этом обнаружена единственная непрерывная рамка считывания аминокислот по универсальному коду, не выявлено вставок и делеций в кодирующей части фрагмента. Старт малой субъединицы определяет кодон GTG, также как для некоторых других водорослей и высших растений. Выравненный набор последовательностей на участке длиной 568 п.н. содержал 105 информативных сайтов (19%).Анализ нуклеотидного состава кодирующей части фрагмента показал, что соотношение G+C и А+Т в составе последовательностей указывает на предпочтительность использования А,Т нук-леотидов (81,7%), выявил наличие сдвига в сторону использования кодо-нов с основаниями А и Т в третьем положении синонимичных кодонов.

Показана неодинаковая частота в использовании синонимичных кодонов фрагмента гена Rubisco видов Aulacoseira. Это явление было отмечено ранее у растений, зеленых водорослей, и, как недавно показано, справедливо для пластидных генов некоторых морских диатомей (Sorhannus, Fox, 1999; Morton et al, 2002).

Оказалось, что межгенный участок оперона Rubisco у Aulacoseira не превышает 40 нуклеотидов, чезначительно варьирует по длине (3-4 нуклео-тида) как в пределах рода Aulacoseira, так и для центрических диатомей. Не-кодирующий участок на 98% обогащен основаниями АйТи содержит мотив AGGA, предположительно участвующий в связывании следующей за ним малой субъединицы с рибосомами. Структура исследованного фрагмента у видов Aulacoseira соответствует оперонной организации генов Rubisco, подобно тому, как это было показано для Cryptophyta, Chromophyta и Rodophyta (Hwang, Tabita, 1989; Valentin, Zetsche, 1990). У близкородственных байкальских видов межгенный участок оказался идентичным по длине, по нуклеотидному составу содержит одну замену у A. islandica (рис. 5). У эволюционно более удаленных представителей Aulacoseira различий в последовательностях больше, а в сравнении с представителями другого центрического рода - Cyclotella. и тем более пеннатной диатомеи Cylindrotheca sp. - существенно больше и по длине, и по количеству замен.

Рис. 5. Последовательность участка ДНК, разделяющего большую и малую субъединицы гена КиЫжо (межгенного спейсера) для некоторых видов диатомовых водорослей.

Максимально-правдоподобное древо по последовательностям гена КиЫ8со (рис. 4, Б) оказалось в согласии с топологией 188-древа (рис. 4, Б) и также содержало отдельную «байкальскую» кладу, сформированную эндемичными видами Байкала и канадской А. islandica. По наличию замен в исследованном фрагменте гена КиЫжо пелагический вид A. skvortzowii и популяция из Чивыркуйского залива оз. Байкал оказались генетически обособленными (3 замены), такая же степень вариабельности отличает вид

Рис. 4. Сопоставление филогенетических гипотез на основе анализа полноразмерного гена Ш рибосомной РНК (А) и фрагмента гена Rubisco (Б) с кладограммой, построенной по 15 морфологическим признакам для 8 представителей рода (программа PAUP), длина древа 35 шагов, О = 0,833 (В).

А. islandica из канадского оз. Виннипег и А. skvortzowй (табл. 2). Известно, что представители A. islandica из залива отличаются от A. skvortzowii экологически - дают дополнительный, осенний, пик цветения из прорастающих спор и имеют минорные морфологические отличия.

Обнаруженные различия последовательностей гена КиЫвсо, с одной стороны, являются указанием на изолированность популяции Чивыркуйского залива, а, с другой стороны, могут свидетельствовать об адаптации к различным температурным режимам прогреваемого мелководного залива и глубоководной холодной пелагиали.

Таблица 2. Количество замен нуклеотидов между представителями Aulacoseira в последовательности фрагмента гена КиЫвсо (в скобках приведено соотношение синонимичных:несинонимичных замен)._

A. skvortzowii A. islandica (Виннипег) A. islandica (Чивыр. зал.) A. baicalensis A. subarctica

A. islandica (Виннипег) 3 (3:0)

A. islandica (Чивыр. зал.) 3(2: 1) 4(3:1)

A. baicalensis J (4:1) 6 (5:1) 2 (2.0)

A. subarctica 23 (17:6) 25 (20.5) 25 (19:6) 25 (20:5)

A. nyassensis 30 (23:7) 30(24:6) 29 (23:6) 25 (19:6) 30 (26:4)

Сравнение психрофильных и мезофильных одноклеточных водорослей (Chloromonas sp.) показало, что у водорослей, адаптированных к холодным условиям обитания, обнаружены мутации, затрагивающие участки первичной структуры гена большой субъединицы Rubisco, в том числе высоконсерватив-ные (Devos et al., 1998).

Таким образом, наблюдаемые нами различия в последовательности фрагмента гена Rubisco между популяциями открытой воды и Чивыркуйского залива можно интерпретировать как физиологическую адаптацию, экотипиче-скую вариацию, с одной стороны, также как свидетельство отсутствия перемешивания пелагической и заливной популяций - с другой.

Определенные последовательности депонированы в GenBank под номерами: A. baicalensis - AY121821, AF522281; A. skvortzowii - AY121822, AF522279; A. islandica - AY121820, AF522280; A. islandica (Chivyrkuy Bay) - AF522284; A. nyassensis - AY12189, AF522282; A. subarctica - AY121818, AF522283.

4.3. Оценка времени дивергенции видов по молекулярным данным

Исходя из оценки средней скорости эволюции гена 18S рРНК, рассчитанной для диатомовых водорослей - 1 % замен за 18-26 млн лет (Kooistra, Medlin, 1996), нижняя граница формирования «байкальской клады» от общего предка попадает в интервал не более 5,2-3,4 млн л.н.

Для оценки времени дивергенции «байкальской клады» от общего предка по кодирующей последовательности хлоропластного гена Rubisco, наиболее подходящим типом замен являются синонимичные замены, поскольку их фиксации не несет функциональных последствий для клетки, и накопление их во времени можно считать линейным; кроме того, мала вероятность наличия возвратных замен в этой «молодой» линии. Используя средние значения скоростей появления синонимичных замен в последовательности гена большой субъединицы Rubisco (rbcL) у диатомовых водорослей (Sorhannus, Fox, 1999) определено время дивергенции байкальских эндемиков в диапазоне 8,8-3,3 млн лет.

Расчет времени дивергенции байкальской линии эндемичных Aulacoseira по белок- кодирующим последовательностям ДНК и 18S рРНК попадает на границу миоцена-плиоцена и находится во временных рамках существования Байкала (27-25 млн л. по Мац, 1993). Принадлежность A. islándica из оз. Виннипег к группе байкальских доминирующих видов и происхождение этой клады от общего предшественника, вместе с тем фактом, что ареалы этих видов не пересекаются, приводит к необходимости считать их предка широко распространенным видом.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ КЛАДИСТИКИ

Для сравнения морфологического и молекулярного древ на рисунке 4, В приведена кладограмма, построенная по 15 морфологическим признакам для тех же 8 представителей, для которых проведен молекулярный анализ (рис. 4, А и Б). Группа видов, обитающих в озере Байкал (A. baicalensis, A. skvortzowii, A. islandica из Чивыркуйского залива озера) и близкой к ним по строению A. islandica из водоемов Европы и Северной Америки, также как на молекулярно-филогенетических схемах, образуют отдельную общую кладу.

Таким образом, с помощью молекулярных данных показано происхождение от единого общего предка современных близкородственных эндемичных видов Aulacoseira Байкала, их дивергенция в пределах времени существования озера, а также показано согласование характера группирования видов на молекулярных и морфологическом древах.

Возникает вопрос о том, можно ли выделить какие-то морфологические признаки, изменения которых сопряжены с эволюцией и дивергенцией этих видов. Для ответа на него был проведен максимально-экономный (parsimony) анализ 15 признаков тонкого строения створок большего количества видов Aulacoseira (программа PAUP, v. 4.0b10). В результате определено единственное древо (длина 126 шагов, Q=1), которое получило индексы поддержки при тестировании на «устойчивость/распад» с применением программы TreeRot (Sorenson, 1996). Изменения состояний признаков, представленных на рис. 2, по ветвям и узлам (предковые состояния) морфологического древа анализировали с помощью с помощью программы McClade, v. 3.04 (Maddison, Maddison, 1992) что позволило проследить судьбу каждого из этих признаков в эволюции рода.

Проведенный анализ показал, что некоторые признаки строения панциря Aulacoseira неоднократно появляются и исчезают в истории рода (го-моплазии). Это, во-первых, два признака, связанные с особенностями жизненного цикла водорослей. Первый из них - идентичность соединительных и разделительных шипов (признак 9), характерные для A. subarctica и А. perglabra (Oestrup) Haworth. Второй признак - выбор стратегии переживания неблагоприятных условий: формирование спор покоя (A. italica, A. skvortzowii, A. islandica из Чивыркуйского залива) или образование клеток покоя с утолщенным панцирем (A. granulata, A. baicalensis, A. islandica из Великих Американских озер) (рис. 6, признак 15).

Неоднократно появляется в ходе эволюции и утрачивается у филогенетически удаленных таксонов клетки с соотношением высоты к диаметру створок близким к 1 (рис. 6, признак 1, В), а также гранулированная поверхность створок (признак 3) и мелкая диафрагма (признак 7).

На древе выделены несколько аутоапоморфий, то есть модификаций исходного предкового состояния признака, свойственные только отдельным эволюционно более поздним линиям. Это, например, направленность рядов ареол налево у A. italica (признак 2), отсутствие ареол на загибе у А. perglabra (признак 4), полая кольцевидная диафрагма, свойственная только A. ambigua (признак 8). Эти признаки являются идентификационными для данных видов.

На древе также определяются продвинутые апоморфные состояния некоторых признаков для групп видов, унаследованные ими от ближайшего общего предка (так называемые, синапоморфии). Эти синапоморфии, свойственные отдельным кладам, свидетельствуют о формировании групп

видов на основе наследования от предковой формы некоторых необычных свойств, то есть, другими словами, они несут филогенетический сигнал. Например, по количеству двугубых выростов на створке (рис. 6, признак 11) все Aulacoseira распадаются на две группы (А - несколько; В - много). По строению поддерживающих структур велума (рис. 6, признак 5) состояние В (в виде ребер) объединяет группу A. italica - A. volgensis, а состояние А (в виде волы и роты) объединяет группу A. pseudoislandica - A. islandica. По структуре мембраны велума (признак 6, тонкая мембрана со свободным краем), объединяется группа A. pseudoislandica - A. islandica; по локализации двугубых выростов (рис. 6, признак 12, D - по всему загибу створки) объединяются байкальской виды и A. pseudoislandica, A. islandica. Расположение наружного отверстия двугубых выростов в ареолах (рис. 6, признак 14, С) свойственно ветви A. skwortzowii - A. islandica. Таким образом, у группы видов A. pseudoislandica, A. baicalensis, A. skvortzowii и популяции Чивыркуйского залива из озера Байкал вместе с панарктической A. islandica имеется несколько синапоморфий, унаследованных членами этой группы от общего предка. Оказалось, что все эти признаки именно в таких состояниях характеризуют вид A. pseudoislandica, наиболее близко расположенный к предполагаемому предку этой группы видов. Для этого вида покоящиеся стадии не описаны. Возможно, что именно отсутствие такой способности привело к исчезновению вида во время смены климата и условий обитания в верхнем плейстоцене. Все остальные члены этой клады образуют покоящиеся стадии, правда, разные - покоящиеся споры (состояние В) или покоящиеся клетки (состояние С) (рис. 6, признак 15). Спорообразование встречается у многих удаленных в эволюционном плане видов диатомей (McQuoid, Hobson, 1996). Однако процесс формирования споры, возникая неоднократно в эволюции рода, происходит по-разному в разных видах. У близкородственных A. skvortzowii, A. islandica из Чивыркуйского залива, озера Ханка и реки Амур (Жузе, 1952а; Баринова, Медведева, 1996) одного типа (Скабичевский, 19536; Edlund, Stoermer, Taylor, 1996), а у отдаленного от них вида A. italica способ образования спор другой (Muller, 1906). По мнению авторов (Edlund, Stoermer, Taylor, 1996) второй тип является более продвинутым, так как в этом случае из одной материнской клетки образуется 4 споры (а не 2), и не происходит образования сопутствующих клеток с деградированными протопластами. Покоящиеся (зимние) клетки являются более экономичным способом переживания

Рис. 6. Картирование состояний признаков на кладограмме. Номера соответствуют признакам (рис. 2), буквами обозначены различные состояния признаков.

неблагоприятных условий, чем споры, и более продвинутым (Smetacek, 1985). Возможно, что именно способность образовывать толстостенные зимние клетки и "экономичные" тонкостенные весенние (Поповская, Скабичевский, 1970) позволила виду A. baicalensis занять доминирующие позиции в глубоководной пелагиали Байкала, о чем можно судить по обильному их представлению в донных отложениях (Grachev et ai, 1998; Likhoshway, 1999), пережить последнее плейстоценовое оледенение (Безрукова и др.,

1991) и господствовать в озере до настоящего времени. Возможно также, что различие по толщине стенок панциря у зимних и весенних клеток, описанное авторами (Stoermer, Kreis, Sicko-Goad, 1981), позволило другому виду A. islandica "возродиться" в водоемах Северной Америки и Европы после того, как там исчезли его родственники, образующие споры.

ГЛАВА 6. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ЭВОЛЮЦИИ ВИДОВ РОДААULACOSE1RA В ОЗ. БАЙКАЛ 6.1. Сопоставление гипотез эволюции Aulacoseira по молекулярным и морфологическим данным Филогенетические взаимоотношения видов Aulacoseira исследованы мною с молекулярной и морфологической стороны. Проанализированы разные наборы признаков, отличающихся качественно (морфологические и молекулярные) и количественно (15 признаков и 1890/570 п.н.) При этом использовали разные методы анализа: кладистики, максимальной экономии и максимального правдоподобия. Несмотря на различия в подходах, выводы, вытекающие из полученных результатов, не противоречат, а дополняют друг друга.

Группирование видов на морфологической кладограмме в целом согласуется с филогенетической гипотезой, построе иной для части этих видов по данным сравнения последовательностей полноразмерного ядерного гена 18S РНК и фрагмента хлоропластного гена Rubisco. Топологии молекулярного и морфологического древ указывают на п эоисхождение байкальско-исландской группы Aulacoseira от общего предка (рис. 4). Восстановленная картина эволюции строения панцирей клеток Aulacoseira, полученная при-картировании признаков по морфологическому древу, предлагает морфологическое обоснование дивергенции групп, которая выявлена с помощью мо-лекулярно-филогенетического анализа: дивергенция байкальско-исландской группы связана с синапоморфиями по локализации и тонкой структуре функционально важных специализированных выростов - римопортул. Эти структуры играют важную функциональную роль в жизнедеятельности диа-томей, обеспечивая движение клеток и являясь якорем нитей веретена при митозе (Medlin et al., 1986; Pickett-Heaps et al., 1991; Schmidt, 1994), вероятно, с их эволюцией связаны адаптивные возможности и дивергенция групп.

6.2. Разные стратегии выживания как возможные пути эволюции видовAulacoseira в Байкале Датировка дивергенции байкальских видов Aulacoseira, полученная на основе молекулярных данных выпадает на интервал 8,8-3,3 млн л.н., позднего миоцена - плиоцена. По палеонтологическим данным в миоцене род Aulacoseira

переживает период расцвета - происходило расселение по водоемам Европы (Порецкий, 1939, Логинова, 1979), Северной Америки (Bradbury, 1991), азиатского континента (Жузе, 19526; Хурсевич, 1992) и обычно связанное с освоением новых ареалов активное видообразование. Так миоценовые отложения Тункинской котловины, расположенной на юго-западе байкальской рифтовой зоны отличались обилием видов Aulacoseira (Жузе, 19526; Моисеева, 1971; Ли-хошвай, Помазкина, Никитеева, 1997). Как показывает изучение непрерывных байкальских осадков, полученных путем глубоководного бурения и поднятием 8-12 м кернов (Bradbury et al., 1994; BDP-93 .... 1997; Grachev et al., 1998; Коллектив ..., 1998, 2000; Likhoshway, 1999; Antipin et a!., 2001; Хурсевич и др., 2001), начиная с 5 млн л.н., состав доминирующих видов диатомовых водорослей неоднократно менялся, происходило вымирание одних, исчезновение и повторное появление других. Появление в осадках узкими пиками космополит-ных видов A. ambigua, A. granulata.A. subarctica (Likhoshway, 1999) свидетельствовало о разнообразии экологических ниш. В настоящее время, не претерпев морфологических изменений (Сапожникова и др., 2000), эти виды обитают в мелководных заливах Байкала (Поповская, Генкал, Лихошвай, 2002). Результатом адаптации палеоарктического морфологически «продвинутого» предка «байкальско-исландской» линии к условиям Байкала, могло быть симпатриче-ское видообразование, дивергенция вследствие специализации по нишам и стратегиям. Одна линия выжила благодаря «атавизму» - спорообразованию, вторая - за счет формирования прогрессивных «экономичных» зимних клеток

Рис. 7. Схема эволюции видов Aulacoseira по разным стратегиям выживания.

(Бондаренко, Гусельнико-ва, 1988; Бондаренко,

1997). Вид А. skvortzowii благодаря способности создавать «примитивные» споры покоя и тяготением к более мелководным зонам (Кожова, 1961; Бондаренко, 1997), вероятно, оказался преадаптирован к условиям Байкала, что позволило ему развиваться в достаточно массовых количествах, так что его характерные споры были «замечены» в осадках озера возрастом начиная с 5 млн л. (Grachev et al., 1998; Лихошвай и др., 2004). Специализация истинно глубоководного А.

baicalensis проявилась позднее, доминирующие позиции в пелагиали озера вид занял только в верхнем плейстоцене около 100 тыс. л.н. (Grachev et al, 1998; Хурсевич и др., 2001). Таким образом, А. skvortzowii и A. baicalensis, развившие уникальные стратегии выживания в холодном и глубоководном озере, оказались эндемичными для Байкала формами среди Aulacoseira. Потомком в менее специфической (по сравнению с байкальской) экосистеме стал современный вид A. islandica, не образующий спор, но способный, также как и A. baicalen-sis, формировать толстостенные клетки покоя, что способствовало его широкому расселению в голоценовых водоемах Северного полушария. Схема возможной эволюции видов изображена на рисунке 7.

ВЫВОДЫ

1. Разработан основанный на микроманипуляции метод выделения суммарной ДНК из отдельных клеток диатомовых водорослей диаметром около 10 мкм, позволяющий амплифицировать фрагменты ДНК в полимеразной цепной реакции для последующего определения нуклеотидных последовательностей. Метод предоставил новую возможность молекулярно-филогенетического исследования диатомовых водорослей из природных популяций и анализа строения панцирей тех же индивидуальных клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии.

2. Определены последовательности полноразмерного ядерного гена 18S рРНК и фрагмента хлоропластного гена Rubisco для нескольких видов рода: распространенных в Северном полушарии A. islandica и A. subarc-tica, эндемика озера Малави (Восточная Африка) A. nyassensis, A. bai-calensis и A. skvortzowii из пелагиали озера Байкал, а также A. islandica из Чивыркуй-ского залива озера.

3. Молекулярно-филогенетический анализ показал, что род Aulacoseira монофилетичен, и эндемичный байкальский вид A. baicalensis, спорооб-разующие A. skvortzowii из пелагиали озера Байкал и A. islandica из его Чивыркуйского залива образуют единую "байкальско-исландскую" кладу с A. islandica из озера Виннипег (Канада), которая споры не образует. Эта клада объединяет генетически различающихся родственных представителей, дивергенция которой от других видов рода произошла в позднем миоцене - раннем плиоцене.

4. Впервые для диатомовых водорослей показано, что кладограмма видов Aulacoseira, построенная методом максимальной экономии по морфологическим признакам, согласуется с молекулярно-филогенетической гипотезой их эволюции.

5. Путем картирования признаков тонкого строения панцирей на морфологической кладограмме выявлены синапоморфии "байкальско-исландской" клады - по локализации и строению двугубого выроста,

строению велума и форме створок. Специализация отдельных представителей этой клады свя: ана с гомопластичным признаком - образованием покоящихся стадий. Выявленные признаки являлись ключевыми при освоении исследованными видами различных экологических ниш.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щербакова Т.А. Сравнение генов Aulacoseira baicalensis и A. isladica, кодирующих 168-подобную рибосомную РНК с помощью рестрикци-онного анализа // Диатомовые водоросли - индикаторы изменений окружающей среды и кл* мата: Тез. докл. V школы по диатомовым водорослям стран СНГ, 16-20 марта 1993, Иркутск. - Иркутск 1993. - С. 70.

2. Sherbakova T.A. Genetic approach to the taxonomy of Baikalian algae // Abstr. 13th Int. Diatom Sympos., Sept. 1-7, 1994, Maratea, Italy. - Naples: Stazione Zoologica Anton Dohrn, 1994. - P. 70.

3. Щербакова Т.А., Кирильчик СВ., Лихошвай Е.В., Грачев М.А Филогенетическое положение некоторых диатомовых водорослей рода Aulacoseira из озера Байкал по данным анализа последовательностей фрагмента гена 18S рРНК // Мол. биол. -1998. - Т. 32. - С. 735-740.

4. Грачев М.А., Земская Т.И. Белых О.И., Воробьева С.С., Гольдберг Е.Л., Горшков А.Г., Кузнеделов К.Д., Лихошвай Е.В., Мац В.Д., Мельник Н.Г., Тимошкин О.А., Федорова ГА, Ходжер Т.В., Шимараев М.Н., Щербакова Т.А. Лимнологические исследования на Байкале в 19871998 гг. (некоторые итоги). - Академическая наука в Восточной Сибири (к 50-летию Иркутского научного центра Сибирского отделения Российской Академии наук). Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения РАН, 1999.-С. 161-182.

5. Sherbakova T.A., Rubtsov N.B., Likhoshway Ye.V., Grachev МА. Combined ultrastructural studies and PCR with individual diatom algae cells // Diatom Res. - 2000. - Vol. 15, N 2. - P. 401-406.

6. Sherbakova T.A., Likho shway Ye.V., Usoltseva M.V. Correlation of Hypotheses on the Evolution of Aulacoseira Species from Lake Baikal Based on Morphological and M olecular Genetic Evidence // Ancient Lakes: Speci-ation, Development in Time and Space, Natural History: Abstr. of the IlIrd Int. Sympos., Sept. 2-7, 2002, Irkutsk. - Novosibirsk: Nauka, 2002. - P. 160.

7. Грачев М.А., Деникина Н.Н., Беликов СИ., Лихошвай Е.В., Усольцева

М.М., Тихонова И.В., Адельшин Р.В., Клер С.А., Щербакова Т.А. Элементы активного центра белков транспорта кремневой кислоты в диатомовых водорослях // Мол. биол. - 2002. - Т. 36, № 4. - С. 1-3.

8. Лимнологический институт Основные научные результаты // Сибирское отделение Российской Академии наук в 2001 году. I. Основные научные результаты / отв. В.Д. Ермиков, В.Ю. Колобов. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2002. - С. 211-212.

Подписано в печать 11.05.04. Формат 62x84 1/16 Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,5. Уч. - изд.л. 1,33. Тираж 100 экз. Заказ 4083.

Изготовлено в Издательстве «Макаров» тел. 516-460,516-484

* - 9 О 6 О

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щербакова, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Экология видов рода Aulacoseira в оз. Байкал.

1.2. Филогенетический анализ диатомовых водорослей на основе морфологических признаков.

1.3. Пластичность морфологии в ответ на изменчивость среды

1.4. Данные об эволюции диатомовых водорослей, полученные с применением молекулярных методов.

1.5. Возможные механизмы видообразования у диатомовых водорослей.

1.6. Палеонтологические данные об эволюции видов рода

Aulacoseira в оз. Байкал.

1.7. Метода филогенетического анализа. 30 I

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Выделение суммарной клеточной ДНК.

2.3. Амплификация и секвенирование полноразмерного гена

18S рРНК.

2.4. Выбор праймеров для амплификации и секвенирования фрагмента гена Rubisco.

2.5. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.

2.6. Кладистический анализ морфологических признаков.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ

ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КЛЕТОК.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДОМИНИРУЮЩИХ В ОЗ.БАЙКАЛ ВИДОВ РОДА AULACOSEIRA.

4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерного ядерного гена малой субъединицы рРНК

4.2. Анализ последовательностей фрагмента хлоропластного гена Rubisco.

4.3. Оценка времени дивергенции видов по молекулярным данным.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ

ПРИЗНАКОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ КЛАДИСТИКИ.

ГЛАВА 6. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ЭВОЛЮЦИИ ВИДОВ РОДА

AULACOSEIRA В ОЗ. БАЙКАЛ.

6.1. Сопоставление гипотез эволюции Aulacoseira по молекулярным и морфологическим данным.

6.2. Разные стратегии выживания как возможные пути эволюции видов Aulacoseira в Байкале.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование филогенетических взаимоотношений диатомовых водорослей рода aulacoseira thwaites, доминирующих в экосистеме озера Байкал"

Озеро Байкал, как древнейший пресноводный водоем мира, является уникальным природным объектом для изучения эволюции, формирования биоразнообразия его флоры и фауны на фоне расшифрованных на сегодня палеоклиматических событий в геологической истории озера (Грачев и др., 1997; Grachev etal., 1998).

Пелагические виды диатомовых водорослей играют ведущую роль в функционировании экосистемы озера, и их эволюция была связана с освоением особых экологических ниш. В настоящее время в Байкале обитает 6 видов рода Aulacoseira, два из которых, A. baicalensis (К. Meyer) Simonsen и A. skvortzowii Edlund, Stoermer, Taylor, считаются эндемиками, именно на их долю приходится основная доля первичной продукции весеннего фитопланктона озера. Первый вид известен толстостенными высокостворчатыми панцирями с редко расположенными ареолами, что, по мнению авторов (Kilham, 1990), является приспособительным признаком к обитанию в глубоководном водоеме. В то же время, второй вид, также обитающий в пелагиали Байкала, характеризуется тонкостенным панцирем и высокой плотностью ареол на загибе створки (Genkal, Popovskaya, 1991). Особенностью его цикла развития является способность формировать споры (Скабичевский, 1953), что послужило основанием для выделения его в самостоятельный вид (Edlund, Stoermer, Taylor, 1996) из широко распространенного в водоемах Северного полушария вида A. islandica (О. Mtiller) Simonsen, который споры не образует.

Морфологическое сходство створок вегетативных клеток панарктического вида A. islandica и байкальского вида A. skvortzowii, а также A. baicalensis при прохождении весенних стадий развития (Babanazarova, Likhoshway, Sherbakov, 1996) может свидетельствовать об их генетической близости. Возможность оценки степень генетического родства дает у молекулярно-филогенетический анализ, в котором используются простые в сравнении с морфологическими признаки, слабо зависящие друг от друга, менее подверженные влиянию отбора, которые сами по себе дают большой независимый массив данных (Page, Holmes, 1999). Попытки объяснения эволюционных событий у диатомовых водорослей сопряжены с рядом проблем: морфологии строения клеток свойственен высокий внутри- и межвидовой полиморфизм; адаптивное значение многих наиболее значимых признаков структуры — неизвестно; легкость распространения диатомовых позволяет существование видов-космополитов, и, следовательно, делает маловероятным аллопатрический механизм видообразования. В связи с этим большой самостоятельный интерес представляет механизм генерации эндемичных видов и разделение их по различным экологическим нишам в пределах замкнутой экосистемы.

Актуальность темы. Знания о процессах возникновения, вымирания и филогении диатомовых водорослей до недавнего времени основывались исключительно на сопоставлении морфологических признаков строения кремниевых панцирей у современных и ископаемых видов. Исследования молекулярной эволюции предоставляют дополнительную возможность использовать полученные результаты для моделирования механизмов специализации, выработанных близкородственными таксонами при освоении различных экологических ниш.

Одним из важных элементов флоры Байкала являются диатомовые водоросли рода Aulacoseira, которые представлены как широко распространенными, так и эндемичными формами, причем последние -A. baicalensis и A. skvortzowii"являются видами, доминирующими в \ фитопланктоне и донных отложениях озера. Попытка восстановления эволюционных связей рода Aulacoseira представляет интерес как с точки зрения исследования закономерностей эволюции видов диатомовых водорослей, так и с позиции изучения этапов образования современного доминирующего в экосистеме озера Байкал комплекса видов рода Aulacoseira.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение истории формирования байкальской группы доминирующих видов рода Aulacoseira на основе сравнительного изучения изменчивости некоторых генов и морфологических признаков.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать микрометод отбора клеток одной видовой принадлежности из природных проб фитопланктона для выделения суммарной клеточной ДНК и последующего использования ее в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировании.

2. Выбрать молекулярные маркеры и праймеры для ПЦР, определить нуклеотидные последовательности амплифицированных участков ДНК, провести филогенетический анализ байкальских и внебайкальских представителей рода и оценить время их дивергенции.

3. Провести кладистический анализ признаков тонкого строения панцирей видов Aulacoseira и сопоставить полученные данные с результатами молекулярно-филогенетического анализа.

4. Проследить изменения состояний морфологических признаков в ходе эволюции рода Aulacoseira и предложить гипотезу формирования байкальской группы видов, занимающих различные экологические ниши.

Научная новизна. Впервые для диатомовых водорослей проведен молекулярно-филогенетический анализ видов внутри одного рода. Впервые показано совпадение филогенетических гипотез, основанных на генетических и морфологических данных и оценена роль признаков строения панцирей в эволюции видов рода Aulacoseira.

Теоретическая и практическая значимость. Приобретение знаний по эволюционной истории изучаемого рода, который в массе представлен как в фитопланктоне, так и в донных отложениях многих водоемов, в том числе озера Байкал, крайне важно для экологического мониторинга и построения точных палеоклиматических реконструкций. Метод отбора небольшого числа клеток из природных проб для выделения ДНК гарантированной видовой принадлежности, разработанный в ходе выполнения работы, позволяет амплифицировать различные гены и определять их последовательности. Это дает возможность исследовать разнообразие диатомовых водорослей из природных популяций, избегая трудоемкого культивирования. Пополнение банка данных последовательностей создает основу для конструирования идентификационных олигонуклеотидных проб (ДНКовых подписей), которые могут быть использованы для изучения видового разнообразия фитопланктона.

Основные защищаемые положения:

1. Преимущества разработанной методики выделения ДНК из индивидуальных клеток диатомовых водорослей или из их небольшого числа, обеспечивающей, с одной стороны, амплификацию и секвенирование ядерных и хлоропластных генов, а с другой — однозначную идентификацию ультраструктурных и иных морфологических признаков.

2. Тесное генетическое и морфологическое родство доминирующих в экосистеме озера Байкал видов рода Aulacoseira и распространенного во всем Северном полушарии вида A. islandica.

3. Информативность параллельного молекулярно-филогенетического и морфолого-кладистического анализов для верификации филогенетических гипотез.

Апробация работы. Результаты работы доложены: на V-ой Школе диатомологов стран СНГ «Диатомовые водоросли - индикаторы изменений окружающей среды и климата», 16-20 марта 1993 г. (Иркутск); на 13-ом

Международном диатомовом симпозиуме, 1-7 сентября 1994 г. (Аквафреда ди Марратея, Италия); на 3-ем Международном симпозиуме "Видообразование древних озер" (SIAL- 3), 4 - 9 сент., 2002 г. (Иркутск).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

В диссертационную работу вошли исследования, поддержанные грантами MVH000 и MVH300; INTAS 93-3604 и 93-3605-ext; РФФИ 94-0411005,97-04-50225,01-04-49470 и 01-04-48991; СО РАН 10.3.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 103 стр., состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы (181 источник, из них 126 на иностранных языках) и приложения; содержит 9 таблиц и 11 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Щербакова, Татьяна Александровна

выводы

1. Разработан основанный на микроманипуляции метод выделения суммарной ДНК из отдельных клеток диатомовых водорослей диаметром около 10 мкм, позволяющий амплифицировать фрагменты ДНК в полимеразной цепной реакции для последующего определения нуклеотидных последовательностей. Метод предоставил новую возможность молекулярно-филогенетического исследования диатомовых водорослей из природных популяций и анализа строения панцирей тех же индивидуальных клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии.

2. Определены последовательности полноразмерного ядерного гена 18S рРНК и фрагмента хлоропластного гена Rubisco для нескольких видов рода: распространенных в Северном полушарии A. islandica и A. subarctica, эндемика озера Малави (Восточная Африка) A. nyassensis, A. baicalensis и A. skvortzowii из пелагиали озера Байкал, а также A. islandica из Чивыркуйского залива озера.

3. Молекулярно-филогенетический анализ показал, что род Aulacoseira монофилетичен, и эндемичный байкальский вид A. baicalensis, спорообразующие A. skvortzowii из пелагиали озера Байкал и A. islandica из его Чивыркуйского залива образуют единую "байкальско-исландскую" кладу с A. islandica из озера Виннипег (Канада), которая споры не образует. Эта клада объединяет генетически различающихся родственных представителей, дивергенция которой от других видов рода произошла в позднем миоцене - раннем плиоцене.

4. Впервые для диатомовых водорослей показано, что кладограмма видов Aulacoseira, построенная методом максимальной экономии по морфологическим признакам, согласуется с молекулярно-филогенетической гипотезой их эволюции.

5. Путем картирования признаков тонкого строения панцирей на морфологической кладограмме выявлены синапоморфии "байкальско-исландской" клады - по локализации и строению двугубого выроста, строению велума и форме створок. Специализация отдельных представителей этой клады связана с гомопластичным признаком -образованием покоящихся стадий. Выявленные признаки являлись ключевыми при освоении исследованными видами различных экологических ниш.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щербакова, Татьяна Александровна, Иркутск

1. Наука/Интерпериодика, 2000. 135 с. Баринова С.С., Медведева JI.A. Атлас водорослей - индикаторов сапробности.- Владивосток, 1996. 364 с.

2. Bacillariophyta) // Бот. журн. 1991. - Т. 76, № 2. - С. 292-293. Глезер З.И. Таксономическая значимость признаков у диатомовых водорослей в свете разработанной новой классификации Bacillariophyta // Бот. журн.- 1983. Т. 68, № 8. - С. 993-1001.

3. Гольдберг Е.Л., Грачев М.А., Эджингтон Д.Н., Навье Ж., Андре Л., Чебыкин Е.П., Шульняков И.О. Прямая уран-ториевая датировка двух последнихмежледниковий в осадках озера Байкал // Докл. РАН. 2001. - Т. 380, № 6.-С. 805-808.

4. Гросвальд М. Г. Покровные ледники континентальных шельфов. М.: Наука, 1983.-216 с.

5. Жузе А.П. К истории диатомовой флоры озера Ханка. Мат-лы по геоморфологии и палеогеографии СССР // Тр. Ин-та географии. 1952а. - Вып. 51, №6.-С. 226-252.

6. Жузе А.П. Диатомовые водоросли в отложениях четвертичного возраста // Мат-лы по четвертичному периоду СССР. Москва: Наука, 19526. - С. 99-112.

7. Кайгородова И.А. Молекулярно-филогенетическое исследование эволюционной истории байкальских люмбрикулид (Oligochaeta, Annelida) // Дис. . канд. биол. наук. Иркутск, 2000. - 127 с.

8. Кирильчик С. В. Молекулярная эволюция митохондриального гена цитохрома Ъ коттоидных рыб озера Байкал: филогенетическая реконструкция // Дис. . канд. биол. наук. — Иркутск, 1998. — 87 с.

9. Кирильчик С.В., Слободянюк С.Я. Эволюция фрагмента гена цитохрома Ъ митохондриальной ДНК некоторых байкальских и внебайкальских видов подкаменщиковых рыб // Мол. биол. 1997. - Т.31, № 1. - С. 168175.

10. Кожова О.М. О периодических изменениях в развитии фитопланктона оз. Байкал (в районе пос. Лиственичное станц. Танхой - бухта Песчаная) // Тр. Всесоюз. гидробиол. о-ва / отв. ред. Л.А. Зенкевич. - М.: Изд-во АН СССР, 1961. - Т. 2. - С. 28-43.

11. Коллектив участников проекта "Байкал-бурение". Непрерывная запись климатических изменений в отложениях озера Байкал за последние 5 миллионов лет // Геология и геофизика. 1998. - V. 39, № 2. - С. 139-156.

12. Коллектив участников проекта "Байкал-бурение". Позднекайназойская палеоклиматическая запись в осадках озера Байкал (по результатам исследования 600-метрового керна глубокого бурения) // Геология и геофизика. 2000. - Т. 41, № 1. - С. 3-32.

13. Лимнологический институт. Основные научные результаты // Сибирское отделение Российской Академии наук в 2001 году. I. Основные научныерезультаты / отв. В.Д. Ермиков, В.Ю. Колобов. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2002.-С. 211-212.

14. Лихошвай Е.В., Помазкина Г.В., Никитеева Т.А. Центрические диатомовые водоросли из миоценовых отложений Байкальской рифтовой зоны (Тункинская котловина) // Геология и геофизика. 1997. - Т. 38, № 9. - С. 1445-1452.

15. Лихошвай Е.В., Усольцева М.В., Поповская Г.И., Воробьева С.С., Никулина Т.В. Споры Aulacoseira (Bacillariophyta) из современных водоемов и осадков разного возраста // Бот. журн. 2004. - Т. 89, № 1. - С. 60-71.

16. Логинова Л.П. Палеография Лихвинского межледниковья Средней полосы Восточно-Европейской равнины. Минск: Наука и техника, 1979. - 137 с.

17. Лунд Д. В. Значение турбулентности вод в периодичности развития некоторых пресноводных видов рода Melosira (Algae) // Бот. журн. 1966. — Т. 51, №2.-С. 176- 187.

18. Лупикина Е.Г., Озорнина С.П. Новый род Aulacoseira (Thw.) Sim. (Bacillariophyta) из эуплейстоценовых отложений Центральной Камчатки. Альгология. - 1992. - Т. 2, № 2. - С. 102-105.

19. Макарова И.В. Классификация диатомовых водорослей на современном этапе и проблема построения их филогенетической системы // Бот. журн. -1986. Т. 71, № 6. - С. 713-722.

20. Мац В.Д., Уфимцев Г.Ф., Мандельбаум М.М. Кайнозой байкальской рифтовой впадины. Строение и геологическая история. Новосибирск: Изд-во СО РАН, филиал ГЕО, 2001.-251 с.

21. Мейер К.И. Введение во флору водорослей озера Байкал // Бюлл. Моск. о-ва испыт. природы. Отд. биол. 1930. - Т. 39, № 3-4. - С. 179-396.

22. Моисеева А.И. Атлас неогеновых диатомовых водорослей Приморского края. -Л.: Наука, 1971.- 152 с.

23. Николаев В.А. О значении строения ареол для таксономии диатомовых водорослей (BACILLARIOPHYTA). Бот. журн. - 1984а. - Т. 69, № 8. -С. 1040-1046.

24. Николаев В.А. К построению системы центрических диатомовых водорослей (BACILLARIOPHYTA). Бот. журн. - 19846. - Т. 69, № 11. - С. 14681474.

25. Николаев В.А., Харвуд Д.М., Самсонов Н.И. Диатомовые водоросли раннего мела. СПб.: Наука, 2001. -76 с.

26. Поповская Г.И. Сезонные и годовые изменения фитопланктона в Чивыркуйском заливе Байкала // Гидробиол. журн. 1973. - Т. 9, № 5. -С. 5-10.

27. Поповская Г.И. Фитопланктон озерно-соровой зоны // Лимнология прибрежно-соровой зоны Байкала / отв. ред. Н.А. Флоренцев. -Новосибирск: Наука, 1977. С. 156-175.

28. Поповская Г.И. Фитопланктон глубочайшего озера мира // Труды Зоол. ин-та АН СССР. 1987. - Т. 172. - С. 107-115.

29. Поповская Г.И. Фитопланктон Байкала и его многолетние изменения (19581990): Докл. дис. . д-ра биол. наук. Новосибирск, 1991. - 32 с.

30. Поповская Г.И., Скабичевский А.П. К морфологии и систематике Melosira baicalensis (С. Meyer) Wisl. Новости систематики низших растений. -1970.-№7.-С. 12-13.

31. Поповская Г.И., Генкал С.И., Лихошвай Е.В. Диатомовые водоросли планктона Байкала. Атлас-определитель. Новосибирск: Наука, 2002. -168 с.

32. Порецкий B.C. "Загадка" Петрозаводского морского постплиоцена Р.А.

33. Воллосовича// Изв. Гос. геогр. о-ва. 1939. - Т. 71, № 5. - С. 690-695. Прошкина-Лавренко А.И. О таксономии диатомовых водорослей

34. Черемисинова Е.А. Диатомовая флора неогеновых отложений Прибайкалья. -Новосибирск: Наука, 1973. 68 с.

35. Черняева Г.П., Шимараева М.К., Лазо Ф.И., Мац В.Д., Климанова В.М. Комплексное исследование трехсотметрового разреза озерных отложений Тункинской впадины // Мат-лы докл. к VI Всесоюз. лимнол. совещ. Иркутск, 1985. - Вып. V. - С. 74-75.

36. Armbrust E. V. Identification of a new gene family expressed during the onset of sexual reproduction in centric diatom Thallassiosira weisflogii II Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. - P. 3121-3128.

37. Armbrust E.V., Galindo H.M. Rapid evolution of a sexual reproduction gene incentric diatoms of the genus Thallassiosira II Appl. Environ. Microbiol. -2001.-Vol. 67.-P. 3501-3513.

38. Babanazarova O.V., Likhoshway Ye.V., Sherbakov D.Yu. On the morphological variability of Aulacoseira baicalensis and Aulacoseira islandica (Bacillariophyta) of Lake Baikal, Russia // Phycologia. 1996. - Vol. 35, N 2. -P. 113-123.

39. Bakker F.T., Olsen J.L., Stam W.T. Evolution of nuclear rDNA ITS sequences in the Cladophora albida/sericea clade (Clorophyta) // J. Mol. Evol. 1995. — Vol. 40.-P. 640-651.

40. Bailey-Watts A.E. Studies on the control of the early spring diatom maximum in Loch Leven 1981 // Algae and the Aquatic Environment / Ed. by F.E. Round. -Bristol: Biopress, 1988b.-P. 53-87.

41. BDP-93 Baikal Drilling Project Members. Preliminary results of the first scientific drilling on Lake Baikal, Buguldeika Site, Southeastern Siberia // Quatern. Int. 1997.-Vol.37.-P. 3-17.

42. Bhattacharya D., Medlin L.K. Algae containing a + с chlorophylls are paraphyletic: molecular evolutionary analysis of the Chromophyta // Evolution. 1992. — Vol. 46.-P. 1801-1817.

43. Bradbury J.P. The late Cenozoic diatom stratigraphy and paleolimnology of Tule Lake, Siskiyou Co. California // J. Paleolimnol. 1991. - Vol. 6. - P. 205-255.

44. Bradbury J.P., Bezrukova Ye.V., Chernyaeva G.P., Colman S.M., Khursevich G.K., King J.W., Likhoshway Ye.V. A synthesis of post-glacial diatom records from Lake Baikal // J. Paleolimnol. 1994. - Vol. 10. - P. 213-252.

45. Chepurnov V.A., Mann D.G. Variation in sexual behaviour of natural clones of Achnanthes longipes (Bacillariophyta) // Eur. J. Phycol. 1997. - Vol. 32. -P. 147-154.

46. Coyer J., Smith G., Andersen R. Evolution of Mycrocystis spp. (Phaeophyceae) as determined by ITS1 and ITS2 sequences // J. Phycol. 2001. - Vol. 37. - P. 574-585.

47. Daugbjerg N., Andersen R. A molecular phylogeny of the heterocont algae based on analysis of the chloroplast-encoded rbcL sequence data // J. Phycol. 1997. -Vol. 33. - P. 1031-1041.

48. Destombe C., Douglas S.E. Rubisco spacer sequence in the rhodophyte alga Gracilaria verrucosa and closely related species // Curr. Genet. — 1991. Vol. 19.-P. 395-398.

49. Destombe C., Douglas S.E. Rubisco spacer sequence divergence in the rhodophyte alga Gracilaria verrucosa and closely related species // Curr. Genet. 1992. — Vol. 22.-P. 173-178.

50. Devos N., Ingouff M., Loppes R., Matagne R. Rubisco adaptation to low temperatures: a comparative study in psychrophilic and mesophilic unicellular algae // J. Phycol. 1998. - Vol. 34. - P. 655-660.

51. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. 1990. — Vol. 12.-P. 13-15.

52. Droop S.J.M., Mann D.G., Lokhorst G.M. Spatial and temporal stability of demes in Diploneis smithii / D. fusca (Bacillariophyta) supports a narrow species concept // Phycologia. 2000. - Vol. 39. - P. 527-546.

53. Edlund M.B., Stoermer E.F., Taylor C.M. Aulacoseira skvortzowii sp. nov. (Bacillariophyta), poorly understood diatom from Lake Baikal, Russia // J. Phycol. 1996. - Vol. 32. - P. 165-175.

54. Ellis RJ. The most abundant protein in the world // Trends Biochem. Sci. 1979. -Vol. 4.-P. 241-244.

55. Elwood H.J., Olsen G.J., Sogin M.L. The small-subunit ribosomal RNA gene sequences from the hypotrichous ciliates Oxytrichia nova and Stylonichia pustulata И Mol. Biol. Evol. 1985. - Vol. 2. - P. 399 -^10.

56. Felsenstein J. Cases in which parsimony or compatibility methods will be positivelymisleading//Syst. Zool. 1978.-Vol. 19.-P. 401-410.

57. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: A maximum-likelihood approach //J. Mol. Evol. 1981. - Vol. 17. - P. 368-376.

58. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using bootstrap // Evolution. 1985. - Vol. 39. -P. 787-791.

59. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Department of Genetics. University of Washington. Seattle. 1993.

60. Fryxell GA. Planktonic marine diatom winter stages: Antarctic alternatives to resting spores // Proc. of the 11th Int. Diatom Sympos. / Ed. By P. Kociolek. — San Francisco: California Academy of Sciences, 1994. P. 437-448.

61. Gallagher J.C. Population genetics of Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) in Narragansett Bay I I J. Phycol. 1980. - Vol. 16. - P. 464- 474.

62. Gallagher J.C. Physiological variation and electrophoretic banding patterns of genetically different seasonal populations of Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) // J. Phycol. 1982. - Vol. 18. - P. 148-162.

63. Gallagher J.C., Alberte R.S. Photosynthetic and cellular photoadaptive characteristics of three ecotypes of the marine diatom Skeletonema costatum (Grev.) Cleve // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1985. - Vol. 94. - P. 233-250.

64. Genkal S.I., Popovskaya G.I. New data on the frustule morphology of Aulacoseira islandica (Bacillariophyta) // Diatom Res. 1991. - Vol. 6. - P. 255-266.

65. Hasle G.R. Morphology and taxonomy of Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) //Norw. J. Bot. 1973. - Vol. 20. - P. 109-137.

66. Hasle G.R. The "musculage pore" of pennate diatoms // Nowa Hedwigia. 1974. -Beih. 45.-P. 167-186.

67. Hasle G.R., Syvertsen E.E. Marine diatoms // Identifying Marine Diatoms and Dinoflagellates / Ed. By C.R. Tomas. London: Academic Press, 1996. - P. 5-385.

68. Hasle G.R., Lange C.B., Syvertsen E.E. A review of Pseudo-nitzschia, with a special reference to the Skagerrak, North Atlantic, and adjaicent waters // Helgolaender Meeresunersuchungen. 1996. - Vol. 50. - P. 131-175.

69. Haworth E. Distribution of diatom taxa of the old genus Melosira (now mainly Aulacoseira) in Cumbrian waters // Algae and the aquatic environment / Ed. by F.E. Round. Bristol: Biopress, 1988. - P. 138-167.

70. Heribaud J. Les Diatomees Fossiles D'Auvergne, 2 nd Mem. Paris: Librairie des Sciences Naturelles, 1903. - P. 52-95.

71. Huss V.A., Sogin M.L. Phylogenetic position of some Chlorella species within the Chlorococcales based upon complete small-subunit ribosomal RNA sequences I I J. Mol. Evol. 1991. - Vol. 31. - P. 432-442.

72. Jouse A.P., Mukhina V.V. Diatom units and the paleogeography of the Black sea in the late Cenozoic // Initial reports of the Deep Sea Drilling Project. 1975. -V. XLII, Part. 2. - P. 903-945.

73. Kaufman L., Chapman L., Chapman C. Evolution in fast forward: haplochromine fishes in Lake Victoria region // Endeavour. 1997. - Vol. 21. - P. 23-30.

74. Khursevich G.K. Evolution and Phylogeny of some diatom Genera of the class Centrophyceae // Proc. of 11th Int. Diatom Sympos. / Ed. by P. Kociolek. -San Fracisco: California Academy of Sciences, 1994. P. 257-267.

75. Kilham P. Ecology of Melosira species in the Great Lakes of Africa // Large Lakes. Ecological Structure and Function / Ed. by M.M. Tilzer, C. Serruya. Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong: Springer-Verlag, 1990.-P. 414-427.

76. Kimura M. The neutral theory of molecular evolution. Cambridge: Cambridge University Press, 1983.

77. Kling H.J. Valve determination in Stephanodiscus hantzschii Grunow (Bacillariophyceae) and its implications on species identification // Diatom Res. 1992. - Vol. 7. - P. 241-257.

78. Kooistra W.H.C.F., Medlin L.K. Evolution of the Diatoms (Bacillariophyta). IV. Reconstruction of their age from ssu f RNA coding regions and the fossil records // Mol. Phylog. Evol. 1996. - Vol. 6. - P. 391-407.

79. Krammer K., Lange-Bertalot H. Bacillariophyceae . Jena: VEB Gustav Fischer Verlag, 1991. - Band 2, Teil 3: Centrales, Fragilariaceae, Eunotiaceae. - S. 1940, 232-337, 262-305.

80. Krebs W.N. The biochronology of freshwater planktonic diatom communities in Western North America // Proc. of the 11th Int. Diatom Sympos. / Ed. by P. Kociolek. San Francisco: California Academy of Sciences, 1994. - P. 485499.

81. W.-H. Molecular evolution. USA Sunderland Massachusetts: Sinauer Associates Inc. Publishers, 1997. - 487 p.

82. H.H., Gyllensten U.B., Cui X.F., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.

83. McQuoid M. R., Hobson L. A. Review. Diatom resting stages // J. Phycol. 1996. -Vol. 32. - P. 889-902.

84. Maddison W.P., Maddison L.R. McClade: Analysis of phylogeny and character evolution. Version 3. Sinauer Association, Sunderland, Massachusetts, 1993.

85. Maggs C., Douglas S., Fenety J., Bird C. A molecular and morphological analysis of the Gimnogongurs devoniensis (Rodophyta) complex in the North Atlantic // J. Phycol. 1992. - Vol. 28. - P. 214-232.

86. Mann D.G. The nature of diatom species: analysis of sympatric populations. // Proc. of the 9th Int. Diatom Sympos. / Ed. by F.E. Round. Koeningstein and Bristol: Koeltz Biopress, 1988. - P. 293-304.

87. Mann D.G. The species concept in diatoms: evidence for morphology distinct, sympatric gamodemes in four epipelic species // Plant Systematics and evolution. 1989. - Vol. 164. - P. 215-237.

88. Mann D.G. Phycological Reviews 18: The species concept in diatoms // Phycologia. 1999. - Vol. 38. - P. 437-495.

89. Mann D.G., Droop S.J.M. Biodiversity, biogeography and conservation of diatoms // Hydrobiologia. 1996. - Vol. 336. - P. 19-32.

90. Mann D.G., Chepurnov V.A., Droop S.J.M. Sexuality, incompatibility, size variation, and preferential polyandry in natural populations and clones of Sellaphora pupula (Bacillariophyceae) // J. Phycol. 1999. - Vol. 35. - P. 152-170.

91. Marks J., Cummings M. DNA sequence variation in the ribosomal DNA internal transcribed spacer region of freshwater Cladophora species (Chlorophyta) // J. Phycol. 1996.-Vol. 32.-P. 1035-1042.

92. Martin A.P., Palumbi S.R. Body size, metabolic rate, generation time and molecular clock II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 94. - P. 4087-4091.

93. Medlin L., Crawford R., Andersen R. Histochemical and ultrastructurral evidence for the function of the labiate process in the movement of centric diatoms // British Phycol. J. 1986. - Vol. 21. - P. 297-301.

94. Medlin L.K., Williams D., Sims P. Evolution of the diatoms (Bacillariophyta). I. Origin of the group and assessment of the monophyly of its major divisions // Eur. J. Phycol. 1993. - Vol. 23. - P. 261-275.

95. Medlin L.K., Elwood H.J., Stickel S., Sogin M. Morphological and genetic variation within the diatom Skeletonema costatum (Bacillariophyta): evidence for a new species, Skeletonema pseudocostatum II J. Phycol. — 1991. Vol. 27. - P. 514-524.

96. Medlin L.K., Kooistra W., Gresonde R., Wellbroc U., Crawford R.M. The polyphyletic origin of the centric // // Abstr. 13th Int. Diatom Sympos., Sept. 1-7, 1994, Acquafredda di Maratea, Italy. Naples: Stazione Zoologica Anton Dohrn, 1994. - P. 64.

97. Medlin L.K., Kooistra W., Gresonde R., Wellbroc U. Evolution of the diatoms (Bacillariophyta). III. Molecular evidence for the origin of the Talassiosirales // Nova Hegwiga. 1996b. - Vol. 112. - P. 221-234.

98. Medlin L.K., Kooistra W., Gresonde R., Wellbroc U. Is the origin of the diatoms related to the end Permian mass extinction? // Nowa Hedwigia. 1997. - Vol. 65.-P. 1-11.

99. Medlin L.K., Lange M., Barker G., Hayes P. Can molecular techniques change ourideas about species concept? // Molecular ecology of aquatic microbionts / Ed. by I. Joint. Berlin: Springer-Verlag, 1995. - P. 133-152.

100. Meyer A. Phylogenetic relationships and evolutionary processes in African cichlids II Trends Ecol. Evol. 1993. - Vol. 8. - P. 279-284.

101. Miller P., Scholin C. Identification and enumeration of cultured and wild Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNA-targeted fluorescent probes and filter-based whole cellhybridization // J. Phycol. -1998.-Vol. 37.-P. 371-382.

102. Morgenshtern B. DIALIGN 2: improvement of the segment-to-segment approach to multiple sequence alignment // Bioinformatics. 1999. - Vol. 15. - P. 211218.

103. Morton B.R., Sorhannus U., Fox M. Codon adaptation and synonymous substitution rate in diatom plastid genes II Mol. Phylog. Evol. 2002. - Vol. 24. - P. 1-9.

104. Mtiller O. Pleomorphismus Auxosporen und Dauersporen bei Melosira-Arten // Jahrbucher ftir wissenschaftliche Botanik. 1906. - Bd. 43. - S. 49-88.

105. Murphy L.S., Guillard R.R.L. Biochemical taxonomy of marine phytoplankton by electrophoresis of enzymes. I. The centric diatoms Thalassiosira pseudonana and T. flaviatilis II J. Phycol. 1976. - Vol. 12. - P. 9-13.

106. Nei M. Molecular evolution genetics. — New-York: Columbia University Press, 1987.-512 p.

107. Nikolaev V.A., Harwood D.M. New process, genus and family of Lower Cretaceous diatoms from Australia // Diatom Res. 1997. - Vol. 12, N 1. - P. 43-53.

108. Ohta T. An examination of the generation-time effect on molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 10676-10680.

109. Ohta T. Synonymous and nonsynonymous substitutions in mammalian genes and nearly neutral theory // J. Mol. Evol. 1995. - Vol. 40. -P. 56-63.

110. Paasche H., Johansson S.D.L. An effect of osmotic pressure on the valve morphology of the diatom Skeletonema subsalsum (Cleve-Euler) Bethge // Phycologia. 1975. - Vol. 14. - P. 205-211.

111. Page R.D.M. TreeView. Version 1 .Ob. Division of Environmental and Evolutionary Bology. Inst. Biomedical and Life Sci. University Glasgow, UK. 1996.

112. Page R.D.M., Holmes E.C. Molecular evolution. A phylogenetic approach. — Blackwell Science. 1999. - 346 pp.

113. Pickett-Heaps J.D., Hill D., Weatherbee R. Cellular movement in the centric diatom Odontella И J. Phycol. 1986. - Vol. 22. - P. 334-339.

114. Ross R., Sims P.A. The fine structure of the frustule in centric diatoms: a suggested terminology // British phycological journal. 1972. - Vol. 7. - P. 139 -163.

115. Round F.E. What characters define diatom genera, species and infraspecific taxa? // Diatom Res. 1996. - Vol. 11, N 1. - P. 203-218.

116. Round F.E., Crawford R.M., Mann D.G. The Diatoms. Biology and morphology of the genera. Cambrige: Cambrige University Press, 1990. - 747 p.

117. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. - Vol. 4. - P. 406-425.

118. Schmid A.M.M. Aspects of morphogenesis and function of diatom cell walls with implications for taxonomy // Protoplasma. 1994. - Vol. 181. - P. 43-60.

119. Schmidt H.A., Strimmer K., Vingron M., von Haeseler A.TREE-PUZZLE: maximum likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing // Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - P. 502-504.

120. Sherbakova T.A. Genetic approach to the taxonomy of Baikalian algae // Abstr. 13th Int. Diatom Sympos., Sept. 1-7, 1994, Acquafredda di Maratea, Italy. -Naples: Stazione Zoologica Anton Dohrn, 1994. P. 70.

121. Sherbakova T.A., Likhoshway Ye.V., Usoltseva M.V. Correlation of Hypotheses on the Evolution of Aulacoseira Species from Lake Baikal Based on

122. Morphological and Molecular Genetic Evidence // Hydrobiology. 2004. - in press.

123. Sherbakova T.A., Rubtsov N.B., Likhoshway Ye.V., Grachev M.A. Combined SEM ultrastructured studies and PCR with individual diatom cells // Diatom Res., 2000.-Vol. 115.-P. 349-354.

124. Simonsen R. Ideas for more natural system of the centric diatoms // Beih. Nova Hedwigia. 1972. -H. 39. - P. 37-54.

125. Simonsen R. The Diatom System: Ideas on Phylogeny // Bacillaria. 1979. - Vol. 2. -P. 9-71.

126. Siver P.A., Kling H. Morphological observations of Aulacoseira using scanning electron microscopy // Can. J. Bot. 1997. - Vol. 75. - P. 1807-1835.

127. Skvortzow B.W. Bottom diatoms from Olhon gate of Baikal Lake, Siberia // Philipp. J. Sci. 1937. - Vol. 62, N 3. - P. 293-377.

128. Skvortzow B. W., Meyer K.I. A contribution to the Diatoms of Baikal lake // Proc. of the Sunaree River Biol. Station. 1928. - Vol. 1, N 5. - P. 1-55.

129. Smetacek V.S. Role of sinking in diatom life-history cycles: ecological, evolutionary, and geological significance // Mar. Biol. (Berl.). 1985. - Vol. 84.-P. 239-251.

130. Sorhannus U. Higher ribosomal RNA substitution rates in Bacillariophyceae and Dasycladales than in Mollusca, Echinoderrmata, and Actinistia-Tetrapoda // Mol. Biol. Evol.- 1996.-Vol. 13.-P. 1032-1038.

131. Sorhannus U., Fox M. Synonymous and nonsynonymous substitution rates in diatoms: a comparison between chloroplast and nuclear genes // J. Mol. Evol. 1999. - Vol. 48. - P. 209-212.

132. Sorhannus U., Ga'sse F., Perasso R., Tourancheau B. A preliminary phylogeny of diatoms based on 28S ribosomal RNA sequence data // Phycologia. 1995. -Vol. 34.-P. 65-73.

133. Sorenson M.D. TreeRot // Museum of Zoology, University of Michigan, Ann Arbor, 1996.

134. Soudek D., Robinson G. Electrophoretic analysis of the species and populationstructure of Asterionella formosa II Can. J. Bot. 1983. - Vol. 61. - P. 418433.

135. Stache-Crain В., Miiller D., Goff L. Molecular systematics of Ectocarpus and Kuckuckia (Ectocarpales, Phaeophyceae) inferred from phylogenetic analysis of nuclear- and plastid-encoded DNA sequences I I J. Phycol. 1997. - Vol. 33.-P. 152-168.

136. Stoermer E.F., Kreis R.G., Sisco-Goad L. A systematic, quantitative and ecological comparison of Melosira islandica O. Miill. with M. granulata (Ehr.) Ralfs from the Laurentian Great Lakes // J. Great Lakes Res. 1981. - Vol. 7. - P. 345-356.

137. Swofford D. L. PAUP. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and other methods). Version 4. Sinauer Associates. Sunderland, Massachusetts. 1998.

138. Syvertsen E.E. Thalassiosira rotula and T. gravida: ecology and morphology // NovaHedwigia.- 1977.-B. 54.-P. 99-112.

139. Theriot E. Clusters, species concepts and morphological evolution of diatoms // System. Biol. 1992. - Vol. 41. - P. 141-157.

140. Theriot E., Stoermer E. Principal component analysis of Stephanodiscus: observations on two new species from the S. niagarae complex // Bacillaria. -1984.-Vol. 7.-P. 37-58.

141. Valentin K., Zetsche K. Structure of Rubisco operon from the unicellular red alga Cyanidium caldarium: evidence for a polyphyletic origin of plastids // Mol. Gen. Genet. 1990. - Vol. 222. - P. 425-430.

142. Van de Peer Y., Neefs J-M., De Rijk P., De Wachter R. Reconstracting evolution from eukariotic small-ribosomal-subunit RNA sequences: calibrating of the molecular clock II J. Mol. Evol. 1993. - Vol. 37. - P. 221-232.

143. Villareal T.A., Fryxell G.A. The diatom genus Porosira Jorg.: cingulum patterns and resting spore morphology // Bot. Mar. 1990. - Vol. 33. - P. 415-422.

144. Vis M.L., Sheath R.G. A molecular and morphological investigation of the relationship between Batrachospermum gelatinosum and B. spermatoinvolucrum (Batrachopspermales, Rhodophyta) // Eur. J. Phycol. -1998. Vol. 33. - P. 231-239.

145. Vis M.L., Miller E.J., Hall M.M. Biogeographical analyses of Batrachospermum helmintosum (Batrachopspermales, Rhodophyta) in North America using molecular and morphological data // Phycologia. — 2001. Vol. 40. - P. 2-9.

146. Wood M., Leatham T. The species concept in the phytoplankton ecology // J. Phycol. 1992. - Vol. 28. - P. 723-729.

147. Wood A., Lange R., Fryxell G. Quantitative genetic analysis of morphological variation in an Antarctic diatom grown at two light intensities // J. Phycol. -1987.-Vol. 23.-P. 42-54.

148. Zechman F., Zimmer E., Theriot E. Use of ribosomal DNA internal transcribed spacers for phylogenetic studies in diatoms // J. Phycol. 1994. - Vol. 30. -P. 507-512.

149. Zuckerkandl E., Pauling L. Evolutionary divergence and convergence in proteins // Evolving Genes and Proteins / Ed. by V. Bryson, H.J. Vogel. — New-York: Academic Press, 1965. P. 97-166.