Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ МЕТАНОТРОФОВ, КАТАЛИЗИРУЮЩЕЙ ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНОЛА И ФОРМИАТА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ МЕТАНОТРОФОВ, КАТАЛИЗИРУЮЩЕЙ ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНОЛА И ФОРМИАТА"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ НИКРОБИОЛОГШ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д. К. ЗАБОЯОТНОГО

На правах рукописи

ВОДОШНА ЕЛЕНА СЕМШОВНА

ИООВДКШНИЕ ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕШ МЕТАНОТРОФС®, КАТАЛИЗКРЛЩЙ ОКИСЛЕНИЕ МБШЮДА И ФОЙКАТА

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия.

Автореферат диссертации на соискание учеиоК степени кандидата биологических наук

Киев — 1992

Работа выполнена в лаборатории кинетика ферментативного катализа Отделения Института химической физики АН СССР (г.Ыосква)

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Г.И.ЛИШЖГГЕЙН

кандидат биологических наук р.и.гвоодав

доктор биологических наук В.К.КИШРЕВ

кандидат биологических наук И.Н.ПАВЖША

Ведущая организация;

Зенита состоится

Киевский Государственный университет

1992 года в

часов

аа заседании специализированного совета Д 016.06.01 по защита диосертащЕй на соиокание ученой степени доктора наук при Институте шкробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН Украины (25214Э, г.Киев, ул.Зайолотного, 154. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН Украшш)

С дксоертащай можно ознакомиться в библиотеке Института шкробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН Украины

Автореферат разослан 1992

года

Ученый секретарь специализированного совета, _

кандидат биологических наук с^/с^ А, — Э.А.Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ДРОЕДЕШ. В последние годы во многих лабораториях мира значительно интенсифицировались исследования различных аспектов метаболизма метанотрофных микроорганизмов. Необходимость таких исследование определяется широкими возможностями использования этих микроорганизмов в качестве продуцентов кормового белка, витаминов, ферментов, нуклеиновых кислот. В течение .года на земном шаре образуется примерно I млрд. тонн метана. Большая его часть (около 80-90?J потребляется метано-трофами. Однако набладается тенденция к повышению концентрации метана в атмосфере. Исследование метанотрофов, которые являются уникальными природными биокаталитическими системами, окисляющими метан, вероятно, поможет в будущем научиться контролировать этот процесс.

Окисление метана до углекислого гаэа у метанотрофов проходит последовательно через метанол, формальдегид и формиат, Каж-»дая стадия катализируется отдельным ферментом. Исследование физико-химических и каталитических функций этих ферментов, проведенное современными методами, представляет научный и практический интерес. В литературе имеются сведения о проведения таких исследований на гомогенных препаратах метандоноокоегекавы Walton et ai., 1905/. Шла очищена метанолдепадрогекаэа некоторых штаюлов метанотрсфшх бактерий. Описаны свойства этого фермента, определена его локализация в клетке / Anthony, 1962/. Исследование формиатдегидрогслазы метанотрофных бактерий проводилось на бесклеточных препаратах, так как все попытки очистить фермент не приводили к ожидаемому результату из-за крайне высокой лабильности фермента /Родионов, 1981/.

ЦЕПЬ Ц ЗАДАЗД РАБОТЫ. Целью наших исследований было получение высокоочишенных препаратов метанол— и формиатдвгидрогша— зы матанотрсфшх бактерий Methjlococcua oapeulatue (штамм И), научение структуры и каталитических функций этих ферментов.

В соответствии о целью были поставлены следующие задачи:.

- получить шсокоочиЩенные препараты метанол- и формиатде-. гидрогенаэы;

- определить кинетические и термодинамические параметры реакции окисления метанола;

- исследовать строение каталитического центра метаяолде-гидрогеназц; „т^" 3 О'г'í/4"

Централ ^ .■■; л .■*

- разработать способа кристаллизации ыетанолдегидрогеназы х определить основные параметры элементарной ячейки монокристалла этого фермента;

- определить каталитические свойства формиатдегидрогеназы.

НА ЗАЖГУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУШИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Способ получения высокоочяценных препаратов ыетанол-И формиатдегидрогеназы Ке«1у1ососсиа сарвц1а1иа {шТЭШ М).

2. Физико-химические особенности метанол- и формиатдегид-рогенази метанотрофных бактерий Ио^угососсия сарвц1агиа (штамп М)

3. Термодинамические характеристики стадии активации фермент-субстратного комплекса реакции окисления метанола, — - _

4. Способ получения кристаллов метанолдегидрогеназы би-пкрамидальной и палочковидеюй формы, а также свойства элементарной ячейки монокристалла ыетанолдегидрогеназы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА, 1 Впервые получены гомогенные препараты ттанол- и формиатдегидрогеназы иетанотрсфшх бактерий Мвгьу1си. оосси« сареи!аЬиа (штвИ! М)•

Впервые получены две формы кристаллов метанодцехидрогеказы.

Определены параметры элементарной ячейки кристаллической кетанолдегидрогенаэы,

Показано, что кофактор метанедцегвдроганазы Ме№у1ососсие оарви!агив (штамм м) относится к семихинонам и расположен внутри белковой глобулы на глубине 18 X.

Изучена субстратная специфичность и подучены основные кинетические параметры метмолдегидрогэназы и формиатдегидрогеназы Н«1Ьу1осовси* сар«и1а1ив .(штамм М).

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗН^РЩЕ РАВОТК, Результаты настоящей-работы. _ могут быть использованы дня промышленного получения метанол- и форшатдегидрогенаэы как биокатализаторов процессов синтеза • продуктов окислении углеводородов, дня составления системы ферментов регенерации НАДН. Исследовании свойств метанол- и формиатдегидрогеназы могут быть использованы при разработке алкобио-сенооров на основе сухой химии,.аналитическом определении спиртов а ашквчного азота в полевых и лабораторных условиях в учреждениях здравоохранения и медицинской промышленности, а также дня определения минимальных концентраций ашшака, метанола, формальдегида и формиата в сточных водах предприятий химической пршыпленнооти о целью сохранения окружащей среда от вредного воздействия этих веществ.

/ЦРОБАШЯ РАБОТЫ. Основные материалы работа была доложены на Конференции молодых ученых Института биохимии им. А.Н.Баха All СССР (Москва, 1983), 4-ом Украинском биохимическом съезде (Львов, 1982), Конференции молодых ученик ОИХФ АН СССР (Черноголовка, 1982), 4-ом Международном симпозиуме по гомогенному катализу (Лишнград, 1984), 7-ом съезде Украинского Микробиологического ойцества (Черновцы, 1988).

ПУБМКДШЦ. По результатам исследований опубликовано 7 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЬМ ЖССЕРТАшда, Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), описания методов исследования, 3-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов к выводов. Работа изложена па 139 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы включает 159 наименование.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовалась облигатная метанокислякщая культура Меthylo coccus eapeulatue (штаьм М) , ЛОЛучеННаЯ ИЗ ВНИИСИН-тезбелок.Биомассу наращивали в условиях непрерывного культивирования в ферментерах объемом 40 л на минеральной среде Д1аяа-шенко и др., 1978/ при постоянной подаче природного газа и воздуха в соотношении Ш^: » 1:5. Скорость подачи'газовой смеси 40 л/мин, г« среда культивирования равно 5,5.Температура культивирования 42°С.

Для опытов использовала клетки, находящиеся в' экспоненциальной фазе роста.Полученную бактериальную массу, концентрировали центрифугированием при в течение 10 мин, затем дважды промывали 0,02 М трис-HCI буфером CfH 7,2) и ресуспенди-ровали в том хе буфере. Клетки разрушали при +4°С в экструзи-онном дезинтеграторе ДКМ-6 конотрукцки Института химической физики АН СССР при перепаде давления 1500-2000 кг/см3. Разрушенную бактериальную массу разделяли на центрифуге VAC - 801 (ГДР) 65*10^в в течение I часа. Доя выделения ферментов использовали супернатант,содержащий 40-60 мг белка в I мл раствора.

Активность метанолдегидротеиазн определяли полярогра^ячос-кш методам по поглощению Og /Грушаков, 1973/ на полярографе LP - 7 (Чехословакия) с платино-серебряным елекгродом закрытого типа в объеме 3,3 мл при 20°С. Состав реакционной среды: 0,02 М трис-HCI буфер) рН 9,0; феназинметосульфат 3 мМ; аммоний

сернокислый 5 мМ; метанол 2 мМ и препарат фермента от 0,05 до 0,1 мг белка.

Активность форыиатдегидрогеназн определяли спектрофотомет-рически на спектрофотометре ОФ—4А яо изменению оптической плотности при 340 нм. Величину молярного коэффициента экстинкции НАДН принимали ратной 6,21*103 М~г-см~*. Реакционная смесь содержала; 0,02 M трис*-НС1 буфер» píí 8,0; НАД - I мМ; HC0ÛH -0,2 мМ; препарат фермента от 0,05 да» I мг белка. Общий объем смеси 2,6 мя / Johns он et el. ,1964/.

Зависимость окорости ферментативной реакции от рН среда исследовали в диапазоне рН 6,0 — 11,0 при 20°С. Величину рН контролировали на потенциометре ЛПУ-OÏ.

При изучении тепловой денатурации ивганоддегидрогенаэы и формиатдегидрогекаэы, раствор фермента в 0,02 M трис-HCI буфере с оптимальным для изучаемого фермента значением рН выдерживали в ультратермостато 0-10 С1ДР) при соответствующей температуре.

Термодинамические показатели реакции 'окисления метанола определяли как описано Березнным /Березин и др., 1976/.

Молекулярную массу определяли методом гельфильграции на сефадексе s - 150. Колонку (1,5x70 см) предварительно калибровали белками с различной молекулярной массой: цитохромом о, миоглобвном, хинотрипсиногеном, альбумином лошади, альбумином быка, альдолазой.

Содериание металлов в препарате формиатдегидрогеназы определяли на атомко-абсорбционном спектрофотометре aas - i ("Карл Цейс", ГДР) о приставкой.

Скоростное аналитическое ультрацентрифугирюваяив проводили в аналитическом роторе центрифуги * Spinoo модель Е v • (56«ICr об/мин. при 8 С в течение 1,5 часа).

Электронные спектры регистрировали на спектрофотометре SF - 800 (Англия). Спектры флуоресценции записывали на спектрофотометр® Amine« bowman (США). Спектры электронного парамагнитного резонанса изучали на ЭПР-спектрофотометре-3.- _

Анализ аминокислотного состава метанолдегидоогенази проведали на аминокислотном анализаторе (модель kla hitachi Япония) но методике описанной Муром /Moor et al., 1963/.

Изучение кристаллов метанолдегидрюгенаэы проводили на рентгеновском аппарате СХ-6 в камере Бюргере с использованием K¿ -излучения меди /Елондел и др., 1979/.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЭДОВАНИЙ

ШДЕШШИЕ, ЖШСО-ШШЧЕСКИЕ, СЦШРАЛШЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА МЕГАНОЛДЕПЩРОЕЕНАЗЫ меенплоосстэ саргихлтиз (ШТАШ М)

Выделение метанолдегидрогенаэы проводили в анаэробных условиях. Этапы очистки представлены в таблице I.

Таблица I

очистка штшдтирсганазы

МЕТНПуОСОССШ С4РЗиЪАТиЗ(ШТАШ М)

Этапы очиоткк Объем фракции, м и Удельная активность фермента, ин-j.tr оеляа Количество белка, Г Кратность очистки, раз

Бесклеточкнй экстракт 420 0,142 II ,2 I

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлоэе- 80 0,332 1.7 2,3

Фракционирование сульфатом аммония {55-7СЙ насыщения) 18 0,75 0,8 5,3

Хроматография на сефадексе 0-75 60 2,28 0,55 19,6

Хроматография на сефадексе С - 150 50 з,г 0,45 22,5

В результате проделанной работы получен препарат метанолде-' гадрогекаэц с удельной активностью 3,2 мимоль 02*мин~г*(мг белка). Кратность очистки 22,5 раза. По данным электрофореза в 7,Ь%~м по-лнакрилашдаом геле фермент гомогенен. Электрофорез в присутствии додецилоульфата натрия показ ал; что ферлент состоит из двух субъединиц о одинаковой молекулярной массой.

На с одиментограимах, полученных при аналитическом ультрацен-. ^тиЗугярованйи гомогенных црепаратов метанолдегидрогеназы, наб-лвдали одан основной симметричный шшрен-пик, константа садимая-

танки которого составляла 7,2 Молекулярная масса» рассчитанная по методу Арчибальда и определенная гельхроматографиой на сефвдексе G - 150, равна 120 кДа.

Оптимальное pH для проявления ферментативной активности составляет 9,5.

Искусственным акцептором электронов метанолдегидрогенаэы является феназинметосульфат / Johnson et вХ.,Г964/. По нашим данным некоторые соли тетразолия также могут служить искусств. вешшмк акцепторами электронов металолдегидрогенаэы (рис.1, прямая 2).

Рио.1. Скорость окисления метанола в присутствии раэлгпцшх

акцепторов электронов: 1 - феназинметосульфат (3-10~^м); 2 - n-нитротетраэолий хлористый (1-103М); 3 - цитохром сС0 Ketbyloooeeu* oapeulatue (шташ Н) .концентрация белка 1,4 мг/мл

Естественным акцептором электронов ме танолдегидрогеназ ы, вероятно,является цитохром c^q. Нами было показано,что цитохром Cqq, выделенный из того же метанотрофкого микроорганизма Mtthyloooocun oapeulatue (лгтамм М) .может служить акцепторам электронов в опытах 1« vitro, так кок в присутствии этого ци-тохроиа скорость окисления метанола значительно возрастает по сравнению с искусственными акцепторами электронов, такими как феназинметосульфат и тетразолий (рис.Х, прямая 3).

Аминокислотный состав метанолдегидрогеназы Methylасоeeus ¿арaulatus (штамм И) представлен в таблице 2, столбец 2. Приведенные в таблице данные показывают, что ваделейная нами ме-танолдегидрогенаэа по своему аминокислотному составу .практически не отличается от метаноддегидрогенаэ других микроорганизмов.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АШГОКИСЖЯНОГО СОСТАВА МЕПАНОЛДЕПадРОГЕНАЗЫ МВТНПОСОССиз САРзиЬАТиз (ПГГАШ Ы) И ШЯАН0ЛДЕЩДР0ГШАЗ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Таблица 2

---:-Т-■-:-------1------1

Мвг11у1ооа(1сив Ке1Ьу1ов111иа Аминокислота о&раиа^ие арог!ия ше1Ьап1оа пав 2941

(штамм М) У^е1,197в/ /?аг«1г19вО/ /Хатапака,

1977/

Лизни' 7.Б 9,4 9,6 8,97

Гистидкн 3,4 2,5 2,3 Г.74

Асгшрагин и.о. и.о. н.о. 1.75

Аргинин 8,8 2,6 3,1 3,51

Асаарапшовая

кислота 11,2 10,0 10,7 12,22

Треонин 4,5 х 4,2 4,0 6,6

Серии 1,8 2,0 1,7 . 2,07

Глутаминовая

кислота 8,7 'б,8 6,9 7,83

Црояин 4,9 3.2 3,6 З^бв

Глицин 5,4 4,7 4,а 5,27

Алании 5,2 4,6 4Л 4,6

Дкстеин 1.8 0,3 0,3 0.4

Валик 5,9 4,3 4,3 4,74

Метионин 2,1 1.8 1.8 ■ 1,71

Изолейцин 3,7 2.7 2,8 3,09

Лейцин 8,3 5,9 6,0 6,3

Тировин 6,9 3,3 2,7 6,19

Фенилалашш 5,9 3,9 3,4 3,71

Триптофан н.о. 2,2 1,9 1 4,06

Црнмвчашю: содержание вмшополоти дано в процентах от 1 общего количества ашгаокяолот; к*о. - ке определяли.

ТермостаЗильность метанолдегидрогеваэн исследовали в интервале температур 50 - 80°С (рио.2).

2 - 70°С; 3 - 60°С; 4 - 50°С

Полученные результаты свидетельствуют о том,что при 50°С ферлевт не теряет свою активность в течение длительного времени. При дальнейшем повышении температуры (60°С, 70°С ,и 80°С) происходит снижение ферментативной активности с временем поду-инактивации 10, 5и 2 минута, соответственно .На этом основании метанолдегидрогеназу можно отнести к термостабильным ферментам.

Спектры поглощения метанопдепадрогеназы имеют максимуш про 280 и 345 км и плечо в области 410 нм. Поглощение при 345 им свидетельствует о наличии хромофора в молекуле фермента.

При возбуждении в области 360 нм кативный фермент не флуоресцирует (рис. 3). Нарушение пространственной структуры белка приводит к появлению голубой флуоресценции при 445 нм, что, очевидно, обусловлено окислением хромофора при его отделении от полипептидной цепи белка и сопровождается необратимым падением ферментативной активности. Положения максимума флуоресценции (445 нм) и максимума возбуждения {380 нм) не зависели от ДО, но при рН 10 квантовый выход флуоресценции в 2 - 2,5 раза ниже, чем при рН I или 10.

Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) мета-нолдегидрогеназы определяли при 293 К (ряс. 4). Спектр имеет узкую линии шириной 6,25 эрстед, - ^-фактор 2,003. В спектре наблюдается небольшая анизотропия ^-фактора, которая, по-видимому, обусловлена связью хромофора с макромолекулой фермента. Параметры этого спектра характерны для семихиионов. Сигнал ста-

Квантовый

-ixJ : -Бftr для возбуждения

Рко.З. Спектры воэбувдения и флуоресценции метанолдегид-рогенаэы (некорректировашше): I - нативный фермент (5 кг белка/мя) при jfl I,Oi jK 7,0 и jH Ю,0( 2 и 4 - фермент в присутствии It додецилоульфата натрия при рН 10,0; 3 а 5 - фермент в присутствии 1% доде-цвлсульфата натрия при jH 1,0 и рН 7,0.

Примечание: Л в - длина волны максимума возбуж^ дення; Л й - длина волны максимума флуоресценции.

Уис.4. Спектр ЭПР метанолдегидрогенаэы ¿

билен на воздухе и не исчезает при добавлении метанола или акцепторов электронов, таких как феррицианид калия. Однако экспозиция фермента в 1% растворе тритона Х-100 на воздухе при рН I или рН Ю ,0 приводит к исчезновению сигнала, который уже не восстанавливается при добавлении субстрата или датионита натрия. Стабильность сигнала ЭПР в присутствии кислорода'воздуха и его

- ю -.

быстрое исчезновение ори разворачивании валковой глобулы на воздухе указывают на то, что в натидаой молекуле радикал стабилизирован полипептиднсй цепью белка. Такая стабилизация, по-видимому, обусловлена тем, что семихиноновый радикал утоплен в белковую матрицу или расположен в щели между двумя субъединицами фермента. Спектральные свойства метанолдегпдро-генаэы свидетельствуют о наличии хромофора в молекуле фермента, лринимаяцего участие в ферментативном процессе.

Глубину погружения кофактора в молекулу метанолдегидро- \ геяазы определяли методом( предложенным Куликовым /Куликов и др., 1981/, по формуле:

с* >

где ' V/ - скорость спин-решеточной релаксации радикала при изменении концентрации феррициакида;

Л- - численный множитель, зависящий от формы молекулы; - число "пи", равно 3,14;

^И - величина магнитного момента электронов феррициа-нида;

Т - время спин-решеточной релаксации ионов феррициа-нида;

У - гирсжагнитное отношение,равно 1,7 • Ю7 с"1;

С - концентрация феррнцианида;

р - глубина погружения кофактора в макромолекулу фермента.

Полученный результат показал, что хромофор, являющийся кофактором метанолдегидрогеназы расположен на глубине 1&±3 X, вероятно, между субьединицами форманта.

Кристаллы мотаяодчегидрогеназы получали из растворов белка (коиц. 30 мг/мл). Для понижения растворимости фермента использовали полиэтаденгликоль (м.м. 6000) или 2-метил-2,4-пен-тадвол. Кристаллы бапирамндальной формы (рис.5, А) росли, в растворах с лоли&тиленгликолем, палочковидной - в растворах с 2-мвтил-2,4-лентаднолом (рис.5, Б).

Исследование пространственной структуры монокристалла метанолдегидрогенаэы проводили методом реятгеноотруктурного анализа. Кристаллы бшшрамнцальнов формы оказались непригод-шми для проведения анализа. Рентгеноструктурннй анализ палочковидных кристаллов показан, что они относятся к ромбической сингонии, принадлежат к пространственной груше Р212121, имеют параметры элементарной ячейки' а в 132,13 Я, ь = 214,50

Рио.5. Кристаллы метаноддегидрогонаэы Ме^гоооосиа

<мФ»и1агиа (штат М): А - пирамидальной форм; Б - палочковидной фсдаг

о = 227,00 X в обвелечивают дифракционное поде до 2,5 X. В независимой части элементарной ячейки содержится 4 молекулы фермента- Но функции вращения Рооснана в независимой части ячейки выявлены взаимно перпендикулярные оси, что указывает аа тетраэдрическую упаковку- молекул в ячейке.

Таким образом, очищенная наш метанолдэгидрогенаэа

НвгЬу 1оооооиа Оарви1аЪиа (штат М) ПО СВОИМ фИЭИКО-ХИИПвС-

ким и спектральный характеристикам сходка о метанолдегидрогена-эами других микроорганизмов /Йетрусов, 1987/. Установлено, что кофактор метанслдегадрогеназн имеот семихиноноаую природу и расположен на глубине около 18 Я, вероятно, мевду субъеда-ницами фермента. Исследования кристаллической метанолдегидроге-нааы, проведенные методом рентгеноструктурного анализа, дали возможность определить основные параметры элементарной ячейки монокристалла фермента.

шштзскиЕ и таэдпишшичшш характшютики

РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ЦЕГГАН01А, КАТАЛИЗИРУЬМОЙ МСТАНОЯДЕГВДРОГЕНАЗСЙ

Исследование скорости окисления различных субстратов препаратам» метанолдегидрогеназы показало, что фермент обладает сирокой субстратной специфичностью, окисляет (помимо метанола) формиат, формальдегид, спирты с достаточно высокими скоростями. Вторичные спирты окисляются значительно медленнее по сравнению о первичными. .

Активность окисления различных спиртов метанолдегидроге-каэой представлена ниже.

Субстоат Удельная шиявность,

^о«трат мкмоль 02/мт1-мг белка

' 8 * 0,6 5 ± 0,3 0,4 ± 0,05 2,5 * 0,1 0,2 ± 0,04 ' 0,2 * 0,04 1,5 ± 0,2

1.4 ±0,2

1.5 * 0,3 1,5 ±0,3

Константа Михаэлиса для некоторых субстратов метанолдегидрогеназы и искусственного акцептора электронов,определенные на гомогенных препаратах фермента.равны!

сн3ш с^щ

изо-О^Н^Ш н-С^НдСН изо-С^НдОН изо-С5НпШ н-С6Н13СН ,н-СдН170Н н-СэН190Н К_С10Н21СН

метанол - 0,6

формальдегид 2,5

этанол - 0,8

н-бутанол - 1,0

н-гексанол - 1,8

феназинметосульфат - 30

иг4*!

ю-ю-10-

: м м

'М

10-* м то"4«.

Зависимость окоросот ферментативной реакции окисления метанола от температуры исследовали в интервале температур от 10 до 70°С при оптимальном значении рН,равном 9,5. Гра^ш этой зависимости имеет вид колоколообраэной кривой с оптимумом при 50°С (рис. е). Удельная скорость окисления

метанола» М -

30 го ю

0 10 ' зА ' 5Й 1 температура, Тис, 6. Влияние температуры на активность метаиолдепщрогеваан

Температурный коэффициент реаюдщ окисления метанола (} в 1,6. Применив теорию абсолютных скоростей химических реакций к ферментативной реакции окисления метанола /Берез ин я др., 1978/, нами были определены термодинамические показатели процесса перехода фермент-субстратного комплекса в активированное состояние:

- изменение свободной энергии активации дЬ4^ в 93 да/моль;

- изменение свободной энтальпии активации йНг = 39,3 кдк/ыоль;

- изменение свободной энтропии активации = - 43 энтропийных единицы.

Результаты определения термодишмичееких показателей ферментативной реакции окисления метанола показали, что на стадии активации фермент-субстратного комплекса эта реакция идет с поглощением тепла (значение д!Г положительно). Полученные нами

«начеши й И н л сравнимы с подобными термодинамическими показателями для других ферментативных реакций /Бвреэин, 1978/. Кинетические характеристики метанолдегидрогеназы Мв1Ьу1осооси» оар«и1агиа («там* М) ооглаоуются о литературными даншми, полученными для метаноддегидрогеназ других метало тройных микроорганизмов /Хатапакь , 1961/.

- ВЦПВЛЕНИЕ И ШЗИКО-ХИЩЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОПШХЩТЩРОШиШ ИЕТНУЪОООССиЗ САРЗШЛТОЗ (ШТАШ М)

Формютдегидрогеяаау выделяли из надооадочаой фракции, полученной после центрифутарования грубого беоклеточного экстракта метакотрофных микроорганизмов Ме1Ь^1осоесив оарви1«ги» (штат М), Последовательность этапов очистки фермента приведена в таблице 3.

, Таблица 3

ОЧИСТКА ФаИШтаВДЦРОГЕНАЗЫ метнуьососсю САРЭЩЛТШ (ШТАШ к)

Обми Удельна« . Коли— - Крат-

фрак- активность чество нооть

Этапы очистки ции, фермента, белка, очистки,

мл mtMtuti н*птт г раз ынн'мг сюлка

Еесжлеточный 8кстракт 1600 0,13 40 I

Хроматография на ДЭАЭ -^еллмоэе (I) в ли-? неВком градиенте

(0,1-0,3 М) На» 400 0,5 38 3,9

Фракционирование сульфатом ввмошш (30—40^ насыщения), хроматог- .'.■■■■.. рафия на сефадексе

С - 75 100 0,8 32 6 '

Хроматография на ДЭАЭ -целлюлозе (2) в линейном градиенте

(0,2-0,3 М) Had 32 0,9 18 ' 7

Хроматографет на се-

фадексе G - 150 38 2,17 4 16,7 ■

В результата проделанной работы бил получен препарат форшатдегидрогеназн с удельной активность» 2,17 мшоль НАДИ* мин 'мг балка1.Кратность очистки составляли 16,7 раза.

Очищенная форшштдегидрогенаэа имеет коричневую окраску. Молекулярная масса, определенная методом Ар^шбальда, составляла 300 кДа,Коиотш;та седиментации равна 13 5. Фермент отличается высокой чувствительностью к кислороду. Ферментативная активность сохраняется только в анаэробных условиях. При наличии в растворе фермента уЗ - мериаптоэтанола £5 • Ю""3 М) или этилендиаминтотрауксусно.Ч кислот (не вше 6 * 10"^ М) активность формиагдегидрогеназы частично сохраняется (рис. 7).

Рис.7. Влияние условий хранения на активность форниатдегид-рогенаэы: I - аэробные условия; 2 - аэробные условия +р - меркаптоэтанол; 3 - аэробные условия + ЭДТА; 4 - анаэробные условия:

Зависимость активности форшатдогидрогекази от рН имеет вид колоксиообраэной кривой о оптимумом при рН равным 8,0.

Терлостабильность форлиатдегидрогеназы исследовали в анаэробных условиях при 30°С, 50°С и 60°С (рис. 8).Полученные результаты свидетельствуй? о той, что при повышении температуры до 30°С ферментативная активность резко снижается. При дальнейшем повышении температуры ( 50°С и 60°С) происходит быстрое снижение ферментативной активности с временем лолу-инактивации фермента 20 к 3 минуты,соответственно.

2 - 50°с; 3 - 30°с.

Выделенная нами формиатдегздрогенаэа ингабирувтся реагентом на ?Н-грушш ~ парахлормеркурибензоатом (ПХМБ), комплексо- ' образователями такими как цианид, азид, о-фенантролин, о-фта-левцй альдегид (о-ФТА), этилендааминтетрауксусной кислотой (ЭДГА) в концентрациях выше 6 • 10^«

Таблица 4

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ Ф0РЖАЩЩ№0ГШАЗЫ мвгнуьососсиа САрешлтиз Сшташ м)

Название вещества ..Концентрации, М % ингибнрования

ПШБ 5 * Ю"4 ■ 100

Цианид натрия 5 * ЮГ4 73

Азид натрия 5 * 10 64

о-ФТА , I • 10 100

о-фенантролин 0,5- Ю-4 38

ЭДТА 6 • ' 45

Полученные результата свидетельствуют о наличии в молекуле фермента 5Н-групп, атомов двухвалентных металлов, что и было подтверждено анализом, проведенным методом атомно- абсорбционной спектроскопии. По данным этого анализа молекула формиатдегидрогеназц содервлт атомы но , ?е и Си в соотношении I : 20 ; 50.

Исследование спектральных свойств формиатдегидрогеназы показало, что фермент имеет максимумы поглощения при 276 км в 415 нм.

Фермент обладает строгой субстратной специфичностью, акцептором электронов фермента может быть, только НАД, но не НАДФ. Константа Михазлиса дли формпата равна 2,3 • иг**, дая НАД - 1,9 * Ю-4!!.

Таким образом, выделена в гомогенном состоянии форкиатде-гидрогеназа метанотрофиых бактерий M*thyloooocue capeulatue (шта*м М). Показано, что ферлент относится к металлоферментам. Как известно из литературы /Лихтенштейн, 1979/, метаддофер-менты отличаются большой избирательностью к субстрату и акцептору электронов, сложность» устройства макромолекулы и активного центра, высокой каталитической активностью,что и было показано нами в работе с формиатдегидрогенаэой.Детальное и глубокое исследование окислительно-вос станоштельных процессов, происходящих в таких ферментах, может помочь химикам, фиэико-химикам создать новые эффективные катализаторы проце-соов синтеза.

ВЫВОДЫ

I. Метанолдегидрогенаэа метанотрофиых бактерий Methylосоа-оив capsula tua (штаам М) выделена и очищена до гомогенного состояния. Изучены макромолекулярные (м.м. равна 120 кДа, субъе-диничиый состав), спектральные (спектры ЭПР, влектронные спектры и спектры флуоресценции) и кинетические свойства (оптимум pfí, субстратная специфичность) фермента.

2.Оценены термодинамические параметры реакции окисления метанола,катализируемой метанолдегидрогеназой:

- изменение стандартной свободной энергии активации 93 дя/молы

- изменение стандартной свободной энтальпии активации

39,3 кд*/моль;

- изменение стандартной свободной энтрошга активации равно

-43 энтропийных единицы.

3. Получены кристадин иетаиолдегидрогеназы двух форм - палочковидной и бипирамидальной, Сняты рентгенограшы палочковидных кристаллов с разрешением 2,5 X. Сценевд параметры симметрии элементарной ячейки монокристалла (»■= 132,13 Я, Ъ = 214,5 A It о» 227,0 А).

- 18 -

4. Органическим кофактором метанодцегкдрогеназы является семшсинон, который по нашим данным, погружен в белковую матрицу на глубину около 18 А и расположен, вероятно, между субъ-едакицами фермента,

5. Впервые у иетанотрофшх бактерий вид едена и очищена НЛД-эависимая формиатдегядрогеназа Methyiocoocue оарeulatue(штамм М). Изучены макромолекулярные (м.м. равна 300 кДа), спектральныеи кинетические (Ку дня формиата 2,2* Ю^М и Ку для НАД 1,9-10 М) свойства фермента. Показано наличие ЙН-групц и атсмов металлов

в молекуле фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волошина Е.С. Выделение и общая характеристика метанодде-гидрогеназы метанотрофных бактерий tiethyloeoocue e&psulatua ■

' (вггама) // Тезкой докладов конференции молодых учета ОИХФ АН ■ СССР.* - Черноголовка, 1982, - С. 59-60.

2. Волошина Е.С. Изучение и некоторые свойства ферментов катаболизма метана у метанокнеяшяцих бактерий // Тезисы докладов

' 4-го Украинского биохимического съезда. - Львов, 1962. - №2.

- С. 185.

3. Волошина Е.С. Выделение, очкетка и физико-химические свойства метенолдегйдрогенази бактерий wethyiocoecus oapeuiatua (штавм М) // Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биохшши им. А.Н.Баха АН СССР.' - Москва, 1983. - С.26.

4. Гвоздев Р.И.,Волошина Е.С., Белова B.C., Шушеначева Е.В., Соофенов H.H., Чирикова Л.А., Григорян А.Н., Лихтенштейн Г.И. Ферментная система метамокисляицих бактерий, катализиружщая окисление метана и его производных // Тезисы докладов 4-го Международного симпозиума по гомогенному катализу. - Ленинград, 1984. - JS3. - С.28.

5..Гвоздев Р.И., Волошина E.G., Малашенко Ю.Р., Григорян A.R. Метанолдегидрогенаэа метанокисляпцих бактерий Methylocoocue capsulata (штат М) // Биохимия. - 1965. - 50, J&6. - С.980-985. .

6. Волошина Е.С. Формиатдегидрогенаэа метакокисляивих бактерий Methylосоecu« cap sula t ue (штама М) // Тезисы докладов 7-го съезда Украинского Микробиологического общества. - Черновцы, ; 1989. - JH. - С.47.

7. Гвоздев Г.И., Волошина Е.С., Малашенко Ю.Р., Григорян А.Н. Метанолдегидрогенаэа метанокнеляадих бактерий Muthyloceocws eapsulatus (штамм М) // Прикладная биохимия и микробиология,

- 1990. - 25, JJ5. С.- 629-634.

Подл**ule я Пвчкть 12.05,95г. *орн»Т 60хВ4/16 Бумаг* ая«чая.7*л.печ.л. 1,0. Тнрмс i00 txe. Э«к«в и 857

0inutm ЦГОП КФ "Пя«диаму**кг" г. Кие» , С«к»•ran«к*г*,1.