Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фазового состояния замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей методом термопластистической деформации

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование фазового состояния замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей методом термопластистической деформации"



РГб од

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИШ- 7 ПЮП |393 ИНСТИТУТ ПРОЕЛИ.! КРИОБИОЛОГИ И КШОМЕДЩЦМ

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАЗОВОГО СОСТОЯНИЯ ЗАМОРОЖЕННЫХ РАСТВОРОВ КРИШРОТЕКТОРОВ, КЛЕТОЧНЫХ: СУСПЕНЗИИ И ТКАНЕЙ МЕТОДОМ ТЕРМОПЛАСТИЧЕСКОЙ ДЕФОРМАЦИИ

(03.00 - криобиология 03.00.02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

РУИША Татьяна Михайловна

Харьков - 1993

Работа гшюлгона в Институте проблем криобиологии и кримэди-цгаш ЛИ Украины.

Научные руководители: член-корреспондент АН Украшш, профессор Н.С.Пушкарь,

кандидат йлгаико-матемгтпеских наук А.И.Оссщкий.

Официальные о!' .онэнты: доктор биологических наук, профессор,

лауреат Государственной премии Украшш В.И.Луговой,

доктор биолоппесгак наук, про!»? ссор, В.В.Лемошко.

Рэдущая организация - Физико-технический институт низких температур.

£0

Заяц1та состоится " /В - шхх 1ЭЭЗ года в ../Л " часов на заседании споциализирпоачиого сокэта Д 016.60.01 при Институте проблем криобиологии и грподадацшш All Украины (г. Харьков, ул. Переяславская, 23).

С диссэртщи?й можно ознакомиться в библиотеке института. Аиторэ.^эрат разослан " /о " qs)p2JJ- 1993 года.

Учений секретарь специализированного совета, доктор медцвднеклх науч

А.Н.Гольцов

Актуальность проблемы. Данные о фазовых состотшях охлаждаемых биологических систем входят в число основных параметров, определяющих как структурно-функциональные характеристики биообъектов, так и технологию их криоконсэрвирования. Поэтому 'проблемам их определения в криобиологии уделяется традиционно большое внимание. В настоящее время относительно хорошо разработаны вкспериментальные метода определения таких параметров, как температура начала кристаллизации вода в биообъектах, температурный интервал, а котором развиваются кристаллизационные процессы или процессы плавления при отогреве, температура стеклования (расстеклования) системы, а также интервалы температур, соответствующие рекристаллизационным процессам. Однако эти метода недостаточно эффективны при изучении кинетики протекаюцкх в криоконсврвируемых биологических системах фазовых или структурных переходов при температурах, близких к температурам стеклования. Кроме того, они не позволяют определить упруго-пластические свойства исследуемых систем в каадой конкретной точке фазовой диаграммы. В тоже время результаты последних исследований показывают, что именно особенности кинетики структурных переходов и изменение упруго-пластических: свойств биосистем, связанных с этими переходами, во многом определяют механизмы их повреждения.

Проблема определения упруго-пластических свойств твердых образцов достаточно хорошо решена в физике металлов (Р.Бернер, Г.Кронмюллер, 1969; Д.А.Вигли, 1974) я физике полимеров (В.Е.Гуль, В.Н.Кулезнев, 1972). Но все известные устройства для определения механических свойств образцов совершенно непригодны для работы с образцами, изначально находящимися в нсидкофазном состоянии (В.В.Пуставадов, 1971). А как известно, большинство изучаемых в криобиологии биообъектов, являются жидкообразными.

Таким образом, актуальным стал вопрос о разработке метода, который позволил бы определять не только традиционно измеряемые температурные интервалы фазовых переходов, но и одновременно регистрировать кинетику самого явления, а такта измерять упруго-пластические свойства биосистем в процессе их охлаждения или нагрева.

В связи с этим был предложен новый метод фазового анализа замороженных растворов и биосистам, основанный на их термопластической деформации.

Цель'и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка нового метода, предназначенного для изучения фазовых и ■структурных переходов в замораживаемых биосистемах - мэтода термо-

пластической деформации, позволяющего исследовать кинетику этих ' процессов и определять изменения упруго-пластических свойств системы, связанные с такими переходами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить слэ-дукщие задачи:

- разработать и теоретически обосновать метод термопластической деформации для изучения фазового состояния замороженных биосистем, а также устройство для его реализации;

- апробировать метод термопластической деформации на водных растворах криопротекторов различной концентрации (глицерин, ПЭО-1500, I,3-ДМЭГ), клеточных суспензиях и тканях;

- экспериментально и теоретически изучить фазовое состояние и кинетику структурных переходов в водных растворах криопротекторов различной концентрации, клеточных суспензиях и тканях;

- с учетом полученных результатов сформулировать практические рекомендации по совершенствованию технологии криоконсервирования биологических объектов.

Научная новизна работы. Разработан новый метод для изучения фазовых и структурных переходов в замораживаемых биосистемах - метод термопластической деформации, позволящий впервые исследовать не только кинетику этих процессов, но и определять упруго-пластические свойства системы, связанные с этими переходами.

Создана оригинальная установка с набором деформационных приставок для реализации метода термопластической деформации в криобиологическом эксперименте. Впервые проведено изучение термопластических свойств целого ряда растворов криопротекторов и биосистем в широких интервалах температур и внешних напряжений.

На водных растворах криопротекторов обнаружено новое явление их заторможенного низкотемпературного эвтектического расслоения. Рассмотрен механизм действия этого явления, как одного из основных повреждающих факторов при криоконсервировании биосистем с суммарной концентрацией криопротекторкых веществ до 30 %.'

Основные положения, выносимые на защиту: ' •

I. Разработанный новый метод позволяет:

- проводить фазовый анализ замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей;

- исследовать кинетику процессов, протекающих при охлаждении-нагреве растворов криопротекторов, клеточных суспенззгй и тканей;

- изучать структурные изменения биосистем, а также связанные •

о ними упруго-плаотича скив свойства.

2. Экспериментально обнаружено явление низкотемпературного эвтектического расслоения »охлаждаемых криопратекторшх растворов.

3. Рассмотрено влияние явления низкотемпературного эвтектического расслоения криопротекторных растворов на сохранность крио-консервируемых биосистем.

4. Сформулированы принципы оптимизации режимов криаконсерви-рования клеточных суспензий и тканай на основе данных по термопластике их образцов.

Практическая ценность. На основании полученных в работе экспериментальных данных и развития теоретических представлений будут сформулированы рекомендации по оптимизации режимов криоконсервиро-вания биологических систем.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XV Всесоюзной конференции по химии низких температур (Москва, МГУ, 21-23 декабря 1988), II Всесоюзной конференции "Химия и применение неводных растворов" (Харьков, ХГУ, 3-5 октября 1989), Всесоюзном семинаре "Современные методы аттестации методик выполнения измерений" (Харьков, ХГУ, 18-20 апреля 1990), XVIil-th. International Congress of Refrigeration, (Canada, August 10-17, 1991), International Symposium on Calorimetry and Chemical Thermodynamics (ussh, moboow, June 23-28, 1991), Мевдународной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 21-25 апреля 1992)

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, получено I авторское свидетельство, 2 заявки признаны изобретением и принято решение о выдаче патентов.

Объем и структура работа. Диссертация изложена на /22 страницах машинописного текста и иллюстрирована 29 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 3-х глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 168 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В качестве материала для исследований были использованы:

- водные растворы криопротекторов различной концентрации (глицерин, ПЭ0-1500, I,3-ДОЭГ);

- клеточные суспензии (эритроциты, клетки костного мозга линейных мшей-гибридов);

- ткани животных (печень крысы, сердце крысы, почка крысы,, головной мозг крысы, поперечно-полосатая мышца бедра крысы).

Для исследований Сил разработан новый метод фазового анализа замороженных .растворов и биосистем - метод термопластической деформации и устройство для его реализации.4 Суть предложенного метода заключается в том, что исследуемые образцы водных растворов криопротекторов, клеточных суспензий или тканей, помещенные в специальное деформационное устройство, охлаждаются по заданной программе до температуры жидкого азота с последующей стабилизацией температуры в течение определенного промежутка времени. После этого к ним прикладываются внешние напряжения и начинается отогрев образца с заданной скоростью.

Получаемые экспериментальные термопластические кривив позволяют в деталях проследить кинетику фазовых и структурных переходов в исследуемых образцах, и, что особенно важно, с высокой разрешающей способностью определить изменение их физико-механических характеристик. Зто открывает принципиально новые возможности при исследовании целого ряда криобиологических проблем и оптимизации технологий криоконсервироваяия биообъектов.

На рис. I представлена типичная термопластическая кривая £ = е(Т) (позиция 2), полученная в режима отогрева замороженного раствора глицерина доэвтектической концентрации. Для сравнения на этом же рисунке представлена термограмма процесса расстеклования того же раствора'глицерина (позиция I), полученная с помощью сканирую-

Гис. I. Термограмма ' (I) п термопластическая кривая процесса расстеклования водного раствора глицерина доэвтектической концентрации.

щаго калориметра. Из приведенных графиков видны преимущества термопластических нрИЕЫх, на которых эффект расстеклования сопровождается увеличением скорости термопластической деформации на четыре порядка. Это естественно, так как на несколько порядков изменяется при расстекловании модуль упругости образцов. Столь резкое изменение контролируемого параметра позволяет значительно точнее определять температуру начала процесса расстеклования, а также проследить кинетику самого процесса расстеклования и всех протекающих при более высоких температурах процессов, связанных с изменением структуры образца (например, образование микрокристаллов льда). То же относится и к другим процессам, сопровождающимся резким изменением упруго-пластических характеристик исследуемых биообъектов.

Метод термопластической деформации позволяет с большой точностью определять температуры стеклования (расстеклования) растворов криопротекторов, температурные интервалы .и кинетику процессов рекристаллизации, кристаллизации и протекающих в' расстекловании, системах явлений.

На водных растЕорах глицерина по термопластическим кривым была получена концентрационная зависимость температуры расстеклования Т (рис. 2). Полученные данные по зависимости Т = Тв(Сгл) хорошо согласуются с имеющимися в литературе.

Учитывая, что охлаждаемые растворы крионротекторов, применяв- • мне в криобиологии, имеют высокие вязкостные параметры, то обычная кристаллизация обеих компонентов А и В не идет до конца, т.е. в остающейся жидкой фракции не достигается эвтектическая концентрация С = С° . В результате в эти системах не происходит обычная эвтектическая кристаллизации, заканчивающаяся выпадением кристал-

Рис. 2. Температура расстеклования водных растворов глицерина.

лов обеих фаз при строго постоянной температуре эвтектики Процесс низкотемпературного эвтектического расслоения раствора протекает в широком температурной интервале (Г^-.-Т^), где Т^ -температура стеклования, а Таэ - температура начала сборки молекул криопротектора в ассоциаты, и имеет заторможенный характер. В этом интервале происходит образование ассоциатов из молекул криопротек-торнкх Еещаств, что вызывает уменьшение гидратационных чисел молекул криопротекторов. Часть молекул вода сказываются свободными при крайне низких температурах -60...-100 °С, и они немедленно образуют мякрокристаллы льда. Это явление впервые удалось обнаружить с помощью метода термопластической деформации.

Для выяснения природа наблюдаемого аффекта на растворах крио-протекторов различных концентраций были сняты как термопластические кривые, так и дилатограммы. Для раствора ГОО-1БОО с концентрацией 45 % на рис. 3 нанесены термопластическая кривая I и дилатометрические кривые, полученные в процессе охлаждения раствора со скоростью уохл= 0,5 град/мин (кривая 3) и при отогреве образца со скоростью 7 = I град/мин (кривая 2).

л £,.

лу.10?сма

люо 2Ь/Н /

2*00 1 /

2000 зЦУ

1100

(ООО

500 / С = 45 % . 1 530

0

Рис. 3. Термопластическая кривая (I) и дилатометрические кривые на отогреве (2) и охлшвде-нии (3) 45 й-го раствора ИЗО-1500.

-120 -к» -во -Ю -10 -20 о го 40 Т,<С

Итак, при низкотемпературном эвтектическом расслоении раствора идет образование двух новых фаз: сшивка ассоциатов из молекул криопротекторов и образование микрокристаллов льда за счет появляющихся вблизи ассоциатов СЕободнгх молекул еоды. Процесс образова-

ния ассоциатов из молекул криопротектора ведет к повышению вязкости раствора и отчетливо регистрируется на термопластической кривой характерным перегибом в области температур -65...-23 °0 (кривая I рис. 3). А специфические объемные эффекты, сопровождающие образование микрокристаллов льда, и кинетика их протекания отчетливо отображены на дилатометрических кривых. Согласно дилатометрической кривой, снятой на охлаждении (кривая 3 рио. 3), после окончания кристаллизации раствора при достижении температуры Т = -45°С в процессе охлаждения образца вновь начинается резкое возрастание его объема, что однозначно подтверждает наличие процессов образования микрокристаллов льда, сопровождающих явление низкотемпературного эвтектического расслоения.

При помощи термопластических кривых удалось определить значения предельных концентраций и 0®и1;, которые достигаются компонентами А и В при охлавденвд раствора со скоростью Тохл . Этот интервал ДС„ = [С^ С® . ] условно можно назвать эвтектическим

Т} риь

концентрационным интервалом. В связи с отсутствием в этих растворах макрокристаллов льда они должны иметь повышенную текучесть выше температуры расстеклования Т^, а значит интервал ДС^ должен однозначно определяться с помощью термопластических кривых.

На примере водных растворов глицерина на рис. 4 показана полученная с их помощью зависимости Де10 = Ае (сгл), где Ае,0- приращение пластической деформации исследуемого образца при повышении его температуры на 10 градусов после начала процесса расстеклование, т.е. от температуры Т^ до температуры (Гв+ 10) °С.

Резкий пик на кривой однозначно определяет предельные значе-

&6. мкм

6 * 400 г/мы2 Г

» 10 г&ов. I

\о

1

¡С 'С1

Еис. 4. Приращение деформации водных растворов глицерина при изменении температуры на 10 градусов после начала процесса расстеклования.

с. Г

ния эвтектического концентрационного интервала. Ширина этого интервала является функцией скорости охлаждения раствора . Чем выше скорость охлаждения, тем шире интервал и наоборот, чем меньше скорость охлаждения, тем уже интервал.

При значениях концентраций до С < структура образца представляет собой макрокристаллы льда, являющиеся результатом обычной кристаллизации, в промежутках между которыми находятся прослойки расстекловаваегося раствора Слизкого к эвтектической концентрации. Приложенная к образцу нагрузка а воспринимается макрокристаллами и кривые е = б (Т) в этом интервале фактически отражают дислокационную пластичность льда.

При концентрациях Сгл> С®цЪ образец имеет аморфную структуру и его течение определяется вязкостью т] аморфной фазы после ее расстеклования. Твк как величина ,т| растет с увеличением 0гл, то приращение деформации Ае10 соответственно падает вплоть до концентрации с = 1 (JC.it.

^ гл

Аналогичные результаты для определения эвтектического концентрационного интервала были получены для водных растворов криопро-тектора полиэтиленоксида с молекулярной массой 1500 (ПЭ0-15ВД).

Метод термопластической деформации позволяет исследовать особенности фазового • состояния не только растворов криопротекторов, но и клеточных суспензий, тканей.

Из литературных данных был известен тот факт, что при предварительной инкубации клеток крови в растворе криопротектора ГОО-1500 при температуре О °С с последупцим замораживанием клеточной суспензии, результаты по выкиваемости клеток крови оказывались выше, чем в случае, когда клетки замораживались без такой начальной обработки. В работе мы попытались объяснить этот эффект, используя данные по термопластике образцов.

Из рис. 5 хорошо видно, что сразу после расстеклования аморфной фракции скорость пластического течения образцов из эритромас-сы, которая инкубировалась с криопротектором при температуре 22 °С (кривая 2), значительно выше скорости пластического течения образцов из эритромассы, инкубированной при О °С (кривая I). Это озна^-чает, что процесс низкотемпературной сборки кластеров из молекул криопротектора в клеточной суспензии, инкубированной перед охлаждением при О °С, в значительной, степени подавлен. Этот факт можно объяснить предположив, что при достаточно длительной выдержке при О °С некоторая часть молекул ПЭ0-1Б00 адсорбируется на иоверхнос-

ти клэток. В результате подвижность молекул криопротектора снижается и создаются энергетически благоприятные условия для начала сшивки молекул криопротектора на Поверхности клеток при более высоких температурах, что в дальнейшем приводит к обрастанию клеток кластерами из молекул 1130-1500 и соответствующему уменьшению концентрации этих молекул в общем объеме раствора. Поэтому при дальнейшем охлаждения этой клеточной суспензии процесс низкотемпературной сборки кластеров во внеклеточной среде заторможен. Соответственно менее активно, протекают связанные с этим процессы 1Шзко-температурного эвтектического расслоения раствора криопротектора, происходящие в интервале температур -35...-65 °С. Поскольку низкотемпературное эвтектическое расслоение наиболее опасно с точки зрения повреждения охлавдаемых клеток, то их сохранность должна быть значительно выше в случае предварительной инкубации клеточной суспензии при умеренно низких температурах.

«о

я»

20с

Рис. 5. Термопластические кривые эритромассы человека, инкубированной с 100 ЗОй-ным раствором ПЭО-1500

при'температуре О °С (кривая О и 22 С (кривая 2).

о

-(да -но -12о -1оо -во -во -4о о

т,°с

В экспериментальной биохимии традиционно большое внимание уделяется исследованию конформационной подвижности молекул белков как одному из основных факторов, определящих их реакционную спо- . собность. Особую важность данная проблема приобретает при исследо- V Еашш механизма холодовой адаптации гетеротэрмов, где структурно- -функциональные свойства белковых молекул изменяются в зависимости от физиологического состояния животных.

Исследуя с помощью метода термопластической деформации плазму крови сусликов, находящихся в состоянии зимней спячки, при искусственно вызванном пробуждении и бодрствовании, удалось получить новые данные по низкотемпературной динамики белковых молекул.

При низких температурах (-100 °С...-20 °0) метод термопластической деформации очень чувствителен к химическому составу межзе-решшх прослоек и определяется аффективной вязкостью этих прослоек, которая зависит от подвижности внешних фрагментов входящих в прослойки белковых молекул.

Чтобы выделить межзаренюе скольжение в чистом виде были построены дифференциальные термопластические кривые, которые представляют собой разность пластической деформации двух образцов, замороженных и отогретых в одинаковых условиях: плазмы крови суслика и закристаллизованного физиологического раствора. Это позволило вычесть деформацию, связанную с дислокационной пластичностью во всем исследованном интервала температур. В результате регистрируемые дифференциальные термопластические кривые отражают процессы, происходящие в межзеренных прослойках при непрерывном нагреве образцов.

Эффект резкого уменьшения термопластической деформации образцов кз плазмы крови сусликов при переходе кивотных в состояние зимней спячки наглядно показан на рис. 6. Представленная здесь зависимость е = е ^ ) получена на основании дифференциальных

Рис. 6. Влияние температуры тела тавотного на суммарную термопластическую деформацию ааморо-женных образцов плазмы крови сусликов.

в

ю

20

30

термопластических кривых, где деформация еэ в каждом из четырех исследованных случаев (температура тела животного 5, 10, 27, 37 °0) определялась как Суммарная термопластическая деформация замороженного образца к моменту достижения им температуры -20 °С. Данный эффект может быть связан с появлением в плазме естественных модификаторов, которые могут адсорбироваться на белковых молекулах и достаточно сильно менять микровязкость среды, с которой контактируют фрагменты белковых молекул.

На основании экспериментальных данных, получогашх с помощью метода термопластической деформации, в работе показана возможность оптимизировать технологию криоконсэрвировштя клеточных суспензий.

Материалом для исследований служил костный мозг мышей-гибридов Рг (СВА х С57 В16). Суспензию клеток готовили на растворе ЦОЛШК-3 с добавлением 15 % глицерина и 10 % мышиной сыворотки. Влияние различных скоростей охлаждения (нагрева) на биологическую полноценность клеток костного мозга оценивали по изменению функции стволовых клеток: их пролиферативной активности, дифференцировки и вызревания.

Ранее считалось, что существует лишь две причины возникновения внутренних напряжений: градиенты температур в охлаждаемом (нагреваемом) образце и анизотропия теплового сжатия (расширения) отдельных кристаллов льда в твердофазной матрице. Проведешше в настоящей работе исследования выявили еще один механизм возникновения внутренних напряжений: образование микрокристаллов льда, сопровождающее эффект низкотемпературного эвтектического расслоения растворов полиолов. Оценки показывают, что характерная амплитуда возникающих напряжений может на несколько порядков превосходить характерную амплитуду внутренних термоупругих напряжений. Поэтому сохранность криоконсервируемых клеточных суспензий в значительной степени. зависит от удачной реализации попыток уменьшить этот эффект. Исходя из полученных экспериментальных' данных по термопластике криоконсерЕирукщего раствора был' предложен следующий . оптимальный режим охлаждения (нагрева) криоконсервируемых клеточных суспензий.

На. первом этапе замораживания, определяемом интервалом температур от комнатной до температуры начала кристаллизации, ггроисхо- . дат частичная адсорбция молекул криопротэктора на клетках и их агрегация в растворе. Оба эти эффекта в дальнейшем уменьшают интенсивность процесса низкотемпературного эвтектического расслоения и связанного с ним явления докристаллизации освобождающихся молекул

воды. Поэтому этот этап необходимо проходить с минимальными скоростями охлаждения (менее 1 град/мин), чтобы обеспечить необходимое развития процессов адсорбции и агрегации молекул криопротектора.

Второй этап охлаждения охватывает интервал от температуры начала кристаллизации до температуры начала низкотемпературного эвтектического расслоения раствора криопротектора. В этом диапазоне температур охлаждение можно вести с обычно применяемыми в криобиологии скоростями: 5...10 град/мин.

Третий этап охлаждения определяется интервалом температур, в котором при охлаждении или нагреве наблюдается явление низкотемпературного эвтектического расслоения раствора криопротектора. Этот этап следует проходить с максимально возможными'скоростями изменения температуры (выше 20...50 град/мин), чтобы уменьшить время нахождения криоконсервируемого объекта в этом интервале температур и, следовательно, снизить влияние явления низкотемпературного эвтектического расслоения как одного из основных повреждающих факторов на этом этапе.

Четвертый этап охлаздэния наступает при переходе системы в полностью твердофазное состояние (ниже температуры стеклования биосистемы) и продолжается до конечной температуры охлаждения -196 °0 (температуры жидкого азота, при которой будет храниться замороженная клеточная суспензия). На этом этапе следует вновь уменьшить скорость охлаждения до I...5 град/мин для уменьшения амплитуды внутренних термоупругих напряжений, связанных с градиентом температур в образце.

Согласно имеющимся экспериментальным данным в процессе охлаждения тканей ниже температуры начала кристаллизации воды в них неизбежно развиваются такие повреждения, как механические пробои мембран клеток, фрагментация основных молекулярных комплексов, изменение пространственной структуры отдельных элементов тканей. Основным механизмом, способным вызвать такие повреждения по Есему объему охлаждаемой биосистемы, является пластическая релаксация термоупругих напряжений. Этот механизм особенно важен для тканей и органов, где явлэния, связанные с развитием осмотических давлений и концентрационных эффектов в значительной степени подавлены спецификой кристаллизации воды в этих объектах.

В связи с этим особую важность приобретает проблема фазового анализа тканей и определения температурных интервалов, в которых возникают оптимальные условия для реализации деформационного меха-

низма повреждений, что однозначна можно определить при помощи метода термопластической деформации.

Термопластические кривые были получены для целого ряда тканей животных. Типичный вид таких кривых показан на примере поперечнополосатой мышцы бедра крысы и мозга крнси (рис. 7). Представленные кривые имеют ярко выраженный многостадийный характер, причем каждая из стадий соответствует определешгаму фазовому состоянию ткани. Температуры начала фазовых переходов Тт для разных тканей могут сильно отличаться. Экспериментально было получено, что для тканей головного мозга Тш = -77 °С, в то время как для ткани желудка крысы она составляет Тщ = -38°С. Температура плавления ткани почки крысы Тт = -62 °С, ткщш сердца = -44,5 °С, ткани поперечнополосатой мышцы бедра крысы Тт= -43 °С.

Таким образом, термопластические кривые могут служить объективным тестом при определении температурных интервалов наибольшего повреждения охлаждаемых тканей. Так на основашш рис. 7 можно сделать вывод, что для повышения эффективности криодеструкции необходимо обязательно охлаждать ткани ниже температуры Тщ, где образцы переходят в полностью твердофазное состояние и процессы повреждений необратимы. В то время, как при охлавдении образцов до температуры Тт процессы механических поврендений ткани не успевают развиться в полной мэре и возможна неполная криодеструкция ткани.

1000

вот

Рис. 7. Типичный вид термопластических кривых замороженных образцов тканей животных.

Т.°с

выводи

1. Разработан новый метод фазового анализа растворов криапро-текторов и криоконсервируемых биосистем, a также определения температурных зависимостей их упруго-пластических свойств - метод термопластической деформации.

2. Создана установка с набором деформационных устройств для реализации метода термопластической деформации в криобиологических вкспериментах.

3. Методом термопластической деформации исследована кинетики фазовых и структурных превращений в охлаждаемых растворах криопротекторов и биосистэмах и определены изменения упруго-пластических свойств изучаемых образцов, сопровождающие ати превращения.

4. Показана эффективность метода термопластической деформации при получении данных для гостроения полных диаграмм состояния растворов криопротекторов.

5. Обнаружено новое явление - затормокенное низкотемпературное эвтектическое расслоение переохлажденных водных растворов криопротекторов и определены основные параметры этого явления.

6. Показано, что низкотемпературное эвтектическое расслоейие растворов криопротекторов может являться одним из основных повреждающих факторов криоконсервируемых биооистем при суммарных концентрациях криопрогекторных Еаществ до 30 iï.

7. Сформулированы принципы оптимизации технологий криоконсер-вирования биообъектов с учетом эффекта низкотемпературного эвтектического расслоения растворов криопротекторов.

8. Разработаны методы определения оптимальных режимов криоде-струкции тканей на основе их термопластической деформации.

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую и искреннюю признательность доктору мед. наук Игнашевой Л.П., канд. биол. наук Бабийчук Л.А., канд. биол. наук Загнойко В.П., канд. мед. наук Ва-силовскому B.D., канд. хим. наук Видному С.Ю. за постоянный интерес к разрабатываемым проблемам и помощь в проведении совместных экспериментов.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

I. Влияние рекима замораживания на сохранность эритроцитов, консервируемых под защитой I,2-пропандиола. / Сб.науч.тр.: Крио-консервирование клеток и тканей.- Харьков: ИПКиК АН Украины, 1989. - С. 43-48 (совместно с Печеным U.JI., 'Воротшшным A.M.).

2. Устройство для замораживания биообъектов.- Л.с. 1464059. МКИ4 F 25 D 3/10,- Опубл. 07.03.89.- Еюл. 9 (совместно с Печеным М.Л., Рудько Ю.М.", Тодршшм А.Ф.).

3. Универсальный объемный микротензодилатометр для исследования термодинамических характеристик неводных и смешанных растворителей./ В кн.: Тезисы II Всесоюзной конференции "Химия и применение неводных растворов", Харьков, ХГУ.- т.2.- 1939.- С. 121 (совместно с Осецким А.И., Видным С.П.).

4. Применение тензодилатометрии для изучения кинетики расстеклования растворов./ В кн.: Тезисы Всесоюзного семинара "Современные Методы аттестации методик выполнения измерений".- Харьков, ХГУ.- 1990.- 0. 92 (совместно о Осецким А.И., Видным С.Ю.).

5. New methods of determination of the phaee Btate of biological systems being frozen. / Abstracts of XVIII-th International CongreBBOf Refrigeration, Montreal, Canada.- 1991.- P. 161 (jointly with OsetBky A.I., IgnaBhova L.P.).

6. Thermodynamics of the ргооеввев of low temperature association of moleouleB in aqueous polyol solutions. / AbstraotB of International Symposium on Calorimetry and Chemioal Thermodynamics, Moeoow, USSR.- 1991.- p. 141 (jointly with A.I.OBetBky, J.G.Alexandrov, S.J.Bidny).

7. Заявка N4903585/14 (006381). МКИ5 0 01 S 33/483. Способ определения фазового состояния биологических объектов./ А.И.Осецкий, В.Ю.ВасилоЕСКий, Т.М.Турина.- Пол.реи.на вид. патента от 12.10.91.

8. Низкотемпературное консервирование щитовидной железы. Трансплантация криоконсервированной щитовидной железы как метод лечения гипотиреоза. / В кн.: Тезисы II Международной конференции "Успехи современной криобиологии", Харьков.- 1992.- С. 147 (совместно с Пушкарем Н.С., Осецким А.И., Македонской В.А.).

9. Исследование фазовых состояний замороженных растворов и биосистем методом термопластической деформация. // Проблемы криобиологии,- 1992.- N 2.- 0.24-29 (совместно с Осецким А.И.).

10. Термопластические свойства замороженной плазмы крови зи-мослящих животных. // Проблемы криобиологии.- 1992.- н 3.- С. 1924 (совместно с Осецким А.И., Загвойко В.И.).

11. Заявка n 4900524/28. МКИ5 G 01 N 3/18. Устройство для испытания на сдвиг образцов материалов при низких, температурах. / А.И.Осецкий, Г.М.Турина.- Полок, реш. на выд. патента от 07.06.92.