Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование факторов, определяющих антимикробную активность нового антимикробного препарата из рыбных жиров
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Исследование факторов, определяющих антимикробную активность нового антимикробного препарата из рыбных жиров"
На правах рукописи
РГ6 од
РЫБИН Вячеслав Григорьевич
ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ АНТИМИКРОБНУЮ АКТИВНОСТЬ НОВОГО АНТИМИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ РЫБНЫХ ЖИРОВ
/
03.00.23 - биотехнология, 03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владивосток - 2000
Диссертация выполнена в Тихоокеанском научно-исследовательском
рыбохозяйственном центре Государственного комитета Российской Федерации по рыболовству, г; Владивосток.
Научные руководители:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
кандидат биологических наук Акулин В.Н.
кандидат технических наук Блинов Ю.Г.
доктор биологических наук, профессор Э.Я. Костецкий доктор химических наук, профессор Л.А. Иголкина Институт биологии моря ДВО РАН
Защита состоится 14.06.2000 г. в часов на заседании
диссертационного совета К 003.97.01 в Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу:
690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159 Факс: (4232) 310-193
С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке ДВО РАН
Автореферат разослан & 2000 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета к.б.н. (уС^^^^у^ М.В. Ходаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы:
Скрининг природных соединений с целью получения антимикробных агентов представляет перспективное научное направление в биотехнологии. Потенциальными источниками новых антимикробных субстанций является рыбный жир, интенсивные исследования биологической активности соединений которого проводятся в течение последних 30 лет. До настоящего времени использование рыбных жиров в пищевой и медицинской промышленности было обусловлено высоким содержанием п-3 ПНЖК и витаминов групп А и Б. В ТИНРО-центре разработана технология приготовления нового антимикробного препарата (Патент РФ № 2043725, 1995), в основе которой лежит процесс автоокисления рыбных жиров. Полученный препарат имеет природное происхождение, но не уступает по силе и спектру антимикробного действия применяемым в настоящее время синтетическим антисептикам и характеризуется безвредностью в отношении высших организмов (Бывальцева, 1997). Вместе с тем, как продукт пищевого либо лечебно-профилактического назначения, новый препарат нуждается в изучении его химического состава и биологических свойств отдельных компонентов для обоснования и применения его антимикробного эффекта. В связи с этим, актуальным вопросом является исследование процесса, приводящего к образованию антимикробной активности АП, определение структур его активных компонентов, а также исследование механизма их действия. Цель работы:
Целью настоящего исследования являлось научное объяснение образования антимикробной активности препарата из рыбных жиров.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
- исследовать кинетику образования антимикробной активности препарата;
Список основных сокращений: АП - антимикробный препарат; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ПЖХ - тазо-жидкостная хроматография; ЖК - жирные кислоты; КХ - колоночная хроматографии; МИК - минимальная икгибирующая концентрация; ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты; ПОЛ - продукты окисления лили-дов; ТСХ - тонкослойная хроматография; 15-НРЕТЕ - 5Д8Д11Д13£'-15(5)-гидроперокси-5,8,11,13-эйкозатетраеновая кислота; 4-НЖ - (2£)-4-гидрокси-2-ноненаль; 4-НМ)Е -(2Д62)-4-гидрокси-2-нонадиеналь; 15-ЬО - 15-литюксигеназа.
- выявить связь между процессом автоокисления рыбных жиров и образованием антимикробной активности препарата.
- идентифицировать его активные компоненты;
- исследовать биохимические и микробиологические свойства установленных активных компонентов.
Научная новизна
Впервые в окисленных рыбных жирах, различающихся по степени их ненасыщенности, обнаружены и выделены два продукта автоокисления полиненасыщенных жиров: (2£)-4-щцрокси-2-ноненаль, образующийся при окислении п-6 полиненасыщенных жирных кислот, и (2£,62)-4-гвдрокси-2,6-нонадиеналь, образующийся при окислении п-3 полиненасыщенных жирных кислот. Впервые установлено наличие выраженной антимикробной активности у данных соединений. Исследовано и доказано влияние (2£)-4-гидрокси-2-но-неналя на биосинтез (5Д8Д112',13£)-15(5)-гидроперокси-5,8,11,13-эйкозатет-раеновой кислоты - первичного липоксигеназного метаболита арахидоновой кислоты. Установлен двойственный (активирующий и ингибирующий в зависимости от концентрации) эффект (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля на активность 15-липоксигеназы. Проведена сравнительная оценка действия (2£)-4-гадрокси-2-ноненаля на 15-липоксигеназу, его антимикробной активности и известной генерации данным соединением протекания различных внутриклеточных процессов.
Практическая ценность
Разработан препаративный метод выделения индивидуальных низкомолекулярных продуктов автоокисления полиненасыщенных жиров. Оптимизированы условия приготовления антимикробного препарата с максимально-возможной величиной антимикробной активности. Апробапия работы
Отдельные части настоящего исследования были представлены на IV международном конгрессе по сравнительной физиологии и биохимии (Бирмингем, Великобритания, 1995), на региональной конференции "Рыбохо-зяйственные исследования океана" (Владивосток, 1995), на конференции молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов" (Владивосток, 1999), на II Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии (Владивосток, 1999), на международной конференции молодых ученых Россий-
ского Дальнего Востока "Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока" (Владивосток, 1999). Публикации
Основное содержание диссертации изложено в 14 публикациях. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы (179 ссылок) и приложения, включает 32 рисунка и 11 таблиц. Общий объем диссертации составляет 156 страниц. Основные положения, выносимые на защиту
1. Антимикробная активность смеси водорастворимых продуктов
окисления рыбного жира зависит от степени ненасыщенности жира.
2. Антимикробная активность получаемого в процессе автоокисления жира
препарата обусловливается наличием в нем карбонильных соединений -продуктов окислительной деградации полиненасыщенных компонентов рыбного жира.
3. Механизм действия активных компонентов препарата определяется их
способностью необратимо инакгивировать ферменты и может относиться как к антиферментному так и к антиметаболическому типам.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследование зависимости активности антимикробного препарата от степени кенасьпценности жира - источника препарата
Исследование зависимости активности препарата от степени ненасыщенности жира - источника препарата - показало, что большим антимикробным эффектом обладает препарат, приготовленный из жира, обладающего большей степенью ненасыщенности. Скорость образования антимикробной активности в препарате из такого жира была наибольшей среди таковых из всех жиров, выбранных для исследования (табл. 1). Сопоставление изменения состава ЖК в жире при получении АЛ и уровня антимикробной активности показало, что активность препарата возрастает по мере снижения содержания ПНЖК. в окисляемом жире. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о влиянии на величину антимикроб-
ной активности препарата содержащихся в нем продуктов окисления рыбных жиров.
Таблица 1
Скорость образования и уровень антимикробной активности АЛ, изготовленного из разных жиров
Содержание Время образования Максимальная
Источник жира ПНЖК в жире, антимикробной активность,
% от суммы ЖК активности (8000 ЕД/мл), сутки ЕД/мл
Сардина 33.95 4-5 40000
Сайра 29.66 7-8 37000
Печень минтая 22.13 8-10 29000
Частично гид-
рированный 9.5 15-18 (7500 ЕД/мл) 7500
жир сардины
На основании результатов данных исследований следует, что для приготовления АП с максимально-возможной активностью следует использовать жир с наибольшей степенью ненасыщенности.
2. Исследование состава антимикробного препарата
2.1 Исследование зависимости антимикробной активности препарата от его качественного состава
Исходя из предположения о том, что водная фракция окисляемой эмульсии жир/вода содержит водорастворимые продукты окисления и окислительной деградации полиненасыщенных соединений, была исследована зависимость антимикробной активности препарата от содержания в нем пероксвд-содержащих компонентов, свободных ЖК и формальдегида. Однако результаты этих исследований показали, что данные соединения присутствуют в значительно меньших концентрациях, чем их МИК и, таким образом, не способны оказывать заметное влияние на антимикробную активность препарата. Кроме того, после проведения разделения смеси компонентов препарата методом ТСХ, было обнаружено, что продукты окислительной поли-
меризашш (полимеры и олигомеры) также не обладают антимикробным эффектом.
Следующим классом соединений, антимикробное действие которых было исследовано, были карбонильные соединения. Для установления взаимосвязи между наличием в препарате карбонильных соединений, исключая формальдегид (отсутствие влияния которого на активность препарата было установлено ранее), и его антимикробным эффектом было проведено сравнение между образованием сопряженных <х,р-ненасыщенных карбонильных соединений, возникновением и ростом активности препарата. Исследование смеси компонентов препарата в процессе его приготовления методами УФ-спектрофотометрии, ИК-спектросхопии и обрашенно-фазовой ВЭЖХ показали, что его активность растет вместе с накоплением а,р-ненасыщенных карбонильных соединений. После обработки смеси компонентов АЛ боргидридом натрия полученная смесь продуктов реакции антимикробную активность не проявляла. Это обстоятельство позволило вычеркнуть из списка возможных претендентов, отвечающих за активность препарата, спирты, диолы и т.п., образующиеся из пероксид- содержащих и карбонильных соединений при их восстановлении боргидридом натрия. Таким образом, было показано, что только карбонильные соединения определяют общую антимикробную активность препарата. Тот факт, что боргидрид натрия кроме карбонильных групп восстанавливает и пероксндные, особого значения не имел, так как раньше было установлено отсутствие зависимости между содержанием в препарате пероксидов и его антимикробной активностью.
2.2 Определение активных компонентов антимикробного препарата
Определение факторов активности АП заключалось в предварительном его фракционировании, определении антимикробного эффекта полученных фракций, выделении и идентификации проявляющих антимикробное действие компонентов из активных фракций. Методический подход к этой части наших исследований, характеризующий все проведенные процедуры, показан на рис. 1.
После разделения смеси компонентов АП методом колоночной хроматографии на силикагеле было получено 16 фракций, обогащенных отдельными группами его компонентов (рис. 2). Фракции №5, 10 и 11, показа-
вшие антимикробную активность, (рис. 2), в дальнейшем были разделены на компоненты методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 3).
(5
42
{Определенней состтжя ЖК)
/Опвлдр-юттА ^ 1состма ЖК Г^
У*
(Ъаслсте, 37*(Г\
Остаток ДЦ
|>(чр»т
гОпределенна аэтпмнкробкой жтикности/
^■(едиене аклмнкробнов
у«1ТШ»НОСТУ
^Определена«1
Хдорофо,
Эксгршот
'ОпределешаеЧ *втаатсро6во< И лтнесту
?
Водный
слой
ипнмшробноС
Хнорофодоный
СЛОЙ
-И!
Конаеятрировалне
3
3
^Иалцоипс^ "аспмшх* "Актные" фракции
(Разделение на колонке] I с сндшигелем 1
Фракции с различным* компонентами
Рис. 1. Схема определения активных компонентов АЛ
Использование УФ-детектора на диодной матрице позволило записать УФ-спектры отдельных компонентов активных фракций препарата. После препаративного разделения компонентов активных фракций методом обращенно-фазовой ВЭЖХ были получены индивидуальные компоненты АП, содержавшиеся в активных фракциях. У выделенных соединений, с выраженным антимикробным действием, методами спектроскопии ]Н-ЯМР и масс-спекгрометрии была установлена структура.
Компонент 2 фракции №11 и 8 фракции №10 (рис. 3) представляли собой соединения, которым была приписана структура (2Е,б2)-4-щдрокси-2,6-нонадиеналя (4-1ШВЕ) и (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля (4-1ЮТ), соответственно.
а-.
©СП'
я
>» л:
а :
й Ч» " &
ш
хФ №
г» й© «Ч3> 0 О Ов
С'Л # I
Л а.
©
■СУ
«5»
е.».
о <»
в«
«»
'"Ч
4 5 6 7
11 12 13 14 15 16 и<;«
10
Рис. 2. ТСХ-анализ (силикагель) фракций, полученных после разделения смеси компонентов АП методом колоночной хроматографии. Элюент - п-гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (2:3:0.05)
Структуру активного компонента фракции №5 из-за малых его количеств, а также высокой его лабильности в чистом виде, установить не удалось, однако было определено наличие в его составе смеси изомеров с сопряженными оксо-
2 3
диеновыми фрагментами. Кроме того, по данным ТСХ, значение этого компонента лежало в области, соответствующей кето-ироизводным ПНЖК.
мттн
В 3 6 5 12 15 18 21 24 2? 30
В,**,.*,,»
0»гппсская пгопгекгп.
I]речи, мин
Рис. 3. ВЭЖХ-анализ фракций, обладающих антимикробной активностью, а) фракция №5, б) фракция №10, в) фракция №11, "+" - наличие антимикробной активности
4-РШБЕ является аналогом 4-ЬШЕ и отличается от последнего наличием в структуре одной изолированной цис-двойной связи.
Факт наличия в структуре 4-НМ)Е изолированной чыс-двойной связи и отсутствие ее у 4-1ШЕ следует из сравнения спектров 'Н-ЯМР этих соединений (рис. 4). Различия значений химических сдвигов протонов при б и 7 атомах углерода (4-НРТОЕ: 5.35 (6), дд, 5.65 (7), дд, 9 - соответствуют протонам при атомах углерода с цис-двойной связью; 4-Н1ЧЕ: 1.25 (6), м, и 1.25 (7), м -соответствуют протонам насыщенного фрагмента цепи атомов углерода) показывают наличие изолированной ч"с"Дв°йной связи в молекуле 4-НГШЕ и отсутствие ее в молекуле 4-Н№2.
6,7.8 9
'''.Л... ..''.Л-Л т (2)
сись
___________
сна,
б.'
А А
(3)
2
(2)
(7)
т
I 6 4
II I ¿ж /„ Лил^Ь- V. КМ/к»
ОЯ 40 ЛП 7(1 6«; ^ О 4 ^ 40 Л Я 4.0 2< 2.0 М 10
______ ________РР"1______________________
Рис. 4. Спектры 'Н-ЯМР 4-HNE (а) и 4-ННЧВЕ (б). Нумерация атомов показана на рис. 5
Таким образом, на основании приведенных выше исследований по определению активных компонентов АП установлено, что за антимикробную активность препарата отвечают соединения, относящиеся к классу а,р-ненасыщен-ных шдроксиальдегидов - 4-1ШЕ и 4-НКВЕ. Кроме того, биологической активностью обладают соединения с оксодиеновыми фрагментами в структуре их молекул. Это - высоколабильные соединения, способные к самопроизвольной конденсации. Наличие их в свежеприготовленном АП привносит свой вклад в общую активность препарата. При хранении АП уровень этих соединений падает вместе с незначительным снижением общей его активности. Несмотря на высокую реакционную способность пероксид- содержащих продуктов автоокисления полиненасыщенных жиров, а также формальдегида, обладающего также и антимикробным действием, следует отметить, что присутствие этих соединений в АП не определяет его биологического эффекта. Такой же вывод можно сделать и в отношении свободных ЖК, отдельные представители которых, как известно, обладают сильным антимикробным действием.
2.3 Свойства установленных активных компонентов антимикробного препарата
Установленными активными компонентами АП являлись 4-НКЕ и 4-HNDE, представляющие собой летучие, практически бесцветные маслянистые жидкости с характерным фруктовым запахом. Как уже отмечалось выше, данные соединения относятся к классу а,р-ненасыщенных гидроксиальдегидов и способны легко вступать в реакции 1,4-присоединения, а также конденсации, например, с карбонильными соединениями, -Б-Б- фрагментами белков (в том числе ферментов, разрушая третичную структуру белка, что приводит к их необратимой инактивации) и т.д. В настоящее время известно о сильном цито-токсическом действии 4-НМЕ, однако о подобных свойствах 4-HNDE ничего не сообщалось.
Рис. 5. Структура 4-НКЕ и 4-НгаЕ
4-HNDE является аналогом 4-HNE и отличается от последнего, как отмечалось выше, наличием в структуре одной изолированной дос-двойной связи в 6-м положении (рис. 5).
Преимущественное образование 4-HNE происходило при окислении жира, имеющего в составе до 20% ПНЖК, а в случае окисления жира с содержанием ПНЖК более 20% начиналось заметное образование 4-HNDE. Известно, что главным источником образования 4-HNDE являются п-З ПНЖК. Использование в качестве источников АП жиров с разным содержанием ПНЖК и, в частности, n-З ПНЖК позволило установить зависимость образования этих альдегидов от содержания ПНЖК в выбранных для исследования жирах, представленную в таблице 2, из которой видно, что с возрастанием в жире содержания n-З ПНЖК растет концентрация 4-HNDE в АП, а также и общая активность препарата. Однако концентрация 4-HNE, зависимая главным образом только от п-6 ПНЖК, в том числе линолевой кислоты, значительно не изменяется. Этот факт свидетельствует как о большом вкладе 4-HNDE в общую активность препарата, так и о взаимном влиянии этих компонентов АП на его общую активность.
Таблица 2
Зависимость содержания 4-HNE н 4-HNDE в АП от содержания ПНЖК в жире - источнике препарата
Содержание ПНЖК в жире, % от суммы ЖК (источник жира) Содержадае n-З ПНЖК, % от суммы ЖК Q-HNE, мкМ C4-HDNE> мкМ
33.95 (сардина) 30.05 20 45
29.66 (сайра) 26.13 18 39
22.13 (печень минтая) 18.64 20 7
9.5 (частично гидрированный жир 1.88 0.5 не обн.
сардины)
При выбранных нами условиях для проведения ВЭЖХ исходной смеси компонентов антимикробного препарата эти соединения между собой не разделялись (рис. 6), однако, применив предварительно колоночную хроматографию на нормальной фазе, нам удалось получить фракции, содержащие данные компоненты по отдельности.
в 4.5 9 13.5 ib 22.5 27 31.5 36 4в.5 45
Время, мин
Рис. 6. ВЭЖХ-аиализ исходной смеси компонентов антимикробного препарата
Изучая антимикробные свойства исследуемого препарата, а также выделенных его активных компонентов - 4-HNE и 4-HNDE, мы обнаружили, что антимикробный эффект АП и в том числе его компонентов - 4-HNE и 4-HNDE - проявлялся в отношении вегетативных клеток микроорганизмов, а именно патогенных энтеробакгерий, листерий, протеев, плазмокоагулирующих стафилококков, а также споровых форм бактерий родов Clostridium и Bacillus.
Общее содержание 4-HNE в АП из жира сардины составило 1.8%, а 4-HNDE - 3.9% от сухого веса суммарных водорастворимых продуктов окисления жира, входящих в состав АП. Минимальная действующая концентрация в инкубационной смсси 4-HNE составляла 20 мкМ, a 4-HNDE -45 мкМ. Активность указанных соединений при этих концентрациях соответствовала 6500 единиц действия натриевой соли бензилпенициллина на 1 мл инкубационной смеси (ЕД/мл). Однако смесь 4-HNE и 4-HNDE проявляла активность 6500 ЕД/мл при их парциальных концентрациях 9 и 18 мкМ, соответственно. Этот факт указывает на возможный синергический эффект данных компонентов АП.
В таблице 3 показана зависимость активности 4-HNDE и 4-HNE в единицах действия бензилпенициллина от их концентрации в инкубационной смсси, а также атияние данных компонентов антимикробного препарата на некоторые выбранные для определения антимикробных свойств тест-микроор-
ганизмы. Известно, что при концентрации 40 мкМ 4-1ШЕ обладает генотоксическим эффектом, а его антимикробная активность при этой концентрации эмпирически определена как 8000 ЕД/мл. При увеличении концентрации от 100 мкМ и выше, 4-Н1ЧЕ проявляет ярко выраженное общетоксическое действие на ктетку (ингибирование ферментативных процессов).
Таблица 3
Воздействие 4-1ШЕ и 4-Н1ЧБЕ на тест-микроорганизмы
4-1ЮЕ, мМ* 4-1ГО№, мкМ* 4-™Е/4-1ЮКЕ (смесь), мкМ* Ажтнвяость, ЕД/мл Тест-мнхрооргыизмы**
Е. сой Л'г. аыгеах Вас. ЬиЬпОз
240 520 200/430 38000 100 100 100
120 260 100/220 33500 88 80 70
80 175 70/150 28500 75 68 20
60 130 50/90 24000 64 52 4 4
50 100 40/60 21000 56 32 0
40 80 18/40 8000 21 14 0
20 45 9/18 6500 17 11 0
* Концентрация антимикробного агента в инкубационной смеси. ** Доля числа погибших клеток от общего числа клеток (в %).
Кроме того, из табл. 3 видно, что в смеси этих компонентов суммарная их концентрация, соответствующая определенной активности бензилпеницил-лина, в большинстве случаев больше, чем соответствующая такой же величине активности концентрация отдельных этих компонентов. Это обстоятельство наблюдается уже при парциальных концентрациях 4-1ШЕ и 4-1^0Е 50 и 90 мкМ, соответственно, в их смеси. Однако при низких концентрациях 4-НГ№ и 4-НГ>ГОЕ (9 и 18 мкМ, соответственно), суммарная их концентрация, соответствующая активности 6500 ЕД/мл превосходит только концентрацию 4-1ШЕ, отдельно взятого для исследования. Эти факты также свидетельствуют о взаимном влиянии данных компонентов на их антимикробную активность.
2.4 Определение (2£',62)-4-гидрокси-2,6-нонадиена,тя и (2£)-4-гидрокси-2-нонсналя методом газо-жидкостной хроматографии
Для проведения качественной и количественной оценки АП на предмет содержания в нем 4-1ШЕ и 4-1ШВЕ и сопоставления этой величины с уровнем антимикробной активности препарата, мы разработали метод определения вышеназванных компонентов газо-жидкостной хроматографией. В качестве стандартов использовали выделенные нами ранее 4-Н1ЧЕ и
Определение указанных компонентов в смеси продуктов окисления жира, используя стандартные процедуры для определения карбонильных соединений, не предста&тялось возможным из-за большого разнообразия мешающих балластных соединений. Для их удаления проводили предварительное извлечение низкомолекулярных водорастворимых компонентов АП методом твердофазной экстракции, используя неполярный сорбент "Полихром", практически не обладающий необратимой адсорбцией. Далее полученную смесь, освобожденную от полимерных и олигомерных образований, разделяли методом КХ на силикагеле, обработанным 5%-м раствором ионола в н-гексане. Общий выход 4-Н№ и 4-НЫБЕ составил 95±2%. Полученные после проведения КХ фракции анализировали методом ГЖХ без предварительной дериватизации компонентов фракций, проведение которой неизменно привело бы к уменьшению общего выхода 4-ЬШЕ и 4-НГО)Е.
Результаты ГЖХ-анализа объединенных фракций, содержащих 4-1ШЕ и 4-НГ>ГОЕ (рис. 7), показали, что выход этих соединений при проведении экстракции ПОЛ из АП хлороформом и последующей КХ на колонке с силикагелем, не обработанным ионолом, составлял около 20%, причем количественная воспроизводимость данной процедуры низка.
Проведя модельный эксперимент, а именно, используя для этого стандартный водный раствор 4-Н№£ и 4-ЬШБЕ с известными их концентрациями, мы добились извлечения этих соединений с выходом 95+2% и высокой степенью воспроизводимости. Максимальные потери составляли 7%. Таким образом, с точностью до 7% мы определяли содержание 4-НГ4Е и 4-1ШОЕ во всех образцах препаратов, изготовленных из использованных нами рыбных жиров.
шиш
м
! Í
i I'll
б)
1 ,L jijjL-^jiiiiU^iU^
Рис. 7. ГЖХ-анализ фракций смеси компонентов АП, полученных после КХ смеси низкомолекулярных компонентов АП.
Обозначения:
а) - объединенные фракции, содержащие 4-Н1ЧЕ;
б) - объединенные фракции, содержащие
2.5 Условия приготовления антимикробного препарата с максимальной
активностью
Варьируя условия приготовления АП и наблюдая за образованием в нем антимикробной активности, мы обнаружили, что наибольшим влиянием на активность препарата обладали следующие факторы:
1) температура реакционной смеси;
2) гомогенность реакционной смеси (поддержание эмульсии).
Перечисленные условия протекания процесса автоокисления жира, а
также степень их влияния на активность препарата были тщательно изучены и на основании полученных результатов мы пришли к следующему:
1. При увеличении температуры реакционной смеси до 55°С активность АП возрастала незначительно, однако при хранении препарата, приготовленного при 55°С и выше, антимикробный эффект значительно снижался. При снижении температуры до 20°С и ниже активность препарата возрастала медленнее и ее максимальный уровень был значительно ниже, чем у АП, изготовленного при 37°С. Таким образом, мы установили, что оптимальной температурой получения препарата с наибольшей активностью является 37°С с возможными небольшими отклонениями (2-3°).
2. Скорость окисления жира зависела от гомогенности системы жир/вода. При постоянном поддержании эмульсии АП образовывался за более короткий промежуток времени, чем при окислении жира, не эмульгированного с водой, и, как следствие, антимикробная активность возрастала быстрее, а ее величина была значительно больше, чем в случае окисления жира не в эмульсии с водой.
На основании результатов наших исследований по определению зависимости активности АП от степени ненасыщенности жира - его источника, было установлено, что препарат из высоконенасыщенного жира сардины проявлял максимальную антимикробную активность на 18 сутки выдержки окисляемой эмульсии жир/вода. В дальнейшем уровень активности не изменялся. В случае использования жиров с меньшей степенью ненасыщенности время образования максимальной активности увеличивалось. Таким образом, мы полагаем, что для приготовления АП с наибольшей антимикробной активностью необходимо использовать жир с высокой степенью ненасыщенности.
Исследовав зависимость активности АП от рН реакционной смеси
(автоокисления жира), мы установили, что для получения препарата с
наибольшим значением активности наиболее приемлемым диапазоном рН
реакционной смеси является интервал от 4.6 до 7.0. При увеличении значения
рН (>7.0) происходило заметное увеличение активности препарата, а также
уменьшение времени его приготовления, однако полученный при таких
условиях препарат в процессе хранения утрачивал практически всю
активность, что несомненно является отрицательным показателем с точки
зрения его использования. По нашему мнению, в щелочной среде наряду с
автоокислением жира интенсивно происходит его гидролиз, приводящий к
увеличению содержания в водной фазе эмульсии солей жирных кислот,
которые, как известно, обладают выраженным антимикробным эффектом, но в
дальнейшем соли ПНЖК окисляются с образованием типичных
представителей ПОЛ. С одной стороны, мы установили, что некоторые ПОЛ, а
именно карбонильные соединения, обладают антимикробной активностью, но
в щелочной среде такие соединения, особенно сг.р-ненасыщенные, легко
/
подвержены конденсации, что и происходило в АП при рН>7. При уменьшении значения рН (<4.6) происходило замедление образования антимикробной активности, также связанное с конденсацией карбонильных соединений, катализируемой как щелочной, так и кислой средой. При этом наибольшее значение антимикробной активности (8000-9000) ЕД/мл было далеко от максимального (при оптимальном интервале рН).
2.4 Влияние (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля иа биосинтез (5Z,8Z,llZ,13i)-15(S)-гидроперокси-5,8,11,13-эйкозатетраеновой кислоты in vitro
В большинстве своем известные к настоящему времени цитотоксические свойства 4-HNE легко применимы в отношении бактерий, что объясняется легкой доступностью данного соединения к клеточным образованиям бактериальной клетки (по сравнению с клетками макроорганизма).
Особенность строения 4-HNE, связанная с а,р-ненасыщенной конфигурацией, предопределяет его способность к инактивации многих ферментов и, как следствие этого, приводит к ингибированию разнообразных жизненно важных метаболических процессов клетки. Одним из таких процессов является окислительный метаболизм ПНЖК. Однако до сих пор влияние 4-HNE на процессы ферментативного окисления ПНЖК широко не изучалось.
Целью нашего исследования было определение степени влияния 4-1ШЕ на процесс липоксигеназного окисления ПНЖК. Варьируя концентрацией 4-1ШЕ в инкубационной смеси при фиксированных концентрациях фермента и субстрата, мы получили зависимость активности 15-Ш от концентрации 4-1ШЕ (рис. 8). Результаты показывают, что при низких концентрациях (до 5 мкМ) 4-Н№ не оказывает влияния на свойства 15-Ш и выход продукта окисления арахидоновой кислоты - 15(8)-гидроперокси-5г,82,112,13Е-эйко-затетраеновой кислоты (15-НРЕТЕ). При увеличении концентрации 4-НГЧЕ с 10 до 50 мкМ наблюдается заметная активация фермента, что может приводить к большому выбросу в цитоплазму клетки 15-НРЕТЕ, большие концентрации в клетке которого могут вызвать возникновение воспалительных процессов. Кроме того, из-за своей неустойчивости 15-НРЕТЕ способен деградировать с образованием продуктов его распада, в том числе токсичных альдегидов, присутствие которых в цитоплазме клетки может обусловливать инактивацию жизненно важных ферментов.
Концентрация 4-HNE, мкМ
Рис. 8. Зависимость удельной активности 15-LO от концентрации 4-HNE
При увеличении концентрации 4-HNE с 50 мкМ до 105 мкМ отмечается снижение активности 15-LO до аномально низкого значения. Это означает, что образующийся 4-HNE может приводить к снижению уровня 15-НРЕТЕ и, следовательно, способствовать формированию дестабилизации нормальных процессов окислительного метаболизма ПНЖК в клетке и разбалансировке уровня оксилипинов. И, наконец, при увеличении концентрации со 105 мкМ
до 310 мкМ происходит незначительный рост удельной активности 15-ЬО, значение которой так и не достигает исходной величины.
Таблица 4.
Сравнительная оценка влияния 4-Н\Е на активность 15-ЬО, генерации 4-*ШЕ различных клеточных процессов и его антимикробной активности
Концентрация 4-ШЕ, мкМ Эффект на ферменты н органоиды клетки* Антимикробная активность, ЕД/мл Эффект на И-Ш
0-5 Отсутствует Не обнаружена Не обнаружен
5-10 Модулирует рост клеток; хемо-таксический агент для нейтро-филов и макрофагов; активирует фосфолипазу С Не обнаружена Не обнаружен
10-50 Генотоксический эффект; релаксация артерий головного мозга человека 6500-21000 Значительная активация
50-105 Потенщшрует агрегацию тромбоцитов 21000-28500 Сильное снижение активности
105-310 Ингибирует синтез белков и ДНК; ингибирует агрегацию тромбоцитов; нарушает катьци-евый гомеостаз; ингибирует дыхание митохондрий; ингибирует клеточное деление; ингибирует ферменты: цитохром Р-450, глюкозо-6-фосфат-дегидрогена-зу, глицерадьдегад-3-фосфат дегадрогеназу, протеинкиназу С, аденилатцихлазу, аминопу-ривдеметилазу 28500-38000 Незначительное восстановление активности
* По литературным данным
Действие 4-Н№ на некоторые ферменты и 15-ЬО, в сравнении с его антимикробным эффектом, показано в табл. 4. При низких концентрациях (до 5 мкМ) 4-1ШЕ не влияет на активность клеточных ферментов, в том числе и 15-1X1. Заметный рост активности 15-ЬО наблюдается в интервале концентраций 4-1ШЕ 10-50 мкМ, при которых проявляется генотоксический и, как установлено нами, антимикробный эффекты этого соединения.
Дальнейшее увеличение концентрации 4-1ШЕ до 105 мкМ приводит к сильной инактивации 15-ЬО (потеря активности около 40% от начальной). В пределах указанных концентраций 4-1ШЕ является инициатором возникновения негативных клеточных процессов, а его антимикробная активность значительно возрастает. При больших концентрациях (свыше 100 мкМ) 4-Н№ вызывает.. восстановление активности 15-ЬО почти до исходного уровня, но одновременно сильно активизирует ряд отрицательных клеточных процессов, приводящих к гибели клетки. Антимикробная активность 4-НКЕ при концентрации выше 100 мкМ (до предельного, исследованного нами значения) продолжает расти.
Таким образом, мы показали, что 4-НЫЕ способен вовлекаться в процесс липоксигеназного окисления ПНЖК на первой же стадии, существенно меняя количественную картину поведения фермента. Однако, влияния на направленность действия 15-ЬО в отношении арахидоновой кислоты мы не отмечали. Во всем исследованном диапазоне концентраций 4-НОТ наблюдалось селективное образование 15-НРЕТЕ.
ВЫВОДЫ
1. Исследована зависимость антимикробной активности нового антимикробного препарата из рыбных жиров от степени ненасыщенности жира -источника препарата. Устаноатено, что наибольшей активностью обладал препарат, приготовленный из жира сардины {ЗагсИпорь теШпо^сЮ), характеризующегося наибольшей степенью ненасыщенности среди выбранных жиров. Наименьшей активностью обладал препарат из частично гидрированного жира той же сардины, имеющего самую низкую степень ненасыщенности в ряду выбранных жиров.
2. Определена связь между процессом автоокисления жира и образованием антимикробной активности препарата. Установлено, что только окисленные производные полиненасыщенных компонентов рыбного жира отвечают за проявление препаратом антимикробного действия.
3. Установлена структура двух главных активных компонентов антимикробного препарата - (2£)-4-пщрокси-2-ноненаля и (2£',62)-4-гидрокси-2,6-но-надиеналя - и впервые исследованы их антимикробные свойства. Определены
минимальные ингибирующие концентрации этих компонентов антимикробного препарата.
4. Проведено исследование влияния одного из главных активных компонентов антимикробного препарата - (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля - на биосинтез одного из первичных липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты - (5Д8Д11Д13£)-15(5)-гидроперокси-5,8,11,13-эйкозатетраеновой кислоты - и установлена двойственность этого влияния, в зависимости от концентрации (2.£)-4-гидрокси-2-ноненаля. Проведено сравнение эффекта (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля на 15-липоксигеназу и генерации (2£)-4-гидрокси-2-ноненалем различных внутриклеточных процессов.
5. На основании результатов исследований по определению причины проявления препаратом антимикробного действия, предложены условия для получения препарата с максимально-возможной активностью.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях
1. Rybin V.G., Shulgina L.V., Davletshina Т.А., Kasyanov S.P., Blinov Ju.G., AJculin V.N. Antimicrobial effect of oxidized fish oils and possible using of it // Thesis on Forth International Congress of Comparative Physiology and Biochemistry. Birmingham. U.K.- 1995.-P. 35.
2. Да&тетшииа T.A., Блинов Ю.Г., Шульгина Л.В., Бывальцева Т.М., Акулин
B.Н., Рыбин В.Г. Сравнительная оценка бактерицидного действия экстрактов из липидов рыб // Тезисы докладов научной конференции "Рыбохозяй-ственные исследования океана". Владивосток,- 1995.- С. 18-19.
3. Шульгина Л.В., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н., Бывальцева Т.М., Давлетшина Т.А., Рыбин В.Г. Сравнительная оценка консервирующего действия антимикробного препарата и антисептиков, используемых в технологии рыбных продуктов // Изв. ТИНРО.-1995,- Т. 118,- С. 32-35.
4. Шульгина Л.В., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н., Давлетшина Т.А., Бывальцева Т.М., Сватко C.B., Рыбин В.Г. Влияние антимикробного препарата на микрофлору и созревание мойвы Mallotus villosus при производстве пресервов специального посола // Изв. ТИНРО.- 1997.- Т. 120,- С. 72-76.
5. Давлетшина Т.А., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н., Шульгина Л.В., Бывальцева Т.М., Рыбин В.Г. Разработка технологии получения антимикробного препарата на основе липидов рыб // Изв. ТИНРО.- 1997,- Т. 120,- С. 61-67.
6. Рыбин В.Г. Новый природный антимикробный препарат из рыбных жиров и отходов жирового производства // Тезисы докладов международной конференции молодых ученых Российского Дальнего Востока "Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока". Владивосток. ВГУЭС.- 1999.- С. 186-187.
7. Рыбин В.Г. Продукты перекисного окисления липидов - активные компоненты нового антимикробного препарата // Тезисы докладов конференции молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов". Владивосток. ТИНРО-центр.- 1999.-
C. 217-218.
8. Талабаева C.B., Рыбин В.Г. Эффект (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля - активного компонента нового природного антимикробного препарата на 15-липок-сигеназу // Тезисы докладов конференции .молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробион-тов". Владивосток. ТИНРО-центр. - 1999.- С. 224-227.
9. Бывальцева Т.М., Давлетшина Т.А., Шульгина J1.B., Блинов Ю.Г., Рыбин
B.Т. Влияние антимикробного препарата из липидов рыб на дрожжеподоб-ные и плесневые грибы в рыбной продукции // Изв. ТИНРО.- 1999.Т. 125,- С. 321-324.
10. Рыбин В.Г., Бывальцева Т.М., Шульгина Л.В., Давлетшина Т.А., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н. Зависимость антимикробной активности водного раствора продуктов окисления рыбных жиров от степени их ненасыщенности // Изв. ТИНРО.- 1999.- Т. 125,- С. 232-237.
11. Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Бывальцева Т.М., Акулин В.Н., Блинов Ю.Г. (2£',62)-4-гидрокси-2,6-нонадиеналь - активный компонент антимикробного препарата // Изв. ТИНРО,- 1999.- Т. 125,- С. 238-243.
12. Рыбин В.Г., Куклев Д.В. Определение 4-гидрокси-2Е-ноненаля в смеси продуктов окисления полиненасыщенных липидов методом газо-жидкост-ной хроматографии //Изв. ТИНРО,- 1999.- Т. 125,- С. 115-121.
13. Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Бывальцева Т.М., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н. (2£)-4-гидрокси-2-ноненаль - активный компонент нового природного антимикробного препарата // Биоорганическая химия,- 1999.- Т. 25.- № 9. -
C. 716-720.
14. Рыбин В.Г., Талабаева C.B. Влияние (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля - продукта перекисного окисления липидов биомембран - на 15-липоксигеназу // Тезисы докладов "И Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии". Владивосток. ДВГУ.-
' 1999.- С. 112-113.
Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр _Владивосток, тупик Шевченко, 4_
Подписано в печать 27.04.2000 г. Формат 60x90/16. Уч.-издл. 1. Тираж 100. Заказ № 9
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рыбин, Вячеслав Григорьевич
Список использованных сокращений.
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1 Антимикробные свойства липидов.
2.1.1 Жирные кислоты.
2.1.2 Продукты окисления липидов.
2.1.2.1 Продукты перекисного окисления липидов, классификация и механизм образования.
2.1.2.2 Биологическая активность продуктов перекисного окисления липидов.
2.1.2.3 а,Р-ненасыщенные альдегиды, механизм действия.
2.1.2.4 Антимикробные свойства продуктов окисления липидов.
2.2 Состав и структура клеточных оболочек микроорганизмов.
2.3 Используемые в пищевой промышленности антисептики, механизм и избирательность их антимикробного действия.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование факторов, определяющих антимикробную активность нового антимикробного препарата из рыбных жиров"
Скрининг природных соединений с целью получения антимикробных агентов представляет перспективное научное направление в биотехнологии. Потенциальными источниками новых антимикробных субстанций является рыбный жир, интенсивные исследования биологической активности соединений которого проводятся в течение последних 30 лет. До настоящего времени использование рыбных жиров в пищевой и медицинской промышленности было обусловлено высоким содержанием п-3 ПНЖК и витаминов групп А и Б. В ТИНРО-центре разработана технология приготовления нового антимикробного препарата (Патент РФ № 2043725, 1995), в основе которой лежит процесс автоокисления рыбных жиров. Полученный препарат имеет природное происхождение, но не уступает по силе и спектру антимикробного действия применяемым в настоящее время синтетическим антисептикам и характеризуется безвредностью в отношении высших организмов. Вместе с тем, как продукт пищевого либо лечебно-профилактического назначения, новый препарат нуждается в изучении его химического состава и биологических свойств отдельных компонентов для обоснования и применения его антимикробного эффекта. В связи с этим, актуальным вопросом является исследование процесса, приводящего к образованию антимикробной активности АП, определение структур его активных компонентов, а также исследование механизма их действия.
ЦЕЛЬЮ настоящего исследования являлось научное объяснение антимикробных свойств антимикробного препарата из рыбных жиров.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
- исследовать кинетику образования антимикробной активности препарата;
- идентифицировать его активные компоненты;
- исследовать биохимические и микробиологические свойства установленных активных компонентов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Проведены исследования механизма образования компонентов антимикробного препарата, обладающих антимикробным действием, показана прямая связь антимикробной активности препарата и окисления рыбного жира - его источника. Обнаружены и выделены 2 продукта автоокисления полиненасыщенных жиров ((2£)-4-гидрокси-2-ноненаль, образующийся при окислении п-6 полиненасыщенных жирных кислот, и (2Е,62^)~ 4-гидрокси-2,6-нонадиеналь, образующийся при окислении п-3 полиненасыщенных жирных кислот), различающихся по степени их ненасыщенности. Установлено наличие антимикробной активности у вышеназванных соединений. Было исследовано и описано влияние (2Е)-4-гидрокси-2-ноненаля на биосинтез (5^8^ 11^13£)-15(8)-гидроперокси-5,8,11,13-эйкозатетраеновой кислоты - первичного липоксигеназного метаболита арахидоновой кислоты. Установлен двойственный (активирующий и ингибирующий, в зависимости от концентрации) эффект (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля на активность 15-липоксигеназы. Проведена сравнительная оценка действие (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля на 15-липоксигеназу, его антимикробной активности и известной генерации данным соединением протекания различных внутриклеточных процессов.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Разработан препаративный способ выделения низкомолекулярных продуктов автоокисления полиненасыщенных жиров. Сформулированы условия приготовления антимикробного препарата с максимально возможной величиной антимикробной активности.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Результаты исследований, вошедшие в настоящую работу докладывались на отчетных сессиях технологического отделения ТИНРО-центра по итогам НИР в 1995, 1998 гг., а также на расширенном межлабораторном коллоквиуме ТИНРО-центра в 1997 г. Отдельные части настоящего исследования были представлены на IV международном конгрессе по сравнительной физиологии и биохимии (Бирмингем, Великобритания, 1995), на региональной конференции "Рыбохозяйственные исследования океана" (Владивосток, 1995), на конференции молодых ученых "Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов" (Владивосток, 1999), на II Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии. (Владивосток, 1999), на международной конференции молодых ученых Российского Дальнего Востока "Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока" (Владивосток, 1999).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Антимикробная активность смеси водорастворимых продуктов окисления рыбного жира зависит от степени ненасыщенности жира.
2. Антимикробная активность получаемого в процессе автоокисления жира препарата обусловливается наличием в нем карбонильных соединений
- 9 продуктов окислительной деградации полиненасыщенных компонентов рыбного жира.
3. Механизм действия активных компонентов препарата определяется их способностью необратимо инактивировать ферменты и может относиться как к антиферментному так и к антиметаболическому типам.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рыбин, Вячеслав Григорьевич
Выводы
1. Исследована зависимость антимикробной активности нового антимикробного препарата из рыбных жиров от степени ненасыщенности жира -источника препарата. Наибольшей активностью обладал препарат, приготовленный из жира сардины (БагсИпорз те1апоя(1с1а), обладающего наибольшей степенью ненасыщенности среди выбранных жиров. Наименьшей активностью обладал препарат, полученный из частично гидрированного жира той же сардины, имеющего самую низкую степень ненасыщенности в ряду выбранных жиров.
2. Определена связь между процессом автоокисления жира и образованием антимикробной активности препарата. Установлено, что только окисленные производные полиненасыщенных компонентов рыбного жира отвечают за проявление антимикробного действия препарата.
3. Установлена структура двух главных активных компонентов антимикробного препарата - (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля и (2£',62)-4-гидрокси-2,6-нонадиеналя - и исследованы их антимикробные свойства. Определены минимальные ингибирующие концентрации этих компонентов антимикробного препарата.
4. Проведено исследование влияния одного из главных активных компонентов антимикробного препарата - (2Е)-4-гидрокси-2-ноненаля - на биосинтез одного из первичных липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты - 1^13£)-15(8)-гидроперокси-5,8,11,13-эйкозатетраеновой кислоты - и установлена двойственность этого влияния, в зависимости от концентрации (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля. Проведено сравнение влияния (2£)-4
-124гидрокси-2-ноненаля на активность 15-липоксигеназы, его антимикробного эффекта и известных генераций им различных внутриклеточных процессов.
5. На основании результатов исследований по определению факторов, обусловливающих антимикробное действие препарата, предложены условия для получения препарата с максимально-возможной активностью.
3.5 Заключение
Выделенные и идентифицированные нами ПОЛ являются не единственными компонентами АП, проявляющими антимикробное действие. Это следует из сравнения общей антимикробной активности АП из жира сардины, которая соответствует 40000 ЕД/мл, а активность 4-ЬИЧЕ и 4-ЕИ>ШЕ при концентрациях, равных их концентрациям в АП, соответствует 6500 ЕД/мл. В то же время, смесь этих компонентов АП, при сумме их парциальных концентраций, равных таковой в АП, показывала активность, немного превышающую 8000 ЕД/мл. С нашей точки зрения это может означать следующее: в АП, кроме установленных нами активных компонентов, присутствуют и другие соединения, обладающие антимикробным действием, однако, вследствие их возможного синергического эффекта, антимикробное действие каждого из них, взятого отдельно при его концентрации, равной таковой в АП, зафиксировать трудно. Однако эта задача является выполнимой и ее решение представляет интерес с точки зрения поиска новых антимикробных агентов. Вся сложность в решении такой задачи заключается в большом разнообразии ПОЛ, образующихся при автоокислении рыбных жиров, обладающих высокой степенью ненасыщенности. На сегодняшний день полный состав смеси ПОЛ не установлен и является
-107предметом для исследований в перспективе. Установленный нами факт наличия антимикробной активности у некоторых представителей ПОЛ обусловливает особый интерес к их определению и исследованию.
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1 Материалы и оборудование
4.1.1 Растворители
В работе были использованы следующие органические растворители: п-гексан, петролейный эфир (40°-70°С), хлористый метилен, хлороформ, бензол, толуол, пиридин, этилацетат, метанол, этанол, изопропиловый спирт, ацетонитрил, ацетон, ацетилацетон, диэтиловый эфир, 1,4-диоксан и тетрагидрофуран. Все растворители очищали по стандартным методикам [173].
4.1.2 Реактивы
Серная, соляная, уксусная, трифторуксусная кислоты, хлористый ацетил, йод, калий йодистый были квалификации "хч"; гидрооксид натрия, гидрооксид калия, гидроокись лития, гидрокарбонат калия, карбонат натрия, хлорид натрия, сульфат натрия, тиосульфат натрия, боргидрид натрия, дигидрофосфат калия, тетраборат калия, фосфорномолибденовая кислота, оксид фосфора (У), ацетат аммония, триметилхлорсилан, N, N -дим етил ф ор м ам ид, гидрохлорид ме-токсиамина, гидрохлорид бензоксиамина, М,0-бис-(триметилсилил)трифтор-ацетамид - квалификации "чда"; натрий - квалификации "ч". 15-липоксигеназа (липоксигеназа из соевых бобов, тип I) была приобретена у химической компании "Sigma".
4.1.3 Культуры микроорганизмов
Штаммы всех использованных в работе микроорганизмов {Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonad fluorescus, Clostridium botulinum и Candida albicans) были получены из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. J1.A. Тарасевича (г. Москва).
4.1.4 Тонкослойная хроматография
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках с силикагелем "Merck", закрепленным золем кремниевой кислоты, с применением систем: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота 2:3:0.05* (метод А) и бензол (метод Б). Все значения Rf приведены для этого вида хроматографии. Для обнаружения веществ на хроматограммах использовали 5%-й раствор серной кислоты в метаноле либо 10%-й раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле.
4.1.5 Колоночная хроматография
Колоночную хроматографию (КХ) проводили с использованием силикагеля L Chemapol (ЧСФР) (40-100 мкм, 40 г). На колонку наносили 2.5 г сухой смеси продуктов окисления жира. Элюировали в следующей последовательности: сначала гексаном (200 мл), затем бензолом (800 мл) и далее смесью бензол-этилцетат (1:1, 600 мл). Элюат собирали в пробирки по 10-30 мл Фракции, по данным ТСХ содержащие близкие по составу смеси, объединяли, упаривали и высушивали в вакууме.
4.1.6 Твердофазная экстракция
Аналитическую твердофазную экстракцию осуществляли на колонках - Здесь и далее все соотношения для смесей растворителей - объемные.
Supelclean Ci8 (США), и Sep-Pak Cis Cartridge (США) с использованием водно-метанольных систем в качестве элюента. Установка для препаративной твердофазной экстракции состояла из модифицированного жидкостного градиентного насоса PPM ("Micritechna", ЧСФР) со скоростью потока до 20 мл/мин., алюминиевой экстракционной гильзы (15x200 мм) заполненной обращеннофазным силикагелем С12 (40-100 мкм, Юг), проточного УФ-детектора Hitachi CLC-5-UY (Япония). В качестве элюента использовались водно-метанольные и водно-этанольные системы.
4.1.7 Высокоэффективная жидкостная хроматография
Аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляли на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-6A (Япония) с использованием колонок Zorbax ODS (4.6 х 250 мм, 5 мкм, DuPont, США) или Separon SGX Ci8 (4.6 х 250 мм, 4 мкм "Tessek", ЧСФР). В качестве детекторов использовали рефрактометр RID-6A и УФ-детектор с диодной матрицей SPD-M6A (оба - Shimadzu, Япония). Скорость элюирования 1 мл/мин. Для препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали колонку "Zorbax ODS" (9.4 х 250 мм, 5 мкм), скорость элюирования составляла 6 мл/мин. В качестве элюента применяли системы растворителей метанол-вода-уксусная кислота (60:40:0.05) - система 1, метанол-вода-уксусная кислота (85:15:0.05) - система 2, ацетонитрил-уксусная кислота (100:0.05) - система 3, ацетонитрил-вода-уксусная кислота (80:20:0.05) - система 4, метанол-вода-уксусная кислота (90:10:0.05) - система 5.
4.1.8 Газожидкостная хроматография
Анализ метиловых эфиров жирных кислот и их производных (МЭЖК) проводили на газовых хроматографах "Shimadzu GC-14B" и "Shimadzu GC-16A" с пламенно-ионизационными детекторами. В работе были применялись насадочные и капиллярные кварцевые колонки. Гелий использовался в качестве газа носителя. Хроматографическое разделение МЭЖК проводили в зависимости от задачи на следующих фазах: Carbowax-20M, OV-lOl, Silar-5CP. Условия хроматографии подбирались индивидуально для каждой фазы и размеров колонок. В качестве стандартов были использованы метиловые эфиры полностью-цис-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновой, полностью-цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой и полностью-цис-5,8,11,14-эйкозатетраеновой (арахидоновой) кислот с чистотой 98%, а также метиловые (этиловые) эфиры жирных кислот из семян льна и универсальная стандартная смесь метиловых эфиров природных жирных кислот, любезно предоставленная Н.В. Науменко (ДВГУ). Эфиры жирных кислот идентифицировали с использованием метода эквивалента длины цепи (индексов Ковача - ECL (equivalent chain-lengths)) [174]. Обработку хроматограмм проводили на базе обсчета данных Chromatopac C-R4AX ("Shimadzu", Япония).
4.1.9 Спектроскопическое оборудование
УФ-спектры регистрировали на приборах Specord UY VIS (ГДР) и Perkin-Elmer 555 UV-VIS (Германия), в качестве растворителя использовали метанол. Спектры 'Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker WM-500 (Германия), химические сдвиги протонов приведены относительно внутреннего стандарта -(CHs)4Si для растворов в дейтерохлороформе. Все отнесения сигналов сделаны на основании экспериментов с селективным подавлением протонов. Масс-спектры регистрировали на приборе Finnigan Mat 4615В (США) при ионизации электронным ударом (70 эВ) и прямым вводом пробы в источник. ИК-спектры регистрировали на приборе 1Ы-420, (БЫта&ш, Япония) в хлороформе.
4.1.10 Источники липидов
В работе были использованы животные, рыбные, и растительные жиры и масла. Льняное масло было получено из семян льна гомогенизацией и экстракцией с хлороформом. Образцы рыбных жиров получали из сардины {ЗагсИпорв те1апо$йс1а), сайры (СоШаЫя .т1га), а также печени минтая (Theragra ска1^гатта) по методу Блайя и Дайера [175]. Частично гидрированный жир сардины был получен, как описано [176]. Источником арахидоновой кислоты (АК) являлись липиды печени крупного рогатого скота.
4.1.11 Хранение липидов
Растворы образцов липидов в органических растворителях (концентрация до 5%) хранили при температуре -40°С, в запаянных стеклянных ампулах. При длительном хранении к раствору образца добавляли ионол (2,6-ди-трет-бутилкрезол) в концентрации 0.05% от веса липидов.
4.2 Общие методы
4.2.1 Получение арахидоновой кислоты
4.2.1.1 Получение смеси жирных кислот
В эмалированную емкость объемом 4 л помещали 630 г сырого паштета из говяжьей печени. К печеночному гомогенату добавляли 380 мл этилового спирта и 420 мл 15%-го водного раствора ЫаОН и выдерживали при температуре кипения в течение 8 ч при непрерывном перемешивании. Получали непрозрачный темно-коричневый раствор.
4.2.1.2 Обогащение смеси жирных кислот полиненасыщенными жирными кислотами
К полученному раствору (см п 4.2.1.1.) добавляли 100 мл п-гексана. Смесь энергично перемешивалась, после расслоения верхний слой отделяли. Процедуру повторяли 3 раза. По данным ТСХ интенсивность окраски пятен со значением холестерина уменьшалась с каждой экстракцией. В нижний слой добавляли 30%-й раствор Нг804 до рН 4. После чего экстрагировали жирные кислоты гексаном (100 мл х 3 раза) до полного извлечения жирных кислот (контроль проводили методом ГЖХ). Экстракты объединяли.
Полученный объединенный экстракт охлаждали до -30°С, после чего осадок отделяли фильтрованием. Содержание ПНЖК в полученном фильтрате увеличивалось на 10-15%) по сравнению с исходным раствором жирных кислот. Раствор сушили над Каг804 (безв.), упаривали в вакууме досуха и остаток взвешивали. Получали 6.9 г жирных кислот.
4.2.1.3 Получение А-4 и А-5 полиненасыщенных жирных кислот методом йодлактонизации
6.9 г жирных кислот, полученных после кристаллизации в гексане, растворяли в 125 мл 5.6%>-го водного раствора КаНСОз при перемешивании в течение 30 минут. К полученной смеси добавляли 241 мл 12%-го раствора К1з в этаноле и выдерживали в течение 12 ч при непрерывном перемешивании и температуре 0°С. После окончания реакции в реакционную смесь добавляли 40%-й водный раствор МагБгОз до исчезновения окраски йода. Йоддактоны экстрагировали п-гексаном (4 х 80 мл). Экстракты объединяли, сушили над
Na2SÛ4 (безв.), упаривали в вакууме и остаток взвешивали. Получали 2 г смеси непрореагировавших жирных кислот и сумму йодлактонов.
4.2.1.4 Разделение йодлактонов А-4 и А-5 полиненасыщенных жирных кислот
На колонку объемом 155 см3, заполненную суспензией силикагеля КСК
30 г, 20-ти минутная фракция) в гексане, наносили 2 г полученной смеси (см пункт 4.2.1.3.) и элюировали 600 мл сухого бензола. Фракции собирали по 12 мл, контроль осуществлялся методом ТСХ. Фракции, содержащие йодлактоны А-5 ПНЖК и йодлактоны докозагексаеновой кислоты объединяли соответственно, упаривали досуха в вакууме и взвешивали. Получали 246 мг йодлактонов А-5 ПНЖК и 210 мг йодлактонов докозагексаеновой кислоты.
4.2.1.5 Восстановление йодлактонов
246 мг йодлактонов арахидоновой кислоты растворяли в 13.8 мл сухого ацетонитрила. К полученному раствору прибавляли раствор 460 мкл триметилхлорсилана в 1 мл сухого ацетонитрила и 595 мг KI. После перемешивания в течение 40 минут, в реакционную смесь добавляли 13.8 мл НгО и 40%-й водный раствор ЫагБгОз до исчезновения окраски йода. Восстановленную арахидоновую кислоту экстрагировали из реакционной смеси п-гексаном (5 х 20 мл). Получали 107 мг арахидоновой кислоты, чистотой 89% (примесь - эйкозапентаеновая кислота (11%)).
4.2.1.6 Разделение смеси метиловых эфиров жирных кислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии
Смесь метиловых эфиров арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот, содержащую 89% арахидоновой кислоты, разделяли на колонке "Zorbax ODS" (250 х 9.4 мм, 5 мкм), скорость элюирования 5 мл/мин, температура колонки 55°С, детекция 215 нм. В качестве элюента использовали систему растворителей метанол-вода (90:10). Фракции, содержащие индивидуальные компоненты анализировали методом ГЖХ, предварительно упарив в вакууме и проэкстрагировав метиловые эфиры из водно-метанольной смеси п-гексаном. Полученные экстракты упаривали досуха в вакууме и взвешивали. Получали 26 мг метилового эфира арахидоновой кислоты чистотой (99.8+2)%. Чистота проверялась методом ГЖХ.
4.2.2 Получение метиловых эфиров жирных кислот
4.2.3.1 Метод 1
К раствору 100 мг жирной кислоты 10 мл эфира прибавляли по каплям эфирный раствор диазометана до появления слабожелтого окрашивания. Реакционную смесь выдерживали в течение 15 мин при комнатной температуре, упаривали на вакууме, растворяли в n-гексане. Метиловые эфиры жирных кислоты имели Rf 0.9(A). По данным ГЖХ, в описанных условиях не происходило побочных реакций внедрения и присоединения.
4.2.3.2 Метод 2
Аликвоту липидов (1-2 мг) растворяли в 0.5 мл бензола и добавляли 0.5 мл 1%-го раствора метилата натрия в метаноле. Смесь выдерживали в течение
-11630 мин при 55°С в пробирке с притертой пробкой, затем добавляли 0.5 мл 5% раствора хлористого водорода в метаноле. Смесь снова нагревали 30 мин при 55°С. Пробу разбавляли дистиллированной водой (1 мл) и образовавшиеся метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном (1 мл). Слой гексана переносили в колбу и упаривали под вакуумом, перерастворяли в гексане и проводили очистку эфиров на пластинках в системах: бензол, гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (80:20:1). Область, по хроматографической подвижности соответствующую стандартным метиловым эфирам жирных кислот, снимали с пластинки, экстрагировали хлороформом и упаривали в вакууме. Пробу перерастворяли в 100 мкл гексана и анализировали методом ГЖХ. Очистку препаративных количеств метиловых эфиров жирных кислот проводили на колонке с силикагелем, элюируя системой растворителей гексан -диэтиловый эфир (9:1) или на колонке с окисью алюминия, элюируя гексаном.
4.2.3 Гидролиз эфиров жирных кислот
К раствору 2 мг эфира жирной кислоты в 200 мкл этилового спирта прибавляли 0.5 мл 1.5 М ЬЮН, 1 мл этилового спирта и 1 мл воды и оставляли на 16 ч при 20°С. Затем к реакционной смеси прибавляли 10 мл воды и осторожно подкисляли 1.5 М НС1 до рН 4. Далее, к реакционной смеси добавляли 10 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1), после чего отделяли верхний слой. Процедуру повторяли 3 раза. Гексановый слой промывали водой (2x20 мл), насыщенным раствором ЫаС1 (15 мл) и сушили над №2804 (безв.). Осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме и получали 1.5 мг (75%-й) свободной жирной кислоты. ПНЖК имели Яг 0.49(А).
-1174.2.4 Получение триметилсилильных производных спиртов (Me^Si-OR) для масс-спектрометрического анализа
3-10 мг образца спирта растворяли в 100 мкл смеси N,0-6hc-(триметилсилил)трифторацетамида, реакционную смесь выдерживали 1 час при температуре 60°С. После охлаждения к реакционной смеси прибавляли 1 мл n-гексана и 1 мл насыщенного водного раствора NaCl, смесь энергично встряхивали, сушили над малым количеством Na2S04 (безв.), упаривали в токе аргона, и сухой остаток перерастворяли в 2 мл n-гексана. Полученные триметилсилиловые эфиры спиртов имели Rf 0.9(A).
4.2.5 Получение метоксииминов и бензоксииминов карбонильных соединений для масс-спектрометрического анализа
3-10 мг образца карбонильного соединения растворяли в 100 мкл насыщенного раствора гидрохлорида метоксиамина ("Fluka") или гидрохлорида бензоксиамина ("Fluka") в пиридине, реакционную смесь выдерживали 12 ч при температуре 40°С. После охлаждения реакционную смесь упаривали в токе аргона, сухой остаток растворяли в 2 мл n-гексана. Полученные метоксиимины и бензоксиимины карбонильных соединений имели Rf 0.9(A).
4.2.6 Определение бактерицидной активности
Раствор 30 мкг сухого образца окисленных липидов в 300 мкл 0.1 М водного раствора ИагСОз, делили на 6 равных частей, 5 из которых разбавляли 0.9%-м раствором NaCl в воде в объемных соотношениях 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 и 1:5, соответственно. В качестве контрольной пробы использовали 1 мл 0.9%-го раствора NaCl в воде. К каждой пробе прибавляли по 1 млрд клеток тест-культуры Escherichia coli М-17, смесь выдерживали 24 ч при температуре 25°С, после чего в каждый образец прибавляли мясопептонный бульон с глюкозой в соотношении 1:5 (образец/бульон, об/об). Далее смесь инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч. Активность определяли по методу [177], используя кривые биологического действия бензилпенициллина. В случае обнаружения антимикробной активности при разведении 1:5, процедуру повторяли при больших разведениях образцов до исчезновения активности. Аналогичные процедуры проводили с культурами Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonadfluorescus, Clostridium botulinum.
4.2.7 Определение фунгицидной активности
Раствор 30 мкг сухого образца окисленных липидов в 300 мкл 0.1 М водного раствора КагСОз, делили на 6 равных частей, 5 из которых разбавляли 0.9%-м раствором NaCl в воде в объемных соотношениях 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 и 1:5, соответственно. Каждую пробу после добавления в нее по 1 млрд клеток тест-культуры Candida albicans заливали по 15-20 мл одной из питательных сред: сусло-агаром, Сабуро, синтетической с антибиотиками. Образцы помещали в термостат и выдерживали при температуре 25°С в течение 5 суток. В качестве контрольной пробы использовали 1 мл 0.9%о-го раствора NaCl в воде. Для количественного определения выбирали образцы, в которых вырастало от 15 до 150 колоний плесневых или дрожжеподобных грибов. Активность определяли по методу [177], используя кривые биологического действия нистатина. В случае обнаружения фунгицидной активности при разведении 1:5, процедуру повторяли при больших разведениях образцов до исчезновения активности.
4.2.8 Определение удельной активности 15-липоксигеназы
К 1 мл раствора 15-LO (0.006 мг/мл) в буро-фосфатном буфере (0.05 М, pH 9.0), предварительно насыщенного кислородом, прибавляли 190 мкл 0.847 мМ раствора АК в том же буфере. Реакционную смесь выдерживали 1 мин при 25 °С, после чего прибавляли 200 мкл 1.4 М раствора HCL для остановки реакции. После остановки реакции липидные компоненты реакционной смеси извлекали, используя метод твердофазной экстракции (см. п. 2.1.5) и анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Далее рассчитывали удельную активность фермента, значение которой составило 2.58 мкмоль/(мин х мг белка).
4.3 Получение антимикробных агентов
4.3.1 Приготовление антимикробного препарата
В стеклянную плотно закрывающуюся бутыль объемом 40 л помещали 2700 г рыбного жира сардины и 27 л воды, подкисленной 10%-й соляной кислотой до pH 4.6. Смесь гомогенизировали в течение 2 мин на механической мешалке, плотно укупоривали и выдерживали при температуре 37°С в течение 35 суток. По прошествии каждых полных суток реакционную смесь тщательно гомогенизировали до образования эмульсии. По истечении срока реакции водный слой отделяли, фильтровали, плотно укупоривали и хранили при 0°С.
4.3.2 Определение суммы свободных жирных кислот (кислотное число)
Определение суммы свободных жирных кислот проводили как описано [178]
Метод определения основан на взаимодействии свободных жирных кислот с гидрооксидом калия.
-1204.3.3 Определение перекисных чисел
Определение значений перекисных чисел в опытном субстрате проводили согласно [178].
Сущность метода основана на взаимодействии перекисей, содержащихся в жире, с йодистым калием в присутствии ледяной уксусной кислоты с выделением йода, содержание которого определяют титрованием, используя для этого раствор тиосульфата натрия.
4.3.4 Определение формальдегида (показатель накопления вторичных продуктов окисления)
Метод определения формальдегида в растворах основан на взаимодействии последнего с ацетилацетоном и ацетатом аммония в слабом растворе уксусной кислоты. В результате этой реакции образуется окрашенное в желтый цвет соединение диацетилдигидолутидин, и интенсивность окраски определяемого раствора зависит от концентрации формальдегида [179].
4.3.5 Экстракция антимикробных агентов
Экстракцию антимикробных агентов проводили при 25°С, добавляя в водный раствор хлороформ в соотношении 1:10 (хлороформ-водный раствор) при непрерывном перемешивании в течение 30 мин. После отделения хлороформного слоя процедуру повторяли. Хлороформные фракции объединяли, сушили над безводным №2804 и упаривали в вакууме досуха, остаток растворяли в бензоле в соотношении 1:1 по весу и хранили при 0°С. Из 27 л исходного водного раствора получали 5.8 г водорастворимых продуктов окисления жира.
4.3.6 Разделение смеси антимикробных агентов на компоненты
4.3.6.1 Предварительное разделение (колоночная хроматография на силикагеле)
5.7 г сухого остатка наносили на колонку (3 х 44 см), заполненную 80 г силикагеля согласно п. 2.1.4. и элюировали в следующей последовательности: гексан (200 мл) --> бензол (800 мл) --> бензол-этилацетат (600 мл). Фракции собирали по 15-20 мл. Контроль проводили методом ТСХ (п. 2.1.З.). После объединения фракций, содержащих компоненты с близким значением Яг, получали фракции, которые тестировались на наличие антимикробной активности.
4.3.6.2 Получение индивидуальных компонентов смеси антимикробных агентов (высокоэффективная жидкостная хроматография на обращенной фазе)
Фракции, проявляющие антимикробную активность, анализировали методом ВЭЖХ (п. 2.1.6.) и разделяли на компоненты методом препаративной ВЭЖХ согласно п. 2.1.7. Получали фракции, содержащих максимально до 5 компонентов. Содержание главных компонентов в полученных фракциях составляло 95-98%. Все фракции тестировались на наличие антимикробной активности.
4.4 Липоксигеназное окисление арахидоновой кислоты в присутствии (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля
К 1 мл раствора 15-липоксигеназы (тип I) (0.006 мг/мл) в буро-фосфатном буфере (0.05 М, рН 9.0), предварительно насыщенного кислородом, прибавляли 1.7 мкл 36 мМ раствора (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля в этаноле. Полученный раствор выдерживали в течение 2 мин, после чего к нему прибавляли 190 мкл
-1220.847 мМ раствора арахидоновой кислоты в том же буфере. Реакционную смесь выдерживали 1 мин при 25 °С, после чего прибавляли 200 мкл 1.4 М раствора HCL для остановки реакции.
Концентрации компонентов в реакционной смеси: Арахидоновая кислота -129 мкМ; 15-липоксигеназа - 0.0048 мг/мл. (2Е)-4-гидрокси-2-ноненаль - 50 мкМ
После остановки реакции липидные компоненты реакционной смеси извлекали, используя метод твердофазной экстракции (см. п. 4.1.6)
Эксперимент повторяли для следующих концентраций (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля в реакционной смеси: 5 мкМ, 10 мкМ, 86 мкМ, 105 мкМ, 168 мкМ, 209 мкМ, 310 мкМ. Далее рассчитывали значение удельной активности фермента для каждой концентрации (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыбин, Вячеслав Григорьевич, Владивосток
1. Clark J.R. On the toxic effect of deleterious agents on the germination anddevelopment of certain filamentous fungi // Bot. Gaz.- 1899.- V. 28,- P. 289-314.
2. Kabara J.J. Fatty acids and derivatives as antimicrobial agents //ACS Symposium
3. Series.- 1978. P. 203-210.
4. Shukla H.S., Tripathi S.C. Antifungal substance in the essential oil of anise
5. Pimpinella-Anisum L ) //Agrical. Biol. Chem.- 1987.- V. 51. №7.- P. 1991-1993.
6. Dube S., Kumar A., Tripathi S.C. Antifungal and insect-repellent activity ofessential oil of Zanthoxylum-Alatum I/ Ann. Bot.- 1990.- V. 65. №4.- P. 457-459.
7. Odebiyi O.O. Isolation of a new flavone and some essential oils with antimicrobialand antifungal properties from the Stem Bark of Jatropha podagrica I/ Planta Medica.- 1982.- V. 45. №3.- P. 138-138.
8. Dubey P., Tripathi S.C. Studies on antifungal, physicochemical and phytotoxicproperties of the essential oil of Piper-Betle // Journal of Plant Diseases and Protection.- 1987.- У. 94. №3.- P. 235-241.
9. Petrowitz H.J., Wagner S. Thin-layer chromatography of insecticidal andfungicidal agents in oil-borne wood preservatives // Fresenius Zeitschrift fur Analytische Chemie.- 1981.-V. 305. №3.-P. 196-199.
10. Mallea M., Anfosso F., Charpin J., Soler M. Antifungal activity of aromatic
11. Essential Oils // Pathologie Biologie.- 1979,- V. 27. №10.- P. 597-602.
12. Asada Т., Ishimoto Т., Sakai A., Sumiya K. Insecticidal and antifungal activity in
13. Garg S.C., Dengre S.I. Antifungal efficacy of some essential oils // Pharmazie.1988.-V. 43. №2.- P. 141-142.
14. Garg S.C., Siddiqui N. Antifungal activity of some essential oil isolates // Pharmazie.- 1992.- V. 47. №6.- P. 467-468.
15. Misra T.N., Singh R.S., Pandey H.S., Prasad C., Singh B.P. Antifungal essentialoil and a long-chain alcohol from Achyranthes aspera II Phytochem.- 1992.- V. 31. №5.-P. 1811-1812.
16. Dwivedi S.K., Dubey N.K. Potential use of the essential oil of Trachyspermumammi against seed-borne fungi of Guar (Cyamopsis tetragonoloba L (Taub)). // Mycopathologia.- 1993.-V. 121. №2.-P. 101-104.
17. Hammerschmidt F.J., Clark A.M., Soliman F.M., Elkashoury E.S.A., Elkawy
18. M.M.A., Elfishawy A.M. Chemical-composition and antimicrobial activity of essential oils of Jasonia candicans and J-Montana // Planta Medica.- 1993.- Y. 59. №1.- P. 68-70.
19. Song-Lin Lim, Seo-Hyun Kim, Yuong-Hwan Ko, Chang-Kyung Oh, Myeong
20. Cheol Oh, Yong-Gu Ko, Che-Seok Park. Extraction yields of Hizikia fusiforme and Aloe vera linne by supercritical carbon dioxide and antimicrobial activity of their extracts //Korean J. Food Sci. Technol.- 1995. -V. 27. №1.- P. 68-73.
21. Soon-Yeong Cho, Byeong-Jin Yon, Mi-Hwa Chang, Soo-Jung Lee, Nak-Ju Sung,
22. Fuller R., Moore J.H. The inhibition of the growth of Clostridium welchii by lipidsisolated from the contents of the small intestine of the pig // J. Gen. Microbiol.-1967.-V. 46,-P. 23-28.
23. Bayliss M. Effect of the chemical constitution of soaps upon their germicidal properties /7 J. Bacteriol.- 1936.- V. 31,- P. 489-497.
24. Kodicek E. The effect of unsaturated fatty adds on gram-positive bacteria // Soc.
25. Exp. Biol. Symp.- 1949.- V. 3.- P. 217-224.
26. Nieman C. Influence of trace amounts of fatty acids on the growth ofmicroorganisms // Bacteriol. Rev.- 1954.-V. 18.-P. 147-161.
27. Chattaway F.W., Thompson C.C., Barlow A.J.E. Action of inhibitors ondermatophytes // Biochem. J.- 1956.- V. 63,- P. 648-657.
28. Classman H.N. Surface active agents and their application in bacteriology // Bacteriol. Rev.- 1948.-V. 12.- P. 105-117.
29. Prince H.N. Effects of pH on the antifungal activity of undecylenic acid and itscalcium salt //J. Bacteriol.- 1959. V. 78.- P. 788-796.
30. Stock C.C., Francis T. The inactivation of the virus of epidemic intluenza by soaps //J. Exp. Med.- 1940.- V. 71.-P. 661-669.
31. Stock C.C., Francis T. The inactivation of the virus of lymphocyticchoriomeningitis by soaps //J. Exp. Med.- 1943.- V. 77,- P. 323-331.
32. Baker Z., Harrison R.W., Miller B.F. Action of synthetic detergents on themetabolism of bacteria //J. Exp. Med.- 1941.- V. 73.- P. 249-255.
33. Classman H.N. Surface-active agents and their application in bacteriology //
34. Bacteriol. Rev.- V. 12.- P. 105-117.
35. Baker Z., Harrison R.W., Miller B.F. Inhibition by phospholipids of the action ofsynthetic detergents on bacteria //J. Exp. Med.- 1941.- V. 74.- P. 621-632.
36. Reichenbach H. The effect of soaps on Echerichia coli // Z. Hyg. Infektionskr.1908.-V. 59.-P. 296-302.
37. Walker J.E. The germicidal properties of chemically pure soaps. // J. Infect. Dis.1924.-V. 35,-P. 557-568.
38. Walker J.E. The germicidal properties of soap // J. Infect. Dis.- 1925.- Y. 37.1. P. 181-193.
39. Waker J.E. The germicidal properties of soap // J. Infect. Dis.- 1926.- V. 38.1. P. 127-136.
40. Eggerth A.H. The effect of the pH on the germicidal action of soap // J. Gen.
41. Physiol.- 1926.-V. 10.-P. 147-158.
42. Eggerth A.H. Effect of serum upon the germicidal action of soaps // J. Exp. Med.1927.-Y. 46.-P. 671-679.
43. Eggerth A.H. Gemicidal and hemolytic action of alpha-bromo soaps // J. Exp.
44. Med.- 1929,- V. 49,- P. 299-311.
45. Eggerth A.H. Germicidal action of alpha-mercapto and alpha-disulfo soaps // J.
46. Exp. Med.- 1931.- V. 53.- P. 27-39.-12941. Larson W.P. The influence of the surfacc tension of the culture medium on bacterial growth // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1921,- V. 19.- P. 62-78.
47. Larson W.P., Nelson E. The antigenic properties of pneumococci and streptococcitreated with sodium ricinoleate // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1925.- V. 22.-P. 357-368.
48. Miller C.P., Castles R. The effect of sodium ricinoleate on the gonococcus // J.
49. Bacteriol.- 1931.-V. 22.-P. 339-352.
50. Kolmer J.A., Rule A.M., Madden B. Chemothrapeutic studies with sodiumricinoleate // J. Lab. Clin. Med.- 1934.- Y. 19.- P. 972-980.
51. Bayliss M. Effect of the chemical constitution of soaps upon their germicidal properties //J. Bacteriol.- 1936.- V. 31.-P. 489-502.
52. Winslow C.E.A., Lochridge E.E. The toxic effect of certain acids upon typhoidand colon bacilli in relation to the degree of their dissociation // J. Infect. Dis.-1906.-V. 3.-P. 547-556.
53. Reid J.D. The disinfectant action of certain organic acids // Am. J. Hyg.- 1932.- V.16.-P. 510-525.
54. Hoffman C., Schweitzer T.R., Dalby G. Fungistatic properties of the fatty acidsand possible biochemical significance // Food Res.- 1939.- V. 6.- P. 539-551.
55. Levine A.S., Fellers C.R. Action of acetic acid on food-spoilage microorganisms //
56. J. Bacteriol.- 1940.-Y. 39.-P. 499-511.
57. Albert A. "Selective Toxicity," Methuen, London, Chapter 4.
58. Tetsumoto S. Sterilizing action of acids. III. Sterilizing action of saturated monobasic fatty acids //J. Agric. Chem. Soc. Japan.- 1933.- V. 9.- P. 563-571.
59. Thornton R.H. Antifungal activity of fatty acids to Pithomyces chartatum (Berkand Curt) M.B. Ellis and other fungi // N.Z. J. Agric. Res.- 1963.- V. 6.-P. 469-481.
60. Kodicek E., Worden A.N. Effect of unsaturated fatty acids on Lactobacillushelveticus and other gram-positive microorganisms // Biochem. J.- 1945,- V. 39.-P. 78-91.
61. Gershon H., Parmegiani R. Organic fluorine compounds II. Synthesis andantifungal properties of 1-fluoro fatty acids // J. Med. Chem.- 1967.- Y. 10.-P. 186-198.
62. Wang L.L., Johnson E.A. Inhibition of Listeria monocytogenes by fatty acids andmonoglycerides // Applied & Environmental Microbiology.- 1992.- V. 58. №2.-P. 624-629.
63. Hogan J.S., Pankey J.W., Duthie A.H. Growth inhibition of mastitis pathogens bylong-chain fatty acids // J. Dairy Sci.- 1987.- Y. 70. №5,- P. 927-934.
64. Akaike T., Ijiri S., Sato K., Katsuki T., Maeda H. Determination of peroxylradical-scavenging activity in food by using bactericidal action of alkyl peroxyl radical // J. Agrical. Food Chem.- 1995.- V. 43. №7.- P. 1864-1870.
65. Garg A.P., Muller J. Fungitoxicity of fatty acids against dermatophytes // Mycoses.- 1993.- V. 36. №1,2.- P. 51-63.
66. Keeney E.L.„ Fungistatic and fungicidal effects of sodium propionate on common pathogens // Bui. Johns Hopkins Hosp.- 1943.- V. 71.- P. 379.
67. Keeney E.L. New preparations for the treatment of fungous infections. In vitro andin vivo experiments with fatty acid salts, penicillin and sodium sulfathiayole // Clin. Invest.- 1944.- V. 23.- P. 929-936.
68. Benyagoub M., Rhlid R.B., Belanger R.R. Purification and characterization of new fatty acids with antibiotic-activity produced by Sporothrix flocculosa II J. Chem. Ecol.- 1996.- V. 22. №3,- P. 405-413.
69. Ababouch L., Chaibi A., Busta F.F. Inhibition of bacterial spore growth by fattyacids and their sodium salts. J. Food Prot.- 1992,- V. 55. №12.- P. 980-984.
70. Feldlaufer M.F., Knox D.A., Lusby W.R., Shimanuki H. Antimicrobial activity of fatty acids against Bacillus larvae, the causative agent of american foulbrood disease //Apidologie.- 1993.- V. 24. №2.- P. 95-99.
71. Carballeira N.M., Reyes E.D., Sostre A., Rodriguez A.D., Rodriguez J.L.,
72. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов вбиологических мембранах.- М.: Наука, 1972.- 252 с.
73. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко JI.JI. Проблема анализа эндогенныхпродуктов окисления липидов. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика, (ред. Ю.А. Овчинников). Изд-во ВИНТИ, 1986.- Т. 118.- 137 с.
74. Beckman J.K., Howard M.J., Greene H.L. Identification of hydroxyalkenals formed from omega-3 fatty acids // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1990.-V. 31.-P. 39-45.
75. Esterbauer H. Aldehydic products of lipid peroxidation // in Free Radicals, Lipid Peroxidation and Cancer. 1982. P. 121-128.
76. Kaneko Т., Honda S., Nakano S., Matsuo M. Lethal effects of a linoleic acidhydroperoxide and its autoxidation products, unsaturated aliphatic aldehydes, on human diploid fibroblasts // Chemico-Biological Interactions.- 1987.- V. 63. №2.-P. 127-137.
77. Jagt D.L.V., Ко lb N.S., Jagt T.J.Y., Chino J., Martinez F.J., Hunsaker L.A.,
78. Royer R.E. Substrate-specificity of human aldose reductase identification of 4-hydroxynonenal as an endogenous substrate // Biochim. Biophis. Acta.- 1995.-V. 1249. №2.-P. 117-126.
79. Di Mauro C., Cavalli G., Curzio M., Ferretti C., Mengozzi G., Rossi M.A.,
80. Paradisi L., Dianzani M.U. Evidences of 4-hydroxynonenal involvement in modulation of phagocyte activities // International Journal of Tissue Reactions.-1995.-V. 17. №2,-P. 61-72.
81. Friguet B., Stadtman E.R., Szweda L.I. Modification of glucose-6-phosphatedehydrogenase by 4-hydroxy-2-nonenal formation of cross-linked protein that inhibits the multicatalytic protease // J. Biol. Chem.- 1994.- V. 269. №34.-P. 21639-21643.
82. Uchida K., Stadtman E.R. Covalent attachment of 4-hydroxynonenal toglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase a possible involvement of intramolecular and intermolecular cross-linking reaction // J. Biol. Chem.- 1993.-V. 268. №9.- P. 6388-6393.
83. Esterbauer H., Zollner H., Lang J. Metabolism of hydroxynonenal in rat liver cells //Biochem. J.- 1985,- V. 228.- P. 363-372.
84. Grune T., Siems W.G., Petras T. Identification of metabolic pathways of the lipid peroxidation product 4 hydroxynonenal in situ perfused rat kidney // J. Lipid Res.- 1987.-Y. 38. №8.-P. 1660-1665.
85. Esterbauer H. Cytotoxicity and genotoxicity of lipid-oxidation products // Am. J.
86. Clin. Nutr.- 1993,- Y. 57. №5,- P. 779-786.
87. Takamura H., Gardner H.W. Oxygenation of (3Z)-alkenal to (2£)-4-hydroxy-2alkenal in soybean seed (Glycine-Max L) // Biochim. Biophys. Acta.- 1996.-Y. 1303. №2.-P. 83-91.
88. Canuto, R.A.; Muzio, G.; Maggiora, M.; Biocca, M.E.; Dianzani, M.U.
89. Glutathione-S-transferase, alcohol-dehydrogenase and aldehyde reductase activities during diethylnitrosamine-carcinogenesis in rat liver // Cancer Letters. -1993.-V. 68. №2,3.-P. 177-183.
90. Raguenez-Viotte G., Dieber-Rotheneder M., Dadoun C., Fillastre J.P., Esterbauer
91. H. Evidence for 4-hydroxyalkenals in rat renal cortex peroxidized by N-2-methyl-9-hydroxyellipticinium acetate or celiptium // Biochim. Biophys. Acta.- 1990.-V. 1046. №3.- P. 294-300.
92. Colli S., Caruso D., Stragliotto E., Morazzoni G., Aletti A., Galli G., Canesi B.A.,
93. Tremoli E. Proinflammatory lipoxygenase products from peripheral mononuclear cells in patients with rheumatoid arthritis // J. Lab. Clin. Med.- 1988.- V. 112. №3.- P. 357-362.
94. Akabane H. Synthesized leukotoxin: its biological activity and establishment ofradioimmunoassay//Hokkaido J. Med. Sei.- 1991,-V. 66. №4. P. 510-521.
95. Dellar J.E., Cole M.D., Waterman P.G. Antifungal polyoxygenated fatty acids from Aellanthusparvifolius II J. Chem. Ecol.- 1996.- V. 22. №5.- P. 897-906.
96. Kono Y. Apparent antibacterial activity of catalase role of lipid hydroperoxidecontamination // J. Biochem.- 1995.- Y. 117. №1.- P. 42-46.
97. Orafidiya L.O. The effect of autooxidation of lemon-grass oil on its antibacterialactivity // Phytotherapy Research.- 1993.- V. 7. №3.- P. 269-271.
98. Курочкин Б.И. Бактерицидные свойства белорыбьего жира // Сб. Науч. Тр. Астрах. Мед. Ин-та.- 1946,- Т. 8.- С. 166-171.
99. Горгиев Т.Б. К усовершенствованию методов изготовления аутовакцин //
100. Термические и практические вопросы иммунологии. Киев.: Здоровье, 1958,-С. 309.
101. Горгиев Т.Б. О приготовлении аутовакцин с применением бактерицидныхфакторов рыбьего жира // Лаб. дело.- I960.- Т. 1.- С. 43-44.
102. Горбунова Е.С. Исследование эффективности различных дизентерийных вакцин и стимулирующего влияния ацетоксана на дизентерийный иммуногенез // Автореф. канд. дис. на соиск. учен, степ.- канд. мед. наук. -Владивосток, 1966. 15 с.
103. Safton M.R.J. The bacterial cell wall III. Preliminary investigation of the chemical constitution of the cell wall of Treptococcus faccalis II Biochim. Biophyi. Acta.-1952.-Y. 8.-P. 510-523.
104. Salton M.R.J. Bacterial Anatomy. Edited by E.T.C. Spooncr and B.A.D. Stocker, Cambridge University Press. 1956.-P. 81.
105. Salton M.R.J. The Bacteria.- Edited by I.C. Cunsalus and R.Y. Stanier. Academic Press. New York. I960.- Y. l.-P. 97.
106. Luson L.W., Larson W.P. Factors governing the fat content of bacteria and the influence of fat on pellicle formation // J. Infect. Dis.- 1922.- Y. 31.- P. 407-418.
107. Dyar M.T., Ordal E.J. Electrokinetic studies on bacterial surfaces. (1) Effects of surface-active agents on the electrophoretic mobilities of bacteria // J. Bacteriol.-1946.-Y. 51.-P. 149-163.
108. Lerche C. Electrophoresis of Micrococcus pyogenes //Acta Pathol. Microbiol. Scand.- 1953.-V. 98.-P. 1-14.
109. Hill M.J., James A.M., Maxted W.R. Physical investigations of the behavior of bacterial surfaces IX. The streptococcal cell wall // Biochim. Biophys. Acta.-1963.-V. 75.-P. 414-425.
110. Few A. Interaction of polymixin E with bacterial and other lipids // Biochim. Biophys. Acta.- 1955.-V. 16.-P. 137-144.
111. Viczi L., Farkas L. Association between lipid metabolism and antibiotic sensitivity (I) lipid composition of antibiotic sensitive and resistant Staphlococcus aureus strains //Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung.- 1961.- V. 8.- P. 205-214.
112. Bartnicki G.S. Ceil wall chemistry, morphogenesis, and taxonomy of fungi // Ann. Rev. Microbiol.- 1968,- V. 22,- P. 87-101.
113. Красильников А.П. Справочник по антисептике.- М.: Высш. шк., 1995.-367 с.
114. Бусалов А.А. Антисептики // Руководство по хирургии.- М.: Медицина,1962,-Т.1-С. 175-190.
115. Галицкий А.Б. Антисептика.- М.: Медицина, 1975.- 38 с.
116. Гудкова Е.И., Красильников А.П. Контроль за микробной контаминацией антисептиков и дезинфектантов // Лаб. дело.- 1991.- № 1.- С. 59-61.
117. Красильников А.П., Адарченко A.A. Клиническое значение и методические подходы к определению чувствительности-устойчивости бактерий к антисептикам //Антибиотики и химиотерапия.- 1991.- №9. С. 39-44.
118. Сазыкин Ю.О. Биохимические основы действия антибиотиков на микробную клетку.- М.: Наука. 1965.- 312 с.
119. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках.- М.: Высшая школа, 1979.455 с.
120. Красильников А.П., Адарченко A.A., Собещук О.П. Сопоставление показателей антибактериальной активности антибиотиков и антисептиков // Госпитальные инфекции и лекарственная устойчивость микроорганизмов.-М.:Медицина, 1992,-С. 72-74.
121. Красильников А.П., Гудкова Е.И. Лекарственные инфекции // Акт. вопр. микробиологии, эпидемиологии и клиники инфекционных болезней.-Харьков, 1993. 194 с.
122. Наместников А.Ф. Химия в консервной промышленности. М.: Пищ. пром-сть, 1965,- 260 с.
123. Уерман С. и др. Новое в зарубежной пищевой промышленности.- М.: Пищ. пром-сть, 1966. - 106 с.
124. Шевченко М.Г., Шиллингер Ю.И, Штенберг А.И. Добавки к пищевым продуктам. М.: Медгиз, 1969.- 164 с.
125. Борисочкина Л.И. Антиокислители, консерванты, стабилизаторы, красители, вкусовые и ароматические вещества в рыбной промышленности.-M.: Пищ. пром-сть, 1976.- 182 с.
126. Плетнев М.Ю. Косметико-гигиенические моющие средства М.: Химия, 1990,-272 с.
127. Росивал Л., Энгст Р., Соколай А. Посторонние вещества и пищевые добавки в продуктах.- М.: Легк. и пищ. пром-сть.- 1982.- 264 с.
128. Штенберг А.И., Шиллингер Ю.И., Шевченко М.Г. Добавка к пищевым продуктам.- М.: Медицина, 1969.- 94 с.
129. Wedricha В. Sulphur dioxide in foods. Chemical interactions // BNF Nutr. Bull.-1984.-У. 9. №3.-P. 155-164.
130. Rhoma S. Suljites and food. A scientific review and regulatory update // Manuf. Confect.- 1985.- У. 65. №11.- P. 45-55.
131. Наседкина E.A., Теплицкая A.M. Применение нового антисептика для сохранения качества соленой лососевой икры II Рыбн. хоз-во, 1967.- N2.-С. 51-53.
132. Уэно Т., Миядзаки Т., Инатакэ Н. Препарат на основе сорбиновой кислоты для добавления в рыбные продукты. Японский пат. кл. 34.0,4 N14104. заявл. 27.03.67., опубл. 20.05.1970.
133. Шульгина Л.В., Михалева В.Ф., Бояркина Л.Г., Галкина Л.М. Оценка качества и сроков хранения рыбных вареных колбасных изделий помикробиологическим показателям // Гиг. и сан.- 1991.- №7.- С. 41-43.
134. Калантарова М.В., Волгушева З.П., Головченко В.Н., Черемина Е.П. Применение консервантов при изготовления зернистой баночной икры осетровых // Тр. Касп. НИРХ. М.: Пищ. пром-сть,- 1968.- Т. 24,- С. 222-233.
135. Lohne Р. Experiments on preservation of capelin in tanks // Word Fish. Abstr.-1969.-Y. 20.-P. 29-30.
136. Windsor M. Fish meal // J.Torry Advisery Note.- 1971.- №49.- P. 4-6.
137. Meyer U. Zur frage der Schonung durch hexamethylentetramin bei der herstellung von marinaden aus abfallender rohware // Lebensmittel untersuch und Förch. // 1964.-V. 123. №6.-P. 416-418.
138. Лемешек-Ходоровская К. Химические консерванты для пищевых продуктов.- М.: Пищ. пром-сть,- 1969.- 104 с.
139. Morris С. Natural preservative through biotechnology // Food Eng.- 1989.- Y. 61. №7.- P. 44-46.
140. Пат. № 60-48354 МКИ A 01 35/00, A 23 В 7/14. Антимикробный агент и его изготовление. Инаминэ Сигэо, Асама Касэй. (Япония). Заявлено 13.03.85; Опубл. 13.09.86.
141. Ravindranathan N.A. Preservation process for ready to cook fish portions at room temperature // Seafood Export J.- 1990,- №7,8.- P.45-47.
142. Уитон Ф.У., Лосон Т.Б. Производство продуктов питания из океанических ресурсов. М.: ВО "Агропромиздат", 1989.- 415 с.
143. Пат. 4832972 США. МКИ 54 0 А 23 В 4/08. Process for preservation of fish / Toledo Flores Luis Y., Zall Robert R. (США). - №178096. - Заявлено 06.04.88; Опубл. 23.05.89.
144. Давлетшина Т.А., Блинов Ю.Г., Акулин В.Н., Шульгина Л.В., Бывальцева
145. Т.М., Рыбин В.Г. Разработка технологии получения антимикробного препарата на основе липидов рыб. // Изв. ТИНРО.- 1997.- Т. 120.- С. 61-67.
146. Кейтс М. Техника липидологии. (перевод с англ. д.х.н. Вавера В.А.). М.: Мир, 1975.-322 с.
147. Kabara J.J. Antimicrobial agents derived from fatty acids // J. Amer. Oil Chem. Soc.- 1984.- У. 61. №2. P. 397-403.
148. Kabara J.J. Fatty acids and esters as antimicrobial insecticidal agents// ACS Symp. Series.- 1987,-P. 220-238.
149. Moreno E., Martinez J., Perez J., Ramoscormenzana A. Antimicrobial effect of waste-water from olive oil extraction plants selectiong soil bacteria after incubation with diluted waste // Microbios.- 1987.- V. 51. №208.- P. 169-174.
150. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих. М.: Пищепромиз-дат, 1976. - 470 с.
151. Larsson К., Noren В., Odham G. Antimicrobial effect of simple lipids and the effect of pH and positive ion. // Antimicrob. Agents Chemother.- 1975.- V. 8. №6.- P. 733-736.
152. Савойский И.И. Сравнительная оценка бактерицидности различных образцов трескового и дельфиньего жира в отношении гноеродных микробов //Новый хирургический архив.- 1938.- Т. 41. Вып. 2.- С. 253-256.
153. Tovomizu М. Studies of the antimicrobic action of fish components. VIII. Fractionation of an antimicrobic substance from antioxioli leol. Fish oils. // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.- 1965.- V. 21. №4,- P. 258-261.
154. Акулин В.Н., Блинов Ю.Г., Бывальцева Т.М., Будаева Г.В., Давлетшина Т.А., Шульгина JI.B. Влияние нового пищевого консерванта на микрофлору соленой лососевой икры // Изв. ТИНРО.- 1997.- Т. 120.- С. 68-71.
155. Эмануэль Н.М., Денисов Е.Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. М.: Наука, 1965.- 375 с.
156. Владимиров Н.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.- 252 с.
157. Итабэ X., Иноуэ К. Методы определения перекисей липидов и оценка окисления липидов // Toxocology forum.- 1987.- У. 10. №3.- Р. 292-303. (пер. с яп.).
158. Parr L.J., Swoboda Р.А.Т. The assay of conjugable oxidation products applied to lipid deterioration in stored foods // J. Food. Technol.- 1976.- Y. 11. № 1.-P. 1 12.
159. J. Pokorny. Nonvolatile lipid oxidation products. Handbook of Chromatography. Lipids. CRC Press. Boca Raton. Florida, 1984.- V. 2. P. 205-219.
160. Beckman J.K., Howard M.J., Green H.L. Identification of hydroxyalkenals formed from omega-3 fatty acids // Biochem. Biophys. Res. Comraun.- 1990.-V. 169 №1.-P. 75-80.
161. Schauer R.J., Zollner H., Esterbauer H. // Membrane Lipid Peroxidation. / Ed. Vigo-Pelfrey, Boca Raton: CRC Press, 1990.- V. 111.- P. 141-163.
162. Poli G., Chirpotto E., Biasi F., Pavia R., Albano E., Dianzani U. Enzymatic impairment induced by biological aldehydes in intact rat liver cells // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol.- 1982.- V. 38. JSfel.- P. 71-76.
163. Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner. H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes // Free Rad. Biol. Med.-1991,-V. 11.-P. 81-128.
164. Chen H.J.C., Chung F.L. Epoxidation of trans-4-hydroxy-2-nonenal by fatty acid hydroperoxides and hydrogen peroxide // Chem. Res. Toxicol.- 1996.- V. 9. №1.-P. 306-312.
165. Jensen E.C, Ogg C., Nickerson K.W. Lipoxygenase inhibitors shift the yeast/mycelium dimorphism in Ceratocystis ulmi II Applied & Environmental Microbiology.- 1992.-V. 58. №8. P. 2505-2508.
166. Chung F.L., Chen H.J., Guttenplan J.B., Nishikawa A., Yard G.C 2,3-epoxy-4-hydroxynonanal as a potential tumor-initiating agent of lipid peroxidation // Carcinogenesis.- 1993.-Y. 14.-P. 2073-2077.
167. Гордон Ф., Форд P. Спутник химика. М.:Мир, 1976.- с. 437-444.
168. Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography a reappraisal // J. Chromatogr.- 1988.- Y. 447. №2.-P. 305-314.
169. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. // Can. J. Biochem. Physiol.- 1959.-Y. 37,-P. 911-917.
170. Patterson H.B.W. // Hydrogenation of Fats and Oil: Theory and Practice. Hardbound: AOCS Press, 1994.- 288 p.
171. Bliss C.F. Retative potency as applied to the assay of penicillin. // Science.- 1944.-V. 100,-P. 577-578.
172. ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа. М.: Госком СССР по стандартам, 1985.
173. Городниченко Л.В., Байдалинова Л.С., Биденко М.С. Определение формальдегида в мышечной ткани рыбы как показатель ее качества // Изд. АтлантНИРО, Исследования по технологии рыбных продуктов.-Калининград- 1979. С. 8-15.
174. Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйетвенныйцентр /ТШРО-центр/1. ОКП 92 81;00 СОГЛАСОВАНО
175. Главный врач Приморского Краевого центра Государство санитарно-эпидемиоло-(ого нааа1. Г.В.Маслов1. Группа Н 28 УТВЕРЗВДАЮ
176. Директор Тихоокеанского научно-исследовательского ^хозяйственного центра :тр/1. В.Н.Акулин1. ПРтехничес:1. БНШ УСЛОВИЯ1. ТУ 9281-021-00472012-96
177. Введены впервые Дата введения с 01,07,96
178. Государстеенный комитет Российской Федерации по стандартизации, метрологиии сертификации Приморский центр стандартизации, метрологии и сортнфикации Зарегистрирован и внесен в реестр государстоенной регистрации-г.? л от ¿6. км
179. РАЗРАБОТАНО Заместитель директора ТЩРО-а1. О.Г.БАинов
180. Заведующая сектором микробиологии лаборатории технологии и химии процессов консервирования ^у / Л.В.Шульгина
181. Научный сотрудник лаборатории технологии и химии процессов консервирования
182. Т.А.Давлетшина Заведующая лабораториейстандартизации961. В.М.Курханова
183. Настоящи© технические условия распрострлняются чя антимикрос!гный препарат из жира рыб, предназначенный для использования в качестве консерванта при изготовлении продукции из гидробиочтов,
184. Условное обозначение продукции при заказе: "Препарат антимикробный"' ТУ 9281-021-00472012-96.1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ
-
Рыбин, Вячеслав Григорьевич
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2000
-
ВАК 03.00.23
- Изучение бактерицидных свойств водного экстракта из липидов рыб как основы пищевого консерванта
- Обоснование регулирования микробных и ферментативных процессов в биотехнологии рыбных продуктов
- Эколого-биологическое обоснование применения лечебно-профилактического препарата на основе гриба-ксилотрофа Trametes Pubescens (Shumach. FR) Pilat. в отношении энтерогеморрагической кишечной палочки
- Влияние антимикробного препарата из липидов морских рыб на возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний
- Получение и биологические свойства бактериоциноподобных веществ, продуцируемых Bacillus circulans
