Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фактора роста нервов в сыворотке крови человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование фактора роста нервов в сыворотке крови человека"

академия наук узбекской сср институт биохимии

На правах рукописи

акраыов марат шарифовш

исследование фактора роста нервов в сыворотке крови человека

03.00.04 - Биологическая химия

автореферат

диссертации на соиоканиэ ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ-1991 г.

Работа выполнена в Институте биохимии АН УзССР

Научные руководители: академик АН УзССР,доктор биологических наук.професоор Д.Х.ХАМВДШ кандидат биологических наук Р.С.САЛИХОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

МД.Гайнутдинов кандидат биологических наук Э.С.Садыков

Ведущая организация: Ленинградский педиатрический

медицинский институт

Защита дисоертации соотоится " ф^&гЙЛ 1991г. в " часов на заседании специализированного совета Д 015.16.01 при Институте биохимии АН УзССР (г.Ташкент* проспект М.Горького,56)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН УзССР

Автореферат разослан » 1991г.

Ученый секретарь специализированного

совета »доктор биологических наук Л.---е;Л.Турханов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальнозть проблемы. Проблема регуляции межклеточных отношений в развивающемся и зрелом организме относится к числу наиболее актуальных в современной биологии и медицине. Непосредственное участив в процессах регуляции принимают факторы роста, к числу которых относится фактор роста нервов (ФРН). ФРН участвует в становлении симпатичеокой иннервации, направляя рост и развитие адренергических и части сенсорных нейронов (Калюнов,- 1984, 1986; Levi-Mcmtalcinl , 1987), Действие ФРН на ограничивается пе~ риферической нервной системой, центральные холинзргические нейроны также зависят от фактора в развитии и при нормальном функционировании (Large et al, 1986; Kromer, 1987). После повреждения как периферических, так и центральных волокон ФРН участвует в активизации их регенерации, Эти факты стали известны в результате всестороннего изучения ФРН из разных классов животных.

Наиболее актуальным и перспектившлд представляется изучение ФРН человека. Однако, имеются объективные трудности, тормозящие исследования в этом направлении. Прежде всего ФРН обнаруживается в тканях человека в незначительных количествах и чувствительность биологических методов тестирования, как правило, недостаточна, Применение.иммунологических методов детектирования с использованием антител к ФРН животных позволяет получать лишь относительные значения, так как существуют видовые отличия в состава и свойствах ФРН из разных источников.

Тем не менее важность выполняемых функции фактора в организме и перспективы применения ФРН в биологии и медицине являются мощным стимулом к попеку эффективных путей получения ФРН человека и антител к нему, разработке адекватных методов количественного анализа,

Цель и задачи работу. Основной целыо настоящей работы является исследование природа и содержания нейритстимулирующего белка в крови человека. Для достижения поставленной цели реша-ляоь следующие задачи:

1. Разработать способ выявления ФРН-активноати в препаратах тканей человека.

2. Получить в очищенном виде белок о нейроростовой активностью я оценить его принадлежность к Ш1,

3. Определить содержание этого белка в крови человека при некоторых физиологических и патологических состояниях.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан способ получения фракции сыворотки крови человека, содержащей . шявляемые бяотестом уровни нейрягстлмулирукщего балка. Среди иоследованных образцов тканей и жидкостей взрослых лвдей наиболее высокий уровень нейроростовой активности обнаружен в абортивной крови и молозиве, у новорожденных - в тимусе при диабете матери. Из сыворотки абортивной крови получена высокоактивная фракция ФРН и охарактеризована по физико-химическим параметрам. Установлено, что нейритстимулирующая активность фракции ассоциирована именно о ФРН и частично блокируется антителами к р -ФРН мыши в культура. Изучена динамика изменения уровня ФРН в крови женщин в процессе беременнооти. Показано, что весь период беременнооти сопровождается трехкратным увеличением содержания ФРН, о максимальным уровнем на 13-16 недели развития плода. Содержание ФРН в крови кратно гювы^ затея при воостановитольных процессах в организме. Хронический алкоголизм и шизофрения сопровождаются значительным уменьшением сывороточного ФРН,

Полученные результаты имеют не только теоретическое значение, но и непосредственный практический интерес. Благодаря разработанному способу получения сывороточной фракции ФРН становится возможной оценка уровня фактора в крови при различных состояниях организма. Увеличенный уровень сывороточного ФРН, сопровождающий процессы роста и восстановления и изменение его уровня при некоторых заболеваниях указывают на возможность использования полученных препаратов ФРН человека в медицине.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи, тезисы сообщений опубликованы в материалах 1У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ашхабад,1986),II рабочего совещания "Морфогенвтически активные вещэства"(Пущино,1988).советско-финляндского симпозиума по клеточной диффервнцировке а экспрессии генов (Ташкент, 1988).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и включает разделы "Введение", две главы литературного обзора, четыре главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов,"Заключение", "Выводы" и список литературы из 16 советских и 158 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами а 13 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили образцы сыворотки крови донорской,абортивной,ретроплацентарной и венозной на 2-9 месяцы беременности женщин; сыворотка крови на 3-6 день после травмы (перелом тазобедренного сустава) и на 6-14 дни после инфаркта; сыворотка крови больных гипвртиреозом, шизофренией,хроническим

алкоголизмом до и посла лечения, в состоянии алкогольного делирия; моча женщин, молозиво 2-6 дня лактации, ткань плаценты и 8-12 нодольного плода (абортивный материал); синовиальная кидкость и сперма; ткани новорожденных (трупный материал): костный мозг,селезенка,миндалины,подчелюстная слюнная железа,тимуо и аппендикс.

Активность viPH оцонивпли по интенсивности роста нейритов из сенсорных спиналышх и симпатических ганглиев 7-9 дповних куриных эмбрионов, инкубированных при 37ÜC в течение 16-24 чаоов в среда, содержащей различные концентрации исследуемых балков (Levi-Montuicini,1968; Оленев 1969), a также в культуре клеток крысиной феохромоцитомы PC 12 (Greene,1970).

В экспериментах по подавлению активности ФРН использовали аф$шшо очищенные бараньи антитела к р ФРН мыши, дополнительно аффинно очищенные и на колонке с иммобилизованным ФРН быка.

Гельфлльтрациы и ионообменную хроматографию на так-гелях и на КМ-целлшозе выполняли согласно рекомендациям фирм-кэготовителей соответствующих материалов с использованием установки для фракционирования (1KB ,Ивоция), включавшей коллектор для сбора фракций, микронасос, регистратор оптической плотности злаата "иvi card и ", самописец й холодильную камеру. Эксперименты по фракционированию вели на холоду при 4°"5°С, Фракции объединяли согласно "пикам" белка или активности, концентрировали на роторной иск-парителе, освобождали от солей с помощью диачкэа и лиофи-лизяровали.

Для сорбциошюй хроматографии использовали частицы сто-кла размером 0,2-0,4 мм. Полученные фракции бачков освойотк-д-эли от солей с помощью диализа пли ультрафильтрации.Ультрафильтрацию проводили под давлением 4 кг/см^ при использовании фильтров ИЛ—10 (Amioon ,CU1A),

Количество белка определяли спектрофотометричоски ло поглощению при 280 им и методом Лоури (Lowry et al, 1954).

Диск-элоктрофороз проводили в 7,5$-ном поли акрила».«! дном геле (ШАГ) при рН 8,3 (Маурер,1971), а также в 12,5$ ГМГ в присутствии додецялсульфата натрия (ДСП) и 2-моркэи-тоэтанола (Laemmii V. ,1983); аналитическое изээлектрофоку-сирование на стандартных пластинах (5#-гай ПЛАГ,рН 3,5-9,5), аналитическую гельфильтрацню на калиброванных колонках с сефадекеамл G-75 л G-I00 (0сгерг.ган,1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I! ИХ ОБСУВД0ШЕ I, Исследование нейроросговой активности в тканевых экстрактах и биологических жидкостях человека

Известными биологическими тестами практически не удается обнаружить ФРН в биологических жидкостях и тканях человека; Так как это может быть связано с наличием ингибиторов или просто низкой концентрацией фактора, представляется целесообразны!.! фракционированио цельных образцов. Проведенный поиск оптимальных условий фракционлрованпя, в частности, сыворотки донорской крови, показал неэффективность гельфильт-рация на сефадаксе 0-200 и различных вариантов высаливания сульфатом аммония. Более успешным оказался подход, используемый при разделения альбуминов и глобулинов, я именно разбавление сыворотки крови дистиллированной водой в соотно-

¡пения 1:1 или 1:2, отстаивании 30-60 мин и центрифугировании 30 мин при 6000 об/мин. В результате получен осадок, содержащий 0,033-0,035$ общего белка сыворотки крови, количество ФРН в котором составляет 3 БЕ/мг белка, Достаточным же количеством сыворотки для выявления ФРН активности биотео-том является 10-15 мл.

Вышеописанный принцип получения фракции ФРН был использован при обработке других биологических жидкостей а оупер-натанта гомогонатов тканей. В таблицах I и 2 представлены результаты биологического тестирования полученных фракций ФРН из доступных образцов человеческого материала. Исследуемые концентрации белка - 0,01 - 1,0 мг/мл. Анализу подвергались также белки биологических жидкостей без указанной обработки.

Таблица I,

Нейроростовая активность тканей и биологических жидкостей взрослого человека

Ш §

о

Я

наличие фрн

#й

i '

га аз

Ей «

(Ч и «ч И И

ги и ы о

+ -

ы а и о

+ -

Н

о я

к 4

о Й

<а

И Ч

О ю

к (М

§

о а

+ -

Таблица 2.

Нейророотовая активность тканей новороаденного

м я

Плод человека £ 39 - 40 недель; асфиксия, внутричэреп, травма

Плод человека £ 32 недали диабетическая фетодатия

и со со ет

« Ф

н «

I

й М О

й

И 01 го т И о) ь ч о <в Я И

i!

I

Образцы сыворотки крови, молозива и тимуса новороаденного при диабете матери стимулируют характерный рост волокон вокруг культивируемых спинальных ганглиев эмбрионов кур в концентрации 300, 100 и 10 мет/мл соответственно. Незначительную активность обнаруживают белки спермы,слюны и мочи, остальные же проверенные образцы нейроростовой активность*» не обладали.

2. Выделение и характеристика препарата ФРН из сыворотки крови

Оценка нейроростовой активности донорской и абортивной крови показала, что по содержанию БЕ ФРН абортивная кровь в 3 раза богаче, чом донорская. Поэтому в дальнейшей работе по выделению фактора в качестве источника использовали абортивную кровь,

Разработаны две схемы получения высокоактивной фракции ФРИ, существенно отличающиеся по первичным процедурам очистки белка, В первом случае применяли вышеописанный метод получения гюбулиновой фракции, во втором иопольэовали свойство ФРН сорбироваться на поверхности отекла, отмечаемое в литературе (Реагсе «г а1,1973). Это свойство легло в основу метода, позволяющего по данному признаку отделить искомый белок от остальных в белковой смеои.

Первая схема последовательно включала гельфильтрацию глобулиновой Фракции на так Ш55 и ионообменную хроматографию сначала на ДЭАЭ-ТзК 35РМ, а затем на КМ-целлюлозе. Профили и программы элюирования представлены на рисунке I, После каждого этапа фракционирования материал фракций, обладая* щих нейроростовой активностью, собирали, обессоливали и лио-фильно высушивали, В результате получена белковая фракция, содержащая 200 БЕ/мг белка. Данная схема имела следующие недостатки; в соотаве фракции значительно доминировали оопутс-твугацие белки, в процессе выделения происходило рассредоточение нейроростового белка по нескольким фракциям,

В охеме II первоначально сыворотку абортивной крови фракционировали на колонках, наполненных стеклянными частицами, Белки о нейроростовой активностью, десорбированные со стекла далее последовательно хроматографировали на ТЗК ¡га-5 5 и КМ-целлюлозе (рисунок 2), Степень очистки белка на каждом этапе контролировали с помощью биотеота и электрофореза.После хроматографических процедур полученный активный материал подвергали препаративному электрофорезу в полиакриламидном геле. Из полученных 5 белковых зон только в одной, соответ-

Рис.1. I вариант очистки ней-роросгового балка,включающий последовательно хроматографи-рование глобулиновой фракции на колонках о ТЭК ОТ-55 (А)» ДЭАЭ-ТЖ 350М (Б) и КМ-целлю-Л039 (В).

3()о мл"

Рис.2, II вариант очистки ней-ророотового белка,вюгочакшшй последовательно хроматографи-рованив сыворотки крови на колонках с частицами стекла (А), рН я,о КМтЦшши080й (Б) и ТЗК Нуг-55

V (В).

Заштрихована Бона ФРН-активностя

280

0,1

100 мл

ствутощей по подвижности иммуноглобулину (».обнаруживается ней-роростовая активность. После освобождения от примесоИ элокт-рофоротичоски гомогенный балок обладает активностью 670 БЕ/мг. В таблице 3 отражены цифровые данные результатов очистки ней-роростового белка на каждом этапе двух вариантов.

Таблица 3.

Очистка ФРН из сыворотки абортивной крови.

Схема Этапы очистки Количество болка в мг Выход Нейроростовая активность в БЕ/мг

Дельная сыворотка 7200 100 -

Освадение глобу-линовсй фракция 183 2,6 7

I Гольфильтрация на ТзК №?-55 67 0,94 20

Хроматография на ДЭАЭ-ТЗК 350 М 38 0,50 33

Хроматография на КМ-целлкшозе 7 0,09 200

Хроматография на стекл. частицах 54 0,75 12

II Гольфильтрация на ТзК Ш-55 31 0,44 33

Хроматография на Ш-цоллшозе 1,5 0,02 ■ 200

Препаративный электрофорез 0,12 0,001 670

В процессе выделения и очистки ив специальных экспериментах были определены некоторые фязико-хшичэские параметры исследуемого белка. По результатам гельфильтрации на откалиб-рованных хроматографичоских колонках значение его молекулярной масон - 150-160 яДа, что соответствует данным литературы

относительно Ш ФРН (Goldstein et ai,I978). Результаты препаративного электрофореза и изоэлектрического фокусирования свидетельствуют о щелочной природе изучаемого белка о pi в диапазоне 9,1 - 9,7, что также соответствует данным по известным ФРН.

В сыворотке крови человека присутствуют белки отимули-рующяе, как и ФРН, рост нейритов у культивируемых ганглиев и диссоциированных нейронов, такие как трансферрин, фибро-нектин,otj гликопротеид (орозомукоид)(Ы.и et al, 1986).Для определения принадлежности исследуемых белков именно к ФРН, их нейритстимулирующуга активность блокировали антителами к известному ФРН. Антитела были получены в нашей лаборатории, с помешаю двухкратной иммунноаффинной очистки бараньей антисыворотки к р-ФРН М1ШШ последовательно на колонках с иммобилизованными р-ФРН мыши и ФРН быка. Параллельно с изучаемыми белками использовали в качестве контроля 7s ФРН мыши и ФРН быка. Результаты этого эксперимента предсташе-

Рис.З. Действие антител к р-ФРН мыыи, дважды очищенных иммушоаффинной хроматографией, на активность 7 3 ФРН мши (I), ФРН из спергщ быка (2) и исследуемого белка человека (3)

Для подавления I БЕ ФРН мши (Юнг) потребовалось 25 нг антител, I БЕ ФРН быка (5нг) - 400 нг,1 БЕ белка человека (5мкг)~ 1,6 ыкг.Причем блокирование в последнем случае было частичным. Полного подавления активности нейроростовой фракции крови человека достичь не удалось даже при концентрации антител 16мкг/мл.

Обработка дитиотреитолом показала,что нейроростовая активность ассоциирована с белком 15-30 кДа,который связан с белком-носителем глобулнновой природы посредством з-э- овлзей.

Наличие активности, обуславливающей рост нейритов у культивируемых спнналышх сенсорных и симпатических ганглиев куриных эмбрионов и у клеток феохромоцитомы РС 12 крыс, полученные характеристики молекулярной массы и изоэлектри-ческой точки, а также блокирование, хотя и неполное, антителами к известному ФРН - все перечисленные фякты свидетельствуют о принадлежности выделенного белка к группе факторов роста нервов.

3. Исследование сывороточной нейроростовой активности у женщин в течение беременности.

Выявление повышенного содержания нейроростового белка в абортивной и ретропледентарной крови послужило стимулом к изучению динамики этого показателя в течение беременности. Для анализа использовали венозную кровь женщин с 8 по 39 недоли беременности, объединив образцы по срокам в 8 групп. Для контроля использовали сыворотку крови небеременных женщин детородного возраста. Из образцов извлекали гдо-булиновые фракции и исследовали в них лейроростовута активность. После расчета количества БВ в мл сыворотки крови составлена диаграмма уровня нейроростового белка в тачание бэре»отгости (рисунок 4).

БЕ/мл

Л

Сч)

да ..

норма 3 3 - й -3 2 2 «а'

И М N

Рио.4, Уровень нейроростового белке в крови женщин при бероменносм.

Очевидно, что трехкратное увеличение уровня сохраняется на протяжении всей беременности, а в 13 - 16 недели пико-образно возрастает еще в 2 раза, то есть уровень нейророотового белка в этот период в 6 раз выше, чем в норме.

Повышенный уровень нбйророотового балка в крови бере-мешшх может быть обусловлен причинами различного характера: началом функционирования плаценты, увеличенной секрецией андрогенов, общей реакцией материнского организма,потребностями развивающегося плода, Пик активности на четвертом месяце беременности может быть связан и с усиленной экспрессией рецепторов ФРН на шванновских клетках развивающегося плода,, отмечаемой именно на 13 - 14-ю недели его развития и уменьшающейся на 17 - 19 недели ( Зсагргп! et а1., 1988).

ю со I 8

Я

недель

4,Сравнительное изучение нейроростовой активности онво-ротки крови при некоторых патологиях человека.

Описанный в п.1 способ получения фракций о активностью ФРН позволил провести сравнение сывороток крови больных и здоровых людей по нейроростовой активности* Для изучения выбраны заболевания - шизофрения и хронический алкоголизм, которые характеризуются нарушением уровня дофамин-р-гид-роксилазы - фермента, зависимого от ФРН; гипертиреоз с увеличенным уровнем тироксина в крови. Известные антивоспалительные и трофические свойства ФРН побудили нао исследовать и кровь больных после перенесенной травмы (перелом тазобедренного сустава) и инфаркта миокарда. Результаты исследований представлены в таблице 4, где ненроростовая активность выражена в БЕ в расчете на I мл сыворотки крови. Выход фракций по массе во всех исследуемых олучаях был практически одинаков, то есть содержание балластных белков не оказывало влияние нэ уровень фактора. Для сравнения приведены данные по сыворотке донорской,абортивной и ретроплоцентарной крови.

Известно, что при шизофрении уровень ФРН резко снижается (Perez-Polo et al.,I978). Нашк эксперименты подтвердили, что при этом заболевании содержание БЕ ФРН снижается по крайней мере в 5,5 раз. Исследование кровй больных хроническим алкоголизмом до и после лечения показало, что при остром течении болезни наблюдается пятикратное снижение уровня сывороточного ФРН, однако 45--дневный курс инсулино-терашш способствует повышенно концентрации регулятора, хотя уровень его не достигает нормы.

Таблица 4.

Содержание нейророотового белка в крови при некоторых физиологических и патологических состояниях человека.

Образцы оыворотш Количество проб Содержание глоб, фракции в % Количество ФРН в БЕ/мл

Донорская (норма) 18 0,033 1.050 * 0,117

Абортивная 27 0,031 3,413 2 0,136

Ретро плацентарная 12 . 0,030 3,291 ± 0,098

Травматическая (3-7 дн.) 16 0,034 2,879 ± 0,109

Инфарктная (б - 14 дн.) 4 0,031 6,666 ± 0,174

Гипертиреоидная 4 0,033 1,320 ± 0,129

Шизофрения 7 0,032 0,186 * 0,112

Хронический алкоголизм 9 0,034 0,181 ¿0,084

Инсули но т е рапия (хрон.алкоголизм) 9 0,032 0,750 ± 0,100

Алкогольный .да.лирий. 4 0,030 1,320 ~ 0,078

Сравнительно незначительный подъем (на 26$) по содержанию БЕ ФРН отмечается в крови больных гипертиреозом. Более интенсивные изменения следуют в ответ на перенесеннуи травму и инфаркт миокарда - на 3 - 7 день после перелома тазобедренного сустава количество-БЕ в мл возрастает в 3 раза, а на 6 - 14'дни после инфаркта - в 6 раз.

ВЫВОДЫ

I. Разработан способ получения фракции сыворотки крови человекасодержащей выявляемые биотестом уровни нейритсти-мулнрумцего белка. Проведен анализ активности ФРН в некото- 16 -

рте тканях и биологических жидкостях человека. Наиболее высокий уровень нейроростовой активности обнаружен в абортивной, ретроплацентарной крови и молозиве.

2. Из сыворотки абортивной крови выделена фракция ФРН по разработанной схеме с последовательным использованием адсорбционной хроматографии на частицах кварцевого стекла, гельфиль-трации на Тоуореаг1 ни-55,ионообменной хроматографии иа Ш-целлюлозе и препаративного электрофореза в полиакриамидном геле.

3. Выделенный белок представляет собой высокомолекулярный комплекс ФРН с белком-носителем глобулиновой природы,связанных посредством дисульфидных связей, характеризуется нейритстиму-

Г)

лпрующеи активностью 2 х 10" БЕ/мг, имеет молекулярную массу 160 кДа и р1 9,1 - 9,7, Его нейритогешшй эффект частично блокируется антителами к р-ФРН мыши в концентрации 1,6 мкг/мл. Обработка дитиотрентолом приводит к освобождению белка с моле-

о

кулярной массой 15 - 30 кДа я активностью 6 х 10 БЕ/мг. Пере-числонные свойства указывают на принадлежность полученного белка к ФРН.

4. Изучена динамика изменения уровня ФРН в крови женщин при беременности. Выявлено, что течение всего периода беременности сопровождается трехкратный увеличением содержания <№Н,

а в 13 - 16 недоли уровень его повышается пикообразно еще в 2 раза.

5. Исследовано содержание сывовдточного ФРН в восстановительный период поело инфаркта и травмы. Уровень фактора увеличивается в 3 раза поело перелома бедренной кости и в 6 раз после инфаркта миокарда.

6, Проведен сравнительны!! анализ уровня ФРН в крови больных хроническим алкоголизмом до и после лечения. При данном заболевании содержание ФРН пятикратно уменьшается. 45-дневный курс инсулинотврапии приводит к заметному повышению уровня ФРН, однчко последний не достигает показателей в норме. При шизофрения также установлено уменьшение уровня ФРН (в 5,6 раз) Вместе о тем, при алкогольном делирии и гипертиреозе отмечается незначительный подъем содержания сывороточного фактора (на 25 - 3050.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТШ2 ДИССЕРТАЦИИ

1, Нейророотовая активность сыворотки крови млекопитающих/ Хамидов ДД.,Салихов P.C.,Мамаджаиов А.Дафизова М.Г,,Лдм А.В.Дкрамов M.IÜ,Доджаева И.И.,Алимов МД.//1У конф, биохимиков республик вредней Азии и Казахстана: Тез.докл, -Ашхабад, 1986. - C.I3Ü - 131,

2. Нейророотовая активность сыворотки крови человека Демидов Д,Х,,Акрамов М.Ш.Дафиэова М.Г.Доджаева Н,И.,Лим А,, Оалихов Р.С./Даб,биол.журн. - 1987, - № 4. - С. 65 - 66. •

3. Фактор роота нервов у позвоночных и его уровень при репаративной рогенерации и некоторых физиологических сос-тояниях/Хамидов Д.Х,,Салихов P.C..Юкелвоон Л.Я.Дафизова М,Г,,Мамаджанов А.,Исанбаев Ч,И.,Акрамов М,Ш,.Мирходжаев Д,Б.,Лим A.B. и др.//Онтогенез. - 1988. - Т. IS. № 4, -С. 445,

4, Фактор роста нервов в сыворотке крови чаловекз/Хамвдов. ДД.,Салихов P.C.Дафиэова М.Г.,Акрамов М.Ш.,Казанов Е.Ю,// Онтогенез. - 1988, - Т. 19, № 5. - С. 551.

б. Фактор роста нервов у поэвоночннхЛамидов Д.Х., Юн ель-сон Л.Я.,Салихов Р,С.,Парилио И.И.Дафизовя М.Г..Акрамов М.Ш. //Цитология. - 1989. - Т. 31. № 9. - С. 1132.

6. Изменение уровня ФРН в крови женщин при беременности /Салихов P.C..Акрамов М.Ш.Дафизова М*Г.,Лим A.B.Демидов ДД.//ДАН УзССР. - 1990. - Ü 12. - С. 38-39.

7. Исследование уровня ФРН при хроническом алкоголизме и шизофренииДамидов ДД. »Акрамов М.Ш, ,Саляхов P.C. Дафизова М.Г, Додааева Н.И.//ДАН УзССР. - 1991'. - $ 8. -

с. 43-45.

п

Подписано к печати 3.30,91г, Заказ » 270 Тираж 100 зкщ. Отпечатано на ротапринте ¿БАН/аСОР г.Ташкент Муиинова 13