Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фагозависимого синтеза бета-лактамазы в клетках Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование фагозависимого синтеза бета-лактамазы в клетках Escherichia coli"

р г б №

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1нститут молекулярно! б!ологП та генетики

На правах рукопису УДК 577.21

СОРОЧИНСЬКА ТЕТЯНА ВОЛОДИМИР1ВНА

Д0СЛ1ДЖЕННЯ ФАГ03АЛЕЖН0Г0 СИНТЕЗУ &-ЛАКТАМАЗИ В КЛ НИНАХ Escherichia coll

03.00.03 - молекулярна б!олог!я

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацП на здобуття вченого ступеня кандидата б1олог!чних наук

КиГв - 1994

Дисертац1я е рукописи

Робота виконана у в!ддШ регуляторних механ1зм1в кл1тини 1нституту молекулярно! 61ологГ1 та генетики HAH УкраЗни.

Науковий кер1вник: член-кор.. HAH Укра!ни

доктор б!олог1чних наук, професор, В.А.Кордюм

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б!олог1чних наук С.С.Малюта

Пров!дна органiзад!я: Знститут м!кроб!ологГз та Bipycojiori'i iM.Д.К.Заболотного HAH Укра'Зни, м. Ки jв

зас1данн1 Спец1ал1зовано1 ради Д 016.11.01 при 1нститут1 молекулярной б!олог11 та генетики. HAH УкраЗни ва адресою: 252143, Кшв-143, вул. Заболотного, 150. 3 дисерташею можна ознайомитися в б2бл1отещ ]нституту молекулярно! бшлогИ та генетики HAH УкраЗни за адресою: 252143, Ки3в-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат дисертацп роз1слано " " *<■ <-ic7t-ll-Aj- о ^ дд4

кандидат б!олог1чних наук, доцент В.11.Пол1щук

Вчений секретар Спец1ал1зовано] Ради кандидат баологачних наук

Лукаш Л.Л.

Актуальн1сть тени. 1нтенсивний розвиток метод!в гене-тично! 1нженерП та молекулярно! б1олог!! дозволяе конструю-вати рекомб!нантн1 молекули ДНК з заданный властивостями, вводити i'x в бактер!альн! юптини i, тим самим, створювати нов! промислов! итами-продуценти та суперпродуценти ц1нних важкодоступних б1лк1в людини та тварин. Для цнх щлей вико-ристовують pisHi м1кроорган!зми, проте основн! пронислов1 суперсинтетики отриман! на основ 1 Escherichia coli за допо-i.ioroK) плазм 1дних технологий. В згаданих випадках ц!левий продукт накопичуеться в цитоплазм! клхтин i досить часто ут-ворюе нерозчинн! гранули та агрегати, що утруднюе його вид1-лення. Тому акту алы-.ими е досл!дження, як! спрямован! на по-шук та розробку високоефективних систем отримання б1олог1ч-но-активних речовин, яким не притаманн! трудноцЦ, зв'язан! з плазм1днши технолог!ями. Використання для ампл1ф!кацП чу-жер!дних генio бактер1офагу I. е одним i3 шлях!в подолання цих перешкод. Вектори на основ! фагу X забезпечують значно б!лыяий piseHb ампл1ф!кацП донорних ген!в, н1ж б!льш!сть плазм!дних. Вони дозволяють використовувати сильн! фагов1 промотори, коли промотор клонованого гену малоефективний та зд!йснювати контроль експресП цього гену.

Мета та завдання досл1дження. Метою дано! роботи було розробити спос!б отрицания ферменту р-лактамаза TEMI в кл!-тинах Е. coli, використовуючи переваги аыпл!ф!кацп ген1в як на плазм!дах, так i на фагах, об'еднавши i'x в одну систему.

Основним завданнш роботи було:-

1. Розробити систему, оптимальну для синтезу р-лактамази в кл1тинах Е.coli з використанням фагу лямбда.

2. Сконструювати рекомб1нантний фаг V, який включае в себе структурний ген е-лактамази - Ы,а.

3. Отримати noxiflHi фагу X CI 857 bla з амбер-мутац!ями в регуляторних генах ( N та Q), та в деяких ni3Hix генах (R), а також досл!дити вплив цих мутац!й на фагозалежний синтез ß-лактамази в клiтинах E.coli.

4. Вивчити вплив к1лькост1 коп1й плазм!д з bla геном на вих1д ß-лактамази при фагозалежном синтез! в кл!тинах Е. coli.

5. Показати можлив!сть використання ß-лактамази для !м-муноферментого анал!зу.

Наукова новизна та практичне значения робота.' Еперше, на прикладi синтезу ß-лактамази, запропонована система, в як!й експрес!я гетеролог!чного гену забезпечуеться одн!ею системою регуляцП з використанням плазы!дного та фагового вектор!в. Показано, що введения амбер-мутац!й в регуляторнх та деяк! ni3Hi гени фагу X приводить до зб!льшення виходу фермента при фагозалежному синтез!його в кл!тинах Е.coli.

В результат! проведених досл!джень розроблено новий спо-с!б отримання ферменту ß-лактамаза, коли ген bla експресу-еться в клiтинах Е.coli i в склад! плазм!ди, i в склад! фагу X. Такий фагоплазм!дний спос!б отримання ß-лактамази забез-печуе високий вих1д продукту з його позакл!тинною локал!за-. ц!ею (1-2*106 од/мл). Ця розробка не мае аналог1в i эахищена авторським св!доцтвом / Кордюм В.А. ,1984/.

Вид!лений та очищений препарат fl-лактамази був апробо-ваний при детекцП в!рус!в та в!русспециф!чних антит!л в !м-муноферментному анал!з!. Було показано, що чутлив!сть тест-систем з використанням ß-лактамазних кон'югат!в анало-г!чна таким , в яких використовували традиц!йну пероксидазу.

Досл!дн! зразки ферменту були передан! для подальших

досл1джень в 1нститут в1русолог1! 1м. Д. 1.1вановського АМН Pocli та в 1нститут б!оорган1чно! xiMii АН Pocii.

Складено лабораторний технолог1чний регламент на вироб-ництво препарату в-лактамаза ТЕМ I.

Апробац1я роботи. Матер1али дисертацП допов1дались на 16-й конференцП FEBS (Москва, 1984), на 4-й Всесоюзн1й конференцП "Шкрооргатзми - продуцента фермент1в" (Ташкент, 1988), на Всесоюзна конференцП "Досяжнення б1отехнолог11 -агУопромиаповому комплексу" (Черн1вц1, 1991), на VI З'гзд! Укра1нського товариства генетик!в та селекц1онер1в 1м. М. I. Вав1лова (Полтава. 1992), на м!жнародн1й конференцП " Fundamental and applied problems in phytovirology" (Ukraine, Yalta, 1994), на VII М1жнародному кон.грес! " "Bacteriology and Applied Microbiology Division" (Czech Republic, Pragua, 1994).

Публ1кац11. За темою дисертацП опубл1ковано 13 po6iT та 1 авторське св!дотцтво.

Структура та об'ем роботи. Дисертац1я складаеться 1з вступу, огляду л1тератури, експериментально! частини, результат, обговорення, висновк1в та списку л1тератури, який включае 226 найменувань. Робота викладена на 135 стор1нках машинописного тексту та м!стить 9 малюнк!в та 5 таблиць.

Матер1али та метода. Штами бактер!й та фаг!в, викорис-тан! в робот!, були отримаш з колекц!й культур в1дд1лу ре-гуляторних механ!зм!в кл1тини МБтаГ НАН Укра1ни та з 1нсти-тутсько! коллекцп.

Середовища. В робот! були використан! р1дк! поживн! се-редовшца ам1нопептид (ферментативний г1дрол1зат б1лку) та LB /Ман1атис Т. ,1984/. Тверде середовище готували за допомогою

агару - 1.5 % та 0,6 %. Розведення фагол!зату та бактер1аль-них культур проводили в 0,14 М розчин1 NaCl.

Отримання фагол!зату.Л1зогенну культуру, яка мае в соб! профаг з ts мутац!ею 1нкубували при 28°С в умовах 1нтенсив-но! aepaqii до густини (1-2)*108 кл1тин в 1 мл середовища. Пот1м на протяз! 20 хв. проводили термо1ндукц!ю при 43°С, при цьому термолаб!льний б1лок-репресор 1нактивуеться 1 в1дбуваеться 1ндукц1я профага. Подальшу 1нкубац1ю проводили при 37°С до повного л!зису ил iтин (приблизно 1,5 години). Титр фагу визначали двохшаровим методом /Шллер Дж. ,1976/.

Вид1лення ДНК плазм!д. Для вид1лення плазм1дно! ДНК ви-користовувапи метод р1вноважного центрифугування в град1снт! густини хлористого цез1ю в присутност! бромистого етид1ю /Ман1ат1с Т., 1984/.

Вйд1лення ДНК фагу X. ДНК фагу X вид1ляли загальноприй-нятим фенольним методом /Ман1ат1с Т., 1984/.

Трансформац!» 1 трансфекц!ю кл!тин E.coli плазм1дною та фаговою ДНК проводили на хлор-кальц1евих компетентних кл!ти-нах за методом Дагерта та Epnixa /Dagert М..Ehrlich S..1979/.

Отримання рекомб!нантно? фагово! молекули X CI 857 Ыа. Для ц1е! мети в фаговий вектор X AZ UV5, який мае один EcoRI сайт клонували плазм1ду pcVII як донор структурного гену ß-лактамази Ыа. Ця плазм1да також мае один EcoRI сайт. Г1д-рол!з ДНК фага та плазмiди та л1гування фрагмент1в проводили за оптсаною методикою /Ман1ат1с Т.,1984/, використовуючи рестриктази EcoRI та Т4-ДНК-л1гази (виробництво НВО "Фермент". В1льнюс). Анал1з отриманих рекомб1нант1в проводили за допомогою рестриктази Sali того к виробництва.

Рекомб1нац1я ген!в. Амбер-мутацП в гени N, ü, R реком-

б!нантного фагу Ч Gl 857 Ыа вводили методом рекомб1нац11 фаг!в X CI 857 Ыа та X plac CI 857 If N" IX plac 5 Q'R" . Bifl6ip рекомб!нантних фаг1в з введенным амбер-мутац!ями проводили на культурах Е. со Ii СА77 (Su°) та Е. cot i RLMI (Su*).

Визначення к!лькост! коп!й плазм!д проводили з враху-ванням 'ix молекулярних мае та з використанням стандартно! комерщйно! ДНК плазм!ди pBR 322 (Amersham, Англ!я) за методикою, опкеаною /Харди К., 1989/.

Визначення активност! р-лакта«ази проводили йодометрич-ним методом за Чайковською /Чайковська С. ,1362 /. За одиницю активност1 приймали найменшу к1льк!сть ферменту, яка може 1нактивувати 10"7 М пен!цил1ну (60 од.) за 1 годину при 37°С у фосфатному буфер! pH 6,8 - 7,0.

Кон'югати на основ! в-лактшлази отршували за допомогою глютарового методу в одну стад1ю /Егоров A.M. ,1991/.

Твердофазний 1ммуноферментний анал!з з використанням кон'югат!в на основ! ß-лактамази та пероксидази проводили за методкою Егорова /Егоров A.M.,1991/. Результати та обговорення.

1. Конструювання фага X CI 857 Ыа та характеристика експре-cl 1 гена big.

При створенн1 штам1в-суперпродуцент1в майже завжди вико-ристовують плазм1дн! вектори, апе використання Ix мае багато трудное}!в i недол!к!в. Для ix усунення в наш!й лабораторП було розроблено ряд метод!в отримання б!олог!чно-активних речовин за допомогою бактер!офага X. Якщо 1нф1кувати кл!тини Е.coli бактер!офагом х, котрий несе в соб1 ген певного продукту, то це приводить до значного зб!льшення виходу цього продукту. При 1нфекц1Г бактер1ально! кл!тини фагом почина-

еться синтез генних продукт!в, що забезпечують автономну репл!кац1ю фагово! ДНК, утворення фагових корпускул та л!зис кл1тини. При цьому утворюеться 100-200 фагових корпускул i йде синтез тих ген!в, як! кпонован! о фаг. Введения аал-бер-мутац1й в регуляторн! гени фага приводить до б!льш ■ по-в1льного процесу л!зису кл1тини, а значить до лродовження часу функц1онування клонованого гену 1 накопиченню того продукта, за який в1н в!дпов1дае. Для створення системи суперсинтезу р-лактамази по фагозале»н1й технолог!! найпершю метою було отримати конструкц!ю на баз! фагового вектора, в як!й буде розм!щений структурний ген р-лактамази п1д контролем ефективного промотора, та введения амбер-мутац!й в регуляторн! гени фагу. При створенш рекомб!нантного фагу X CI 857 Ыа у нас з'явилась можлив!сть просл!дкувати експрес!ю bta гена п1д контролем р!зних промотор!в: Piac промото-р1в фага X та п1д контролем власного промотора, оск1льки ген bla в рекомб1нантну молекулу вбудований склад! ц!ло! плазм!-ди. За допомогою рестриктного анал!зу та подальшого електро-форезу було встановлено, яккм чином орхеитований вбудований ген fl-лактамази, оск1льки максимальна експресс!я гену bta можлива т1льки тод1, коли його робота контролюеться сильними промоторами фага X - Р1ас та PL. Це пряма ор!ентац!я клонованого гену. Активность 0-лактамази в цьому випадку досягала (3-5)*103 од/мл л1зату. При зворотн!й ор!ентацП вставки ак-тивнЮть ферменту була на порядок меншою - (2-4)*10z од/мл л1зату. Зниження активност! &-лактамази пов'язано, напевно, з конвергентной транскрипц1ек>, яка описана Ворд та Мурей /Ward F.,1979, Murray N.Е.,1979/. При конвергентн!й транс-крипцП синтез РНК подавлюеться за рахунок взаемодП молекул

РНК-пол!мераз, як! прямують в зворотн!х напрямках. В першому випадку, при прям1й ор!ентацП, на експресс!ю гена bta, який роэташований поряд з tac-промотором, впливають промотори Р1ао та PL Фага X та власний сильний промотор. Тому актив-HiCTb ß-лактамази була на порядок вища, н!ж у клон!в 1з зво-ротньою ор!ентац1ею. Подальш! досл!дження проводили з клонами, в яких вставка знаходилась у прям!й ор!ентацП. 2. Синтез В-лактаыази в р!зних штамах Е.соЫ при 1нф!куван-н1 Фагом XGI 857 bta з амбер-мутац!ями в р!зних генах. Для усп!шного використання фагового вектора з вбудованим в нього певним геном в систем! суперсинтезу продукт1в цього гену потр!бно подовжити час його функц!онування в кл!тин!. Для цього потр1бно затримати л!зис бактер1альног кл!тини за рахунок введения амбер-мутац!й в регуляторн! гени фага N чи Û та в структурн!, як! в!дпов!дають за л1зис кл!тини, нап-риклад, й. Ген N - ранн!й ген позитивно! регуляцП фага X. В!н потр!бний для повноц!нно1 експресН BCix ранн!х ген!в фага лямбда, в першу чергу, ген!в 0 та Р. продукта яких не-обх1дн! для репл!кацП фаговох ДНК. При в!дсутност1 продукта гена N транскрипц1я з цих ген!в дещо затруднена ! р!сень репл!кацП фагово* ДНК у ff -мутант!в невисокий. В зв'язку з цим л!зис бактер!ально1 кл1тини гальмуеться. Ген й зд!йснюе позитивну регуляц!» дП п!зн1х ген!в фагу (S,R,A-J). Його продукт активуе синтез РНК та б!лк1в з п!зн!х ген!в фага. Гени R,RZ,S потр!бн! для л1зису бактер!ально1 кл!тини.Bel ц! гени складають один оперон ! Юнують як одна транскрипц!йна одиниця, починаючи з промотора PR •, який розташований право-руч в!д гена Q. Транскрипц!я в!дбуваеться конститутивно, але при в!дсутност! продукта гена Q терм!нуеться в tR> сайт!,

який розташований поряд з промотором PR.. У £Г-мутант1в ут-ворення РНК з п1зн!х ген!в сильно подавлено ! це теж дозво-ляе подовжити час л!зису кл!тин. Були отриыан! ff N" - та Q" R' -пох1дн1 рекомб!нантного фагу X CI 857 Ыа. Активн1сть ß-лактамази в цих пох!дних пор!вняно з ix попередником зб1льшилась на порядок i досягла величини (2-4)*104 од/мл. Зб1льшення активност! fi-лактамази п!сля введения амбер-мута-ц1й св!дчить про те, що використання ff- та £Г R -мутант!в доц!льно, оскЛльки дозволяе затримати утворення структурних б!лк1в та б1лк1в, потр1бних для л!зису кл1тини-хозя1на, блоку вати Ix утворення у ff" ff -мутантiß i, тим самим, подовжити час д!яльност1 гена Ыа. Процеси л!зису клгтини фагом спо-в!льнен1, проте репл1кац!я фагово! ДНК 1де, що призводить до ампл!ф!кац!1 гена Ыа та до накопичення його продукта - ферменту ß-лактамаза. Експрес!» bla гена при фагозалежному синтез! дослхджували на 10 штамах Е.coli, як1 р1знилися наяв-н!стю чи в1дсутн!стю супресора, що виправляе амбер-мутацП в регуляторних генах фага. Результат« цих експершент!в приведен! в таблиц! 1.

При !нф!куванн! фагом X CI 857 bla Q"R" штаму Е. coli №3101 (Su°) продукуеться приблизно в два рази б!льше ß-лак-таыази. н1ж при !нф!куванн1 цим фагом ycix !нших досл!джених штам!в, як! мають супресор (Su+). Вих!д ферменту становить 3.1+0,06»105од/мл л!зату. В !нших доел1Джених Su° щтамах Е. coli ß-латамази накопичувалось менше пор!вняно 3i штамом Е. coli W 3101. При !нф!куванн! фагом X CI 857 bla fTN" вс!х досл1джених Su° штам1в E.coli синтезувалось приблизно в 20 раз!в менше ферменту, н!ж при 1нф1куванн! фагом Su+ (табл.1). Експрес1я Ыа гена в Su+ штамах при 1нф1куванн1 як

Таблица 1.

Активн1сть р-лактамази в р!зних штамах Е. соИ при 1нф1ку-ванн! фагами X С1ЫаМ~ {Г та X СТЫай' К' (од. акт./мл л!зату).

Активн1сть &-лактамази Активн!сть р-лактшази Штам при 1нф1куванн1 фагом при !нф!куванн! фагом

X С1ЪШ1Г X С1ЪШЯ'

3000«74(Яи0) 5.0+ 0,1 » 103 1,16+ 0.05 105

АВ 259 " 6,7+ 0.1 * 103 1.16+ 0,05 ю5

СА 77 1.7+ 0.1 * 103 '1.61+ 0,05 ю5

10 0, 7+ 0, 05» 103 , 1,39+ 0,05 105

МЯ 31 0,8+ 0.05* 103 0,34+ 0,03 ю5

И> 3301 " 1,3+ 0,05* 103 3,1 ± 0, 06 ю5

ИВ 101 (Зи1) 13,3+ 0,4 ♦ 103 1,06+ 0,05 ю5

С 600 31,1+ 0,6 ♦ 103 1.42+ 0.05 105

К 12 " 1.37+ 0,05* ю5 1,33+ 0,05 ю5

СА 5013 " 1.33+ 0,05* ю5 1.55+ 0,05 105

фагом з АГАТ так 1 з О" И' -мутац1ями була приблизно на одному р!вн1 тому, що мутацЦ в цих фагах виправляе один ! той же амбер-супресор Е, який вп!знае амбер-кодон 1 вбудовуе в цьому м!сц! ам!нокислоту глутам!н. Для суперсинтизу р-галак-тозидазн /Глушакова Л. Г.. 1982а, Глушакова Л. Г., 19826, Кордюм В. А. ,1980 / з одинаковою - ефективн1стю були використан! ¡Г-та 0"Н"-пох1дн! фагу х р1де. Проте в систем! синтезу р-лак^ тамази фаг X С1 857 гГ {Г виявився неефективним. Ймов1рно, що тут в1дбуваються так! процеси. Ген Ыа клонований в фаг в склад! ц1ло! плазм!ди рсШ. В!домо, що № -мутанта фагу X в

безсупресорних штамах 1снують як плазм!ди /Lieb М. ,1970 /, тому фаг X CI 857 bta If if в Su° штамах 1снуе як дворепл1-конова плазм!да. В результат! взаемодП фагового та плазм!д-ного репл!кон!в або зменшуеться к!льк1сть коп!й Я-плазм!ди (в норм! IX 10-20 на ,.кл!тину /Klechner N. ,1977 /), або зб!льшуеться П нестаб!льн!сть. Про нестаб1льн!сть плазм!д-ного стану X С Г If If в безсупресорному хозя1н! при р1зних умовах культивування пов1домляли pi3Hi автори /Hadfield Ch.,1984, Lieb М., 1S70, Signer Е. R., 1960 /.

Такиы чином продемонстровано, що для фагозалежного синтезу ß-лактамази необх!дно використовувати рекомбхнантний фаг X CI 857 bta Q~J?~, а штамом-продуцентом може служити т1льки безсупресорний штам Е. соU 1С 3101.

3. Дагозалежний синтез ß-лактамази в кл!тинах Е. coti, як!

мають р1зн! плазм!ди з геном bta.

Для вивчення можливостей отпим1зацП фагозалежного синтезу ß-лактамази в кл1тинах Е.coti досл1джували ряд плазм1д, як! мають в своему геном1 ген bta: pcVII, pBR322, pMCR4, pMCRltlb, pGEMI. Ц1 плазм1ди були трансформован! у штам-продуцент Е. coti У/ 3101 Su°. Цей штам характерний тим, що у своему геном! в!н несе мутац!ю в reHi гес А, який в1д~. пов1дае за процеси рекомб!нац!1 в кл!тин1. МутаьЦя в ген! гес А сприяе зниженню частоти рекомб1нац11 м!ж гомолог1чними посл!довностями гена bta, 1нтегрованого у фаг, та який е в склад! досл1джуваних плазм1д. Кл1тини з плазм1дами вирощували в умовах п!двищено1 аерацП до логар1фм1чно! фази росту 1 1н-ф!кува'.-и фагом X CI 857 bta Q"R" в к!лькост1 10-20 корпускул на кл!тину. Через 14-16 годин п!сля !нф!кування визначали активн!сть ферменту в культуральному сёредовипЦ. Р!вень син-

тезу фермента в штам!-продуцент1, в якому е р1зн! плазм !ди, показано в таблиц! 2.

Таблиця 2.

Активн1сть ß-лактамази в штам1-продуцент! £. coli Ш101, який мае плазм1ди з Ыа геном р1зно! коп!йност1, при 1нф1куванн1 фагом X CI Ыа О".

Коп1йн1сть плазм1ди Активн1сть &-лактамази Плазм!да в кл!тин! (од. /мл л!зату)

pcvll 15+5 3,5+0,2 * .10*

pbR322 40+10 3,2+0,02 * 105

pMCR4 30±10 1,5+0,01 ♦ 105

pMCRltlb ■ 30+10 7,7+0,2 * 104

pGEMl 80+10 6,0+0,03 * 105

В ход! досл1джень було доц!льним вияснити, якою к1ль-к1стю коп1й ген bid представлений у штам1-продуцент!.■В робот! /-■ Mason Anthony., 1989 / автори вивчали рекомб!нантн! плазм!ди, кожна з котрих мала,в своему геном! ген bla. Ак-тивн!сть &-лактамази зростала при зб!льшенн! к!лькост! коп!й гена bta. В наших досл!дженнях найб!льша активн!сть ß-лакта-мази виявлена при 1нф1куванн! фагом X С1 857 Ыа Q~R~ бакте-р!й з плазм!дою GEMI, коп!йность яко! ставила 80+10 коп!й на кл!тину (табл.2 ). Про кореляц1ю м!ж експрес!ею клонованого гену та к!льк!стю коп!й цього гену в кл1тин! говориться в робот! Бейл! /ВаШу J.-H. , 1985/, що сп!впадае i з нашими результатами.

4. Тестування в!рус1в та в!русспециф1чних антит!л за допомо-гою в-лактамазних нон'югат!в в 1ммуноферментному анализ! (1ФА).

0станн1м часом фермент в-лактамаза стае все б!льш поши-реним для використання в 1ФА поряд з традиц!йними пероксида-зою, в-галактозидазою, лужною фосфатазою. Розробка та ство-рення д1агностикум1в з застосуванням кон'югат!в на основ! В-лакта)лази вимагае високоочищеного преперату. Запропонована подв!йна система синтезу цього ферменту дозволяе отримувати велик1 к1лькост1 преперату в легкодоступна та розчинн!й форм!, що створюе умови для розробки простого та дешевого методу його вид1лення та очистки. В!дом! методи вид!лення та очистки цього ферменту базуються на отриманн! його з кл!тин м!кроорган!зм!в, в яких BiH синтезуеться, ! знаходиться або в невеликих к1лькостях, або в важкодоступн1й форм! /Hirai К., 1980, Georgion G., 1986/. В зв'язку з цим, вид!-лення та очистка вимагають багато стад1й, а це, в свою черту, приводить до втрат б!лку та часткоео! його деградацП. Запропонований нами метод вид!лення та очистки ß-лактамази дозволяе ввести цей процес до трьох стад!й ! йде в м'яких умовах /Сорочинська Т.В.,1990/. Вих!д препарату становить 45Ж, електрофоретичний анал!з показуе його гомогенн!стъ та 95%-у чистоту (мал. 1.2).

Отриманий таким методом препарат ß-лактаыази був випро-буваний при створенн! тест-систем для виявлення в!русспеци-ф!чних антит!л в!русу грипа та HBs-антигену в!русу гепатита / Сорочинська Т.В.,1989, Родн!н М.В.,1991/. На модел! Bipycy грипа та в!русспециф!чних до нього антит!л було проведено пор!вняння чутливост! тест-систем, в яких використовувапи

'ГЗ

к V—*

'}"

N г ^

ь —

р! -,3

I -

БАА

С: (68КД)

Пол1е

ьл Др1н

(28КД)

Л РНКза

УМ

(14КД)

Малюнок 1. Електрофорез препарат1в р-лактамази в 10%-ому ПААГ э додецилсульфатом • натр1ю. (1,9 - сум1ш стандартна маркерних б1лк1в; 2 - пер-винний препарат р-лактамази, частково очищений висолюван-ням (НН4)2804; 3-8 - фракцП р-лактамази п!сля 1онообм1н-но1 хроматограф!х.

123456789

ЧКл.

Малюнок 2. Денситограма електрофореграми очищеного препарату р-лактамази.

кон'югати з 0-лактамазою та традиц1йно вживаною пероксида-зою. Показано, що нижн1 меж! визначення р!зних антиген1в для обох тест-систем близьк! 1 становлять: для 1ммуноглобул1н1в кролика - 0,1 нг в зразку, для в1р1он1в грипу - 1-2 нг для тотального в1русного б!лку (мал.3,4).

о.о1 о./ / /о о.1 1 ю гоо

Малюнок 3. (зл!ва) Пор1вняння чутливост! 8-лактамазно1 (1) та пероксидазно! (2) тест-систем при виявленн! кролячих 1ммуно-глобул!н!в. По горизонтап1 зверху - к!льк1сть 1ммуноглобул1-н1в в лунцКв нг), знизу - логарифм ц1еТ величини; по вертикали - оптична густина.

Малюнок 4. Пор1вняння чутливост! р-лактамазно! (1) та перок-сидазно1 (2) тест-систем при виявленн! в!русу грипа. Позна-чення координат - т! ж, що й на мал. 3.

2.0 -

1.5 -

1,0

0,5 -

- 15 -

Ц1 ж системи- були здатн! виявити в1русспециф1чн! ±ммуно-глобул1ни при розведенн! кролячо! анти-МР-сиворотки 1:2560000 (мал. 5).

Малюнок 5. Пор1вняння чут-ливост1 &-лактамазно°1 (1) та пероксидазно! (2) систем при виявленн! в!русс-пециф!чних антит1л в кро-ляч!й анти-иР-сиворотц!. По горизонтал! - розведен-■ ня сиворотки. В лунки вносили по 50 нр в1русу гри-па, пот!м посл!довно - 1м-, мунну сиворотку, кон'югат (розводення 1:1000) та субстрат.- Контроль - нормальна кроляча сиворотка в тому ж розведенн!.

1-20000

1-320000

г- 5 /го оо о

Видно, що за чутливостю ц! системи практично не в!др!зня-ються. Проте Б-лактамазн! системи мають ряд переваг, а са-ме - це зручний фермент для роботи з ним, бо мае малу моле-кулярну масу (28,5 КД), за своею будовою в!н односубодинич-ний, термост1йкий, реагент для його виявлення абсолютно без-печний - розчин йоду в йодистому калП, крохмаль та петци-л!н. В ряд! роб!? /Лев! МЛ., 1985, Лев1 МЛ., 1987, Жв!рблене А. А. ,1987, Леонов С. В. ,1989/ п!дкреслюеться, що д!агностику-ми з використанням р-лактамазних кон'югат!в можуть бути перспективними нав1ть для застосування в польових умовах, бо дозволяють в!зуально рееструвати результата.

Висновки.

1. Сконструйовано рекомб!нантний фаг X СI 857 Ыа, який несе в своему геном! структурний ген р-лактамази Ыа на ос-нов1 фагового вектору X СI 857 та плазм!ди pcVII.

2. Отриман! та охарактеризован! його пох!дн!, як! несуть амбер-мутацП в регуляторних генах N та й ! в п!зньому структурному ген! R. Показано, що ген bta експресуеться максимально, коли в!н розмЦений nifl контролем сильних Piac- та PL-npOMOTOpiB фагу X.

3. П1д!браний штам-продуцент р-лактамази - кл!тини Е.coli У 3103 Su°. При 1нф!куванн! цього штаму фагом X CI 857 Ыа Q~R~ антивн1сть ферменту стаиовила 3,11±0,06»105 од/ /мл. W" -ппх1дн! фагу X СI 857 bta виявилися неефективнш.ш для системи суперсинтезу р-лактамази.

4. Вперше, на приклад! синтезу р-лактамази показана можлив!сть об'еднання переваг плазм!дно1 та фагозалежно! технолог!й в одн!й подв!йн!й систем!, коли експрес!я клоно-ваного гену bla йде в кл!тинах E.coli одночасно як в склад! плазм1ди, так 1 в склад1 фагу з позакл!тинною локал!зац!ею ферменту в KiHq! процесу. Вих1д б!лка досягав 600 мг з 1 л культурального середовища.

5. Встановлено пряму кореляц1ю Mi» к!льк!стю коп!й кло-нованого гену в штам!-продуцент! та р!внем синтезу продукта, за який в!н в1дпов1дае.

6. Розроблено простий та економ1чно виг!дний препара-тивний метод вид1лення та очистки р-лактамази. Вих!д б!жу становить 45% в!д початково! к!лькост!, а його чистота - 9555.

7. Кон'югати на основ! В-лактамази можна пор!внювати а кон'югатами, де використовують традиц!йну пероксидазу - вони мають аналог1чну чутлив1сть, що становить 0,1нг/мл для iMMy-ноглобул!н!в кролика та 10-20 нг/мл для в!р1он!в грипу. Фермент е перспективний для використання в 1ФА, оск!льки мае певн! переваги над традиц!йно вживаними ферментами.

8. Складено лабораторний технолог!чний регламент на ви-робництво препарату р-лактамази.

Основн! результата дисертацН надрукован! в таких працях:

1. Сорочинская Т. В., Черных С. И., Левитина Т.Л., Роднин Н. В. / Получение и очистка р-лактамазы ТЕМ I Escherichia coli// Биопол. и клетка, 1990, т. 6, N 3. С. 99-102.

2. Сорочинская Т.В., Черных С.И., Кордюм В.А./ Оптимизация системы фагозависимого синтеза В-лактамазы ТЕМ I в клетках .Escherichia coli// - Биопол. и клетка, 1991, т. 7, N 2, С. 19-22.

3.Сорочинская Т.В., Черных С.И./ Исследование синтеза В-лактамазы ТЕМ I в различных штаммах Escherichia coli при заражении их фагом X Ыа с амбер-мутациями в регуляторных генах // Биопол. и клетка, 1991, т. 7, N 7, С.101-106.

4.Благодатный В.Н., Гирин В. Н., Палатная Л.А., Крамаров С. А., Сорочинская Т. В., ЗезекаО.Д., Чопик М. В. / Новые возможности изучения ротовирусных инфекций// Сб. "Вирусы и вирусные заболевания". Киев.- 1994.- с. 1-4 (в печати).

5. Кордюм В. А., Черных С. И., Сорочинская Т. В. /Способ получения в-лактамазы // Авт. свид. СССР N 1089110, 1984 г.

- 18 -

6. Черных С. И., Стельмашенко Л. Н., Сахно (Сорочинская) Т. В., Кордам В.А./ Экспрессия Лр-гена под контролем собственного и Тас-промоторов в лямбдовых векторах // Тез. докл. 6 раб. совещания. по программе "Плазмида".- Москва. 1981, с. 143.

7. Черных С. П., Стельмашенко Л. Н., Сорочинская Т. В., Кордюм В.А/ Суперсинтез р-лактамазы в клетках Е. coli, индуцируемый фагом X bta // Тез. докл. 16-й конфер. ФЕБО.- Москва, 1984, с. 380.

8. Сорочинская Т. В., Леонов С.В. / Использование р-лакта-мазы ТЕМ I из Е. coü в твердофазном иммуноферментном анализе //Тез. докл. школы-конфер. "Структура и функции биополимеров". - Львов, 1989, с. 73.

9. Роднин Н.В., Сорочинская Т.В./ Выделение и очистка фермента &-лактамаза ТЕМ I E.coli для иымуноферментного анализа // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Достижения биотехнологии -агропромышленному комплексу. - Черновцы, 1991, т. 2, с.136.

10. Перерва Т.П., Мирюта А.Ю., Даниленко Т. С., Бух И.Р., Мартынов С.А., Сорочинская Т.В./ Клонирование мутант-ной области инициации репликации Е. coli, обеспечивающей повышенную копийность рекомбинантных плазмид II Тез. . доп. VI ЗЧзду Укра!нського товариства генетик!в та селекц!онер1в 1м. МЛ. Вав1лова. - Полтава, 1992, с. 3

11. Благодатный В. М., Зозуля И. С., ЗезекаО.Д., Сорочинская Т. В., Дембик И. А., Палатна Л. А., Применова И. А., Петренко Е.В./ Пути совершенствования даигностики инфекционных болезней II Тез. доп. науково-практично! конф. "Актуапь-н! питания MiKpoöio^oril, еп1дем1олог1! та 1ммунолог1х 1н-

- 19 -

i/eKqIfiHKX 3axBOpK>0aHb". - XapKiB, 1993, C. 53.

12. SorocMnsKa T.V., Chernykh S.I.,' Kordium V.A. / Using of the ^-lactamase TEM I from Escherichia coU for detection of the plant's viruses // Abstr. Intern. Conf. "Fundamental and applied problems in phytovirology".- Yalta, 1994, p. 61.

13. Sorochinska T.V., Chernykh S. I.% Kordlura V.A. / Synthesis of B-lactaraase TEM I in E. coli cells based on phage-dependent technology // Abstr. 7th Intern. Congress of Bacteriol. and Appl. Microbiol. Division and 7th International Congress of Mycology Division.- Pragua, 1994, p. 125.

Sorochinska T.V. Research of phagedependent synthesis of p-lactamase in Escherichia coli cells.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences, specialization 03.00.03 - molecular biology, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1994.

In the thesis' was submitted the new process'"for . production of p-lactamase, where bla gene expression was carried out by one regulation system with using phage and plasmid vectors. Such system has not any analogues. This method of getting p-lactamase gives high yield of the product (eOOmg/L) with out-of-cell localization. This is important for the p-lactamase extraction and purification. The extracted and purified -p-lactamase preparation was applied for virus and virus specified antibody detecting.

Сорочинская Т. В. Исследование фагозависимого синтеза р-лак-тамазы в клетках Escherichia coli.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1994.

В диссертационной работе представлен новый способ получения р-лактамазы, при котором экспрессия Ыа .гена осуществляется одной системой регуляции с использованием фагового и плазмидного векторов. Такая . система не имеет аналогов. Этот.способ получения р-лактамазы дает высокий выход продукта (600 мг/л) с внеклеточнрй локализацией. Это важно для выделения и очистки р-лактамазы. Выделенный и очищенный препарат р-лактамазы был апробирован для детекции вирусов и ви-русспецифических антител.

Ключов! слова: р-лактамаза, Escherichia coli, фагоза-лежний синтез, плазмой, 1ФА , кон'югати антит!л.

ГИдписано ДО друку 14.II.94р. формат 60x84/16 1зп1р друк. Умов, друк. л. 1,0. Тираж 100 прим1рник. Заказ М163Х

эуковано ЦУОП ДНПП " Плодвинконсерв" м. Ки1в, Саксаганоького , I