Мутационная изменчивость CTX-M β-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli

Степанова, Марина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мутационная изменчивость CTX-M β-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Мутационная изменчивость CTX-M β-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli"

На правах рукописи

СТЕПАНОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА

МУТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ СТХ-М ß-ЛАКТАМАЗ И ФОРМИРОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К ЦЕФТАЗИДИМУ У КЛИНИЧЕСКИХ И ЛАБОРАТОРНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

4844238

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2011

2 1 АПР 2011

4844238

Работа выполнена в лаборатории антибиотикорезистентности НИИ Антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ.

Научный руководитель: Кандидат биологических наук

Эйдельштейн Михаил Владимирович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Чернов Владислав Моисеевич

Доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Сергей Владимирович

Ведущая организация: Самарский государственный медицинский

Университет

Защита диссертации состоится «28» апреля 2011 г. В 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211. Факс: (843) 238-76-01; e-mail: attestat.otdel@ksu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского федерального университета

Автореферат разослан «_» марта 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

Актуальность проблемы. Продукция (3-лактамаз является основной причиной резистентности к (3-лактамным антибиотикам у грамотрицательных бактерий. Плазмидпо-кодируемые Р-лактамазы молекулярного класса А, обладающие активностью в отношении цефалоспоринов Ш-IV поколения и известные, как Р-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), представляют собой одну из наиболее значимых групп Р-лактамаз. Эти ферменты являются основными детерминантами устойчивости к цефалоспоринам и монобактамам у бактерий семейства Enterobacteriaceae. В настоящее время, в России и ряде других стран Европы, Азии и Южной Америки, СТХ-М Р-лактамазы являются доминирующей группой БЛРС (Canton, 2006).

Частота встречаемости СТХ-М р-лактамаз особенно высока среди госпитальных возбудителей, что связано с повышенным потреблением современных Р-лактамных антибиотиков в стационарах. В отдельных лечебных учреждениях России, частота распространенности этих ферментов достигает 80-100%. В 2006-07 гг. суммарная доля СТХ-М БЛРС среди нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae в различных стационарах России достигла 69,9% (Sukhorukova and et al., 2010). Стремительное распространение генов СТХ-М Р-лактамаз связывают в основном с активностью мобильных генетических элементов (JSEcpl), которые обеспечивают их перенос на различные плазмиды энтеробактерий.

В отличие от БЛРС ТЕМ- и SHV-типа, большинство СТХ-М проявляют значительно более высокую активность в отношении цефотаксима и цефтриаксона по сравнению с цефтазидимом. В связи с этим преимущественная устойчивость штаммов к цефотаксиму по сравнению с цефтазидимом часто рассматривается как основной диагностический признак продукции СТХ-М ферментов. Кроме того, штаммы, продуцирующие СТХ-М Р-лактамазы, часто ошибочно оцениваются как чувствительные к цефтазидиму in vitro, что приводит к необоснованному назначению цефтазидима и клинической неэффективности терапии инфекций, вызванных продуцентами СТХ-М БЛРС.

Вместе с тем, в последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что продуценты СТХ-М Р-лактамаз могут проявлять высокую устойчивость к цефтазидиму. Изменение резистентности к цефтазидиму может быть связано, как с гиперпродукцией или мутациями самих СТХ-М ферментов, так и с наличием дополнительных факторов резистентности, например, пониженной проницаемости наружной клеточной мембраны. Более того, для отдельных СТХ-М ферментов была показана преимущественная активность в отношении цефтазидима, связаная с мутационной изменчивостью генов, кодирующих СТХ-М Р-лактамазы. В связи

с этим, изучение закономерностей эволюции СТХ-М ß-лактамаз и роли отдельных аминокислотных позиций в изменении спектра активности этих ферментов имеет большое научное и клиническое значение.

Целью работы явилось установление механизмов формирования резистентности бактерий к цефтазидиму, связанных с мутационной изменчивостью СТХ-М ß-лактамаз.

Основные задачи исследования:

¡.Охарактеризовать новые мутантные варианты СТХ-М ß-лактамаз расширенного спектра, определяющие высокий уровень устойчивости к цефтазидиму у клинических штаммов Escherichia coli.

2.0пределить роль АК в области Q-петли СТХ-М-3 в изменении спектра ферментативной активности и формировании резистентности к цефотаксиму и цефтазидиму у штаммов-продуцентов.

3.Выявить с использованием методов молекулярно-генетического тонирования источники происхождения цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамаз у клинических изолятов.

4.Определить локализацию генов цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамаз, их связь с мобильными генетическими элементами и возможные механизмы распространения среди нозокомиальных штаммов энтеробактерий.

5.Исследовать мутационную изменчивость СТХ-М ß-лактамаз в экспериментах по in vitro селекции резистентности к цефтазидиму у гипермутабельных штаммов Е. coli.

6.Установить взаимосвязь между копийностью генов различных СТХ-М ß-лактамаз и уровнями устойчивости штаммов-продуцентов к различным ß-лактамам.

Научная новизна. Основной научный приоритет работы заключается в исследовании мутационной изменчивости СТХ-М ß-лактамаз и роли отдельных аминокислотных позиций в изменении спектра активности данных ферментов. В ходе настоящей работы выявлена, охарактеризована и зарегистрирована в международной классификации новая ß-лактамаза расширенного спектра, СТХ-М-42; установлена ключевая роль аминокислотных позиций 167 и 136 в области омега-петли в формировании субстратной специфичности СТХ-М ферментов в отношении цефотаксима и цефтазидима; доказана эволюция СТХ-М-3 и появление СТХ-М-42 у клинических штаммов Е. coli, обладающих повышенной частотой мутирования in vivo; показана возможность селекции мутаций устойчивости к цефтазидиму в генах СТХ-М ß-лактамаз у

гипермутабельных штаммов клинических и лабораторных штаммов Е. coli in vitro\ установлены механизмы распространения новой цефтазидим-гидролизующей СТХ-М ß-лактамазы; впервые установлено наличие точной взаимосвязи между количеством копий гена СТХ-М ß-лактамаз и уровнями резистентности штаммов продуцентов к различным о кс и и м и н о-ß-л актам ам.

Практическая значимость результатов. Нуклеотидная последовательность гена ¿/астх-м-42 и прилежащего участка IS Ecpl депонирована в GenBank под номером DQ061159 и может быть использована для сравнительного анализа генов. Результаты проведенных нами исследований по in vitro селекции цефтазидим-резистентности у гипермутабельных штаммов Е. coli и по изучению взаимосвязи между количеством копий гена СТХ-М ß-лактамаз и уровнями резистентности штаммов продуцентов к различным оксиимино-р-лактамам свидетельствуют о наличии у штаммов, продуцирующих ß-лактамазы расширенного спектра СТХ-М-типа, широких возможостей формирования резистености к различным оксиимино-Р-лактамам, связанных как с изменением субстратной специфичности, так и уровня продукции данных ферментов. Полученные данные свидетельствуют о том, что для выявления продукции БЛРС у клинических штаммов энтеробактерий в практике диагностических микробиологических лабораторий недостаточно оценки уровней МПК цефалоспоринов III-IV поколений, и, следовательно, о необходимости использования с этой целью специальных тестов (фенотипических или молекулярных).

Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (№ гос. регистрации ВНТИЦ 01200608913).

Положения, выносимые на защиту:

1. Появление ß-лактамазы СТХ-М-42, вызывающей преимущественную устойчивость к цефтазидиму, связано с мутационной изменчивостью СТХ-М-3 у клинических штаммов Е. coli.

2. Аминокислотные замены в позиции 167 (Pro—»Ser/Thr), выявленные у клинических штаммов и в экспериментах по in vitro мутагенезу, играют основную роль в формировании "цефтазидимазной" активности СТХ-М ферментов.

3. Высокий уровень устойчивости штаммов-продуцентов СТХ-М ß-лактамаз к цефтазидиму может быть связан как с наличием специфических аминокислотных замен в структуре СТХ-М, так и изменением копийности ЫаСух-м генов.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 14-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Прага, 2004 г.), 45-ой Междисциплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Вашингтон, 2005 г.), 34-ой конференции молодых ученых (Смоленск, 2006 г.), 16-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Ница, 2006 г.), 17-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Мюнхен, 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 8 рисунков. Библиография содержи 211 наименований, в т.ч. 208 -зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинические штаммы микроорганизмов. В исследование были включены СТХ-М-продуцирующие изоляты Е. coli (п=21), выделенные у пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии Областной детской клинической больницы города Иркутска в 2002-2003 гг.

Определение чувствительности клинических изолятов к антибиотикам проводили в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04, 2004) и рекомендациями Комитета по клиническим и лабораторным стандартам / Института по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS/CLSI, 2004 г.).

Фенотипическое обнаружение БЛРС. Для определения продукции БИРС использовали фенотипические тесты, основанные на эффекте подавления активности БЛРС в отношении оксиимино-Р-лактамов в присутствии

клавулановой кислоты: метод «двойных дисков», а также определение соотношения МПК цефалоспоринов и их комбинаций с клавулановой кислотой (МУК 4.2.1890-04, 2004).

Выделение бактериальной ДНК для последующей амплификации проводили с помощью набора реактивов InstaGene Matrix (Bio-Rad, США) согласно рекомендациям производителя.

ПЦР-амплификация, клонирование и секвеиирование генов ß-лактамаз. Для первичной детекции генов, кодирующих ß-лактамазы СТХ-М-типа, использовали ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим флуоресцентным красителем SYBR Green I и праймерами, комплементарными внутренним участкам blaçn-u генов: CTX-M-Fext, CTX-M-RIc и СТХ-М(1-2)-Rnest (Таб. 1). Принадлежность СТХ-М ß-лактамаз к одному из 4 известных генетических кластеров (СТХ-М-1, СТХ-М-2, СТХ-М-8/-25, СТХ-М-9) определяли на основании анализа температуры плавления (Тш) ПЦР-продуктов.

Для амплификации полной нуклеотидной последовательности генов группы WücTx-м-ь включая промоторную область и открытую рамку считывания, использовали праймеры ISEcpl, CTX-M-R-stop (Таб. I).

Гены blacTx-м> полученные в результате прямой амплификации с праймерами ISEcpl и CTX-M-R-stop от клинических изолятов Е. coli Irk2320 и Irk 1224, клонировали в вектор pCCl (Epicentre,CIJLlA), в котором отсутствуют гены других ß-лактамаз. Клонирование ПЦР продуктов по осуществляли с использованием коммерческих наборов CopyControl PCR Cloning Kit (Epicentre,США) в соответствии с инструкциями производителя. Компетентные клетки £. coli EPI 300 (Epicentre,США) получали с помощью метода, описанного в работе (H. Inoue and et al.,1990).

Определение полной нуклеотидной последовательности генов Ыастх-ми их промоторной области проводили модифицированным методом Сенгера с использованием прибора ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). В качестве матрицы для проведения реакций секвенирования использовали ПЦР-продукты, полученные с помощью проймеров ISEcpl и CTX-M-R-stop непосредственно от клинических изолятов Е. coli lrk2320 и Irkl224 и рекомбинантные плазмиды, выделенные от трансформантов с помощью коммерческих наборов Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. Реакции секвенирования проводили с использованием внутренних праймеров к генам WßcTx-м и праймеров M13F(-20), M13R(-27) (Таб. 1), а также наборов Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), содержащих флуоресцентно-меченые ддНТФ терминаторы.

Таблица 1.

Олигонуклеотидные праймеры1, использованные в работе.

Название Последовательность, 5'-3' Мишень Назначение

CTX-M-Fext TTTGCGATGTGCAGCACCAGTAA Внутренние Выявление и

участки дифференциация

CTX-M-Rlc CCGCTGCCGGTCTTATC й/остх-м Ыас тх-м генов

различных

CTX-M( I -2)-RNest TGATCTCAACGCGCTGATTTA генетических групп

CTX-M-R-stop TGTCTGGTATAATAAGAATATCATC 5' конец ПЦР-

¿/ястх-м амплификация

lSEcpl TGTCTGGTATAATAAGAATATCATC 5' конец WflCTX-M и

\SEcpl промотора

CTX-M-R1 CACCGCTGCCGGTTTTATC Внутреннй Определение

участок ориентации и

6/астх-м нуклеотидной

M13F{-20): GTAAAACGACGGCCAGTG вектор рСС' 1 последователь-

ности Ä/астх-м в

MI3R(-27): GGAAACAGCTATGACCATG вектор рСС 1 векторе

ERIC1 GTGAATCCCCAGGAGCTTACAT - ПЦР-типирование

изолятов Е. coli с

AP7 GTGGATGCGA произвольными

OPA4 AATCGGGCTG - праймерами

MI3 GAGGGTGGCGGTTCT _

' Синтез олигонуклеотидов осуществлен ЗАО «Синтол» (Россия).

Перенос детерминант резистентности с помощью конъюгации. Перенос СТХ-М-кодирующих природных плазмид от донорных штаммов Е. coli Irk 1224, Irk2320 и Irk2322 в реципиентный штамм Е. coli АВ1456 (F", R if*) про водил и с помощью конъюгации в жидкой среде (бульон Мюллера-Хинтон), используя начальное соотношение суточных культур донора и раципиента 1:2. Эффективность конъюгации рассчитывали как отношение количества колоний трансконъюгантов на чашках с рифампицином и цефотаксимом к количеству колоний реципиента на чашках с рифампицином. Параллельно проводили высев на селективные среды донорных культур для оценки частоты спонтанных мутаций устойчивости к рифампицину и в качестве отрицательного контроля конъюгации.

Изоэлектрическое фокусирование р-лактамаз. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) р-лактамаз проводили в готовых полиакриламидных гелях, содержащих амфолиты Phast Gel, рН 3-9 (Amersham Biosciences;

Piscataway, США), при помощи прибора Phastsystem (Amersham Biosciences; Piscataway, США) согласно рекомендациям производителя.

Типирование клинических штаммов с помощью ПЦР с произвольными праймерами (AP-PCR) проводили с использованием четырех праймеров ERIC1, АР7, ОРА4 и MI3 (Таб. 1). Кластерный анализ ПЦР-профилей был выполнен при помощи компьютерной программы GelCompar версия 4.1 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия) с использованием коэффициента корреляции Пирсона и UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) алгоритма.

Типирование клинических штаммов с помощью пульс-электрофореза (PFGE) макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК проводили с использованием наборов для выделения геномной GenePath Group б Reagent Kit и прибора CHEF Mapper ХА System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, США) согласно стандартному протоколу описанному в работе (Gautom, 1997). Геномную ДНК подвергали рестрикции при помощи эндонуклеазы Xbal (Promega, США).

Анализ природных плазмид, несущих гены ¿/дсгх-м- Выделение бактериальных плазмид у штаммов Е. coli Irkl224, Irk2320, Irk2322 и их трансконъюгантов проводили с использованием коммерческой системы QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Плазмиды, выделенные от трансконъюгантов, подвергали сравнительному рестрикционному анализу. Сто тридцать нанограмм плазмидной ДНК расщепляли эндонуклеазой Луг/II (16 ед.; Amersham Biosciences, США). Нативные плазмиды и их рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электровфореза в 1% агарозном геле. ПЦР-типирование репликонов у трансконъюгантов, полученных от клинических изолятов Е. coli Irkl224, Irk2320 и Irk2322, осуществляли согласно протоколу описанному в работе (Carattoli and et al., 2005)

Определение частоты формирования спонтанных мутантов, устойчивых к рнфампицину. Уровень спонтанных мутаций рассчитывали как соотношение количества колоний, выросших на чашках с рифампицином, к количеству колоний, выросших на чашках без антибиотика. Штаммы рассматривали как гипермутабельные (сильные мутаторы) при частоте мутантов >5x10'7 и как слабые мутаторы при соответствующей частоте от 5х 10"8 до 5x10"7 (Galan and et all., 2004).

In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов, продуцирующих СТХ-М ß-лактамазы. В экспериментах по in vitro селкции устойчивости к цефтазидиму использовали клинический изолят Е. coli Irkl224

и лабораторный штамм-мутатор Е. coli GM2995, экспрессирующие ß-лактамазу СТХ-М-3. Ген ¿/остх-м-з с естественным промотором был перенесен от штамма Irkl224 в GM2995 в составе вектора рСС1. Штаммы Е. coli Irkl224 и GM2995 (pCCl-1224) субкультивировали в бульоне Мюллера-Хинтон в течение 14-16 часов при 37°С и затем высевали на селективный агар Мюллера-Хинтон, содержащий цефтазидим в концентрациях в два раза превышающих значения МПК данных штаммов (64 мг/л для Irkl224 и 2 мг/л для GM2995 (pCCl-1224)). Тридцать две мутантные колонии каждого штамма, выросшие на селективной среде, были отобраны случайным образом для дальнейшего определения чувствительности к ß-лактамным антибиотикам (ампициллину, цефтазидиму и цефотаксиму) и для определения нуклеотидной последовательности ¿/аСТх-м генов. Во избежание накопления мутаций и для определения влияния мутаций, как связанных, так и несвязанных с ß-лактамазной активностью на резистентность мутантных штаммов к ß-лактамным антибиотикам, ¿/аСтх-м гены повторно амплифицировали от всех отобранных клонов и клонировали в составе рСС1 вектора в лабораторный штамм Е. coli EPI300. Параллельно проводили секвенирование è/астх-м генов и их промоторных регионов и определяли МПК ампициллина, цефтазидима и цефотаксима для штаммов мутаторов и штаммов Е. coli EPI300, несущих /;/«ст\-м гены отобранных клонов.

Определение копийности плазмид, несущих гены А/ястх-м- Количество копий плазмид, несущих гены WaCTx-m» определяли при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и праймерами CTX-M-Fext и CTX-M-Rlc (Таб. 1). Определение проводили в двух повторах для каждлго анализируемого образца. Для количественной ПЦР использовали ДНК, выделенную их бактериальной культуры, выращенной в течение 18 часов в LB бульоне, Параллельно определяли количество бактериальных клеток путем приготовления последовательных 10-кратных разведений каждой культуры и высева их на чашки с добавлением хлорамфенникола (12,5 мг/л). Количество копий плазмиды, рассчитанное по данным количественной ПЦР в реальном времени, соотносили с числом бактериальньных клеток для определения числа копий плазмиды на клетку.

Оценку копийности рекомбинантых плазмид на основе вектора рСС1 проводили после культивирования штаммов Е. coli EPI 300 в хлорамфеникол-содержащем LB бульоне с добавлением и без добавления 0,02% L-арабинозы, которая является индуктором «множественной копийности» рСС1 в клетках EPI 300 за счет активации инициации репликации вектора в oriV (Wild and et al, 2002).

В качестве калибровочных стандартов для количественной ПЦР использовали 10-и кратные разведения культуры Е. coli EPI 300 (pCCl-1224), выращенной в LB бульоне с добавлением хлорамфенникола, но без добавления арабинозы. Данные условия культивирования обеспечивают однокопийное состояние вектора рСС1 в клетке за счет инициации репликации в or/F (190). Таким образом, число копий вектора в калибровочных стандартах было рассчитано по количеству бактериальных клеток.

Параллельно с оценкой числа копий плазмид рСС1, несущих гены различных СТХ-М ß-лактамаз, проводили определение чувствительности рекомбинантных штаммов Е. coli EPI 300 к ампициллину, цефтазидиму, цефотаксиму, цефепиму и азтреонаму. МПК антибиотиков определяли методом микроразведений в бульоне. Процедура тестирования соответствовала рекомендациями CLSI (47), за исключением замены бульона Мюллера-Хинтон, содержащего сахара, препятствующие активации репликации рСС1 в oriV, на бульон LB с добавлением и без добавления 0,02% L-арабинозы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация клинических изолятов, продуцирующих цефтазидим-гидролизующие ß-лактамазы СТХ-М-типа. Анализ 614 клинических штаммов энтеробактерий, продуцирующих БЛРС СТХ-М-типа, выделенных в рамках многоцентрового микробиологического исследования в 2002-2004 гг. позволил выявить два изолята Е. coli, обладающих необычным фенотипом резистентности к оксииминоцефапоспоринам, а именно, более высокой устойчивостью к цефтазидиму (МПК128 мг/л), по сравнению с цефотаксимом (МПК 8 мг/л) (Таб. 2). Оба клинических изолята были выделены в отделении реанимации и интенсивной терапии с разницей 10 дней.

ПЦР в реальном времени с праймерамя к внутренним участкам Ыасгх-м выявила наличие у обоих изолятов генов, кодирующих ß-лактамазы СТХ-М-1 группы.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) экстрактов периплазматических белков позволило обнаружить у штаммов Е. coli frk2320 и Irk2322 экспрессию ß-лактамаз с изоэлектрическими точками (pi) 5,4 и 8,4, которые предположительно соответствовали ферментам ТЕМ- и СТХ-М-типа. Фермент с изоэлектической точкой 5,4 был идентифицирован, как пенициллиназаТЕМ-1 в соответствии с результатами амплификации и определения нуклеотидной последовательности гена Wotem- Продукция, ТЕМ-1, таким образом, не влияла на профиль устойчивости исследуемых штаммов к оксииминоцефапоспоринам.

В экспериментах по конъюгации была установлена возможность переноса детерминант устойчивости к цефтазидиму от донорных штаммов Е. coli Irk2320 и Irk2322 к реципиенту Е. coli AB 1456 (F, Rif**) с высокой частотой (7 х 10"3). Трансконъюганты (AB 1456-2320), полученные от штамма Irk2320, проявляли фенотип резистентности к ß-лактамным антибиотикам аналогичный фенотипу резистентности исходного клинического штамма, подтверждая тем самым наличие у выявленной СТХ-М ß-лактамазы необычного спектра гидролитической активности (Таб. 2).

Таблица 2.

Чувствительность к ß-лактамным антибиотикам клинических штаммов

Е. coli Irk2320, Irk2322 и трансконъюгантов £. coli AB 1456-2320

МПК, мг/л*

Штамм AMP AMC СТХ СТХ-С CAZ CAZ-C CTR FEP

Е. coli lrk2320 >256 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 1

Е. coli Irk2322 >256 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 1

Е. coli АВ1456-2320 >256 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 1

*АМР-ампициллин, АМС-амоксициллин-клавулановая кислота, СТХ-цефотаксим, СТХ-С-цефотаксим-клавулановая кислота, CAZ-цефтачидпм, CAZ-C-цефтазидим-клавулановая кислота, CTR-цефтриаксон, FEP-цефепим.

С помощью ПЦР и ИЭФ, у трансконъюгантов было выявлено наличие единственной ß-лактамазы СТХ-М типа с изоэлектрической точкой 8,4, на основании чего был сделан вывод о том, что необычный профиль резистентности исследуемых клинических изолятов связан с продукцией СТХ-М фермента с повышенной гидролитической активностью в отношении цефтазидима.

Прямое секвенирование генов ЫаСт\-м Е. coli Irk2320 и Irk2322, амплифицированных с помощью ПЦР, показало наличие у обоих изолятов идентичной мутации, соответствующей аминокислотной замене Proi67—»Thr (нумерация аминокислотных остатков по R. Ambler (Ambler, 1993)), по сравнению с известной последовательностью ß-лактамазы СТХ-М-3 (GenBank Асс. No. AF550415) (Рис. 1). ПЦР картирование с праймерами ISEcpl и СТХ-М-R1 выявило характерную для ¿/астх-м-з и родственных генов ассоциацию с инсерционным элементом ISEcpl, расположенным на расстоянии 126 пн выше открытой рамки считывания (ORF) blacrx-м-

Ранее замена Pro]67—>Thr была описана у СТХ-М-23 ji-лактамазы, предшественником которой является СТХ-М-1 фермент (Sturenburg and et al., 2004).

Выявленной в ходе данного исследования СТХ-М (3-лактамазе, отличающейся от широко распространенного варианта СТХ-М-3 наличием остатка Pro 167 и повышенной активностью в отношении цефтазидима, присвоено международное номенклатурное название СТХ-М-42 (http://www.lahey.org/studies/). Нуклеотидная последовательность гена ¿/астх-м-42 и прилежащего участка ISEcpl депонирована в GenBank под номером DQ061159.

Рис. 1. Хроматограмма, показывающая нуклеотидную замену в 167 позиции (нумерация по Амберу) в Ыас тх-м гене

Выявление источников происхождения цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамаз. Учитывая широкое распространение СТХ-М-3 ß-лактамаз у нозокомиальных штаммов энтеробактерий в России (Edelstein and et al., 2003) нами была предпринята попытка обнаружения возможного штамма предшественника изолятов Е. coli Irk2320 и lrk2322, продуцирующего исходный вариант ß-лактамазы СТХ-М-3, с низким уровнем устойчивости к цефтазидиму. С этой целью была исследована генетическая родственность между Е. coli Irk2320, Irk2322 и 19 СТХ-М-продуцирующими изолятами Е. coli, проявляющими классический фенотип преимущественной резистености к цефотаксиму, выделенными в течение восьми месяцев ранее в том же отделении, что и штаммы, экспрессирующие СТХ-М-42.

Выбранные клинические изоляты были типированы методом ПЦР-амплификации произвольных последовательностей (AP-PCR) с 4 различными

Mil fi<4' /i стх-м-3 1 ! lUiii ill (167-Pro) T err, -gfccöb GenBank #AF550415

E. coli 2320 (167-Thr)

,C CG AG [AC'dl

праймерами: ERIC1, АР7, 0РА4 и М13. Кластерный анализ суммарных AP-PCR профилей позволил определить единственный изолят, 1гк1224, как наиболее родственный Irk2320 и Irk2322 (Рис. 2). Профиль амплификационных фрагментов Е. coli lrkl224, полученный при использовании праймера ERIC1, отличался от аналогичных профилей Е. coli Irk2320 и lrk2322 только двумя ПЦР-фрагментами. В то же время, AP-PCR профили, полученные с тремя другими праймерами (АР7, ОРА4 и M13) были полностью идентичны у всех трех изолятов. Прочие исследованные штаммы отличались от Irk2320 и Irk2322 по результатам AP-PCR типрования со всеми праймерами. На рисунке ЗА суммарные AP-PCR профили изолятов Е. coli Irk2320, irk2322, Irkl224 и Irkl737 (неродственный штамм) представлены для сравнения.

ER1C1 АР7 ОРА4 М13

Рис. 2. Кластерный анализ (UPGMA) ПЦР профилей клинических штаммов Е. Coli

Для дополнительного подтверждения генетической родственности клинических изолятов Е. coli Irkl 224, Irk2320 и Irk2322 был использован метод пульс-электрофореза (PFGE) Xbal макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК. Результаты PFGE анализа представлены на рисунке ЗВ. Макрорестрикционные профили ДНК Е. coli Irk2320 и !rk2322 были полностью

идентичны. РРвЕ профиль 1гк1224 отличался от них четырьмя фрагментами. Тем не менее, РРОЕ профили всех трех изолятов характеризовались наличием 16 общих фрагментов ДНК и, следовательно, проявляли выраженное сходство, свидетельствующее о родственности изолятов.

Рис. 3. AP-PCR (А) и PFGE (В) профили СТХ-М-продуцирующих изолятов Е. coli.

1 — Irk 1737 (контрольный неродственный шолят); 2 - IrkI224; 3 - Irk2320; 4 - Ггк2322; Ml и М2 - маркеры молекулярной массы (Ml - S. cerevisiae, М2 - Lambda PFGE Standard).

Таким образом, результаты молекулярно-генетического типирования позволили установить клональность изолятов Е. coli Irk2320, Irk2322 и охарактеризовать штамм Irk 1224, как их наиболее вероятный предшественник.

Электрофоретический анализ плазмид, выделенных от Е. coli Irkl224, Irk2320, Irk2322 и их трансконъюгантов, проявляющих устойчивость к оксиимино цефалоспоринам, обнаружил присутствие у них общей СТХ-М-кодирующей плазмиды с молекулярной массой -250 тпн. У штамма Е. coli Irkl224 была вывлена дополнительная плазмида с молекулярной массой -150 тпн., которая отсутствовала у его трансконъюгантов (Е. coli AB 1456-Irkl224), устойчивых к оксиимино цефалоспоринам. СТХ-М-кодирующие плазмиды, выделенные от трансконъюгантов Е. coli AB1456-Irkl224, АВ1456-

1гк2320 и АВ1456-1гк2322 были подвергнуты рестрикционному анализу с использованием эндонуклеазы РумН, который выявил их идентичность (Рис. 4).

Рис. 4. PvMlI-рестрикционныс профили плазмид, несущих гены Wöctx-m-

1 -Е. coli AB1456-Irkl224; 2 - Е. coli AB 1456-Irk2320; 3 - E. coli AB 1456-Irk2322;

Ml - маркер молекулярной массы (смесь рестрикционных фрагментов к Bs!EU и

pUC18 НаеШ)

ПЦР-типирование репликонов позволило отнести СТХ-М-кодирующие плазмиды всех трех исследованных изолятов Е. coli к группе IncL/M.

ПЦР с праймерами ISEcpI и CTX-M-R-stop выявила одинаковый характер ассоциации генов Ь/яСтх-м с ISEcpl в составе IncL/M плазмид у Е. coli Irkl224, Irk2320 и Irk2322. ПЦР-фрагмент с ожидаемой молекулярной массой (1225 пн), был получен от всех трех изолятов. Ассоциация ЫаСтх-м гена с ISEcpl последовательностью говорит о возможной мобильности данного гена. ISEcpl или \SEcpl-подобные инсерционные элементы неоднократно были обнаружены на расстоянии 42-266 пн и выше открытых рамкок считывания (ОРС), кодирующих СТХ-М ферменты, принадлежащих к СТХ-М-1, СТХ-М-2 и СТХ-М-9 кластерам (Bonnet, 2004).

Однако, в соответствии с фенотипами резистентности изолятов, прямое секвенирование данного ПЦР фрагмента показало наличие гена Ыастх-ы-ъ У штамма Irkl224, в отличие от Irk2320 и Irk2322, несущих мутантный вариант A/öctx-m-42 с описанной выше однонуклеотидной заменой в кодоне 167. Отличий

в нуклеотидных последовательностях промоторной области й/встх-м-з и Ыастх. м-42 обнаружено не было.

Выявление фенотипа гипермутабельности у клинических штаммов Е. coli, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42 показало, что изоляты Е. coli Irkl224, Irk2320 и Irk2322 проявляют повышенную частоту формирования спонтанных мутантов, устойчивых к рифампицину, (1 х 1СГ5) по сравнению со штаммами, обладающими нормальной частотой мутирования (<5 х 10"8) (Galan, 2004). Исследованные изоляты были охарактеризованы, таким образом, как сильные мутаторы. Полученные от штаммов Е. coli Irkl224 и Irk2320 амплификационные фрагменты, содержащие гены Ыастх-м-з и б/ястх-м-42 с естественным промотором, были клонированы в вектор рСС1. В результации трансформации лабораторного штамма Е. coli EPI 300 соответствующими рекомбинантными плазмидами (pCCl-1224 и pCCl-2320) были получены полностью изогенные штаммы, экспрессирующие ß-лактамазы СТХ-М-3 и СТХ-М-42, отличающиеся единственной аминокислотной заменой -Pro167-»Thr. Результаты сравнения фенотипов резистентности клинических и лабораторных штаммов, продуцирующих ферменты СТХ-М-3 и СТХ-М-42, представлены в таблице. 3.

Таблица 3.

Чувствительность клинических и лабораторных штаммов Е. coli, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42 к ß-лактамным антибиотикам и их _комбинациям с ингибиторами. ____

МПК, мг/л1

Штамм ß-лактамаза - --------------------

АМР AMC СТХ СТХ-С CAZ CAZ-C CTR FEP

>256 32 8 1 8 1 4 0,5 1 0,25 0,06 0,06

1 AMP-ампициллин, АМС-амоксицпллин-клавулановая кислота, СТХ- цефотаксим, СТХ-С-цефотакснм-клавулановая кислота, CAZ-цефтазидим, CAZ-C-цефтазидим-клавулановая кислота, CTR-цефтриаксон, FEP-цефегшм.

2 Штамм Е. coli EPI 300, несущнн вектор рСС! без вставки, использован в качестве контроля.

ЕсоИШ224 СТХ-М-3 >256 32/16 >256 2/4 32 4/4

Е. coli Irk2320 СТХ-М-42 >256 16/8 8 0,125/4 128 2/4

Е. coli 2322 СТХ-М-42 >256 16/8 8 0,125/4 128 2/4

СТХ-М-3 >256 8/4 4 0,06/4 0.5 0,25/4

СТХ-М-42 >256 8/4 0.5 0,06/4 32 1/4

Е. coli EPI 300 pCCl-1224

Е. coli EPI 300 pCCl-2320

E?1300 нет 2 2/1 0.06 0,06/4 0,25 0,25/4

pLCi

Лабораторные штаммы Е. coli EPI300, несущие гены Ь/астх-м-з и Ыастх-м-42. проявляли фенотипы устойчивости, сходные с таковоми клинических изолятов Е. coli Irk1224 и Irk2320 (Таб. 3). Экспрессия СТХ-М-42 (по сравнению с СТХ-М-3) у Е. coli EPI300 приводила к повышению МПК цефтазидима в 64 раза и одновременному снижению МПК цефотаксима в 8 раз, цефтриаксона - в 4 раза и цефепима - в 2 раза, что однозначно доказывает роль замены РГО1&7—»Thr в переключении спектра активности СТХ-М ферментов.

In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов-продуцентов СТХ-М-3. Предствленные выше данные позволили предположить наличие вероятной взаимосвязи между терапией цефтазидимом и in vivo селекцией мутации PrO|67—>Thr в СТХ-М-3 у клинического гипермутабельного штамма Е. coli. Для проверки данной гипотезы нами была предпринята попытка воспроизвести эволюцию СТХ-М-3 в эксперименте по in vitro селекции мутаций устойчивости к цефтазидиму у гипермутабельных штаммов Е. coli.

В качестве исходных штаммов были использованы клинический изолят Е. coli Irkl224 и лабораторный штамм-мутатор Е. coli GM2995 (mutD5), трансформированный плазмидой pCCl-1224, несущей ген Wacrx-м-з- При культивировании данных штаммов на среде с добавлением цефтазидима в концентрации, превышающей МПК каждого штамма в два раза, цефтазидим-резистентные мутанты были получены с частотой 2 х 10*8 и 2 х 10"6, соответственно, отIrkl224 и GM2995 (pCCl-1224).

В результате эксперимента случайным образом было отобрано тридцать две мутантные колонии каждого штамма, выросшие на селективной среде.

Во избежание накопления дополнительных мутаций в процессе субкультивирования штаммов-мутаторов, гены СТХ-М ß-лактамаз были повторно амплифицированы у выбранных цефтазидим-резистентных мутантов и клонированы в составе вектора рСС1 в лабораторный штамм Е. coli EPI300. У всех трансформантов была определена нуклеотидная последовательность blacxx-u генов и их промоторов, а также определены значения МПК ампициллина, цефтазидима и цефотаксима (Таб. 5).

Таблица 4.

Чувствительность исходных штаммов-мутаторов и полученных от них цефтазидим-резистентных мутантов.

Исходные штаммы и Р-лактамаза N1 МПК, мг/л2

мутанты (мутация) AMP CAZ СТХ

1гк1224 СТХ-М-3 (дикий тип) >256 32 >256

Мутанты 1гк1224 1-го типа СТХ-М-3 (дикий тип) 30 >256 >256 >256

Мутанты 1гк1224 2-го типа СТХ-М-3 (Бег167) 1 >256 >256 64

Мутанты 1гк1224 3-го типа СТХ-М-3 (ЬуБ136) 1 >256 >256 64

вМ2995 (рСС1-1224) СТХ-М-3 (дикий тип) >256 1 4

Мутанты ОМ2995 1-го типа СТХ-М-3 (дикий тип) 24 >256 32 >256

Мутанты 6М2995 2-го типа СТХ-М-3 (5ег167) 8 128 32 1

1 Количество отобранных мутантов каждого типа.

2 AMP - ампициллин, CAZ - цефтазидим, СТХ - цефотаксим.

Таблица 5.

Чувствительность рекомбинантных клонов Е. соН ЕР1300, несущих гены Ь/ястх-м исходных штаммов-мутаторов и полученных от них цефтазидим-

резистентных мутантов.

Источник гена 6/астх-м р-лактамаза N1 МПК, мг/л

(мутация) AMP CAZ СТХ

Irkl224 СТХ-М-3 (дикий тип) >256 1 8

Мутанты Irk 1224 1-го типа СТХ-М-3 (дикий тип) 30 >256 1 8

Мутанты Irkl224 2-го типа СТХ-М-3 (Ser 167) 1 128 16 1

Мутанты Irkl224 3-го типа СТХ-М-3 (Lysl36) 1 32 8 1

GM2995 (рСС1-1224) СТХ-М-3 (WT) >256 1 8

Мутанты GM2995 1-го типа СТХ-М-3 (WT) 24 >256 1 8

Мутанты GM2995 2-го типа СТХ-М-3 (Ser 167) 8 128 16 1

1 Количество отобранных мутантов каждого типа.

2 AMP - ампициллин, CAZ - цефтазидим, СТХ - цефотаксим.

Анализ полученных мутантов позволил разделить их на несколько типов (Таб. 4, 5). Большинство мутантов, резистентных к цефтазидиму (мутанты 1 -го типа), имели одинаково высокие значения МТЖ цефотаксима и цефтазидима (>256 мг/л). Экспрессия Wütctx-m генов этих мутантов в лабораторном штамме Е. coli EPI300 приводила к формированию фенотипа устойчивости, идентичного таковому для исходного гена è/астх-м-з- Секвенирование подтвердило отсутствие мутаций в структурной части и промоторе Ыастх-м генов, полученных от мутантов 1-го типа. Следовательно, повышенная устойчивость к цефтазидиму у матантов данного типа была связана с изменениями хромосомных генов Irkl224 и GM2995 (pCCl-1224), наиболее вероятно, определяющими снижение проницаемости наружной мембраны или увеличение продукции видоспецифической цефалоспориназы (АтрС). Известно, что такие мутации широко распространены у клинических штаммов энтеробактерий, продуцирующих БЛРС (Livermore D.M., 1987; Livermore D.M., 2005; Martinez-Martinez and et all, 1999; Martinez-Martinez and et all, 2000). Аналогичные мутации были выявлены также исследовательской группой D. Livermore и N. Woodford в экспериментах по in vitro селекции расширенного спектра активности у ТЕМ и СТХ-М ферментов с использованием MutS штаммов Е. coli (Ellington and et all, 2006; Karisik and et all, 2006).

Мутанты другой группы (мутанты 2-го типа) характеризовались наличием более высоких значений МПК цефтазидима по сравнению с цефотаксимом (Таб. 4). У всех представителей этой группы в последовательности гена Л/с/стх-м была выявлена идентичная мутация, соответсвующая аминокислотной замене Рго167—Ser. Как было сказано выше, данная мутация встречается у СТХ-М-52, которая принадлежит к группе СТХ-M-1-родственных р-лактамаз, а также у отдельных ферментов, относящихся к кластерам СТХ-М-2 и СТХ-М-9, например, СТХ-М-35 и СТХ-М-19 (Poirel and et all, 2001) Интересно отметить, что эксперименты К. Welsh и соавт. по in vitro мутагенезу СТХ-М-2 (Welsh and et all, 2005) и E. Karisik и соавт. по селекции устойчивости к цефтазидиму в СТХ-М-3 (Karisik and et all, 2006), проведенные одновременно с нашим исследованием, также привели к идентификации единственной значимой аминокислотной замены Рго|67—> Ser. В то же время, у «природных» СТХ-М цефтазидимаз, были обнаружены и другие аминокислотные замены в позиции 167, например, Thry СТХ-М-23 и СТХ-М-42 (описанной в данной работе) и Gin у СТХ-М-54. Причина невыявления мутаций Рго167 и GInl67 у СТХ-М-производных, полученных in vitro, остается неясной. Возможно, что транзиция С—>А, приводящая к замене Pro^—*Ser является более вероятной мутацией (по сравнению с другими заменами нуклеотидов в кодоне 167) у лабораторных штаммов-мутаторов, включая

MiitDS штамм, использованный в нашей работе и MutS штаммы, задействованные в других исследованиях (Karisik and et all, 2006; Phiiippon, Arlet, and Jacoby, 2002.)- В промоторе Ыастх-м генов, полученных от мутантов 2-го типа, мутаций обнаружено не было. Лабораторные штаммы Е. coli EPI300, продуцирующие мутантный вариант ß-лактамазы СТХ-М-3 (Serl 67), также проявляли фенотип преимущественной рези'стентности к цефтазидиму и пониженной (относительно СТХ-М-3) устойчивости к ампициллину и цефотаксиму, что однозначно подверждает ключевую роль мутаций в позиции 167 в изменении спектра активности СТХ-М ферментов.

У единственного мутанта (мутант 3-го типа), полученного от штамма Е. coli Irkl224, в последовательности 6/остх-м была обнаружена ранее неизвестная мутация Т4,7—+G, соответствующая аминокислотной замене Asnn6—1'Lys в области A4 а спирали. Других изменений в промоторной области и структурной части гена Ыастх-м У данного мутанта выявлено не было. Продукция мутантной ß-лактамазы СТХ-М-3 (Lys 136), по сравнению с исходным ферментом, приводила к повышению МПК цефтазидима и одновременному снижению уровня резистентности к цефотаксиму и, особенно, к ампициллину (Таб. 5). Остаток Asnl36, находящийся в A4 а спирали, непосредственно взаимодействует с остатком Thrl65 Q петли и является консервативным у всех СТХ-М ß-лактамаз (Chen and et all., 2005). Замена Asni36—>Lys, по всей вероятности, нарушает данное взаимодействие, что, в свою очередь, приводит к увеличению подвижности Q петли и расширению активного центра. Известно, что увеличение активного центра повышает эффективность связывания и расщепления цефтазидима СТХ-М ферментами. С другой стороны, подобное изменение структуры должно приводить к: снижению общей стабильности и активности фермента, что подтверждается результатами оценки чувствительности к ампициллину изогенных штаммов Е. oli EPI300, продуцирующих исходный фермент (СТХ-М-3) и его мутантный вариант Lysl36. Возможно также, что низкая активность СТХ-М-3 (Asn|36—>Lys) в отношении ампициллина объясняет тот факт, что до настоящего времени данная мутация не была обнаружена у клинических штаммов.

Следует также отметить, что в экспериментах по in vitro селекции устойчивости к цефтазидиму нами не были обнаружены мутанты СТХ-М-3 с заменой Asp^o-1-Gly, которая характерна для наиболее широко распространенной у клинических штаммов ß-лактамазы СТХ-М-15 и некоторых других «природных» СТХ-М ß-лактамаз. Возможно это связано с тем, что замена Asp24o—>Gly обеспечивает менее выраженное повышение

активности в отношении цефтазидима по сравнению с мутациями в позиции 167.

Влияние копийности плазмид, несущих гены СТХ-М ß-лактамаз, на уровени резистентности к ß-лактамным антибиотикам. Система CopyControl (Epicentre Biotechnologies), состоящая из вектора рСС1, имеющего две области инициации репликации: ori F-фактора (oriF) и oriV, и лабораторного штамма Ecoli EPI300, несущего рекомбинантный ген активатора oriV (trfA) под контролем строгого арабинозного промотора, позволяет изменять копийность вектора в зависимости от условий культивирования (Welsh and et all., 2005). В стандартных условиях инициация репликации рСС1 происходит в oriF, что позволяет поддерживать вектор в однокопийном состоянии. При культивировании Ecoli ЕР1300 на среде с добавлением L-арабинозы происходит переключение инициации репликации в oriV, приводящее к резкому увеличению копийности вектора.

Использование системы CopyControl в данной работе позволило исследовать влияние копийности генов Wöctx-.m-з и W^ctx-m«, экспрессируемых в изогенных штаммах Ecoli EPI300, на уровни их устойчивости к ß-лактамным антибиотикам.

По данным количественной ПЦР в режиме реального времени, индукция арабинозой приводила к увеличению копийности плазмид рСС1, несущих гены WtfcTx-м, и контрольного вектора рСС1 (без вставки Ыастх-м) примерно в 10 раз (от 1 до 10±1.1 копий на клетку).

В отсутсвии арабинозы экспрессия одной копии гена Wöctx-m-з в клетках Ecoli EPI300 обеспечивала резистентность высокого уровня к ампициллину (МПК 512 мг/л) и цефотаксиму (МПК 16 мг/л) и несколько пониженную чувствительность к цефтазидиму (МПК 1 мг/л) по сравнению с контрольным штаммом, не продуцирующим ß-лактамазу (МПК 0,5 мг/л). Аналогичным образом, экспрессия гена Ь1астх-м-«, находящегося в однокопийном состоянии, создавала высокий уровень устойчивости к ампициллину (МПК 256 мг/л) и цефтазидиму (МПК 32 мг.л), но низкие уровни резистентности к цефотаксиму (МПК 1 мг/л) и цефепиму (МПК 0,5 мг/л) (Таб. 6).

Таблица 6.

Чувствительность рекомбинантных штаммов Е. соП ЕР1300 к (3-лактамам при различной копийности плазмид рСС1, несущих гены 6/дстх-м-

Плазмида ß-лактамаза Кол-во. копий МПК, мл/л 1

плазмиды на ' клетку АМР СТХ CAZ FEP AZT

рСС1-1224 СТХ-М-3 1 512 16 1 1 2

10 >2048 256 4 4 16

pCCl-2320 СТХ-М-42 1 256 1 32 0.5 1

10 >2048 4 128 1 4

pCCl - 1 2 0,25 0,5 <0,125 0,25

(без вставки) >10 2 0,25 0,5 <0,125 0,25

'АМР - ампициллин. СТХ - цефотаксим, CAZ - цефтазидим, FEP - цсфепим, AZT -азтреонам.

Дясятикратное увеличение копийности плазмид, кодирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42, (в результате индукции арабинозой) сопровождалось параллельным повышением МПК всех оксиимино-р~лактамов в 2-16 раз. Наиболее значительное повышение МПК было отмечено для антибиотиков, которые являются предпочтительными субстратами соответствующих ß-лактамаз. Например, увеличение копийности гена, кодирующего СТХ-М-3. приводило к повышению МПК цефотаксима в 16 раз. Вместе с тем, МПК цефалоспоринов, которые являются «слабыми субстратами» для СТХ-М-3 (цефтазидим) и для СТХ-М-42 (цефотаксим), также возрастали существенно (в 4 раза), достигая пограничного или клинически-значимого уровня резистентности (в соответсвии с категориями оценки чувствительности CLSI и EUCAST).

Наличие арабинозы и увеличение числа копий вектора рССI без вставки Ывсгх-м не влияло на устойчивость контрольного штамма Е. coli ЕР1300 к ß-лактамам (Таб. 6).

Таким образом, представленные выше данные демонстрируют наличие четкой корреляции между числом копий генов СТХ-М БЛРС в бактериальных клетках и уровнями их устойчивости к оксиимино-Р-лактамам.

выводы

1. Выявлен, охарактеризован и представлен в международной классификации новый мутантный вариант СТХ-М ß-лактамазы расширенного спектра, СТХ-М-42, определяющий высокий уровень устойчивости к цефтазидиму у клинических штаммов Е. coli.

2. Аминокислотные замены в позициях 167 (Pro—>Ser/Thr) и 136 (Asp—»Lys) играют ключевую роль в изменении спектра ферментативной активности СТХ-М-3 и формировании резистентности к цефтазидиму у штаммов-продуцентов.

3. Приобретение мутации Рго167—»Thr в СТХ-М-3 и появление СТХ-М-42 in vivo подтверждается обнаружением клонально и эпидемиологически родственных штаммов, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42 ферменты и обладающих фенотипом гипермутабельности. Возникновение данной мутации в гипермутабельных штаммах Е. coli связано с селекцией при использовании цефтазидима.

4. Установлено, что ген СТХ-М-42 ассоциирован с инсерционным элементом ISEcpl, находится в составе IncL/M плазмиды и может передаваться с высокой эффективностью при конъюгации.

5. Данные in vitro селекции цефтазидим-резистентности у клинических и лабораторных гипермутабельных штаммов Е. coli подтверждают роль амнокислотных замен в позиции 167 в формировании резистентности к цефтазидиму.

6. В модельных экспериментах с изогенными лабораторными штаммами установлена положительная корреляция между числом копий генов СТХ-М ß-лактамаз и уровнями устойчивости штаммов к оксиимино-ß-лактамам.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Шевченко, О.В. M етал л о - ß-л актам азы : значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий / О.В.Шевченко, Эйдельштейн М.В., М.Н. Степанова / Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. - Т. 9. - №3. - С. 211-218.

2. Stepanova, M.N. Convergent in vivo and in vitro selection of ceftazidime resistance mutations at position 167 of CTX-M-3 ß-lactamase in hypermutable Escherichia coli strains. / M.N. Stepanova, M. Pimkin, A.A. Nikulin, V.K. Kozyreva, E.D. Agapova, M.V. Edelstein / Antimicrob Agents Chemother. -2008.-V. 52,-№4.-P. 1297-1301.

Другие публикации по теме диссертации:

1. Степанова, М.Н. Мутационная изменчивость СТХ-М ß-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli. / М.Н. Степанова / 34-ая конференция молодых ученых и 54-ая научная студенческая конференция. - Смоленск, 2007. - С. 50-51.

2. Pimkin, М. High frequency of association between CTX-M-ß-lactamase-coding genes and the ISEcpl insertion element. / M. Pimkin, I. Palagin, M. Stepanova, M. Edelstein /' 14th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. - Prague, 2004. -P. 1471.

3. Stepanova, M. Rapid Country-Wide Dissemination of Nosocomial CTX-M-14-Beta-Lactamase-Producing Strains in Russia / M. Stepanova, E. Ryabkova, M. Edelstein, L. Stratchounski /45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2005.

4. Stepanova, M. In Vivo Evolution and Emergence of a New CTX-M Beta-Lactamase with "Ceftazidimase" Activity in a Hypermutable Clinical Strain. / M. Stepanova, O. Shevchenko, M. Edelstein / 45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2005.

5. Narezkina, A. Continuous Spread of ESBL-Producing Salmonellae in Russian Hospitals. / A. Narezkina, M. Stepanova, M. Edelstein / 45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2005.

6. Stepanova, M. Modelling the effect of copy number of plasmids carrying ESBL genes on resistance levels to ß-lactam antibiotics. / M. Stepanova, M. Edelstein / 16th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. - Nice, 2006.

7. Stepanova, M. Convergent selection of ceftazidime resistance mutations at position 167 of CTX-M-3 ß-lactamase in hypermutable Escherichia coli strains. / M. Stepanova, M. Edelstein / 16th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. - Nice, 2006.

8. Stepanova, M. Epidemiological surveillance and characterization of ТЕМ-, SHV-and CTX-M-type ESBLs in Russian nosocomial strains of Enterobacteriaceae using real-time PCR and melting-curve analysis techniques. / M. Stepanova, A. Nikulin, M. Sukhorukova, M. Edelstein / 17th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases / 25th International Congress of Chemotherapy. - Munich,2007.

А.к БИРС ИЭФ МПК ОРИТ ОРС ПЦР AP-PCR АТСС CLSI СТХ-М EUCAST PFGE Аминокислоты Asn аспарагин Lys лизин Pro пролин Ser серии Thr треонин

Список использованных сокращений

аминокислота

р-лактамаза расширенного спектра изоэлектрическое фокусирование минимальная подавляющая концентрация отделения реанимации и интенсивной терапии открытая рамка считывания полимеразная цепная реакция

Arbitrary primed PCR (ПЦР с произвольными праймерами) American Type Culture collection Clinical and Laboratory Standards Institute cefotaxime modifying enzyme

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing pulse field gel electrophoresis

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне.

Благодарности.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. М.В. Эйдельштейну за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и плодотворное обсуждение полученных результатов, к.б.н. М.В. Сухоруковой за постоянное внимание, помощь в работе и консультации.

Отдельная благодарность выражается Е.Д. Агаповой (Иркутская Обласная детская клиническая больница) за предоставление для работы клинических штаммов.

Автор искренне благодарен директору и сотрудникам НИИ антимикробной химиотерапии за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

Автор также сердечно благодарит семью, родных и близких за всестороннюю поддержку и любовь.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 25.03.2011 г. Печ.л.1,6 Заказ № К-7023. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ршография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанова, Марина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.;.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Общая характеристика р-лактамаз расширенного спектра.

Глава 2. Р-лактамазы расширенного спектра СТХ-М типа.

2.1. Хронология появления и классификация СТХ-М р-лактамаз.

2.2 Филогенетическое происхождение СТХ-М Р-лактамаз.

2.3. Особенности генетического окружения 6/астх-м генов.

2.4. Мобилизация и перенос Ыа^х-м генов.

2.5. Эпидемиология СТХ-М ферментов.

2.6. Структурные и функциональные особенности СТХ-МБЛРС.

2.6.1. Значение отдельных аминокислот в формировании расширенного спектра активности.

2.6.2. Структурные изменения СТХ-М Р-лактамаз, приводящие к смене фенотипа резистентности.

2.7. Биохимические свойства СТХ-М ферментов.

2.8. Фенотипы резистентности к Р-лактамам, опсредованные продукцией СТХ-М р-лактамаз.

2.9. Определение СТХ-М БЛРС при помощи фенотипических тестов.

2.10. Эволюция СТХ-М р-лактамаз.

2.11. Роль гипермутабельности в эволюции СТХ-М БЛРС.

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4. Материалы и методы исследования.48'

4.1. Общая характеристика и дизайн исследования.

4.2. Лабораторные штаммы микроорганизмов.

4.3. Клинические штаммы микроорганизмов.

4.4. Определение чувствительности клинических изолятов к антибиотикам.

4.5. Фенотипическое обнаружение БЛРС.

4.6. Выделение бактериальной ДНК для последующей амплификации.

4.7. ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование генов ß-лактамаз.

4.8. Перенос детерминант резистентности с помощью конъюгации.57 (

4.9. Изоэлектрическое фокусирование ß-лактамаз.

4.10. Типирование клинических штаммов с помошью ПЦР с произвольными праймерами (АР-PCR.

4.11. Типирование клинических штаммов с помошью пульс-электрофореза (PFGE) макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК

4.12. Анализ природных плазмид , несущих гены 6/<2стх-м.

4.13. Определение частоты формирования спонтанных мутантов, устойчивых к рифампицинк к рифампицину.

4.14. In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов, продуцирующих СТХ-М ß-лактамазы.

4.15. Определение копийности плазмид, несущих гены 6/ястх-м.

Глава 5. Результаты исследования

5.1. Идентификация клинических изолятов, продуцирующих цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамазы.

5.2. Выявление источников происхождения ß-лактамазы СТХ-М-42, гидролизующей цефтазидим.

5.2.1. Молекулярно генетическое типирование клинических изолятов Е. coli

5.2.2. Анализ СТХ-М-кодирующих плазмид Е. coli 2320, 2322,

1224 и ихтрансконъюгантов

5.2.3. Выявление фенотипа гипермутабельности у клинических штаммов

Е. coli, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42.

5.2.4. Подтверждение роли мутации Pro167—>Thr в изменении спектра активности СТХ-М БЛРС

5.3. In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов-продуцентов СТХ-М

5.4. Влияние копийности плазмид, несущих гены СТХ-М ß-лактамаз, на уровни резистентности к ß-лактамным антибиотикам.

Глава 6. Обсуждение

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мутационная изменчивость CTX-M β-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli"

Актуальность темы

Антибиотикорезистентность клинически значимых видов микроорганизмов остается чрезвычайно важной проблемой во всем мире. Чрезмерное и нерациональное использование антибиотиков в терапии бактериальных инфекций приводит к формированию так называемой вторичной резистентности у изначально чувствительных штаммов. В последние годы среди наиболее частых возбудителей бактериальных инфекций, к числу которых относятся представители семейства ЕМегоЬаМепасеае, отмечается устойчивая тенденция нарастания резистентности к различным [3-лактамам, включая современные препараты цефалоспоринового ряда, монобактамы, карбапенемы и ингибиторозащищенные пенициллины.

Продукция Р-лактамаз является основной причиной резистентности к р-лактамным антибиотикам у грамотрицательных бактерий (5,6).

Плазмидно-кодируемые р-лактамазы молекулярного класса А, обладающие активностью в отношении цефалоспоринов Ш-1У поколения и известные, как р-лактамазы расширенного спектра (БИРС), представляют собой одну из наиболее значимых групп Р-лактамаз. Эти ферменты являются основными детерминантами устойчивости к цефалоспоринам и монобактамам у бактерий семейства Еп1егоЬаМег1асеае. В последнее время во многих странах мира отмечается стремительное распространение БЛРС СТХ-М-типа. В России и ряде других стран Европы, Азии и Южной Америки, СТХ-М р-лактамазы стали доминирующей группой БЛРС (42).

Частота встречаемости СТХ-М Р-лактамаз особенно высока среди нозокомиальных возбудителей, что связано с повышенным потреблением современных р-лактамных антибиотиков в стационарах, создающим условия селективного отбора штаммов, продуцирующих БЛРС. В отдельных лечебных учреждениях России, частота распространенности этих ферментов достигает 80-100%. По данным эпидемиологических исследований в России СТХ-М

БЛРС чаще всего встречаются у таких видов, как Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis и Enterobacter spp. В 2006-07 гг. суммарная доля СТХ-М БЛРС среди нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae в различных стационарах России достигла 69,9% (194).

Стремительное распространение генов СТХ-М ß-лактамаз связывают в основном с активностью мобильных генетических элементов (ISEcpl), которые обеспечивают их перенос на различные плазмиды энтеробактерий. В связи с этим, эпидемиология СТХ-М ß-лактамаз включает различные этапы от мобилизации и переноса отдельных генов до клонального распространения штаммов.

В отличие от БЛРС ТЕМ- и SHV-типа, большинство СТХ-М проявляют значительно более высокую активность в отношении цефотаксима и цефтриаксона по сравнению с цефтазидимом. В связи с этим преимущественная устойчивость штаммов к цефотаксиму по сравнению с цефтазидимом часто рассматривается как основной диагностический признак продукции СТХ-М ферментов. Кроме того, штаммы, продуцирующие СТХ-М ß-лактамазы, часто ошибочно оцениваются как чувствительные к цефтазидиму in vitro, что приводит к необоснованному назначению цефтазидима и клинической неэффективности терапии инфекций, вызванных продуцентами СТХ-М БЛРС.

Вместе с тем, в последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что продуценты СТХ-М ß-лактамаз могут проявлять высокую устойчивость к цефтазидиму. Изменение резистентности к цефтазидиму может быть связано, как с гиперпродукцией или мутациями самих СТХ-М ферментов, так и с наличием дополнительных факторов резистентности, например, пониженной проницаемости наружной клеточной мембраны. Более того, для отдельных СТХ-М ферментов была показана преимущественная активность в отношении цефтазидима, связаная с мутационной изменчивостью генов, кодирующих СТХ-М ß-лактамазы. В связи с этим, изучение закономерностей эволюции СТХ-М ß-лактамаз и роли отдельных аминокислотных позиций в изменении спектра активности этих ферментов имеет большое научное и клиническое значение.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установить механизмы формирования резистентности бактерий к цефтазидиму, связанные с мутационной изменчивостью СТХ-М ß-лактамаз.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Охарактеризовать новые мутантные варианты СТХ-М ß-лактамаз расширенного спектра, определяющие высокий уровень устойчивости к цефтазидиму у клинических штаммов Escherichia coli.

2. Определить роль АК в области £2-петли СТХ-М-3 в изменении спектра ферментативной активности и формировании резистентности к цефотаксиму и цефтазидиму у штаммов-продуцентов.

3. Выявить с использованием методов молекулярно-генетического типирования источники происхождения цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамаз у клинических изолятов.

4. Определить локализацию генов цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамаз, их связь с мобильными генетическими элементами и возможные механизмы распространения среди нозокомиальных штаммов энтеробактерий.

5. Исследовать мутационную изменчивость СТХ-М ß-лактамаз в экспериментах по in vitro селекции резистентности к цефтазидиму у гипермутабельных штаммов Е. coli.

6. Установить взаимосвязь между копийностью генов различных СТХ-М ß-лактамаз и уровнями устойчивости штаммов-продуцентов к различным ß-лактамам.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В настоящей работе впервые:

1. Выявлена и охарактеризована новая ß-лактамаза расширенного спектра, СТХ-М-42, которая отличается от СТХ-М-3 аминокислотной заменой Pro 167—>Thr и вызывает преимущественную устойчивость штаммов-продуцентов к цефтазидиму.

2. Доказана in vivo эволюция СТХ-М-3 и появление СТХ-М-42 у клинических штаммов Е. coli, обладающих повышенной частотой мутирования.

3. Показана возможность in vitro селекции мутаций устойчивости к цефтазидиму в генах СТХ-М ß-лактамаз у гипермутабельных клинических и лабораторных штаммов Е. coli.

4. Установлена ключевая роль аминокислотных позиций 167 и 136 в области омега-петли в формировании субстратной специфичности СТХ-М ферментов в отношении цефотаксима и цефтазидима.

5. В модельных экспериментах с изогенными штаммами Е. coli установлена взаимосвязь между копийностью плазмид, несущих гены СТХ-М ß-лактамаз, и уровнями резистентности к различным ß-лактамным антибиотикам.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. Аминокислотные замены в позиции 167 (Pro—>Ser/Thr), выявленные у клинических штаммов и в экспериментах по in vitro мутагенезу, играют основную роль в формировании "цефтазидимазной" активности СТХ-М ферментов.

3. Высокий уровень устойчивости штаммов-продуцентов СТХ-М |3-лактамаз к цефтазидиму может быть связан как с наличием специфических аминокислотных замен в структуре СТХ-М, так и изменением копийности Ыастх-м генов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Результаты исследования доложены на 14-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Прага, 2004 г.), 45-ой Междисциплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Вашингтон, 2005 г.), 34-ой конференции молодых ученых (Смоленск, 2006 г.), 16-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Ница, 2006 г.), 17-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Мюнхен, 2007 г.).

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 8 - в зарубежной печати.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Общая характеристика ß-лактамаз расширенного спектра

С тех пор, как в 20-х годах прошлого столетия Александром Флемингом был открыт пенициллин, "чудо лекарство", способное подавлять рост бактерий, ß-лактамные антибиотики (ß-лактамы) составляют основу современной антибактериальной химиотерапии и занимают ведущее место в лечении большинства бактериальных инфекций (7). ß-Лактамы представляют собой обширный класс антибиотиков, который включает в себя пенициллины, I цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы. Общим в структуре этих антибиотиков является четырехчленное ß-лактамное кольцо (110). ß-лактамные антибиотики обладают широким спектром активности. Структурное сходство всех ß-лактамов предопределяет одинаковый механизм антимикробного бактерицидного действия, которое связано с подавлением транс- и карбоксипептидаз (пенициллин-связывающих белков) - ферментов, осуществляющих синтез клеточной стенки бактерий. Среди ß-лактамных антибиотиков цефалоспорины занимают одно из первых мест по частоте клинического использования благодаря высокой эффективности и низкой токсичности (7).

В начале 1980-х годов в широкую практику были внедрены цефалоспорины III поколения (оксииминоцефалоспорины): цефотаксим и цефтазидим. Для цефалоспоринов III поколения характерна тенденция к расширению спектра действия и повышению уровня антимикробной активности в отношении грамотрицательных бактерий при некотором понижении активности в отношении грамположительных микроорганизмов, по сравнению с цефалоспоринами I и II поколений (7). Важной особенностью цефалоспоринов III поколения является их способность подавлять рост бактерий, продуцирующих пенициллиназы классов А и D, а также бактерий с низким уровнем экспрессии природных цефалоспориназ класса С. Цефалоспорины IV поколения (цефепим, цефпиром) помимо этого обладают более высокой стабильностью к действию цефалоспориназ класса С. Благодаря? этим особенностям цефалоспорины III-IV поколений на протяжении более двух десятилетий рассматривались как препараты выбора для лечения не только тяжелых внебольничных, но и госпитальных инфекций (151).

Однако их широкое использование, особенно в стационарах, привело к появлению и распространению устойчивых штаммов, экспрессирующих ферменты, способные4 эффективно связывать и разрушать оксиимино-ß-лактамы (38,129). Такие ферменты получили название ß-лактамаз расширенного спектра (БЛРС).

БЛРС способны расщеплять цефалоспорины III-IV поколения и монобактамы (азтреонам) наряду с ранними цефалоспоринами и пенициллинами (38). Продукция БЛРС описана у многих видов Enterobacteriaceae и грамотрицательных неферментирующих бактерий во всем мире, но наиболее частыми продуцентами являются штаммы К. pneumoniae и Е. coli (2,4,6). БЛРС входят в состав молекулярных классов А и D сериновых ß-лактамаз согласно структурной классификации Ambler (10). БЛРС класса А чувствительны к таким ингибиторам, как клавулановая кислота, сульбактам и тазобактам, в то время как активность ß-лактамаз класса D слабо подавляется этими ингибиторами (31).

Все БЛРС спобны расщеплять оксиимино^-лактамы, однако эффективность гидролиза разных цефалоспоринов может существенно варьировать для разных ферментов. В зависимости от преимущественной активности БЛРС в отношении цефтазидима или цефотаксима их принято разделять на цефтазидимазы (ферменты, обладающие более высокой гидролитической активностью в отношении цефтазидима по сравнению с цефотаксимом) и цефотаксимазы (ферменты, преимущественно расщепляющие цефотаксим) (91).

БЛРС класса А представляют собой неоднородную молекулярную группу, включающую ферменты различных генетических типов (семейств), проявляющих гомологию по' аминокислотной последовательности на уровне 20-99% (31).

Впервые БЛРС были обнаружены у клинических штаммов энтеробактерий в Европе. Первая плазмидная ß-лактамаза класса А, способная гидролизовать цефалоспорины широкого спектра, SHV-2, была описана в 1983 году в Германии (97). Ген blashv-2, кодирующий SHV-2, был локализован на конъюгативной плазмиде и практически идентичен гену blashv-ь кодирующему SHV-1 пеницилиназу, за исключением замены одного нуклеотида, приводящей к аминокислотной замене Gly238—>Ser в активном центре фермента. Первая БЛРС другой генетической группы, ТЕМ-3, отличавшаяся от пенициллиназы-предшественника, ТЕМ-2, заменами двух аминокислот: Glul04—>Lys и Gly238—>Ser, была выявлена во Франции в том же году и описана спустя 2 года (190). Позднее были обнаружены другие производные пенициллиназ ТЕМ и SHV группы, отличающиеся заменами одной и более аминокислот и способные расщеплять цефалоспорины III поколения (96,188,189).

В настоящий момент группа так называемых «классических БЛРС» ТЕМи SHV-типа включает более 160 ферментов, которые широко распространенны во всем мире. Большинство ТЕМ и SHY производных, обладающих 1 расширенным спектром активности, являются цефтазидимазами и вызывают более высокий уровень устойчивости к цефтазидиму, чем к цефотаксиму. Лишь немногие ТЕМ и SHV (например, ТЕМ-3, ТЕМ-25, SHV-2) являются цефотаксимазами и создают приблизительно равные уровни устойчивости к цефтазидиму и цефотаксиму у штаммов-продуцентов(31). ТЕМ и SHV БЛРС в основном распространены среди Enterobacteriaceae, но также встречаются у Р. aeruginosa, А. baumannii и других грамотрицательных неферментирующих бактерий (ГНБ) (141).

Начиная с конца 1980-х годов, были обнаружены новые плазмидные БЛРС, не относящиеся к группам ТЕМ и SHV ß-лактамаз: цефтазидимазы: PER, УЕВ, TLA-1, TLA-2, GES/IBS, BEL-1 и цефотаксимазы: SFO-1, BES-1 и СТХ-М

21,25,28,34,122,167,168,170,186,200). Предшественники этих ферментов не* известны, за исключением SFO-1 и СТХ-М ß-лактамаз.

Такие редкие БЛРС, как SFO-1, BES-1, BEL-1, TLA-1 и TLA-2 не получили широкого распространения, большинство из них были обнаружены у единичных клинических штаммов (34,122,162,186,190). В то же время, ß-лактамазы VEB достаточно широко распространены среди энтеробактерий в Восточной Азии, а также выявлены у штаммов A. baumannii. во Франции, Бельгии и Аргентине (128). Ферменты GES/IBS-типа выделены у отдельных штаммов энтеробактерий в разных странах и на разных континентах (128). ß-Лактамазы PER-типа распространены в основном среди ГНБ. Изначально, PER-1 была описана у нозакомиальных штаммов Р. aeruginosa и Acinetobacter spp. в Турции (206), однако, за последние десять лет PER ß-лактамазы были выявлены у ГНБ во многих странах (128).

Полирезистентность (устойчивость ко многим классам антибиотиков) в настоящее время является частой характеристикой БЛРС-продуцирующих штаммов (38). Гены БЛРС часто располагаются на больших конъюгативных плазмидах, которые дополнительно несут гены резистентности к антимикробным препаратам разных групп: аминогликозидам, хинолонам, триметоприму, сульфонамидам, тетрациклину и хлорамфениколу (46,150). Распространение плазмид множественной резистентности среди представителей Enterbacteriaceae создает огромные проблемы для терапии инфекций.

Большинство БЛРС, описанных до конца 90-х годов, относились к группам SHV и ТЕМ" ферментов. Продуценты БЛРС SHV- и ТЕМ-типа в основном ассоциировались с внутрибольничными вспышками, преимущественно в отделениях интенсивной терапии. Для таких продуцентов была необычной связь с внебольничными инфекциями (209). Распространение БЛРС продуцентов среди К. pneumoniae было выше, чем среди Е. coli. Установленными факторами риска являлись недавние хирургические вмешательства, использование катетеров, продолжительная госпитализация и предшествующая антибиотикотерапия с использованим цефалоспоринов и аминогликазидов (151,187).

Эпидемиология БЛРС существенно изменилась за последние несколько лет. СТХ-М р-лактамазы стали преобладающей'группой БЛРС практически во всех странах мира. Во многих странах, например, в;. Аргентине, Тайвани, Испании, Италии и России, среди БЛРС-продуцентов существенно, увеличилась доля штаммов Е. coli, экспрессирующих СТХ-М Р-лактамазы (42). Кроме того, возросла частота БЛРС-продуцирующих штаммов, вызывающих внебольничные инфекции, в частности, инфекции мочевыводящих путей (ИМП), интраабдоминальные инфекции и бактериемии (175-177). В связи с этим, появилась вероятность переноса штаммов не только из госпитальной во внебольничную среду, но и наоборот,- из внебольничной среды в стационары. Похожий сценарий был ранее описан для метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus aureus (MRSA) (27). В качестве дополнительного фактора риска развития внебольничных ИМП, вызванных БЛРС-продуцирующими штаммами, было выявлено предварительное использование фторхинолонов (178). Наконец, резко возросла частота выделения штаммов, продуцирующих БЛРС, в различных отделениях многопрофильных стационаров, помимо-отделений интенсивной терапии (27,160,178).

Молекулярная эпидемиология БЛРС как в стационарах, так и во внебольничной среде является сложной и характеризуется крайним разнообразием генов БЛРС, ассоциированных с ними мобильных генетических элементов и плазмид, а также разнообразием видового состава и популяционной структуры штаммов-продуценов. Глобальная пандемия СТХ-М Р-лактамаз, наблюдаемая в настоящее время, связана с распространением эпидемических клонов и плазмид. В частности, в ряде исследований описано эпидемическое распростанение штаммов Е. coli, продуцирующих СТХ-М-15 и относящихся к генетической линии 025:H4-ST131, в странах Европы, Азии и

Америки (29,42,55,102,133,180). Вместе с тем, наличие БЛРС различных генетических групп, включая наиболее частые в Европе варианты: СТХ-М-15, СТХ-М-3, СТХ-М-14, у многих штаммов и видов Enterobacteriaceae объясняется распространением конъюгативных плазмид, относящихся к группам IncFII и Incll (71,136). Исследования, проведенные в Мадриде с 1988 г. по 2000 г., показали, что резкое увеличение доли БЛРС продуцентов среди госпитальных и внебольничных штаммов Е. coli, К. pneumoniae и других видов энтеробактерий во второй половине 1990-х гг., было связано с одновременным распространением разных ферментов и плазмид среди эпидемических и неэпидемичных (спорадических) клонов, которые проявляли сходный фенотип резистентности. Для описания такой уникальной эпидемилогической ситуации F.Baquero впервые ввел термин «аллодемия», означающий множественность генетических источников (генов резистентности, мобильных элементов и клонов), формирующих пул микроорганизмов с одинаковым фенотипом резистентности на определенной территории (16,42).

Не менее важной проблемой является сложность детекции устойчивости, связанной с продукцией БЛРС, в клинических микробиологичесикх лабораториях (1,4,5). БЛРС-продуцирующие штаммы часто проявляют in vitro устойчивость к отдельным оксииминоцефалоспоринам на уровне, более низком, чем принятые в Российской Федерации пограничные концентрации для умеренно-резистентных или резистентных штаммов (МПК > 8 мг/л) (3). В связи с этим такие штаммы неверно расцениваются как чувствительные к цефалоспоринам. При этом результаты многочисленных клинических наблюдений и систематических исследований показывают, что терапия инфекций, вызванных любыми БЛРС-продуцирующими штаммами, включая штаммы с МПК цефотаксима, цефтриаксона, цефтазидима или цефепима >1-2 мг/л, с использованием цефалоспоринов является неээфективной (12,92,152,153). Наличие БЛРС является, таким образом, важным прогностическим фактором низкой эффективности эмпирической терапии инфекций, вызванных Enterobacteriaceae (38,41).

Глава >2. ß-Лактамазы расширенного спектра СТХ-М типа

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Степанова, Марина Николаевна

ВЫВОДЫ

2. Аминокислотные замены в позициях 167 (Pro—»Ser/Thr) и 136 (Asp—>Lys) играют ключевую роль в изменении спектра ферментативной активности СТХ-М-3 и формировании резистентности к цефтазидиму у штаммов-продуцентов.

3. Приобретение мутации Prol67-»Thr в СТХ-М-3 и появление СТХ-М-42 in vivo подтверждается обнаружением клонально и эпидемиологически родственных штаммов, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42 ферменты и обладающих фенотипом гипермутабельности. Возникновение данной мутации в гипермутабельных штаммах Е. coli связано с селекцией при использовании цефтазидима.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанова, Марина Николаевна, Смоленск

1. Г.Крапивина; И:В.' Антибиотикочувствительность и молекулярные механизмы резистентности к бета-лактамам грамотрицательных микроорганизмов* — возбудителей внутрибольничньш инфещийГ/ ИШ; -.

2. Крапивина,1 Е.В: Галеева; Н;С. Вешутова, Д В: Иванов, С.В; Сидоренко // Журналмикробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2007. — Т. 5; - С.16.20. ; :■ /"i ; '-Y

3. Методические указания МУК 4.2.1890-04. 2004; Определение, чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам., Утверждены; и т введены1 в действие Главным государственным^ санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 04.03.2004.

4. Сидоренко, С.В. Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое значение и методы детекции / С.В. Сидоренко // Consilium Medicum. -2011. -T.4.-N.6.

5. Сидоренко,. С.В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам / С.В: Сидоренко, А.Г. Березин, Д.В: Иванов // Антибиотики и химиотерапия. 2011- Т. 49. - N. 3. - С. 6-16.

6. Страчунский, Л.С. Бета-лактамазы расширенного спектра быстрорастущая и плохо осознаваемая угроза / Л.С. Страчунский //

7. Alobwede, I. СТХ-М extended-spectrum: beta-lactamase arrives in the UK / I Alobwede and et all:// J.Antimicrob.Chemother. 2003. - V. 51. - P. 470-471.

8. Ambler, R.P. The structure of beta-lactamases / R.P. Ambler // Philos.Trans;RSoc.bond.(Biol.). 1980. - V. 289: - P. 321-331.

9. Ambler, R.P., A standard'numbering scheme for the class: A beta-lactamases / R.P Ambler and et al //Biochem. J. 1991. - V; 276. - P. 269-270.

10. Andes, D. Treatment of infections with ESBE-producing organisms: pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations / D. Andes and W.A. Craig // Clin. Microbiol. Infect. 2005. - V. 11. - SuppL 6. - P. 10-17.

11. Arakawa, Y. Chromosomal beta-lactamase of Klebsiella oxytoca, a new class A enzyme that hydrolyzes. broad-specti'um beta-lactam antibiotics 7 Y. Arakawa and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1989. - V. 33. - P. 63-70.

12. Arduino, S.M; blaCTX-M-2 is; located in an unusual class 1 integron (In35) which includes Orf513 / S.M. Arduino and et all // Antimicrob.Agents Chemother.2002. V. 46. - P. 2303-2306.

13. Bae, I.K. A novel ceftazidimehydrolysing extended-spectrum b-lactamase, CTX-M-54, with a single amino acid substitution at position 167 in the omega loop / I.K. Bae and et all // J Antimicrob Chemother. 2006. - V. 58. - P. 315319.

14. Baquero, F. Allodemics / F. Baquero // Lancet Infect Dis. 2002. - V.2 -N.10. -P. 591-592.

15. Baquero, M.R. Polymorphic mutation frequencies in E. coli: emergence of weak mutators in clinical isolates / M.R. Baquero and et all // J Bacterid. -2004. -V. 186. — P.5538-5542.

16. Baquero, F. Antibiotic-selective environments / F. Baquero, M.C. Negri, M.I. Morosini, and J. Blazquez // Clin. Infect. Dis. 1998. - V. 27. - Suppl. 1. - P. S5-11.

17. Baquero, F. Selection of very small differences in bacterial evolution / F. Baquero, M.C. Negri, M.I. Morosini, and J. Blazquez // Int. Microbiol. 1998. -V. 1.-P. 95-300.

18. Baquero, M.R. Increased mutation frequencies in Escherichia coli isolates harboring extended-spectrum, beta-lactamases / M.R. Baquero and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. - V.49. - P. 4754-4756.

19. Bauernfeind, A. A new plasmidic cefotaximase from patients infected with Salmonella typhimurium / A. Bauernfeind and et all // Infection. 1992. - V.' 20. -P. 158-163.

20. Bauernfeind, Ä. A new plasmidic cefotaximase in a clinical isolate of Escherichia coli // A. Bauernfeind, H. Grimm, S. Schweighart,// Infection; -1990. V.18.-P: 294-298.

21. Bauernfeind, A. Characterization, of, beta-lactamase gene blaPER-2, which encodes an extended-spectrum class A beta-lactamase / A. Bauernfeind and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1996. - V. 40: - P. 616-620.

22. Ben Ami, R. Influx of extended-spectrum beta-lactamase-producing enterobacteriaceae into the hospital / R. Ben Ami. and et all'// Clin.Infect.Dis. -2006.-V. 42.-P. 925-934.

23. Ben Ami, R. Influx of extended-spectrum beta-lactamase-producing enterobacteriaceae into the hospital / R. Ben Ami. and et all // Clin.Infect.Dis. -2006.-V. 42.-P. 925-934.

24. Bernard, H. A novel plasmid-mediated extended-spectrum beta-lactamase not derived from TEM- or SHV-type enzymes / H. Bernard and et all // J.Antimicrob.Chemother. 1992. - V. 29. - P. 590-592:

25. Blarzquez, J: Hypermutation as a factor contributing to the acquisition of antimicrobial resistance / J. Blarzquez and et all // Clin.Infect.Dis. 2003. - V. 37.-P. 1201-1209.• • • " . 95 '. ■ ' ,. • ,•

26. Bonnet, R. Growing group1 of extended-spectrum beta-lactamases: the GTX-M enzymes / R Bonnet // Antimicrob.Agents Chemother. 2004. - V. 48. P. 1 -14: .

27. Bonnet;, R. Novell cefotaximase (CTX-M-16) with increased catalytic efficiency ■ due to substitution-Asp-240-->Gly / R. Bonnet and et all // Antimicrob.Agents

28. Chemother.-2001.-V.45;-P: 2269-2275;33; Bonnet; Ri. Effect of D240G= substitution in, a novel ESBL CTX-M-27" / R.;, Bonnet and et all // J.Antimicrob.Chemother. 2003. - V. 52. - P. 29-35. 1

29. Bonnet, R. A novel class A extended-spectrum beta-lactamase (BES-1) in Serratia marcescens isolated in Brazil / R. Bonnet and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2000. - V. 44. - P. 3061-3068;

30. Bonnet, R. A novel CTX-M beta-lactamase (CTX-M-8) in cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolated in Brazil / R. Bonnet and et all // Antimicrob;Agents Chemother. 2000. - V. 44. - P. 1936-1942.

31. Bou, G. Identification and broad dissemination; of the CTX-M-14 beta-lactamase in different Escherichia coli strains in the northwest area of Spain / G. Bou and et all // J.Clin.Microbioli 2002. - V. 40.- P. 4030-4036.

32. Bradford, P.A. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat / P.A. Bradford // Clin.Microbiol.Rev. 2001. - V. 14. - P. 933-51.

33. Bradford, P.A. CTX-M-5, a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase from an outbreak of Salmonella typhimurium in Latvia / P.A. Bradford and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1998. -V. 42. - P.r 1980-1984,

34. Brigante, G. Evolution of CTX-M-type beta-lactamases in isolates of Escherichia coli infecting hospital and community patients / G. Brigante and et all // Int.J.Antimicrob.Agents. 2005. - V. 25. - P. 157-162.

35. Bush, K. New beta-lactamases .in gram-negative bacteria: diversity and impact on-the selection of antimicrobial therapy« / K. Bush // Clin.Infect.Dis. 2001. -V. 32.-P. 1085-1089.i

36. Canton, R. The CTX-M b-lactamase pandemic / R. Canton // Current Opinion in Microbiology. 2006. - V. 9. - P. 466-475.

37. Canton, R. Prevalence and spread of extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe / R. Canton and et all// Clin. Microbiol. Infect.-2008.-V. 14.-Suppl. l.-P. 144-153.

38. Cao, V. ColEl-like plasmid pIP843 of Klebsiella pneumoniae encoding extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-17 / V. Cao, T. Lambert, Pi Courvalin // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. - V. 46. - P. 1212-1217.

39. Carattoli, A. Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae / A. Carattoli // Antimicrob.Agents Chemother. 2009. - V. 53. - P. 2227-2238.

40. Carattoli, A. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. / A. Carattoli and et all // J.Microbiol.Methods. 2005. - V. 63. - P. 219-228.

41. Cartelle, M. High-level resistance to ceftazidime conferred by a novel enzyme, CTX-M-32, derived from CTX-M-1 through a single Asp240-Gly substitution / M. Cartelle and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2004. - V. 48. - P. 2308-2313.

42. Chaibi, E.B. Inhibitor-resistant TEM beta-lactamases: phenotypic, genetic and biochemical characteristics / E. B. Chaibi, D. Sirot, G. Paul, R. Labia // J.Antimicrob.Chemother. 1999. - V. 43. - P. 447-458.

43. Chanawong, A. Three cefotaximases, CTX-M-9, CTX-M-13, and CTX-M-14, among Enterobacteriaceae in the People's Republic of China / A. Chanawong and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. -V. 46. - P. 630-637.

44. Chen, Y. Atomic resolution structures of CTX-M beta-lactamases: extended spectrum activities from increased mobility and decreased stability / Y. Chen and et all // J.Mol.Biol. 2005. - V. 348. - P. 349-362.

45. Chen Y. Structure, function, and inhibition along the reaction coordinate of CTX-M beta-lactamases / Y. Chen, B. Shoichet, R. Bonnet// J.Am.Chem.Soc. -2005. V. 127. -P. 5423-5434.

46. Chmelnitsky, I. CTX-M-2 and a new CTX-M-39 enzyme are the major extended-spectrum beta-lactamases in multiple Escherichia coli clones isolated in Tel Aviv, Israel /1. Chmelnitsky and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 4745-4750.

47. Chopra, I. The role of mutators in the emergence of antibiotic-resistant bacteria. /1. Chopra and et all // Drug Resist Updat. 2003. - V. 6. - P. 137-145.

48. Clermont, O. The CTX-M-15-producing Escherichia coli diffusing clone belongs to a highly virulent B2 phylogenetic subgroup / O. Clermont and et all // J Antimicrob Chemother. 2008. - V. 61. - P. 1024-1027.

49. Clinical and Laboratory Standards Institute / Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 2004.

50. Decousser, J.W. Characterization of a chromosomally encoded extended-spectrum class A beta-lactamase from Kluyvera cryocrescens / J.W. Decousser,

51. Poirel, P. Nordmann // Antimicrob.Agents Chemother. 2001. - V. 45. - P. 3595-3598.

52. Delmas, J. Prediction of the evolution of ceftazidime resistance in extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-9 / J. Delmas and et all7/ Antimicrob.Agents Chemother. 2006. -V. 50. - P. 731-738.

53. Denamur, E. High frequency of mutator strains among human uropathogenic E. coli isolates / E. Denamur and et all // J Bacteriol. 2002. - V.184. - P. 605609.

54. Di Conza, J. Novel class 1 integron (InS21) carrying blaCTX-M-2 in Salmonella enterica serovar infantis / J. Di Conza and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. -V. 46. - P. 2257-2261.

55. Dutour, C. CTX-M-1, CTX-M-3, and CTX-M-14 beta-lactamases from Enterobacteriaceae isolated in France / C. Dutour and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. - V. 46. - P. 534-537.

56. Eckert, C. Dissemination of CTX-M-type beta-lactamases among clinical isolates of Enterobacteriaceae in Paris, France / C. Eckert and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2004. - V. 48. - P. 1249-1255.

57. Eisner, A. Emergence of Enterobacteriaceae isolates producing CTX-Mextended-spectrum beta-lactamase in Austria / A. Eisner and et all //k

58. Antimicrob.Agents Chemother. 2006. -V. 50. - P. 785-787.

59. Ellington, M. Development of extended-spectrum activity in TEM beta-lactamases in hyper-mutable, mutS Escherichia coli / Ml Ellington and et all //Clin.Microbiol.Infect. 2006. - V. 12. - P. 800-803.

60. Fang, H. Molecular epidemiological analysis of Escherichia coli isolates producing extended-spectrum beta-lactamases for identification of nosocomial outbreaks in Stockholm, Sweden / H. Fang and et all // J.Clin.Microbiol. 2004. -V. 42.-P. 5917-5920.

61. Fowler, R. Mutational specificity of a conditional Escherichia coli mutator, mutD5 / R. Fowler and et all // Mol.Gen.Genet. 1974. - V. 133. - P. 179-191.

62. Galan, J.C. Fosfomycin and rifampin disk diffusion tests for detection of Escherichia coli mutator strains / J.C. Galan and et all // J.Clin.Microbiol. -2004. V. 42. - P. 4310-4312.

63. Garcia, A. Characterization of the highly variable region surrounding the bla(CTX-M-9) gene in non-related Escherichia coli from Barcelona / A. Garcia and et all // J.Antimicrob.Chemother. 2005. - V. 56. - P. 819-826.

64. Gautom, R.K. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia coli 0157:H7 and other gram-negative organisms in 1 day / R.K. Gautom //J.Clin.Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 2977-2980.

65. Gazouli, M. Effect of substitution of Asn for Arg-276 in the cefotaxime-hydrolyzing class A beta-lactamase CTX-M-4 / M. Gazouli, N.J. Legakis, L.S. Tzouvelekis // FEMS Microbiol.Lett. 1998. - V. 169. - P. 289-293.

66. Gazouli, M. A plasmid-mediated beta-lactamase conferring resistance to cefotaxime in a Salmonella typhimurium clone found in St Petersburg, Russia / M. Gazouli and et all // J. Antimicrob. Chemother. 1998. - V. 41. - P. 119121.

67. Gniadkowski, M. Evolution of extended-spectrum b-lactamases by mutation / M. Gniadkowski // Clin Microbiol Infect. 2008. - V. 14. - P. 11-32.

68. Golebiewski, M. Complete nucleotide sequence of the pCTX-M3 plasmid and its involvement in spread of the extended-spectrum beta-lactamase gene blaCTX-M-3 / M. Golebiewski // Antimicrob. Agents Chemother. 2007. - V. 51.-P. 3789-3795.

69. Goussard, S. An ISl-like element is responsible for high-level synthesis of extended-spectrum beta-lactamase TEM-6 in Enterobacteriaceae / S. Goussard and et all // J.Gen.Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 2681-2687.

70. Hammond, D.S. bla(SHV) Genes in Klebsiella pneumoniae: different allele 7 distributions are associated with different promoters within individual isolates /

71. D.S. Hammond and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. 49:256-263.

72. Hernandez, J.R. Nationwide study of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum beta-lactamases in' Spain / J.R. Hernandez and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 2122-2125.

73. Ho, P.L. Characterization of a laboratory-generated variant of BPS beta-lactamase from Burkholderia pseudomallei that hydrolyses ceftazidime / P.L. Ho, T.K. Cheung, W.C. Yam, K.Y. Yuen. // J.Antimicrob.Chemother. 2002. -V. 50.-P. 723-726.

74. Hopkins, K.L. Novel plasmid-mediated CTX-M-8 subgroup extended-spectrum beta-lactamase (CTX-M-40) isolated in the UK / K.L. Hopkins and et all // Int.J.Antimicrob.Agents. 2006. -V. 27. - P. 572-575.

75. Humeniuk, C. Beta-lactamases of Kluyvera ascorbata, probable progenitors of some plasmid-encoded CTX-M types / C. Humeniuk and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. - V. 46. - P. 3045-3049.

76. Inoue, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids / H. Inoue, H. Nojima, H: Okayama. // Gene. 1990. - V. 96. - P. 23-28.

77. Ishii, Y. Cloning and sequence of the gene encoding a cefotaxime-hydrolyzing class A beta-lactamase isolated from Escherichia coli / Y. Ishii and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1995. -V. 39. - P. 2269-2275.

78. Jacoby, G.A. Genetics of extended-spectrum beta-lactamases / G.A. Jacoby // EurJ.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 1994. -V. 13. -N.l. -P. 2-11.

79. Kang, C.I. Risk factors for and clinical outcomes of bloodstream infections caused by extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae / C.I. Kang and et all // Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2004. - V. 25. - P. 860-867.

80. Karim, A. Plasmid-mediated extended-spectrum beta-lactamase (CTX-M-3 like) from India and gene association with insertion sequence ISEcpl / A. Karim, L. Poirel, S. Nagarajan, P. Nordmann. // FEMS Microbiol.Lett. 2001. -V. 201.-P. 237-241.

81. Karisik, E. Development of high-level ceftazidime resistance via single-base substitutions of blaCTX-M-2) in hyper-mutable Escherichia coli / E. Karisik and et all // Clin.Microbiol.Infect. 2006. - V. 12 - P. 803-806.103:. .'

82. Kimura, S, Role of a mutation at position 167 of GTX-M-19 in ceftazidime hydrolysis / S. Kimura and et al //. Antimicrob.Agents Chemother. 2004. - V. 48.-P. 1454-1460.

83. Kliebe, C. Evolution of plasmid-coded resistance to broad-spectrum cephalosporins / G. Kliebe and et all7/Antimicrob.Agents Chemother. 1985:-V. 28.-P. 302-307. ' - ■ v'Y ■

84. Knothe, H Transferable resistance to cefotaxime,. cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens / H Knothe and et all // Infection. 1983. - V. 11. - P. 315-317.

85. Knox, J.R. Extended-spectrum' and inhibitor-resistant TEM-type beta-lactamases: mutations, specificity, and three-dimensional structure / J.R. Knox //Antimicrob.Agents Chemother. 1995. -V. 39. -P;2593-2601.

86. Labia, R. Analysis of the bla(toho) gene coding for Toho-2-beta-lactamase / R. Labia // Antimicrob Agents Chemother. 1999; —V. 43. - P.2576-2577.

87. Lau, S.H. UK epidemic Escherichia coli strains A-E, with CTX-M-15 beta-lactamase, all belong to the international 025:H4-ST13! clone / S.H. Lau // J Antimicrob Chemother. 2008. -V. 62. -N. 6. - P. 1241-1244.

88. Li, W.H. Molecular evolution / W.H. Li // Sunderland: Sinauer Associates. MA. USA 1997.-P. 487.

89. Livermore, D.M CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe / D.M Livermore // J Antimicrob Chemother. 2007. - V. 59. - P. 165-174:

90. Livermore, D.M. Clinical significance of beta-lactamase induction and stable derepression in gram-negative rods / D.M Livermore // Eur. J. Clin. Microbiol. -1987. — V.6. — P. 439-445.

91. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to cephalosporin antibiotics / D.M Livermore // Drugs. 1987. - V. 34. - Suppl. 2. - P. 64-88.

92. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics / D.M Livermore// ScandJ.Infect.Dis. 1991. -V. 78. - P. 7-16.

93. Livermore, D.M. beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance. / D.M Livermore// Clin. Microbiol. 1995. -V. 8. - P. 557-584.

94. Livermore, D.M. CTX-M: changing the face of ESBLs in the UK / D.M. Livermore, P.M. Hawkey / D.M Livermore // J.Antimicrob.Chemother. 2005. -V. 56.-P. 451-454.

95. Luzzaro, F. Trends in production of extended-spectrum beta-lactamases among enterobacteria of medical interest: Report of the second Italian nationwide survey / F. Luzzaro and et all // J.Clin.Microbiol. 2006. - V. 44. - P. 16591664.

96. Ma, L. Cloning and sequencing of the gene encoding Toho-2, a class A beta-lactamase preferentially inhibited by tazobactam / L. Ma and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1998. - V. 42 - P. 1181-1186.

97. Mabilat, C. PCR detection and identification of genes for extended-spectrum blactamases / C. Mabilat and S. Goussard //. Diagnostic molecular microbiology.

98. Principles and Applications. American Society for Microbiology, 1993. -Washington, DC. - P. 553-562

99. Mammeri, H. In vivo selection of a chromosomally encoded beta-lactamase variant conferring ceftazidime resistance in Klebsiella oxytoca / H. Mammeri, L. Poirel, P. Nordmann // Antimicrob.Agents Chemother. 2003. - V. 47. - P. 3739-3742.

100. Matsumoto, Y. Novel plasmid-mediated beta-lactamase from Escherichia; coli that inactivates oxyimino-cephalosporins / Y. Matsumoto and et all // Antimicrob. Agents Chemother. 1988. -V, 32. - P. 1243-1246.

101. Matsumoto, Y. Characterization of SFO-1, a plasmid-mediated inducible class

102. A beta-lactamase from Enterobacter cloacae / Y. Matsumoto, M. Inoue. //• ^

103. Antimicrob.Agents Chemother. 1999. - V. 43. - P: 307-313.

104. Mugnaioli, C. CTX-M-type extended-spectrum b-lactamases in Italy: molecular epidemiology of an emerging countrywide problem / C. Mugnaioli and et all // Antimicrob Agents Chemother. 2006. - V. 50. - P. 2706.• ■ . ' ■ 107

105. Munday, C.J:; Molecular and kinetic comparison, of the novel' extendedL spectrum beta-lactamases GTX-M-25 and CTX-M-26 / C.J. Munday and et all. //Antimicrob.Agents Chemother. 2004. -V. 48: - P. 4829-4834.

106. Naas T. Minor extended-spectrum b-lactamases / T. Naas and et all // Clin Microbiol Infect. 2008. V. 14. - P. 42-52.

107. Naas, T. OXA-type;beta-lactamases / T. Naas, P. Nordmann. // Curr. Pharm. Des. 1999. -V. 5. -P.865-879.

108. Nagano, N. Nosocomial transmission of CTX-M-2 beta-lactamase-producing Acinetobacter baumannii in a neurosurgery ward' / N. Nagano and et all // J.Clin:Microbiok 2004. - V. 42. - P.; 3978-3984.

109. Nicolas-Chanoine, M.H. Intercontinental emergence of Escherichia ,coli clone 025:H4-ST131 producing CTX-M-15 / M.H. Nicolas-Chanoine and et all // J Antimicrob Chemother. 2008; -V. 61. - Pi 273-281.

110. Nordmann, P. Sequence analysis of PER-1 extended-spectrum beta-lactamase ; irom Pseudomonas aeruginosa and comparison with class Л beta-lactamases /

111. P:Nordmann, Т. Naas.//'Antimicrob. Agents Chemother. 1994: - V. 38:,-P:. 104-114.

112. Novais, A. Evolutionary trajectories of beta-lactamase CTX-M-1 cluster enzymes: predicting antibiotic resistance / A-Novais.// PLoS. Pathog. 2010. -V.

113. Oliver, A. CTX-M-10 linked to a phage-related element is widely disseminated among Enterobacteriaceae in a Spanish hospital / A. Oliver and' et* all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 1567-1571.

114. Oliver, A. Nucleotide sequence and characterization of a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase (CTX-M-10) isolated in Spain / A. Oliver and et all //Antimicrob.Agents Chemother. 2001. -V. 45. - P. 616-620.

115. Oliver, A. High frequency of hypermutable Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection / A. Oliver and et all // Science 2000. 288. - P. 12511254.

116. Olson, A. Identification of a progenitor of the CTX-M-9 group of extended-spectrum beta-lactamases from Kluyvera georgiana isolated in Guyana / A. Oliver and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 21122115.

117. Oteo, J. Spread of Escherichia coli strains with high-level cefotaxime and ceftazidime resistance between the community, long-term care facilities, and hospital institutions / J. Oteo and et all // J Clin Microbiol. 2006. - V. 44. - P. 2359-2366.

118. Pai, H. Identification of CTX-M-14 extended-spectrum beta-lactamase in clinical isolates of Shigella sonnei, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae in Korea / H. Pai and et all // J.Clin.Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 3747-3749.

119. Palzkill, T. Evolution of antibiotic resistance: several different amino acid substitutions in an active site loop alter the substrate profile of beta-lactamase / T. Palzkill and et all // Mol.Microbiol. 1994. - V: 12. - P. 217-229.

120. Partridge, S.R. In34, a complex In5 family class 1 integron containing orf513 and dfrAlO / S.R. Partridge // Antimicrob Agents Chemother. 2003. - V. 37. -P. 342-349.

121. Paterson, D.L. Recommendation for treatment of severe infections caused by Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) / D.L. Paterson // Clin.Microbiol.Infect. 2000. - V. 6. - P. 460-463.

122. Paterson, D.L. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update / D.L. Paterson,, R.A. Bonomo // Clin.Microbiol.Rev. 2005. - V. 18. - P. 657-686.

123. Paterson, D.L Antibiotic therapy for Klebsiella pneumoniae bacteremia: implications of production of extended-spectrum beta-lactamases / D.L. Paterson and et all // Clin. Infect. Dis. 2004. - V. 39. - P. 31-37.

124. Peduzzi, J. Characterization and amino acid sequence analysis of a new oxyimino cephalosporin-hydrolyzing class A beta-lactamase from Serratia fonticola CUV / J. Peduzzi and et all // Biochim.Biophys.Acta. 1997. - V. 1341.-P. 58-70.

125. Peduzzi, J. Chromosomally encoded cephalosporin-hydrolyzing beta-lactamase of Proteus vulgaris R0104 belongs to Ambler's class A / J. Peduzzi and et all // Biochim.Biophys.Acta. 1994. -V. 1207. - P. 31-39.

126. Peirano, G. Molecular epidemiology of Escherichia coli producing CTX-M beta-lactamases: the "worldwide emergence of clone ST131 025:H4 / G. Peiranoand J., D. Pitout. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2010. - V. 35. - P. 316321.

127. Perilli, M. Cloning and nucleotide sequencing of the gene encoding the beta-lactamase from Citrobacter diversus / M. Perilli and et all. // FEMS Microbiol.Lett. 1991. - Y. 67. - P. 79-84.

128. Philippon, A. Plasmid-determined AmpC-type beta-lactamases / A. Philippon, G. Arlet, G.A. Jacoby // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. - V. 46. - P. 111.

129. Pitout, J.D. Molecular epidemiology of CTX-M-producing Escherichia coli in the Calgary Health Region: emergence of CTX-M- 15-producing isolates. / J.D. Pitout and et all // Antimicrob Agents Chemother 2007. - V. 51. - P. 12811286.

130. Pitout, J.D. Population-based laboratory surveillance for Escherichia coli-producing extended-spectrum beta-lactamases: importance of community isolates with blaCTX-M genes / J.D. Pitout and et all // Clin.Infect.Dis. 2004. -V. 38.-P. 1736-1741.

131. Pitout, J.D. Emergence of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) in the community / J.D. Pitout, P. Nordmann, K.B. Laupland, L. Poirel. // J. Antimicrob.Chemother. 2005. - V. 56. - P. 52-59.

132. Poirel, L. BEL-1, a novel clavulanic acid-inhibited extended-spectrum beta-lactamase, and the class 1 integron In 120 in Pseudomonas aeruginosa / L. Poirel and et all // Antimicrob.Xgents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 3743-3748.

133. Poirel, L. Insertion sequence ISEcplB is involved in expression and mobilization of a bla(CTX-M) beta-lactamase gene / L. Poirel, J.W. Decousser,

134. P. Nordmann // Antimicrob.Agents Chemother. 2003. - V. 47. - P. 29382945.

135. Poirel, L. Biochemical analysis of the ceftazidime-hydrolysing extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-15 and of its structurally related beta-lactamase CTX-M-3 / L. Poirel, M. Gniadkowski, P. Nordmann //i

136. J.Antimicrob.Chemother. 2002. -V. 50. - P. 1031-1034.

137. Poirel, L. ISEcpIB-mediated transposition of blaCTX-M in Escherichia coli / L. Poirel, M.F. Lartigue, J.W. Decousser, P. Nordmann // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. - V. 49. - P. 447-450.

138. Poirel, L. Biochemical sequence analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum beta-lactamase, and the class 1 integron In52 from Klebsiella pneumoniae / L. Poirel and et all. // Antimicrob.Agents Chemother. 2000. -V. 44.-P. 622-632.

139. Poirel, L. Molecular and biochemical characterization of VEB-1, a novel class A extended-spectrum beta-lactamase encoded by an Escherichia coli integron gene / L. Poirel and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1999. - V. 43. - P. 573-581.

140. Poirel, L. CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamase that hydrolyzes ceftazidime through a single amino acid substitution in the omega loop / L. Poirel and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2001. - V. 45. - P. 33553361.

141. Poirel, L. GES-2, a class A beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa iwith increased hydrolysis of imipenem / L. Poirel and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2001. - V. 45. - P. 2598-2603.

142. Pournaras, S. CTX-M enzymes are the most common extended-spectrum beta-lactamases among Escherichia coli in a tertiary Greek hospital / S. Pournaras and et all // J.Antimicrob.Chemother. 2004. - V. 54. - P. 574-575.

143. Power, P. Cefotaxime-hydrolysing beta lactamases in-Morganella morganii / P. Power and et all // Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 1999. - V. 18. - P. 743747.

144. Randegger, C.C. Contribution of natural amino acid substitutions in SHV extended-spectrum beta-lactamases to resistance against various beta-lactams / C.C. Randegger and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2000. - V. 44. -P. 2759-2763.

145. Rodriguez, M.M. Chromosome-encoded CTX-M-3 from Kluyvera ascorbata: a possible origin of plasmid-borne CTX-M-1-derived cefotaximases / M.M. Rodriguez and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2004. - V. 48. - P. 4895-4897.

146. Rodriguez-Baco, J. Community-onset bacteremia due to extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli: risk factors and prognosis / J. Rodriguez-Baco and et all // Clin Infect Dis. 2010. - V. 5. - N. 1. - P. 40-48.

147. Rodriguez-Baco, J. Extended-spectrum beta-lactamases in ambulatory care: a clinical perspective / J. Rodriguez-Baco and et all // Clin Microbiol Infect. -2008.-V. 14.-P. 104-110.

148. Rodriguez-Baco, J. Clinical significance of extended-spectrum beta-lactamases / J. Rodriguez-Baco and et all // Expert Rev Anti Infect Ther. 2008. - V. 6. -N. 5.-P. 671-683.

149. Rodriguez-Baco, J. Bacteremia due to extended-spectrum b-lactamase-producing Escherichia coli in the CTX-M era: a new clinical challenge / J. Rodriguez-Baco and et all // Clin Infect Dis. 2006. - V. 43. - P .1407-1414. '

150. Rodriguez-Martinez, J.M. Common region CR1 for expression? of antibiotic , resistance genes / J.M. Rodriguez-Martinez and' et all // Antimicrob Agents Chemother. 2006. - 50. - P. 2544-2546.

151. Rooney, P.J. Nursing homes as a reservoir of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing ciprofloxacin-resistant Escherichia coli / P.J. Rooney and et all // J Antimicrob Chemother. 2009. - V. 64. - N. 3. - P. 635-641.

152. Rossolini G.M. The spread of CTX-M-type extended-spectrum b-lactamases / G.M.Rossolini and et all // Clin Microbiol Infect. 2008. - V. 14. - P. 33-41.

153. Sabate, M. Novel complex sull-type integron in Escherichia coli carrying bla(CTX-M-9) / M. Sabate and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. -V. 46.-P. 2656-2661.

154. Sabate, M. Cloning and sequence of the gene encoding a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase (CTX-M-9), from Escherichia coli in Spain / M. Sabate and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2000. - V. 44. - P. 19701973.

155. Saladin, M. Diversity of CTX-M beta-lactamases and their promoter regions from Enterobacteriaceae isolated in three Parisian hospitals / M. Saladin and et all // FEMS Microbiol.Lett. 2002. -V. 209. P. 161-168.

156. Shimamura, T. Acyl-intermediate structures of the extended-spectrum class A beta-lactamase, Toho-1, in complex with cefotaxime, cephalothin, and benzylpenicillin / T. Shimamura and et all // J.Biol.Chem. 2002. - V. 277. - P. 46601-46608.

157. Silva, J. TLA-1: a new plasmid-mediated extended-spectrum beta-lactamase from Escherichia coli / J. Silva and et all // Antimicrob.Agents Chemother. -2000!- V. 44. P; 997-1003;

158. Sirot, D. Extended-spectrum plasmid-mediated beta-lactamases. / D. Sirot // J. Antimicrob.Chemother. 1995. - V. 36. - P. 19-34.

159. Sirot, D. Transferable, resistance to third-generation; cephalosporins in clinical; isolates of Klebsiella pneumoniae:, identification 'of CTX-lf, a novel beta-lactamase / D. Sirot // J.Antimicrob.Chemother. 1987. - V. 20. - P. 323-334.

160. Tassios, P. Spread of Salmonella typhimurium clone resistant to expanded-spectrum cephalosporins in three European countries / P. Tassios and et all // J.Clin.Microbiol. 1999. - V. 37. - P. 3774-3777.

161. Therrien, C. Roles of amino acids 161 to 179 in the PSE-4 omega loop in substrate specificity and in resistance to ceftazidime / C Therrien, F. Sanschagrin, T. Palzkill, R. C. Levesque. // Antimicrob.Agents Chemother. -1998. V. 42. - P. 2576-2583.

162. Toleman, M.A ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century / M.A. Toleman and et all // Microbiol.Mol.Biol.Rev. 2006. - V. 70. -P. 296-316.

163. Toleman, M.A. Common regions e.g. orf513 and antibiotic resistance: IS91-like elements evolving complex class 1 integrons / M.A. Toleman, P.M. Bennett, T.R. Walsh.//J.Antimicrob.Chemother. 2006;.

164. Tzouvelekis, L.S. CTX-M-type beta-lactamases: an emerging group of extended-spectrum enzymes / t.S. Tzouvelekis, E. Tzelepi, P.T. Tassios, N.J. Legakis // Int.J.Antimicrob.Agents. 2000. - V. 14. - P. 137-142.

165. Valverde, A. In 117, an unusual InO-like class 1 integron containing CR1 and bla(CTX-M-2) and associated with a Tn21-like element / A. Valverde and et all //Antimicrob.Agents Chemother. 2006. -V. 50. - P. 799-802.

166. Valverde, A. Dramatic increase in prevalence of fecal carriage of extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae during nonoutbreak situations in Spain / A. Valverde and et all // J.Clin.Microbiol. 2004. - V. 42. -P. 4769-4775.

167. Walther-Rasmussen, J. Cefotaximases (CTX-M-ases), an expanding family of extended-spectrum beta-lactamases / J. Walther-Rasmussen, N. Hoiby. // Can.J.Microbiol. 2004. -V. 50. - P. 137-165.

168. Wang, H. Clinical isolates of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases: prevalence of CTX-M-3 at a hospital in China / H. Wang and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2003. - V. 47. - P. 790-793.

169. Weill, F.X. Emergence of extended-spectrum-beta-lactamase (CTX-M-9)-producing multiresistant strains of Salmonella enterica serotype Virchow in poultry and humans in France / F.X. Weill and et all // J. Clin. Microbiol. -2004. V. 42. - P. 5767-5773.

170. Weldhagen, G.F. Ambler class A extended-spectrum beta-lactamases in Pseudomonas aeruginosa: novel developments and clinical impact / G.F. Weldhagen, L. Poirel, P. Nordmann // Antimicrob.Agents Chemother. 2003. -V. 47.-P. 2385-2392.

171. Welsh, K.J. Experimental prediction of the evolution of ceftazidime resistance in the CTX-M-2 extended-spectrum beta-lactamase / K.J. Welsh and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 2005. -V. 49. - P. 1242-1244.

172. Wild, J. Conditionally amplifiable BACs: switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones / J. Wild, Z. Hradecna, W. Szybalski. // Genome Res. 2002. - V. 12. - P. 1434^1444.

173. Yagi, T. Nosocomial spread of cephem-resistant Escherichia coli strains carrying multiple Toho-l-like beta-lactamase genes / T. Yagi and et all // Antimicrob.Agents Chemother. 1997. - V. 41. - P. 2606-2611.

174. Zacharczuk, K. Plasmid-mediated 16S rRNA methylase ArmA in aminoglycoside-resistant Klebsiella pneumoniae in Poland. / K. Zacharczuk an et all // J. Med. Microbiol. 2011.

Информация о работе

Степанова, Марина Николаевна
кандидата биологических наук
Смоленск, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Мутационная изменчивость CTX-M β-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы