ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А

Уляшова, Мария Морисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А"

На правах рукописи

УЛЯШОВА Мария Морпсовна

ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БЕТА-ЛАКТАМАЗ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛАССА А

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2011

4841853

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научные руководители:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Егоров Алексей Михайлович

кандидат химических наук, доцент Рубцова Майя Юрьевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация:

Институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится « /О » марта 2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.ВЛомоносова.

Автореферат разослан « зевраля 2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59 кандидат химических паук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема возникновения и распространения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у клинически значимых видов микроорганизмов имеет чрезвычайно важное значение, поскольку бета-лактамы являются наиболее часто используемыми препаратами для лечения бактериальных инфекций (Rolinson, 1998). У грамотрицательных микроорганизмов известно несколько механизмов резистентности к бета-лактамным антибиотикам, однако основным из них является продукция бета-лактамаз - ферментов, катализирующих реакцию гидролиза бета-лактамного кольца, в результате чего антибиотик теряет свою антибактериальную активность (Livermore, 1995).

В настоящее время внимание исследователей привлечено к изучению трех основных групп бета-лактамаз, относящихся к молекулярному классу А - ТЕМ, SHV и СТХ-М (Bradford, 2001; Pitout, 2008). Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих групп ферментов среди возбудителей инфекционных заболеваний человека приняло угрожающий характер. Ферменты групп ТЕМ и SHV являются производными классических пенициллиназ ТЕМ-1 и SHV-1 и отличаются от них наличием от одной до нескольких единичных аминокислотных мутаций, что является результатом однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) кодирующих их генов (Woodford, 2007). Известно, что некоторые мутации могут изменять субстратную специфичность или приводить к возникновению устойчивости к ингибиторам. Большинство субтипов ТЕМ и SHV бета-лактамаз являются бета-лактамазами расширенного спектра (БЛРС), способными расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и антибиотики, принадлежащие к цефалоспоринам III и IV поколений. Характерную для БЛРС активность проявляют также все ферменты СТХ-М типа. В отличие от ТЕМ и SHV бета-лактамаз они имеют низкую степень гомологии внутри группы, поэтому их дополнительно разделяют на 4 подгруппы, внутри которых ферменты отличаются наличием точечных аминокислотных мутаций (Bonnet, 1999; Bonnet, 2004).

Многообразие бета-лактамаз молекулярного класса А, а также их широкое распространение диктуют необходимость разработки методов точной и быстрой идентификации ферментов данного класса. Рутинная оценка чувствительности к антибиотикам, проводимая в бактериологических лабораториях, не является достаточно эффективной для обнаружения БЛРС вследствие вариабельности их фенотипического проявления. Кроме того, существующие методы исследования бета-лактамаз, основанные на определении их физико-химических свойств и субстратного спектра, не обладают достаточной разрешающей способностью для дифференциации многочисленных ферментов этой

группы. В связи с этим актуальной задачей является разработка молекулярно-генетических методов типирования бета-лактамаз. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является сейчас наиболее распространенной для выявления генов БЛРС, однако положительный результат ПЦР-амплификации генов, как правило, не является достаточным для определения субтипа фермента и предполагает дальнейшее исследование генов с целью выявления возможных мутаций, определяющих расширенный спектр активности (Эйделыптейн, 2001).

Перспективным методом определения множества мутаций как с точки зрения времени получения результата анализа, так и его информативности является метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах (Grimm, 2004; Ensor, 2007; Cohen Stuart, 2010). ДНК-микрочип представляет собой небольшую по площади поверхность носителя с размещенными на ней в виде матрицы ячейками, в каждой из которых иммобилизованы олигонуклеотидные зонды. В настоящее время наиболее распространенными являются ДНК-микрочипы на стеклянных пластинах с флуоресцентной детекцией (Sassolas, 2008). Их основными преимуществами являются высокая чувствительность и простота проведения анализа. Однако данная технология имеет существенные ограничения при мультипараметрическом определении ОНП генов, так как не всегда удается достичь высокой специфичности идентификации однонуклеотидных замен, в том числе, из-за влияния флуоресцентной метки на образование совершенных ДНК-дуплексов. С этой точки зрения использование в качестве метки молекул небольшого размера, например биотина, является перспективным для одновременного определения множества точечных мутаций в генах. Для выявления биотина в дуплексах ДНК возможно использование конъюгата стрептавидин-фермент с последующей колориметрической детекцией фермента. Колориметрические микрочипы могут быть достойной альтернативой флуоресцентным микрочипам, так как регистрация аналитических сигналов в этом случае может проводиться на недорогих оптических сканерах или даже визуально.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А на основе определения однонуклеотидного полиморфизма кодирующих их генов. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

■ оптимизировать метод гибридизационного анализа биотинилированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией;

■ изучить специфичность выявления ОНП генов на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией;

■ разработать методы амплификации полноразмерных генов ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз с одновременным включением биотипа в качестве

метки;

■ разработать колориметрические ДНК-микрочипы для генотипирования ТЕМ, 81IV и СТХ-М бета-лактамаз на основе выявления однонуклеотидно-го полиморфизма кодирующих их генов;

■ разработать интегрированный ДНК-микрочии для одновременной диагностики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз ТЕМ, БНУ и СТХ-М типов.

Научная новизна. В ходе данной работы разработан метод колориметрической детекции на основе пероксидазы хрена для ДНК-микрочипов высокой плотности на стекле и мембранных носителях, сравнимый по чувствительности с флуоресцентной детекцией на основе красителя СуЗ.

Показано, что специфичность выявления ОНП генов методом гибридиза-ционного анализа на ДНК-микрочипах с использованием биотипа в качестве метки выше, чем для метода гибридизационного анализа с использованием флуоресцентной метки СуЗ.

Разработана методика совместной амплификации полноразмерных генов бета-лактамаз ТЕМ, ЭНУ и СТХ-М типов в процессе мультиплексной ПЦР с одновременным включением метки. Показана более высокая эффективность включения биотина в качестве метки в амшшфицируемый ген в сравнении с флуоресцентным красителем СуЗ.

На основе выявленных в работе закономерностей поведения олигонукле-отидов различной структуры в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах сформулированы рекомендации по молекулярному дизайну зондов для определения ОНП генов. Использование разработанного подхода позволило улучшить дифференциацию между совершенными и несовершенными ДНК-дуплексами, образованными молекулами исследуемой ДНК и олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе работы результаты позволили разработать следующие типы колориметрических ДНК-микрочипов:

■ ДНК-микрочипы высокой плотности, изготовленные на поверхности микроскопных стекол, для генотипирования ТЕМ, вНУ и СТХ-М бета-лактамаз на основе определения всех позиций ОНП генов, приводящих к известным аминокислотным заменам;

■ интегрированный ДНК-микрочип средней плотности, изготовленный на поверхности мембранных носителей, для одновременной диагностики БЛРС и ингибитор-резистентных бета-лактамаз ТЕМ, вНУ и СТХ-М типов на основе идентификации типа генов и ключевых мутаций в них.

Применение метода гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией позволяет повысить специфичность определения

ОНП генов, а также значительно снизить себестоимость анализа. Эти преимущества открывают новые возможности для применения тест-систем на основе ДНК-микрочипов в клинической диагностике и для проведения широкомасштабных эпидемиологических исследований.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международных конференциях «Биокатализ. Фундаментальные основы и применение» (Санкт-Петербург, 2007; Архангельск, 2009); IV и V Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007; Москва, 2009); X и XII международных конгрессах по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID (Москва, 2008; Москва, 2009); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобио-технология: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008); 8th International Meeting on Microbial Epidemiological Markers (Закопане, Польша, 2008); 21st IUBMB and the 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Шанхай, Китай, 2009); II и III международных форумах «Руснанофорум 2009» и «Руснанофорум 2010» (Москва, 2009; Москва, 2010); III научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2009); 20th Anniversary World Congress on Biosensors (Глазго, Великобритания, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010); Первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в международных и отечественных журналах, 10 тезисов докладов международных и российских конференций.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1-4), экспериментальной части (глава 5), списывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (главы 6-10), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 188 страницах, содержит Î9 таблиц и 59 рисунков. Список литературы включает 212 ссылок.

Используемые сокращения. БЛРС - бета-лактамазы расширенного спектра, ДС - декстран сульфат натрия, ИРТ - ингибитор-резистентный тип, ОНП - однонуклеотидный полиморфизм, ПХ - пероксидаза хрена, ПЦР - по-лимеразная цепная реакция, ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, ЩФ - щелочная фосфатаза.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Метод гибридизационпого анализа на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией

Принцип гибридизационпого анализа ДНК на микрочипах основан на выделении бактериальной ДНК из исследуемого образца, амплификации нужного ее фрагмента в процессе ПЦР с одновременным введением метки, и последующей гибридизации меченой ДНК со специфическими зондами. Детекция результатов гибридизации проводится по активности метки. В данной работе в качестве метки ДНК использовался биотин, который выявляли конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена (ПХ). На первом этапе работы была проведена оптимизация методов иммобилизации олигонуклеотидов и условий колориметрической детекции пероксидазы хрена в составе ДНК-дуплексов на поверхности носителей различной природы.

При выборе типа носителя и способа иммобилизации олигонуклеотидов проводили оценку эффективности иммобилизации, размера и морфологии получаемых ячеек микрочипа, величины фонового сигнала, воспроизводимости результатов, полученных в разных экспериментах. Для микрочипов «высокой плотности» в качестве носителя были выбраны микроскопные стекла с поверхностью, модифицированной эпокси-группами. Микрочипы «средней плотности» изготавливали на поверхности мембранных носителей, в качестве оптимального был выбран отрицательно заряженный найлон, обработанный карбо-диимидом. Из всех описанных вариантов ковалентной иммобилизации олигонуклеотидов на электрофильных поверхностях использовали способ иммобилизации олигонуклеотидных зондов через концевую нуклеофильную аминогруппу, связанную с кодирующей частью зонда через линкер из 13 остатков тимидина. Преимущество данного метода заключается в том, что кодирующая часть олигонуклеотида остается максимально доступной для последующей гибридизации с ДНК-мишенью. Для изготовления микрочипов использовали роботы с контактным принципом печати иглами (пинами) с внутренней щелью определенного диаметра. Микрочипы высокой плотности изготавливали на поверхности стеклянных носителей с использованием игл с диаметром щели 100 мкм, они содержали 1000 - 1200 ячеек на 1 см2, диаметр ячеек при этом составлял 130 - 140 мкм, расстояние между ячейками - 150-200 мкм. Микрочипы средней плотности изготавливали на отрицательно заряженном найлоне иглами с щелью большего диаметра (300 мкм), они содержали 200-350 ячеек на 1 см2, диаметр ячеек составлял 450 мкм.

Одним из важных параметров, определяющих чувствительность гибридизационпого анализа на ДНК микрочипе, является чувствительность детекти-

рующей системы. В данной работе мы изучили перспективность использования детектирующих систем на основе ферментативных меток для ДНК-микрочипов. изготовленных на стекле или мембранных носителях. Оптимизацию системы детекции проводили на модельной системе, максимально приближенной к условиям проведения гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе. На поверхности носителя иммобилизовали контрольный олигонук-леотид, который затем в процессе гибридизации образовывал ДНК-комплекс с полностью комплементарным ему олигонуклеотидом, меченым биотипом на 5'-конце. Образующиеся на поверхности микрочипа биотинилированные ДНК-комплексы выявляли с использованием конъюгата стрептавидин-ПХ с последующей колориметрической детекцией фермента (рис. 1). Для детекции ПХ были исследованы различные субстратные системы, которые в результате ферментативного превращения образуют стабильные окрашенные нерастворимые продукты, способные хорошо адсорбироваться на поверхности носителя. Для сравнения эффективности выявления биотина в дуплексах ДНК использовали коммерчески доступные наборы на основе конъюгата стрептавидина с щелочной фосфатазой (ЩФ).

Олигонугслаотид.

меченный биотипом

В таблице I представлены значения предела обнаружения биотинилиро-ванного олигонуклеотида с использованием различных субстратных систем. Сравнение результатов, полученных для мембранных микрочипов, показывает, что наименьший предел обнаружения биотинилированного олигонуклеотида в гибридизационной смеси (0,04 нМ) наблюдается при использовании конъюгата стрептавидин-ПХ с колориметрической детекцией на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в присутствии декстран сульфата (ДС). Он сравним с пределом обнаружения, полученным с использованием конъюгата стреп-гавидин-ЩФ с последующей колориметрической детекцией на основе 5-бромо-4-хлоро-З-индолил фосфата в присутствии нитро-голубого тетразолия. В обоих случаях в ячейках микрочипа осуществлялось накопление темно-синего продукта ферментативного превращения субстратов в течение 5-10 мин.

Иммобилизованный олигскуклеотидный зонд

Окрашенный Субстрат продукт

Рис. 1. Структурный элемент ДНК-микрочипа с колориметрической детекцией.

При колориметрической детекции биотинилированной ДНК на поверхности стекла наиболее низкий предел обнаружения меченого олигонуклеотида (0,025±0,005 нМ) наблюдался при использовании ПХ в качестве ферментативной метки и субстратной системы на основе ТМБ/ДС, а также при совместном пероксидазном окислении производных бензидина (3,3'-диаминобензидина, о-дианизидина) с 4-хлор-1 нафтолом. Он был существенно ниже, чем предел обнаружения при использовании ферментативной детекции на основе ЩФ.

Предел обнаружения биотинилированной ДНК на микрочипах с использованием колориметрической детекции на основе ПХ и ТМБ/ДС был сравним с пределом обнаружения олигонуклеотида, меченного флуоресцентным красителем СуЗ (0,020±0,005 нМ). Динамический диапазон определяемых концентраций меченого олигонуклеотида составлял более двух порядков: 0,02 - 10 нМ для микрочипов с колориметрической детекцией и 0,02 - 5 нМ для микрочипов с флуоресцентной детекцией. Данный факт имеет значение как для количественного гибридизационного анализа на микрочипах, так и для одновременного определения точечных мутаций в генах.

Таблица I.

Сравнение различных детектирующих систем в методах гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах

..... Субстратная система Предел обнаружении меченого олигонуклеотида, нМ на мембранах на стекле

Метка-биотин+конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена

3,3'-диаминобензидин (ДАБ) 0,35 ± 0,07 0,95 ±0,15

4-хлоро-1-нафтол (ХН) 1,50 ± 0,20 0,80 ±0,16

о-дианизидин (ОД) 0,08 ± 0,03 1,50 ±0,25

3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) в присутствии декстран сульфата (ДС) 0,04 ±0,01 0,025 ± 0,005

ДАБ+ХН 0,12 ± 0,03 0,08 ± 0,02

ОД + ХН 0,10 ±0,03 0,035 ± 0,005

Метка-биотин+конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой

5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в присутствии нитро-голубого тетразолия 0,04 ± 0,01 | 0,80 ± 0,35

Метка-флуоресцентный краситель СуЗ

- 0,020 ± 0,003

Таким образом, для проведения гибридизационного анализа с колориметрической детекцией на поверхности мембранных микрочипов и микрочипов на основе стекла была выбрана универсальная детектирующая система на основе ПХ с последующим определением ферментативной активности по накоплению продукта окислению ТМБ в присутствии ДС. Помимо высокой чувствительности и широкого динамического диапазона дополнительным ее преимуществом является то, что в отличие от других производных бензидина ТМБ не является канцерогенным субстратом.

2. Амплификация генов ТЕМ, БНУ и СТХ-М бета-лактамаз с одновременным включением метки

В методе ДНК-микрочипов анализируется меченая ДНК, полученная из образца, как правило, методом ПЦР. Для генотипирования бета-лактамаз класса А было необходимо амплифицировать полноразмерные гены ферментов с одновременным введением биотина в качестве метки с использованием минимального количества стадий. Был выполнен дизайн праймеров и проведена оптимизация условий проведения ПЦР. В результате было показано, что амплификация всех типов генов изучаемых бета-лактамаз может быть проведена в формате одной мультиплексной ПЦР с 6 парами праймеров. В результате амплификации наблюдается синтез ПЦР-продуктов длиной 850-870 п.н., соответствующих полноразмерным генам ТЕМ, ЭНУ и СТХ-М бета-лактамаз. Выход продуктов, достаточный для последующего гибридизационного анализа, достигается за 20 циклов ПЦР при амплификации отдельных генов бета-лактамаз и за 25 циклов при одновременной амплификации нескольких типов генов. При этом общее время амплификации не превышает 1 ч. Для включения биотина в качестве метки в реакционную смесь добавляли биотинилированный дезоксиу-рацилтрифосфат. Его концентрация была оптимизирована таким образом, чтобы на каждые 100 нуклеотидов амплифицируемого гена встраивалось 5-7 молекул метки. Чувствительность данного метода составляла 50 - 100 копий гена на одну ПЦР.

3. ДНК-микрочипы с колориметрической детекцией для генотипирования ТЕМ и вНУ бета-лактамаз

Целью следующего этапа работы была разработка колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования ТЕМ и ЭНУ бета-лактамаз. Генотипи-рование заключалось в определении всех однонуклеотидных замен в генах данных типов бета-лактамаз, приводящих к аминокислотным мутациям в белковых последовательностях ферментов.

Для определения ОНП генов бета-лактамаз использовался принцип аллель-специфической гибридизации на ДНК-микрочипе. Для определения одной

однонуклеотидной замены в генах использовался набор из 4-х олигонуклеотид-ных зондов с уникальной последовательностью оснований, соответствующих структуре гена ТЕМ или SHV бета-лактамаз в данном участке и отличающихся друг от друга только нуклеотидом в позиции мутации, в качестве которого использовали один из четырех нуклеотидов A, G, С или Т (рис.2а). Набор из 4-х олигонуклеотидных зондов для определения каждой мутации иммобилизовался на поверхности микрочипа в виде блока из 12 точек - каждый в трех повторах с целью повышения воспроизводимости анализа.

Определение ОНП проводили методом гибридизации меченого ПЦР-продукта, амплифицированного из контрольного или клинического штамма-продуцента бета-лактамазы, с наборами олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на микрочипе. При этом предполагалось, что наиболее стабильный ДНК-дуплекс образуется при гибридизации меченого фрагмента с полностью комплементарным зондом и, соответственно, в этом случае детектируется более высокий аналитический сигнал (Perfect Match - РМ). При образовании ДНК-дуплексов при гибридизации с остальными тремя зондами наблюдаемый сигнал (Mismatch - ММ) свидетельствует об уровне неспецифической гибридизации.

Для исследования специфичности определения нуклеотида в позиции ОНГ1 генов значения абсолютных интенсивностей сигналов переводились в относительные (рис. 26). Для этого значения абсолютных интенсивностей для каждого набора зондов нормировались на величину максимального сигнала, которому соответствовало положение РМ. Таким образом получали гибридизаци-онные сигналы в относительных единицах: сигнал комплементарной гибриди-

Аммнокиспшйая последовательность

ТЕМ-П ..RLDSWEP-

ТЕМ-1 ...RLDSWEP-

«г

Нуютеотидная последовательность

CGC СТТ GAG AgT TGG GAA CCG СОС СТТ GAG CGT TGC GAA CCG | CGC СТТ GAG СОТ TGG САД CCG СОС СТТ GAG TGT TGG GAA CCG

ООО ООО ООО ООО

ф ф «

•рм ■мм 'мм 'мм

Г"

I»

Рис. 2. а. Принцип определения ОНП генов бета-лактамаз методом аллель-специфической гибридизации на ДНК-микрочипе. б. Изображение фрагмента микрочипа для определения одной позиции ОНП и принцип количественной обработки результатов.

зации становился равным L, а три остальных сигнала некомплементарной гибридизации выражались в долях от него:

Мрм ~ 1рм/1рм = 1, ымм = imm^ipm-

где !рМ - интенсивность сигнала гибридизации с полностью комплементарным олигонуклеотидным зондом, 1ММ - интенсивность сигнала гибридизации с остальными тремя олигонуклеотидами, RÍPM - доля комплементарной гибридизации, RI^M - доля некомплементарной (неспецифической) гибридизации. Определение нуклеотида в позиции ОНП считалось специфичным в том случае, если значения всех R¡mm для данного набора не превышали 0.6.

ДНК микрочип для генотипирования ТЕМ бета-лактамаз содержал 164 олигонуклеотидных зонда для определения 41 позиции ОНП генов, кодирующих данный тип ферментов; ДНК микрочип для генотипирования SHV бета-лактамаз содержал 150 олигонуклеотидных зондов для определения 35 позиции ОНП генов. Нуклеотидные последовательности данных зондов были разработаны в Институте технической биохимии, Штутгарт, Германия для микрочипов с флуоресцентной детекцией (Grimm, 2004; Grimm, 2006). Расположение наборов олигонуклеотидных зондов на соответствующих ДНК-микрочипах приведено на рис. 3. Каждый набор зондов нумеровался по номеру аминокислотной мутации, которая является результатом определяемой однонуклеотидной замены в генах. Для некоторых аминокислотных мутаций кодирующие триплеты а. б.

1.« T_ts Т_37 1 I tt I Й1 1 61} Т 7! К' К* S_lí SJ» s М 43 4ft se*

! i! «в® " S , «««««•««« Ч "

• n e r »«Oír ввв »

.•••••••»••••>» « « «■« ев» «

»«ees ÍISS" г г'ввв •

NT T T 1 .* 14 T I T IN fan ^ N M«HH H t- HH

til t » - 1g2 1 111 t_1í2 to! t t 143 s.«í s» t 105 3 1,3 si» s.123 i.a

p. " asee«« " » p "

>«tH*Mie un*»» « '.в •«•»«■ •••>» -

íp >• в*® (р«»и»в -

» 11 H i « 4 И U

pttttpptttfp pm rtlhpphwhhp

т 151 т 1SI т i»?т т ic:г i «.1 т !ш т ш т is; í.,t¡ sjís s_«s s_iw s.m s_ití.i

«•••••* Ht* - • „ • ••« «

P ввв.'р вв» p '»»O pp

к ••• »« «««v » »««»»в «I.

»•• s 5 в«M S s »» , „ S

t 1*4.1 i i».i i гог T íií '^ftn гиг т :ss i т гзе.г ^TJ 5 -s* 9 1 Г.: ъ_ил s,iie s.2« s.ite

s " s s s s в®* ь s • '

« « « *■» ít»»»» «

" " * ' К H WMH ним

t ..t 1 t mi i IJK т,:я т_г«4 r>i т гп j-¿?1 s.rnwo

p • p »©в в«*" ''

в«»«»»-« ®#в « ; ;

N NN И Я "

f т т т т * р т т т т р р и р Р н ^ «

N к N N к f!a ^ v "

р Положительный контроль гибридизации Т Групп-специфический контроль ТЕМ в Контроль иммобилизации N Отрицательный контроль гибридизации н Групп-специфический контроль ЭН\/ ф РМ для гена ТЕМ-1 и вН\Л1

Рис. 3. Расположение наборов олигонуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе для генотипирования ТЕМ (а) и 8НУ (б) бета-лактамаз.

содержали по две однонуклеотидные замены, в этом случае для их определения использовалось по два набора зондов. Для позиций аминокислот 238/240 ЯНУ бета-лактамаз, расположенных рядом и имеющих по несколько замен в каждой, использовался набор из 9 зондов, названных но аминокислотам в данных позициях и последнему нуклеотиду в кодоне аминокислоты 240. Помимо специфических олигонуклеотидных зондов каждый микрочип содержал 4 типа контрольных зонда: контроль иммобилизации (олигонуклеотид, меченный биотипом), положительный контроль гибридизации (олигонуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна меченному биотипом олигонук-леотиду, добавляемому к гибридизационной смеси), отрицательный контроль гибридизации (олигонуклеотид со случайной последовательностью оснований), а также контроль всего процесса анализа, в качестве которого использовались олигонуклеотиды, комплементарные консервативным участкам генов ТЕМ и БНУ бета-лактамаз.

Для выполнения достоверного и специфичного определения всех позиций ОНП генов ТЕМ и БНУ бета-лактамаз проводили оптимизацию температуры и времени гибридизации, состава гибридизационного буфера, количества и размера фрагментов меченой ДНК. На рис. 4 приводятся значения относительных интенсивностей гибридизационных сигналов, полученных при гибридизации 200 нг меченной биотипом ДНК, амплифицированной из контрольного штамма-продуцента бета-лактамазы ТЕМ-1, со всеми наборами олигонуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией в оптимизированных условиях (температура гибридизации 45°С, гибридизационный буфер содержал 0,3 М ЫаС1 и 0,2% ББв, время гибридизации -2ч при интенсивном перемешивании). В данных условиях во всех позициях ОНП нуклеотид определялся правильно и специфично.

Для сравнения специфичности выявления однонуклеотидных замен в ДНК, меченой биотипом и флуорецентной меткой СуЗ, исследовали распределение значений Шмм для всех наборов зондов (таблица 2). Обобщая данные по генотипированию ТЕМ и ЭНУ бета-лактамаз на колориметрических микрочипах, было установлено, что более 60% ММ-зотщов характеризовались значениями Ымм, не превышающих 0,1, значения Шмм для остальных зондов варьировали от 0,1 до 0,6. В случае флуоресцентной детекции специфичность выявления ОНП была ниже: для большинства ММ-зондов значения Шмм находились в диапазоне 0,1 — 0,6. И для 2-х наборов зондов для ТЕМ- и 1 набора для 8НУ бета-лактамаз Шмм превышали 0,6, что делало невозможным достоверное определение типа нуклеотида в данных позициях ОНП. Таким образом, была продемонстрирована более высокая специфичность определения ОНП методом гибридизационного анализа с использованием биотина в качестве метки ДНК и последующей колориметрической детекцией по сравнению с гибридизацион-ным анализом с использованием флуоресцентного красителя СуЗ.

и а

те

□ с

□ т

Рис. 4. Профили относительных интенсивностей гибридизационных сигналов, полученные при гибридизации 200 нг меченой биотином ДНК, амплифицкрованной из контрольного штамма-продуцента бета-лактамазы ТЕМ-), на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией.

Таблица 2.

Специфичность выявления ОНИ генов ТЕМ н 511У бета-лактамаз на ДНК-мнкрочнпах с колориметрической и флуоресцентной детекцией

Ммм Доля ММ зондов с заданным значением ШМм (%)

Колориметрическая детекция Флуоресцентная детекция

ТЕМ Б11У ТЕМ вНУ

<0,1 63,2 71,5 28,7 49,1

0,1-0,6 36,8 28,5 67,8 50,0

>0,6 0,0 0,0 2,6 0,9

4. ДНК-микрочип для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз

Целью следующего этапа работы была разработка ДНК-микрочипа для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз, включающая проведение молекулярного дизайна олигонуклеотидных зондов.

Сложность молекулярного дизайна зондов для мультинараметрического анализа генов состоит в необходимости подбора олигонуклеотидов, которые будут эффективно и специфично гибридизоваться с меченой ДНК-мишенью в одинаковых гибридизационных условиях. В литературе описаны основные правила дизайна олигонуклеотидных зондов для определения ОНП генов (ВоскозБу, 2003). Основным правилом является расположение мутации в центральной части зонда, так как именно эта позиция обеспечивает максимальную дискриминацию между различными аллелями. Также оптимальным является выполнение следующих условий: длина олигонуклеотида должна составлять 17-24 оснований; различия в температурах плавления зондов (Тт) для разных групп олигонуклеотидов не должны превышать 5°С; ОС-состав должен находиться в диапазоне 35 -70 %; вероятность образования вторичных структур должна быть минимальной.

Основываясь на данных правилах, был проведен молекулярный дизайн зондов для определения 19 позиций ОНП генов бета-лактамаз подгруппы СТХ-М-1. Полученные значения абсолютных интенсивностей для РМ-зондов варьировали от 10000 до 60000 и для всех наборов зондов превышали интенсивность фона более чем в 3 раза. Однако специфичность выявления правильного нук-леотида в позиции ОНП для большинства наборов была крайне низкой: для 11 из 19 позиций ОНП относительные интенсивности хотя бы одного ММ-зонда внутри каждого набора превышали 0,6. Поэтому проведение генотипирования СТХ-М бета-лактамаз с данным набором зондов было невозможно. Таким образом, необходимо было разработать подходы к повышению специфичности определения однонуклеотидных замен в генах.

Было установлено, что наиболее частой причиной неспецифического определения мутаций в генах СТХ-М бета-лактамаз являлось наличие в структуре

зондов от 1 до 3 ОС-повторов длиной 4 и более нуклеотидов. В этом случае для повышения специфичности было предложено вводить в зонды дополнительные искусственные замены. Замены вводили непосредственно в ОС-повторы, в большинстве случаев гуанин заменяли на аденин. Максимальная дестабилизация ДНК-дуплексов наблюдалась при введении замены в центральную часть зонда на расстоянии 3-4 основания от позиции истинной мутации. Количество введенных замен, в основном, соответствовало количеству ОС-повторов (от 1 до 3). При этом при каждой искусственной замене нуклеотида необходимо было дополнительно удлинять зонд на 1 - 3 нуклеотида для сохранения значений Тщ,рм в заданном диапазоне.

В качестве примера на рис. 5 приводятся профили относительных интен-сивностей сигналов, полученных при гибридизации гена бета-лактамазы СТХ-М-3 с исходными (Дизайн 1) и модифицированными (Дизайн 2) вариантами зондов. Для всех наборов зондов, содержащих ОС-повторы, данным способом удалось значительно повысить дискриминирующую способность наборов зондов и значения Шмм всех ММ-зондов в результате не превышали 0,2.

Для наборов зондов, в последовательностях которых отсутствовали ОС-повторы, но наблюдалась низкая специфичность выявления однонуклеотидных замен дизайн зондов был проведен по прямой и обратной цепям гена. Было установлено, что разница температур плавления совершенных и несовершенных ДНК-дуплексов различается при дизайне зондов по прямой и обратной цепи. Так при дизайне зондов для позиции ОНП 167 по прямой цепи ДТт составляла 3,1°С, при дизайне по обратной цепи - 8,2°С (рис. 6). При гибридизации с геном бета-лактамазы СТХ-М-3 новый набор олигонуклеотидных зондов показал лучшую дискриминирующую способность - максимальные значения Юмм в наборах зондах не превышали 0,1. Таким образом, при молекулярном дизайне олигонуклеотидных зондов для определения ОНП генов необходимо рассчитывать ДТт для зондов как по кодирующей, так и некодирующей цепи гена, и использовать в анализе те зонды, для которых значение ДТт больше.

Отдельно был проведен дизайн олигонуклеотидных зондов, предназначенных для определения позиций ОНП, расположенных на концах гена. Если определяемая мутация в позиции ОНП располагается на 3'-конце гена и попадает в область отжига обратного праймера, все синтезируемые в ПЦР обратные цепи гена не будут содержать данную мутацию. Нуклеотидная замена будет содержаться только в амплифицируемых прямых цепях гена и для ее правильного выявления молекулярный дизайн зондов должен быть сделан по обратной (некодирующей) цепи. Для определения позиций ОНП, расположенных в начале гена и попадающих в область отжига прямого праймера, наблюдается обратная ситуация, и дизайн олигонуклеотидных зондов необходимо проводить по прямой (кодирующей) ДНК цепи.

а. ОНП С1_.?5

МААСТТСССОААГГАОдеШ « ААААСТТСССО<ЗАТТАОАЗСС 8 ААМСТТаССОСАТТАОАаСС § ААААСТТаСССТАТТАЗАвСС

I "

~ ААМСТТАСССААПАСАСОЗ * АЛААСТТАСС<35АТТА0А<30в I ААААСIIАССОС АТТАО АбОЗ с* ААААСТТАССОТАТТАОАОСС

1.00 | оло

I О.«0

МО

0.20

0.00

Дизайн 1

Дизайн 2

6. ОНП С! 23

ж Ч

вТЙССОСТОААТОСОСА ещсазсг«зодтосвСА отессостосАтососА бтвссвстетАтесссА

1 " I

АОТОССАСТОААГОСАСАААС АСТСССАСТООАТССАСАААС АеТОССАСТОСАТССАСАААС АОТЗССАСТЗТАТССАСАААС

» * * * * *

Г*

3 «де

£ £

ода

ДДОЗЙИ1

Дизайн 2

Б. ОНП С1_77

ТСАТв-ОССЗАШССЗШС

1 твдтзвссооасссвсш

8 ТбАТСвСССССОССвОЗЗ

§ тсАтеосозтвешзсз©

1 "I I

£ вТеАТ6АССвАОЙССАОЗ-ЗТ5

* «тедтайссшзАссАСООте I 6Т9АТ®АСОЗСЗАССАСвОТЗ а вТЗАТЗАССвТвАССАШОТб

♦ • « » » «.

♦ » с

1,00 Г ' ' 1

2 ®.« ' И {" .....|

ж § г.ад • Н 1 в

£ II |[

| 0,40

2 3.20 | £ ] X 0,00 ] ; |

кл

вй ОС

О!

Дизайн 1

Дизайн 2

Рис. 5. Результаты гибридизации меченого гена бета-лактамазы СТХ-М-3 с наборами олигонуклеотидных зондов для определения ОНП в позициях: а. С135; б. б. С1_23; в. С1_77 (до и после введения искусственных замен в последовательности зондов).

Основываясь на выявленных закономерностях, был выполнен дизайн наборов олигонуклеотидных зондов для определения 67 позиций ОНП генов всех подгрупп бета-лактамаз СТХ-М типа. Данные наборы зондов использовали для создания ДНК-микрочипа для генотипирования бета-лактамаз данного типа. Расположение специфических олигонуклеотдных зондов на поверхности микрочипа представлено на рис. 7. Олигонуклеотидный микрочип для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз содержал 4 набора олигонуклеотидных зондов для

идентификации подгруппы СТХ-М бета-лактамаз, 19 наборов зондов для определения позиций ОНП генов бета-лактамаз подгруппы СТХ-М-1, 15 наборов

С1_167_прямая цепь С1_167_о5рагиая цепь

ассстасссазасоассттаа ттаассзтсвастссвтасест

асс6тасссасассассттаа—> СТХ-М-3 (Тт мм ) ттаасстсс2стссстасзст

АСССТАССЗАССССАССТТАА -^ СТХ-М-3 (Тт,РИ ) ТТААСвТСОССТаЗвТАСССТ

ассстасссаотсоасвттаа ттаасвтсстстсостассст

ДТт = 3,1 °С = Тт.рм - Тга.нм ДТт = 8,23С

Рис. 6. Результаты гибридизации меченого гена бета-лактамазы СТХ-М-3 с набором олигонуклеотидных зондов для определения ОНП в позиции С1_167 (дизайн наборов олигонуклеотидных зондов проведен по прямой и обратной цепи).

>СТХ-М-Э (Т^да, )

>стх-м-з (Т,^!

зондов - для подгруппы СТХ-М-2, 9 наборов зондов — для подгруппы СТХ-М-8 и 20 наборов зондов - для подгруппы СТХ-М-9. Всего на микрочипе были иммобилизованы 264 специфических олигонуклеотидных зонда (1056 точек), при этом площадь микрочипа составляла около 1 см2. Проверку эффективности и специфичности работы олигонуклеотидных зондов проводили при гибридизации микрочипов с 8 контрольными штаммами энтеробактерий, продуцирующих следующие бета-лактамазы: СТХ-М-3, СТХ-М-15 и СТХ-М-42 из подгруппы СТХ-М-1, СТХ-М-2 и СТХ-М-5 из подгруппы СТХ-М-2, СТХ-М 9 и СТХ-М-14 из подгруппы СТХ-М-9, а также СТХ-М-8. В качестве условий для гибридизации были выбраны условия, оптимизированные ранее для проведения генотинирования ТЕМ и БНУ бета-лактамаз на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией. Изображение колориметрического микрочипа и профили относительных интенсивностей сигналов после гибридизации с амплифициро-ванным геном бета-лактамазы СТХ-М-3 представлены на рис. 76 и рис. 8 соответственно. Нуклеотиды во всех исследуемых позициях ОНП определялись правильно и однозначно, так как максимальные значения Мммдля всех наборов зондов не превышали 0,6.

1 сг.гвз са_г»в св.гвз

«ва

м с с с

С1.3П С1_Г5 С1_7?

в*®'

Сг_4в С2..о1а С2_Ы1>

<,?.39 с г.*?' сгм19э сг т

С?.225 С2,230 С2_2«Э С2_2'-5

••• . . Р Р .

'8 : '"'.•■ •' $ Г

С» 106 С1 114 С> 119 С1 140 сг 274л С2 2Г4ЬС5 273

е«в»в» " ' - 5 5 , "

р- .... V" •" ■ ■ Р ■ ■. :

« • ••

Р .С с С с р р С с с

67 С1_236 С 1.240 СЗ_Г СЬ_21 С

.«■"■*> I, М

-•»•»С» •

м--. ............. : ■ :г* N

ввв N

■Р

да_м Св_?*й С8_77(> си_139

9_52 С9_77 СЗ_С1

Контроль иммобилизации р Положительный контроль гибридизации;

Отрицательный контроль гибридизации ¡с- Групп-специфический контроль СТХ-М 9 РМдлв гена СТХ-М-3 ММ для гена СТХ-М-3

Рис. 7. а. Расположение олигонуклеотидных зондов на поверхности ДНК-микрочипа для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз. б. Изображение микрочипа после гибридизации с меченой ДНК, амплифицированной из контрольного штамма-продуцента бета-лактамазы СТХ-М-3.

Оценку дискриминирующей способности олигонуклеотидных зондов проводили по значениям относительных интенсивностей гибридизационных сигналов. В таблице 3 представлено распределение полученных значений относительных интенсивностей Ымм? полученных при гибридизации микрочипов с меченой ДНК, амплифицированной из контрольных штаммов микроорганизмов, продуцирующих бета-лактамазы СТХ-М-3, СТХ-М-2, СТХ-М-8 и СТХ-М-9. Большинство ММ-зондов для каждой подгруппы ферментов показывали значения Ымм меньше 0,1, что соответствует высокой дискриминирующей способности. Для остальных ММ-зондов значения Юмм варьировали в диапазоне от 0,1 до 0,6, что также удовлетворяет введенному критерию правильного определения нуклеотида в позиции ОНП.

Позиция ОНП

Рис. 8. Профили относительных интенсивностей гибридизационных сигналов, полученных при гибридизации меченой ДНК, амплифицированной из контрольного штамма-продуцента бета-лактамазы СТХ-М-3.

Таблица 3.

Специфичность выявления однокуклеотидного полиморфизма генов СТХ-М бета-лактамаз на ДНК-микрочипе

К1мм Доля ММ зондов с заданным значением ШМм (%)

СТХ-М-1 СТХ-М-2 СТХ-М-8 СТХ-М-9

<0,1 73,7 68,9 63,0 66,7

0,1-0,6 26,3 31,1 37,0 33,3

>0,6 0,0 0,0 0,0 0,0

Разработанный ДНК-микрочип был апробирован с использованием 90 клинических штаммах энтеробактерий из различных регионов России, продуцирующих СТХ-М бета-лактамазы. У 84% штаммов выявлено наличие генов ферментов, принадлежащих к подгруппе СТХ-М-1. Также были выявлены гены ферментов, принадлежащих к подгруппе СТХ-М-2 (4%) и СТХ-М-9 (12%). Результаты генотипирования СТХ-М бета-лактамаз на ДНК-микрочипе были подтверждены стандартным методом ДНК-секвенирования, при этом наблюдалось соответствие для 94 из 97 протестированных образцов (96,9%).

5. Интегрированный ДНК-микрочип для диагностики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз

Информация о точном генотипе продуцируемой микроорганизмом бета-лактамазы, которую получают на генотипирующих микрочипах, необходима для проведения масштабных эпидемиологических исследований, однако она часто избыточна для диагностики антибиотикорезистентности в клинических лабораториях. Целью подобной диагностики в первую очередь является выбор

лекарственного препарата для эффективной антибиотикотерапии. В этом случае важно знать не генотип продуцируемой микроорганизмом бета-лактамазы, а субстратную специфичность фермента.

Данный раздел посвящен разработке интегрированного олигонуклеотид-ного микрочипа для одновременной диагностики бета-лактамаз ТЕМ, 8! IV и СТХ-М типов, проявляющих расширенный спектр субстратной специфичности и/или являющихся устойчивыми к действию ингибиторов сериновых бета-лактамаз.

Согласно литературным данным [], внутри каждого типа ферментов имеется ограниченное число аминокислотных мутаций, влияющих на спектр их субстратной специфичности. Для бета-лактамаз ТЕМ типа установлено, что мутации Е104К, I* 1648/Н/С, 02388/0, Е240К значительно расширяют спектр субстратной специфичности в отношении цефалоспоринов II - IV поколений, особенно цефтазидима, а мутации М69ШУ, 81300, 11244СЛУ8/Н/170, Н275Ь/0/'А, N2760 приводят к возникновению устойчивости ферментов к ингибиторам сериновых бета-лактамаз. Для бета-лактамаз 8НУ-типа мутации В179А/Ы/0, 02388/А, Е240К расширяют спектр субстратной специфичности, а М691, 81300, К234Я вызывают устойчивость ферментов к ингибиторам. Все СТХ-М бета-лактамазы являются БЛРС и характеризуются тем, что проявляют значительно более высокую активность в отношении цефотаксима и цефтриак-сона по сравнению с цефтазидимом. Однако в последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что продуценты СТХ-М бета-лактамаз могут проявлять высокую устойчивость к цефтазидиму в результате аминокислотных мутации Р167Т/8 и 02400 внутри всех подгрупп данных ферментов. Таким образом, определение типов генов и вышеперечисленных аминокислотных замен позволяет диагностировать продукцию микроорганизмами 95,6% типов известных БЛРС класса А, 97,8% ИРТ бета-лактамаз и 100% бета-лактамаз смешанного типа (проявляют как расширенный спектр активности, так и устойчивость к ингибиторам).

Для изготовления микрочипа для диагностики продукции микроорганизмами БЛРС и ИРТ бета-лактамаз молекулярного класса А использовались два типа олигонуклеотидных зондов: групп(подгрупп)-специфические олигонукле-отидные зонды для идентификации типа гена бета-лактамазы, а также олиго-нуклеотидные зонды для определения ключевых мутаций внутри каждой группы бета-лактамаз. Дизайн гругш(подгруш)-специфических зондов осуществлялся на основе консервативных участков генов всех ферментов, принадлежащих к каждой группе. Для детекции нуклеотидных замен в генах, приводящих к определяемым аминокислотным мутациям, создавались наборы зондов, содержащие от 2 до 7 олигонуклеотидов. Последовательность одного из данных олигонуктеотидов соответствовала нуклеотидной последовательности фермен-

та «дикого типа» (WT - wild type), являющегося родоначальником каждой группы/подгруппы бета-лактамаз (ТЕМИ, SHV-1, СТХ-М-1, СТХ-М-2, СТХ-М-8, СТХ-М-9). Остальные олигонуклеотиды в наборах (один или несколько) были комплементарны участкам генов, кодирующих мутантные по данной позиции формы ферментов (МТ - mutant type). В связи с близким расположением мутаций в позициях 275, 276 ТЕМ бета-лактамаз, а также 238,240 SHV бета-лактамаз, для их определения использовались единые наборы зондов -'Г 275/276 и S_238/240, соответственно. Для изготовления микрочипа в качестве носителя использовали отрицательно-заряженный найлон. На микрочипе площадью около 1 см2 в виде трех блоков (для ТЕМ, SHV и СТХ-М) были иммобилизованы 75 олигонуклеотидных зондов: 7 зондов для идентификации групп/подгрупп ферментов и 68 зондов для определения 8 мутаций в ТЕМ, 7 мутаций в SHV, 2 мутаций в СТХ-М-1, 5 мутаций в СТХ-М-2 и 3 мутаций в СТХ-М-9 бета-лактамазах. Каждый олигонуклеотид наносился на микрочип в 3-х повторах. Расположение олигонуклеотидных зондов на поверхности микро-

ф Контроль иммобилизации

# Положительный контроль гибридизации Отрицательный контроль гибридизации

Ь; Зоиды для идентификации типа [\-ла»гтамазы

Зонды для определения мутации аЬ/зТЕМ ' Зонды для определения мутаций в Ыз5Ш

• Зонды для определения мутаций в ЫзСТХ-М

Рис. 9. Расположение олионуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе для диагностики БЛРС и ИРТ бета-лактамаз молекулярного класса А.

К преимуществам интегрированного микрочипа можно отнести успешную идентификацию смеси генотипов, принадлежащих не только к разным типам генов, но и смеси двух генов, принадлежащих к одному генетическому типу. На рис. 10 приведены результаты тестирования 2-х штаммов Е. coli, один из которых продуцирует только пенициллиназы ТЕМ-1 и SHV-1, а другой - смесь пенициллиназ ТЕМ-1 и SHV-1 и двух БЛРС (SHV-12 и СТХ-М-15). Обе смеси ферментов достоверно определялись на микрочипе. Сравнение профилей гиб-

чипа представлено на рис. 9.

/ Хаи Tj-fspu ■;

:' О".... J

в <r

ф & -

ЯПГМй h mji

а 245

япг щ

* # f

: »CT»-«

Гв i i !0..CTX*

I: : . i V ü » %

Г'Г."

*' 'A» «к

. # А * f »

■ 10 C»Jv« ::

• * •

я ■о

■-<

а s н

¡3

Eî

a u X Si

sr g

Ol V

s S

i-l tri

i! S 2

СЛ S Ж-ч

ti - a Ol и о

а ■о

о £

X -¡

а а -i

Í3

и я

ir,

X <

to s П

i—3

X с > >—:

S §

о ш

« * è> * ? ♦ # # . &

• * 4* s # -t Ф # % i #

* ** f « % * i» * *

$ ? » « it # ä* * s

* « # « ** « ¿5: * Ф

• * * Г- # # ## Ф # # f- S

# ? « # i

t S' # $

4 '* « « :

* » « *

# •fe * * •

fr S * # # •

Интенсивность, отн. ед.

о о о а

.ь s

и g

ш s g

» S

w Я

пЗ "a

И о

Т 69

Т 104

TJ30

Т 164

Т 238

Т 240

Т 275/276

S 89

S 130

S_179

S 234

S 2381240

C1_167

C1 240

■ 0 в s i □ ■ 3 3 3 3 3 3 s

Л 31 А и M j

* » *» ». » * * • * • *

« ♦ ® Ф * Ш Ф

» «•*»-»*««

I ♦ •

« »*•»•»•«

» » S«»*»«

* # * S> # •

• •*•»• •

« » « « * * ♦♦

1П1

Интенсивность, чтн. ед. о о о о о -».

а о н а я о в

3 3 3 3 3 3g

г1 I-1 г1 f I-4 5

О) Ol ^ W M -i

ридизации показывает появление двух сигналов комплементарной гибридизации в позиции 8_23 8/240 вНУ бета-лактамаз, что свидетельствует о продукции как фермента дикого типа 8НУ-1, так и бета-лактамазы 8НУ-12, имеющей мутацию в данной позиции. Наличие гибридизационных сигналов для зондов, идентифицирующих гены ферментов подгруппы СТХ-М-1 и мутации в них, подтвердили продукцию фермента СТХ-М-15 во втором образце.

Разработанный ДНК-микрочип бы апробирован с использованием 100 клинических штаммов микроорганизмов семейства ЕШегоЬаЫепасеае, выделенных в различных лечебных учреждениях РФ. Все образцы были предварительно охарактеризованы феиотипически с использованием диско-диффузионного метода: 10 из них являлись БЛРС(-) и 90 - БЛРС(+). По данным гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах среди БЛРС(-) штаммов продукции бета-лактамаз ТЕМ, вНУ или СТХ-М типов либо обнаружено не было, либо продуцировались только пенициллиназы ТЕМ-1 и 8НУ-1 типов. У всех штаммом с фенотипом БЛРС(+) были обнаружены гены БЛРС: 62% штаммов продуцировали бета-лактамазы подгрупп СТХ-М-1, -2 и -9,13% БЛРС типа БНУ и у 24,6% исследуемых штаммов была выявлена одновременная продукция двух БЛРС. Таким образом, апробация интегрированного микрочипа не выявила ни ложноположительных, ни ложноотрицательных результатов в сравнении с данными фенотипических тестов.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированы условия проведения гибридизационного анализа биотини-лированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией. Предел обнаружения биотинилированных олигонуклсотидов составил 0,025±0,005 нМ на микрочипах из стекла и 0,04±0,01 нМ на мембранных микрочипах. Показано, что специфичность выявления однонуклеотидного полиморфизма генов бета-лактамаз методом гибридизационного анализа ДНК с использованием биотина в качестве метки выше, чем специфичность гибридизационного анализа с использованием флуоресцентной метки СуЗ.

2. Разработан метод мультиплексной ПЦР для совместной амплификации полноразмерных генов ТЕМ, БНУ и СТХ-М бета-лактамаз с одновременным введением биотина в качестве метки. Метод позволяет определять 50 -100 копий гена в одной реакции.

3. Исследовано влияние структурных параметров олигонуклеотидных зондов на специфичность и чувствительность выявления однонуклеотидного поли-

морфизми генов методом гибриднзационного анализа на ДНК-микрочипах. Предложены способы проведения молекулярного дизайна олигонуклеотид-ных зондов для анализа однонуклеотидного полиморфизма генов.

4. Разработан ДНК-микрочип для генотипирования бета-лактамаз СТХ-М типа на основе определения 67 позиций ОНП кодирующих их генов. Апробация экспериментальной серии ДНК-микрочипов на 97 клинических штаммах семейства Enterobacteriaceae показала 96% совпадение с результатами ДНК-Секвенирования.

5. На основе совместного использования олигонуклеотидных зондов для идентификации трех типов бета-лактамаз (ТЕМ, SHV, СТХ-М) и зондов для определения ключевых мутаций в каждом из указанных типов генов разработан интегрированный ДНК-микрочип для диагностики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз. Проведена апробация микрочипа на 100 клинических образцах Enterobacteriaceae, установлена хорошая корреляция полученных результатов с данными феноти-пических тестов.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Уляшова М.М., Рубцова М.Ю., Бахманн Т., Егоров А.М. Оптимизация гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией на основе пероксидазы хрена. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 2008, т. 49, № 2, с. 96-102.

2. Уляшова М.М., Рябова Ю.Ю., Рубцова М.Ю., Егоров А.М. ДНК-микрочипы на пористых мембранных носителях с колориметрической детекцией. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 2010, т. 51, № 3, с. 235-240.

3. Rubtsova M.Yu., Ulyashova М.М., Edelstein M.V., Egorov А.М. Oligonucieo-tide microarrays with horseradish peroxidase-based detection for the identification of extended-spectmm beta-lactamases. Biosens. Bioelectron., 2010, v. 26, 4, p. 1252-1260.

4. Рубцова М.Ю., Уляшова M.M., Бахман T.T., Шмид Р.Д., Егоров А.М. Мультипараметрическое определение генов и точечных мутаций в них для идентификации бета-лактамаз. Успехи биологической химии, 2010, т. 50, с. 303-348.

5. Рубцова М.Ю., Уляшова М. М., Халилова Ю. И., Егоров А. М. Олигонук-леотидные микрочипы для определения генетических детерминант резистентности микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам. Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с междуна-

родным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 24-26 ноября 2010, т.4, стр. 344-347.

6. Ulyashova М.М., Rubtsova M.Yu., Bachmann Т., Egorov A.M. Optimization of hybridization analysis on oligonucleotide-based DNA-microarray with colo-rimetric detection. Abstracts of International conference "Biocatalysis-2007: structure, functions, applications", Moscow - St. Petersburg, Russia, June 17-22, 2007, p. 134.

7. Rubtsova M., Ulyashova M., Ignatenko O., Edelstein M., Egorov A., Schmid R., Bachmann T. Genotyping of CTX-M extended spectrum beta-lactamases with DNA microarrays. Abstracts of 8th International Meeting on Microbial Epidemiological Markers, Zakopane, Poland, May 14-17,2008, p. 56.

8. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. Detection of SNPs in genes of extended-spectrum beta-lactamases with DNA-microarrays. Proceedings of the Fifth International Congress "Biotechnology - State of the Art and Prospects of Development", Moscow, Russia, March 16-20, 2009, part 1, p. 219-220.

9. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. DNA microarrays with HRP-based detection for identification of extended-spectrum beta-lactamases. Proceedings of International conference "Biocatalysis-2009: fundamentals & applications", Arkhangelsk, Russia, June 19-24,2009, p. 57.

10. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. The development of DNA-microarray technology for diagnostics of resistance against beta-lactam antibiotics among Enterobacteriaceae. Proceedings of the Second International Forum «Rusnanotech 2009», Moscow, Russia, October 6-8 октября, 2009, p. 181-182.

11. Уляшова M.M., Рубцова М.Ю., Халилова ЮЛ., Эйделынтейн М.В., Александрова И.А., Егоров A.M. ДНК-микрочип для диагностика устойчивости грамотрицательпых бактерий к бета-лактамиым антибиоткам, вызванной продукцией наиболее распространенных бета-лактамаз. Сборник тезисов XII международного конгресса по антимикробной терапии МАК-MAX/ESCMID, Москва, Россия, 18-20 мая, 2010, с. 51.

12. Rubtsova M.Yu., Ulyashova М.М., Egorov A.M. Oligonucleotide microarrays with horseradish peroxidase based detection for the identification of extended spectrum beta-lactamases. Abstracts of 20th Anniversary World Congress on Biosensors, Glasgow, UK, May 26-28,2010, p. 3.1.049.

13. Ulyashova M,M., Halilova Yu., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. Membrane DNA microarrays for the rapid diagnostics of clinically significant beta-lactamases. Proceedings of the Third International Forum «Rusnanotech 2010», Moscow, Russia, October 6-8.

14. Рубцова М.Ю., Уляшова M. M., Халилова Ю. И., Егоров А. М. ДНК-микрочипы с колориметрической детекцией для диагностики устойчивости микроорганизмов к' бета-лактамным антибиотикам. Материалы первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 1719 ноября 2010 г., стр.71.

Подписано в печать:

07.02.2011

Заказ № 4961 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Уляшова, Мария Морисовна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К БЕТА-ЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ.

1.1. Бета-лактамные антибиотики.В

1.2. Основные механизмы устойчивости микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам.

1.3. Классификация бета-лактамаз.

1.4. Разнообразие основных типов бета-лактамаз расширенного спектра класса А.

1.5. Распространенность бета-лактамаз расширенного спектра класса А.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ТИПИРОВАНИЯ БЕТА-ЛАКТАМАЗ.

2.1, Фенотипические методы.

2.2. Генотипические методы.

ГЛАВА 3. ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ДНК-МИКРОЧИПАХ.

3.1. Технологии изготовления ДНК-микрочипов.

3.2. Методы амплификации и включения метки в ДНК, используемые в технологии микрочипов.

3.3. Параметры, влияющие на гибридизацию на ДНК-микрочипах.

3.4. Детекция результатов гибридизации на ДНК-микрочипах.

ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА НА ДНК-^МИКРОЧИПАХ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БЕТА-ЛАКТАМАЗ.

4.1. Микрочипы для идентификации генов бета-лактамаз.

4.2. Микрочипы для определения однонуклеотидного полиморфизма генов бета-лактамаз.

4.3. ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз расширенного спектра.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.1. Реагенты и оборудование.

5.2. Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 6. МЕТОД ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА НА ДНК-МИКРОЧИПАХ С КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ.

6.1. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности стекла.

6.2. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности мембранных носителей.

6.3. Выбор параметров печати микрочипов на стекле и мембранных носителях.

6.4. Оптимизация условий колориметрической детекции биотинилированной ДНК на поверхности микрочипов.

ГЛАВА 7. АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОВ ТЕМ, 8НУ И СТХ-М БЕТА-ЛАКТАМАЗ С ОДНОВРЕМЕННЫМ ВКЛЮЧЕНИЕМ МЕТКИ.

7.1. Он гимизация выделения бактериальной ДНК.

7.2. Выбор праймеров для амплификации полноразмерных генов ТЕМ, 8НУ и СТХ-М бета-лактамаз.

7.3. Ошимизация температуры отжига праймеров для амплификации генов бета-лактамаз ТЕМ, БНУ и СТХ-М типов.

7.4. Введение биотина в качестве метки в гены амплифицируемых бета-лактамаз в процессе мультиплексной ПЦР.

7.5. Мультиплексная ПЦР для амплификации генов бета-лактамаз ТЕМ, БНУ и СТХ-М типов.

ГЛАВА 8. ДНК-МИКРОЧИПЫ С КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ТЕМ И 8НУ БЕТА-ЛАКТАМАЗ.

8.1. ДНК-микрочип с колориметрической детекцией для геногипирования ТЕМ бета-лаю амаз .;.

8.2. ДНК-микрочип с колориметрической детекцией для генотипиования БНУ бета-лактамаз.

ГЛАВА 9. ДНК-МИКРОЧИП ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ СТХ-М БЕТА-ЛАКГАМАЗ.

9.1. Анализ аминокислотных и кодирующих последовательностей СТХ-М бета-лактамаз.

9.2. Молекулярный дизайн олигонуклеотидных зондов для определения однонуклеотидного полиморфизма генов СТХ-М бета-лактамаз.

9.3. Генотипирование СТХ-М бета-лактамаз на ДНК-микрочипе.

9.4. Апробация ДНК-микрочипа для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз при тестировании клинических штаммах микроорганизмов семейства Еп(егоЬас(ег1асеае.

ГЛАВА 10. ИНТЕГРИРОВАННЫЙ ДНК-МИКРОЧИП ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БЕТА-ЛАКТАМАЗ РАСШИРЕННОГО СПЕКТРА И ИНГИБИТОР-РЕЗИСТЕНТНЫХ

БЕТА-ЛАКТАМАЗ.

9.1. Ключевые аминокислотные мутации в ТЕМ, 1V и С'ГХ-М бета-лактамазах.

9.2. Молекулярный дизайн зондов.

9.3. Диагностика ТЕМ, БНУ и СТХ-М бета-лактамаз и ключевых мутаций в них на интегрированном ДНК-микрочипе.

9.5. Апробация олигонуклеотидного микрочипа на клинических штаммах микроорганизмов семейства Еп1егоЬас1ег1асеае.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А"

Микроорганизмы семейства Enterobacteriacea являются одними из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний, включая госпитальные инфекции. Для их лечения в качестве антибактериальных средств обычно применяются бста-лактамные антибио гики, которые в настоящее время составляют более половины всех используемых в мире антибактериальных препаратов. Однако -'"'все чаще встречаются случаи клинической неэффективности лекарственной терапии данным классом антибиотиков вследствие развития устойчивости микроорганизмов к их действию. Известно несколько механизмов резистентности микроорганизмов к 6e'i а-лактамным антибиотикам, однако основным из них является ферментативный гидролиз антибиотиков бета-лактамазами. Бета-лактамазы представляют собой суперсемейство генетически и функционально различных ферментов, которые объединяет способность разрушать бета-лакчамное кольцо, в результате чего антибиотик теряет свою антимикробную активность. В настоящее время внимание исследователей в большей степени привлечено к изучению 3-х основных групп бе-та-лактамаз молекулярного класса Л - ТЕМ, SHV и СТХ-М. В каждой из этих ^Fpynn бета-лактамазы отличаются от основного фермента данной группы единичными аминокислотными заменами, которые расширяют спектр их ферментативной активности или приводят к возникновению устойчивости к ингибиторам. Большинство ТЕМ, SITV и СТХ-М беш-лактамаз являются бета-лактамазами расширенного спектра (БИРС), способными расщеплять не только антибиотики ненидиллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и антибиотики, принадлежащие к III и IV поколениям цефалоспоринов. Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих ферменюв среди возбудителей инфекционных заболеваний человека приняло угрожающий характер. Особенно быстро растет число внутрибольничных инфекций, вызываемых патогенами, которые являются устойчивыми к современным антибиотикам. В отдельных лечебных учреждениях РФ частота продукции БЛРС среди некоторых микроорганизмов превышает 90%.

Многообразие бета-лактамаз молекулярного класса А и их широкое распространение диктует необходимость иметь методы точной и быстрой идентификации ферментов данного типа. Традиционные фенотипические методы достаточно трудоемки и длительны по времени и, кроме того, эффективность выявления БИРС с их помощью остается крайне низкой. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является сейчас наиболее популярной для выявления генов БЛРС. однако положительный результат ПЦР-амплификации генов не всегда является достаточным для определения субтипа фермента и предполагает дальнейшее исследование генов с целью выявления возможных мутаций, определяющих расширенный спектр активности. Перспективным методом определения как с точки зрения времени получения результата анализа, так и его информативности являются методы генотипирования на ДНК-микрочинах. Данная технология имеет значительные преимущества перед традиционными методами, т.к. позволяет проводить многопараметрический анализ, "а также миниатюризировать исследуемый образец, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения.

Целью данной работы является разработка колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А на основе определения одпонуклеотидного полиморфизма кодирующих их генов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Уляшова, Мария Морисовна

выводы

1. Оптимизированы условия проведения гибридизационного анализа биотинили-рованной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией. Предел обна

-- ружения биотинилированных олигонуклеотидов составил 0,025±0,005 нМ на микрочипах из стекла и 0,04±0,01 нМ на мембранных микрочипах. Показано, что специфичность выявления однонуклеотидного полиморфизма генов бета-лактамаз методом гибридизационного анализа ДНК с использованием биотина в качестве метки выше, чем специфичность гибридизационного анализа с использованием флуоресцентной метки СуЗ.

2. Разработан метод мультиплексной ПНР для совместной амплификации полноразмерных генов ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз с одновременным введением биотина в качестве метки. Метод позволяет определять 50 — 100 копий гена в одной реакции.

3. Исследовано влияние структурных параметров олигонуклеотидных зондов на . специфичность и чувствительность выявления однонуклеотидного полиморфизма генов методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах. Предложены способы проведения молекулярного дизайна олигонуклеотидных зондов для анализа однонуклеотидного полиморфизма генов.

4. Разработан ДНК-микрочип для генотипирования бета-лактамаз СТХ-М типа па основе определения 67 позиций ОНП кодирующих их генов. Апробация экспериментальной серии ДНК-микрочипов на 97 клинических штаммах семейства Enterobacteriaceae показала 96% совпадение с результатами ДНК-секвенирования.

5. На основе совместного использования 'олигонуклеотидных зондов для идентификации трех типов бета-лактамаз (ТЕМ, SHV, СТХ-М) и зондов для определения ключевых мутаций в каждом из указанных типов генов разработан интегрированный ДНК-микрочип для диагностики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз. Проведена апробация микрочина на 100 клинических образцах Enterobacteriaceae, установлена хорошая корреляция полученных результатов с данными фенотипических тестов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Уляшова, Мария Морисовна, Москва

1. Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a pénicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae // British Journal of Experimental Pathology. 1929. -V. 10.-P. 226-236.

2. Chain E., Florey H.W., Adelaide M.B., el al. Penicillin as a chemotherapeutic agent. 1940 // Clin Orthop Relat Res. 1993. - V. 295. - P. 3-7.

3. Elks J. Cephalosporins under development // Drugs. 1987. - V. 34 - P. 247-252.

4. Rolinson G.N. Forty years of beta-lactam research // J Antimicrob Chemother. 1998. - V. 41. -No. 6. -P. 589-603.

5. Fisher J.F., M crouch S.O., Mobashery S. Bacterial resistance to beta-lactam antibiotics: compelling opportunism, compelling opportunity // Chem Rev. 2005. - V. 105. - No. 2. - P. 395-424.

6. Poirel L., Naas T., Nordmann P. Genetic support of extended-spectrum beta-lactamases // Clin Microbiol Infect. -2008. V. 14-P. 75-81.

7. Weldhagen G.F. Intégrons and beta-lactamases a novel perspective on resistance // Int J Antimicrob Agents. - 2004. - V. 23. - No. 6. - P. 556-562.

8. Chambers H.F. Methicillin resistance in Staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications//Clin Microbiol Rev. 1997.-V. 10.-No. 4.-P. 781-791.

9. James P.A., Reeves D.S. Bacterial resistance to cephalosporins as a function of outer membrane permeability and access to their target // J Chemother. 1996. - V. 8 - P. 37-47.

10. Jacoby G.A., Mills D.M., Chow N. Role of beta-lactamases and porins in resistance to erta-penem and other beta-lactams in Klebsiella pneumoniae // Antimicrob Agents Chemother. — 2004. V. 48. - No. 8. - P. 3203-3206.

11. Héritier C., Poirel L., Lambert T., Nordmann P. Contribution of acquit ed carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii // Antimicrob Agents Chemother. 2005. - V. 49. - No. 8. - P. 3198-3202.

12. Ziha-Zarifi I., Lianes С., Kohlcr T., et al. In vivo emergence of multidrug-resistant mutants of ^-Pseudomonas aeruginosa overexpressing the active efflux system MexA-MexB-OprM // Antimicrpb Agents Chemother. 1999. -V. 43. - No. 2. - P. 287-291.

13. Livermore D.M. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance // Clin Microbiol Rev. -1995. V. 8. - No. 4. - P. 557-584.

14. Bush K. The evolution of beta-lactamases // Ciba Found Symp. 1997. - V. 207. - P. 152163.

15. Livermore D.M., Pearson A. Antibiotic resistance: location, location, location // Clin Microbiol Infect. 2007. - V. - P. 7-16.

16. Harada S., Ishii Y., Yamaguchi K. Extended-spectrum beta-lactamases: implications for the clinical laboratory and therapy // Korean J Lab Med. 2008. - V. 28. - No. 6. - P. 401 -412.

17. Woodford N., Ellington M.J. The emergence of antibiotic resistance by mutation // Clin Microbiol Infect. -2007. V. 13.-No. 1.-P. 5-18.

18. Massova I., Mobashery S. Kinship and diversification of bacterial penicillin-binding proteins and beta-lactamases // Antimicrob Agents Chemother. 1998. - V. 42. - No. 1. - P. 1-17.

19. Березняков И.Г. Ингибиторозащищенные цефалоспорнны: перспективы клинического применения. // Медицина неотложных состояний. 2006. — V. 6. - Р. 1 - 5.

20. Березин А.Г., Ромашов О.М., Яковлев С.В., Сидоренко С.В. Характеристика и клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра // Антибиотки и химиотерапия. -2003.-V. 48.-Р. 5-13.

21. Fleming Р.С., Goldner М., Glass D.G. Observations on the nature, distribution, and significance of cephalosporinasc//Lancet. 1963. - V. l.-P. 1399-1401.

22. Richmond M.H., Sykes R.B. The beta-lactamases of gram-negative bacteria and their possible physiological role//Adv Microb Physiol. 1973.-V. 9.-No.-P. 31-88.

23. Sykes R.B., Matthew M. The beta-lactamases of gram-negative bacteria and their role in resistance to beta-Iactam antibiotics // J Antimicrob Chemother. 1976. - V. 2. - No. 2. - P. 115157.

24. Ambler R.P. The structure of beta-lactamases // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1980. -V. 289.-No. 1036.-P. 321-331.

25. Bush K., Jacoby G.A. Updated functional classification of beta-lactamases // Antimicrob Agents Chemother. 2010. - V. 54. - No. 3. - P. 969-976.

26. Bebrone C. Metallo-beta-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily // Biochem Pharmacol. 2007. - V. 74. - No. 12. - P. 1686-1701.

27. Bradford P.A. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat // Clin Microbiol Rev. 2001. - V. 14.-No. 4.-P. 933-951.

28. Pitout J.D. Multiresistant Enterobacteriaceae: new threat of an old problem // Expert Rev Anti Infect Ther. 2008. - V. 6. - No. 5. - P. 657-669.

29. DattaN., Kontomichalou P. Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae // Nature. 1965. - V. 208. - P. 239-241.

30. Du Bois S.K., Marriott M.S., Amyes S.G. ТЕМ- and SHV-derived extended-spectrum beta-lactamases: relationship between selection, structure and function // J Antimicrob Chemother. -1995,-V. 35.-No. l.-P. 7-22.

31. Chen S.T., Clowes R.C. Variations between the nucleotide sequences of Tnl, Tn2,'and Tn3 and expression of beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli // J Bacterid. 1987,-V. 169. - No. 2. — P. 913-916.

32. Wu P.J., Shannon K., Phillips I. Mechanisms of hyperproduction of ТЕМ-1 beta-lactamase by clinical isolates of Escherichia coli // J Antimicrob Chemother. 1995. - V. 36. - No. 6. - P. 927-939.

33. Chaibi E.B., Sirot D., Paul G., Labia R. Inhibitor-resistant ТЕМ beta-lactamases: phenotypic, genetic and biochemical characteristics // J Antimicrob Chemother. 1999. - V. 43. - No. 4. - P. 447-458.

34. Huletsky A., Couture F., Levesque R.C. Nucleotide sequence and phylogeny of SHV-2 beta-lactamase // Antimicrob Agents Chemother. 1990. - V. 34. - No. 9. - P. 1725-1732.

35. Kuzin A.P., Nukaga M., Nukaga Y., el al. Structure of the SHV-1 beta-lactamase // Biochemistry. 1999. - V. 38. - No. 18. - P. 5720-5727.

36. Knothe H., Shah P., Krcmery V., et al. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefa-mandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens // Infection. 1983. - V. 11.-No. 6.-P. 315-317.

37. Bonnet R. Growing group of extended-spectrum beta-lactamascs: the CTX-M enzymes // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - V. 48.-No. l.-P. 1-14.

38. Nordmann P., Lartigue M.F., Poirel L. Beta-lactam induction of ISEcpIB-mediated mobilization of the naturally occurring bla(CTX-M) beta-lactamase gene of Kluyvera ascorbata // FEMS Microbiol Lett. 2008. - V. 288. - No. 2. - P. 247-249.

39. Tzouvelekis L.S., Tzelepi E., Tassios P.T., Legakis N.J. CTX-M-type beta-lactamascs: an emerging group of extended-spectrum enzymes // Int J Antimicrob Agents. 2000. - V. 14. — No. 2.-P. 137-142.

40. Humeniuk C., Arlet G., Gautier V., et al. Beta-lactamases of Kluyvera ascorbata, probable progenitors of some plasmid-encoded CTX-M types // Antimicrob Agents Chemother. 2002.y^V. 46. No. 9. - P. 3045-3049.

41. Canton R., Novais A., Valverde A., el al. Prevalence and spread of extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe // Clin Microbiol Infect. 2008. - V. 14 - P. 144-153.

42. Livermore D.M., Canton R., Gniadkowski M., et al. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe // J Antimicrob Chemother. 2007. - V. 59. - No. 2. - P. 165-174.

43. Bush K. Extended-spectrum beta-lactamases in North America, 1987-2006 // Clin Microbiol Infect. -2008. V. 14 Suppl l.-No.-P. 134-143.

44. Quinteros M., Radice M., Gardella N., et al. Extended-spectrum beta-lactamases in enterobacteriaceae in Buenos Aires, Argentina, public hospitals // Antimicrob Agents Chemother. -2003. V. 47. - No. 9. - P. 2864-2867.

45. Mulvey M.R., Soule G., Boyd D., et al. Characterization of the first extended-spectrum beta-^^-fectamase-producing Salmonella isolate identified in Canada // J Clin Microbiol. 2003. - V. 41.-No. 1.-P. 460-462.

46. Yu Y., Ji S., Chen Y., et al. Resistance of strains producing extended-spectrum beta-lactamases and genotype distribution in China // J Infect. 2007. - V. 54. - No. 1. - P. 53-57.

47. Hawkey P.M. Prevalence and clonality of extended-spectrum beta-lactamases in Asia// Clin Microbiol Infect. -2008. V. 14-P. 159-165.

48. Schlesinger J., Navon-Venezia S., Chmelnitsky I., et al. Extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacter isolates obtained in Tel Aviv, Israel // Antimicrob Agents Chemother.2005.-V. 49.-No. 3.-P. 1150-1156.

49. Livermore D.M., Hawkey P.M. CTX-M: changing the face of ESBLs in the UK // J Antimicrob Chemother. -2005,- V. 56.-No. 3.-P. 451-454.

50. Lartigue M.F., Zinsius C., Wenger A., et al. Extended-spectrum beta-lactamases of the CTX-M type now in Switzerland // Antimicrob Agents Chemother. 2007. - V. 51. - No. 8. - P. 28552860.

51. Pagani L., Dell'Amico E., Migliavacca R., et al. Multiple CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases in nosocomial isolates of Enterobacteriaceae from a hospital in northern Italy // JjElin Microbiol. 2003. - V. 41. - No. 9. - P. 4264-4269.

52. Canton R., Coque T.M. The CTX-M beta-lactamase pandemic // Curr Opin Microbiol.2006. V. 9. - No. 5. - P. 466-475.

53. Empel J., Baraniak A., Literacka E., et al. Molecular survey of beta-lactamases conferring resistance to newer beta-lactams in Enterobacteriaceae isolates from Polish hospitals // Antimicrob Agents Chemother. 2008. - V. 52. - No. 7. - P. 2449-2454.

54. Kim S., Hu J., Gautom R., et al. CTX-M extended-spectrum beta-lactamases, Washington State // Em erg Infect Dis. 2007. - V. 13.-No. 3.-P. 513-514.

55. Meszaros А.Т., Strenkoski L.F., Firstenberg-Eden R. New options for nitrocefin-based beta-lactamase testing // Am Clin Lab. 1995.-V. 14.-No. 2.-P. 20-22.

56. Payne D.J., Farmer Т.Н. Biochemical and enzime kinetic applications for the characterization of beta-Iactamases. // Book. / Humana Press. 1998. - P. 513-535.

57. Mathew A., Harris A.M., Marshall M.J., Ross G.W. The use of analytical isoelectric focusing for detection and identification of beta-lactamases// J Gen Microbiol. 1975. - V. 88. - No. 1. -P. 169-178.

58. Arstila Т., Jacoby G.A., Huovinen P. Evaluation of five different methods to prepare bacterial extracts for the identification of beta-lactamases by isoelectric focusing // J Antimicrob Chemother. 1993. - V. 32.-No. 6.-P. 809-816.

59. Семина C.B., Сидоренко С.В., Резван С.П. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. - V. 6. - Р. 306-359.

60. Sanders С.С., Barry A.L., Washington J.A., et al. Detection of extended-spectrum-beta-Iactamase-producing members of the family Enterobacteriaceae with Vitek ESBL test // J Clin Microbiol. 1996.-V. 34.-No. 12. - P. 2997-3001.

61. V. 40. No. 10. - P. 3703-3711.

62. Tseng C.Y., Liu P.Y., Wu W.L., et al. Comparison of detection of extended-spectrum beta-lactamases by agar dilution method, E-test ESBL screen and double disk test // J Microbiol Immunol Infect. 1998. - V. 31. - No. 2. - P. 90-94.

63. Страчунский Jl.C. Бета-лактамазы расширенного спектра быстро растущая и плохо .^-"бсознаваемая угроза // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.2005.-V. 7.-No. 1.-Р. 92-96.

64. Эйдельштейн М.В. Выявление бет-лактамаз расширенного спектра у грамотрицагель-пых бактерий с помощью фенотипичсских методов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - V. 3. - No. 2. - Р. 183-189.

65. Cormican M.G., Marshall S.A., Jones R.N. Detection of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing strains by the Etest ESBL screen // J Clin Microbiol. 1996. - V. 34. - No. 8. -P. 1880-1884.

66. Paniara, Platsouka E., Dimopoulou II., eta/. Diversity ofbeta-lactam resistance levels among related Klebsiella pneumoniae strains isolated in an intensive care unit // J Chemother. 2000. -V. 12.-No. 3.-P. 204-207.

67. Pitout J.D., Laupland K.B. Extended-spectium beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae: an emerging public-health concern // Lancet Infect Dis. -2008. V. 8. - No. 3. - P. 159-166.

68. Robbcrts F.J., Kohner P.C., Patel R. Unreliable extended-spectrum beta-lactamase detection in the presence of plasmid-mediated AmpC in Escherichia coli clinical isolates // J Clin Microbiol. 2009. - V. 47. - No. 2. - P. 358-361.

69. Cockerill F.R., 3rd Genetic methods for assessing antimicrobial resistance // Antimicrob Agents Chemother. 1999. - V. 43.-No. 2. - P. 199-212.

70. Tenover F.C., Huang M.B., Rashced J.K., Persing D.H. Development of PCR assays to detect ampicillin resistance genes in cerebrospinal fluid samples containing Haemophilus influenzae // J Clin Microbiol. 1994.-V. 32.-No. 11.-P. 2729-2737.

71. Monstein H.-J., Ostholm-Balkhed A., Nilsson M.V., et al. Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM and blaCTX-M genes in Enterobacteriaceae. // APMIS. -2007.-V. 115,- P. 1400-1408.

72. Woodford N., Fagan E.J., Ellington M.J. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding CTX-M extended-spectrum beta-lactamases. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy.2006.-V. 57.-No. l.-P. 154-155.

73. Xu L., Ensor V., Gossain S., et al. Rapid and simple detection of blaCTX-M genes by multiplex PCR assay. // Journal of Medical Microbiology. 2005. - V. 54. - No. l.-P. 1183-1187.

74. Birkett C.I., Ludlam H.A., Woodford N., et al. Real-time TaqMan PCR for rapid detection and typing of genes encoding CTX-M extended-spectrum beta-lactamases // J Med Microbiol.2007. V. 56. - No. 1. - P. 52-55.

75. Randegger C.C., Hachler H. Real-time PCR and melting curve analysis for reliable and rapid detection of SI IV extended-spectrum beta-lactamases // Antimicrob Agents Chemother. 2001. -V. 45.-No. 6.-P. 1730-1736.

76. Nikulin A., Alexeev Y., Edelstcin M. A single-tube real-time PCR and melting-curve analysis for dctcction and characterisation of TEM-type extended-spectrum p-lactamases // Int. J. Antimicrob. Agents. 2007. - V. 29. - No. 2. - P. 222.

77. Stcpanova M., Nikulin A., Sukhorukova M., et al. II Abstracts of 17th European Congress Clin. Microbiol, and Infect. Dis./25th Int. Congress Chemother. March 31 - April 3, 2007. Munich, Germany. P. 1732.

78. Arlet G., Brami G., Deere D., et al. Molecular characterisation by PCR-restriction fragment length polymorphism of TEM beta-lactamases // FEMS Microbiol Lett. 1995. - V. 134. - P. 203-208.

79. Xu L., Evans J., Ling T., et al. Rapid genotyping of CTX-M extended-spectrum bcta-Iactamases by denaturing high-performance liauid chromatography // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2007. - V. 51. - No. 4. - P. 1446-1454.

80. Naas T., Oxacelay C., Nordmann P. Identification of CTX-M-Type extended-spectrum beta--^Tactamase genes using real-time PCR and pyrosequencing // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2007. - V. 51. - No. 1. - P. 223-230.

81. Poirel L., Naas T., Nordmann P. Pyrosequencing as a rapid tool for identification of GES-type extended-spectrum beta-lactamases // J Clin Microbiol. 2006. - V. 44. - No. 8. - P. 30083011.

82. Southern E.M., Maskos U., Elder J.K. Analyzing and comparing nucleic acid sequences by hybridization to arrays of oligonucleotides: evaluation using experimental models // Genomics. -1992.-V. 13.-No. 4.-P. 1008-1017.

83. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis//J Mol Biol. 1975. - V. 98.-No. 3.-P. 503-517.

84. Mullis K.B. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction // Ann Biol Clin (Paris). 1990. - V. 48. - No. 8. - P. 579-582.

85. T07. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray // Science. 1995. - V. 270. - P. 467-470.

86. Sassolas A., Leca-Bouvier B.D., Blum L.J. DNA biosensors and microarrays // Chem Rev. -2008. — V. 108. No. l.-P. 109-139.

87. Ehrenreich A. DNA microarray technology for the microbiologist: an overview // Appl Microbiol Biotechnol. 2006. - V. 73. - No. 2. - P. 255-273.

88. Perreten V., Vorlet-Fawer L., Slickers P., et al Microarray-based detection of 90 antibiotic resistance genes of gram-positive bacteria // Journal of clinical microbiology. 2005. - V. 43. -No. 5.-P. 2291-2302.

89. Van Hal N.L., Vorst O., van Houwelingen A.M., et al. The application of DNA microarrays in gene expression analysis //J Biotechnol. -2000. V. 78. - No. 3. - P. 271-280.

90. Kolchinsky A., Mirzabekov A. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips // 11 urn Mutat. 2002. - V. 19. - No. 4. - P. 343-360.

91. Dufva M. Fabrication of high quality microarrays // Biomol Eng. 2005. - V. 22. - No. 5-6. -P. 173-184.

92. McGall G.H., Barone A.D., Diggelmann M., et al. The efficicncy of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 5081-5090.

93. Singh-Gasson S., Green R.D., Yue Y., et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array // Nat Biotechnol. 1999. - V. 17. - No. 10. - P. 974-978.

94. Del Campo A., Bruce I.J. Substrate patterning and activation strategics for DNA chip fabrication // Top Curr. Chem. 2005. - V. 260. - P. 77-111.

95. Fixe F., Dufva M., Telleman P., Christensen C.B. Functionalization of poly(methyl metha-crylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. -No. 1. - P. e9.

96. Bertucci F., Bernard K., Loriod B., et al. Sensitivity issues in DNA array-based expression measurements and performance of nylon microarrays for small samples // Hum Mol Genet.1999.-V. 8.-No. 9.-P. 1715-1722.

97. T21. Moorcroft M.J., Meuleman W.R., Latham S.G., et al. In situ oligonucleotide synthesis on paly(dimethylsiloxane): a flexible substrate for microarray fabrication // Nucleic Acids Res. -2005.-V. 33.-No. 8.-P. e75.

98. Zammatteo N., Jeanmart L., Hamels S., et al. Comparison between different strategies of covalent attachment of DNA to glass surfaces to build DNA microarrays // Anal Biochem.2000,-V. 280.-No. l.-P. 143-150.

99. Sakata T., Maruyama S., Ueda A., et al. Stable immobilization of an oligonucleotide probe on a gold substrate using tripodal thiol derivatives // Langmuir. 2007. - V. 23. — No. 5. — P. 2269-2272.

100. Hackler L., Jr., Dorman G., Kele Z., et al. Development of chemically modified glass surfaces for nucleic acid, protein and small molecule microarrays // Mol Divers. 2003. — V. 7. -No. l.-P. 25-36.

101. Preininger C., Bodrossy L., Sauer U., et al. ARChip Epoxy and ARChip UV for covalent on-chip immobilization of pmoA gene-speciWc oligonucleotides // Analytical Biochemistry. -2004,-V. 330.-P. 29-36.

102. Heise C., Bier F.F. Immobilization of DNA on Microarrays // Top Cuit. Chem. 2006. - V. ^261.- P. 1-25.

103. Rubina A.Y., Pan'kov S.V., Dementieva E.I., et al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production // Anal Biochem. 2004. - V. 325. -No. l.-P. 92-106.

104. Wei Q., Liu S., Huang J., et al. Comparison of hybridization behavior between double and single strands of targets and the application of asymmetric PCR targets in cDNA microarray // J Biochem Mol Biol. 2004. - V. 37. - No. 4. - P. 439-444.

105. Lind Т., Thorland E.C., Sommer S.S. Genomic amplification with transcript sequencing (GAWTS) // Methods Mol Biol. 1996. - V. 65. - P. 193-200.

106. T31. Grimm V., Ezaki S., Susa M., et al. Use of DNA microarrays for rapid genotyping of ТЕМ beta-lactamascs that confer resistance // Journal of clinical microbiology. 2004. - V. 42. - No. 8. - P. 3766-3774.

107. Leinberger D.M., Grimm V., Rubtsova M., et al. Integrated detection of extended-spectrum-beta-lactam resistance by DNA microarray-based genotyping of ТЕМ, SHV, and CTX-M genes // J Clin Microbiol. 2009. - V. 48. - No. 2. - P. 460-471.

108. Monecke S., Ehricht R. Rapid genotyping of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates using miniaturised oligonucleotide arrays // Clin Microbiol Infect. 2005. - V. 11.-No. 10.-P. 825-833.

109. Volokhov D., Chizhikov V., Chumakov K., Rasooly A. Microarray analysis of erythromycin resistance determinants // J Appl Microbiol. 2003. - V. 95. - No. 4. - P. 787-798.

110. Franke-Whittle I.H., Klammer S.H., Mayrhofer S., Insam H. Comparison of different labeling methods for the production of labeled target DNA for microarray hybridization // J Microbiol Methods.-2006.-V. 65.-No. l.-P. П 7-126.

111. Pinkel D., Segraves R., Sudar D., et al. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays // Nat Genet. 1998. - V. 20. - No.2.-P. 207-211.

112. Raap A.K., van der Burg M.J., Knijnenburg J., et al. Array comparative genomic hybridization with cyanin cis-platinum-labeled DNAs // Biotechniques. 2004. - V. 37. - No. l.-P. 130134.

113. He Z., Wu L., Li X., et al. Empirical establishment of oligonucleotide probe design criteria // Appl Environ Microbiol. 2005. - V. 71. - No. 7. - P. 3753-3760.

114. Suzuki S., Ono N., Furusawa C., et al. Experimental optimization of probe length to increase the sequence specificity of high-density oligonucleotide microarrays // BMC Genomics. 2007. -V. 8.-P. 373.

115. Shchepinov M.S., Case-Green S.C., Southern E.M. Steric factors influencing hybridisation of nucleic acids to oligonucleotide arrays // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - No. 6. - P. 1155-1161.

116. Peterson A.W., Ileaton R.J., Georgiadis R.M. The effect of surface probe density on DNA hybridization // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - No. 24. - P. 5163-5168.

117. Чечеткин B.P., Прокопенко Д.В., Макаров A.A., Заседателей A.C. Биочипы для медицинской диагностики // Российские нанотехнологии. -2006. V. I. — No. 2. - Р. 13-27.

118. Bilitewski U. DNA microarrays: an introduction to the technology // Methods Mol Biol. —2009.-V. 509.-P. 1-14.

119. Relögio A., Schwager С., Richter A., et al. Optimization of oligonucleotide-based DNA microarrays. // Nucleic Acids Research. 2002. - V. 30. - No. 11. - P. e51.

120. Borden J.R., Paredes C.J., Papoutsakis E.T. Diffusion, mixing, and associated dye effects in ^JDNA-microarray hybridizations // Biophys J. 2005. - V. 89. - No. 5. - P. 3277-3284.

121. Sethi A.A., Tybjaerg-Hansen A., Andersen R.V., Nordestgaard B.G. Nanogen microelectronic chip for large-scale genotyping // Clin Chem. 2004. - V. 50. - No. 2. - P. 443-446.

122. Dai H., Meyer M., Stepaniants S., et al. Use of hybridization kinetics for differentiating specific from non-specific binding to oligonucleotide microarrays //Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30.-No. 16.-P. e86.

123. Bishop J., Blair S., Chagovetz A.M. A competitive kinetic model of nucleic acid surface hybridization in the presence of point mutants // Biophys J. 2006. - V. 90. - No. 3. - P. 831-840.

124. Ilerwig R., Aanstad P.; Clark M., Lehrach H. Statistical evaluation of differential expression on cDNA nylon arrays with replicated experiments // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - No. 23.-P.clI7.

125. Hacia J.G., Brody L.C., Chee M.S., et al. Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis // Nat Genet. — 1996. V. 14.-No. 4.-P. 441-447.

126. Marras S.A. Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes // Methods Mol Biol. 2006. - V. 335. - P. 3-16.

127. Medintz I.L., Uyeda H.T., Goldman E.R., Mattoussi H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing // Nat Mater. 2005. - V. 4. - No. 6. - P. 435-446.

128. Gerion D., Chen F., Kannan B., et al. Room-temperature single-nucleotide polymorphism and multiallele DNA detection using fluorescent nanocrystals and microarrays // Anal Chem. — 2003. V. 75. - No. 18. - P. 4766-4772.

129. Ryan O., Smyth M.R., Fagain C.O. Horseradish peroxidase: the analyst's friend // Essays Biochem.- 1994. V. 28. - P: 129-146.

130. Marquette C.A., Thomas D., Degiuli A., Blum L.J. Design of luminescent biochips based on enzyme, antibody, or DNA composite layers // Anal Bioanal Chem. 2003. - V. 377. - No. 5. -P. 922-928.

131. Mallard F., Marchand G., Ginot F., Campagnolo R. Opto-electronic DNA chip: high performance chip reading with an all-electric interface // Biosens Bioelectron. 2005. - V. 20. - No. 9. - P. 1813-1820.

132. Li W., Zhao B., Jin Y., Ruan K. Development of a low-cost detection method for miRNA microarray // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2010. - V. 42. - No. 4. - P. 296-301.

133. Dufva M., Poulscn L. Genotyping of mutation in the beta-globin gene using DNA microarrays // Methods Mol Biol. 2009. - V. 509. - P. 47-56.

134. Marquette C.A., Blum L.J. Conducting elastomer surface texturing: a path to electrode spotting. Application to the biochip production // Biosens Bioelectron. 2004. - V. 20. - No. 2. - P. 197-203.

135. Bao Y.P., Huber M., Wei T.F., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes //Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - No. 2. - P. el5.

136. Blab G.A., Cognet L., Berciaud S., et al. Optical readout of gold nanoparticle-based DNA microarrays without silver enhancement// Biophys J. -2006. V. 90. - No. 1. - P. LI 3-15.

137. Lytton-Jean А.К., Han M.S., Mirkin C.A. Microarray detection of duplex and triplex DNA binders with DNA-modified gold nanoparticles // Anal Chem. 2007. - V. 79. - No. 15. - P. 6037-6041.

138. Tansil N.C., Gao Z. Nanoparticles in biomolecular detection //Nanotoday. -2006. V. 1. -No. I.-P. 28-37.

139. Liao J.C., Mastali M., Gau V., el al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens // J Clin Microbiol. 2006. - V. 44.-No. 2.-P. 561-570.

140. Ghindilis A.L., Smith M.W., Schwarzkopf K.R., et al. CombiMatrix oligonucleotide arrays: genotyping and gene expression assays employing electrochemical detection // Biosens Bioelec-tron. 2007. - V. 22,- P. 1853-1860.

141. Park S.J., Taton T.A., Mirkin C.A. Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes // Science. 2002. - V. 295. - P. 1503-1506.

142. Malic L., Cui В., Veres Т., Tabrizian M. Enhanced surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization on periodic gold nanoposts // Opt Lett. 2007. - V. 32. - No. 21.1. P. 3092-3094.

143. Mannelli I., Lecerf L., Guerrouache M., et al. DNA immobilisation procedures for surface plasmon resonance imaging (SPRI) based microarray systems // Biosens Bioelectron. 2007. — V. 22.-No. 6.-P. 803-809.

144. Nelson B.P., Grimsrud Т.Е., Liles M.R., et al. Surface plasmon resonance imaging measurements of DNA and RNA hybridization adsorption onto DNA microarrays // Anal Chem. -2001.-V. 73.-No. l.-P. 1-7.

145. Kick A., Bonsch M., Katzschner В., et al. DNA microarrays for hybridization detection by surface plasmon resonance spectroscopy // Biosens Bioelectron. 2010. - V. 26 - No. 4 - P. 1543-1547.

146. Moon S., Kim D.J., Kim K., et al. Surface-enhanced plasmon resonance detection of nano-particle-conjugated DNA hybridization 11 Appl Opt. 2010. - V. 49. - No. 3. - P. 484-491.

147. Lee Y., Lee C.S., Kim Y.J., et al. Development of DNA chip for the simultaneous detection ^-of various beta-lactam antibiotic-resistant genes // Mol Cells. — 2002. V. 14. - No. 2. - P. 192197.

148. Chen S., Zhao S., McDermott P.F., et al. A DNA microarray for identification of virulence and antimicrobial resistance genes in Salmonella serovars and Escherichia coli // Mol Cell Probes. 2005. - V. 19.-No. 3.-P. 195-201.

149. Cleven B.E., Palka-Santini M., Gielen J., et al. Identification and characterization of bacterial pathogens causing bloodstream infections by DNA microarray // J Clin Microbiol. 2006. - V. 44.-No. 7.-P. 2389-2397.

150. Cassonc M., D'Andrca M.M., Iannelli F., et al. DNA microarray for detection of macrolide resistance genes // Antimicrob Agents Chemother. 2006. - V. 50. - No. 6. - P. 2038-2041.

151. Yu X., Susa M., Knabbe C., et al. Development and validation of a diagnostic DNA micro-array to detect quinolone-resistant Escherichia coli among clinical isolates // J Clin Microbiol. -2004. V. 42. - No. 9. - P. 4083-4091.

152. Strommenger B., Schmidt C., Werner G., et al. DNA microarray for the detection of therapeutically relevant antibiotic resistance determinants in clinical isolates of Staphylococcus aureus // Mol Cell Probes. 2007. - V. 21. - No. 3. - P. 161 -170.

153. Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis // Clin Microbiol Infect. 2005. - V. 11.-No. 7.-P. 531-539.

154. Ensor V.M., Livermorc D.M., Hawkey P.M. A novel reverse-line hybridization assay for identifying genotypes of CTX-M-type extendcd-spectrum bcta-lactamases. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2007. - V. 59. - No. 1. - P. 387-395.

155. Shibata N., Kurokawa H., Doi Y., et al. PCR classification of CTX-M-type bcta-lactamasc genes identified in clinically isolated gram-negative bacilli in Japan // Antimicrob Agents Chemother. 2006. - V. 50. - No. 2. - P. 791 -795.

156. Pitout J.D.D., Hamilton, Church D.L., et al. Development and clinical validation of a molecular diagnostic assay to detcct CTX-M-type bcta-lactamases in Enterobacteriaceae. // Clinical Microbiology and Infection. 2006. - V. 13. - No. 3. - P. 291-297.

157. Schmitt J., Jacobs E., Schmidt H. Molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamases in Enterobacteriaceae from patients of two hospitals in Saxony, Germany // J Med

158. Microbiol. 2007. - V. 56. - No. 2. - P. 241-249.

159. Jacoby G.A., Sutton L. Properties of plasmids responsible for production' of extended-spectrum beta-lactamases // Antimicrob Agents Chemother. 1991. - V. 35. - No. 1. - P. 164169.

160. Leflon-Guibout V., Heym B., Nicolas-Chanoine M. Updated sequence information and proposed nomenclature for bla(TEM) genes and their promoters // Antimicrob Agents Chemother. -2000. V. 44. - No. 11. - P. 3232-3234.

161. Edelstein M., Suvorov M., Edelstein I., Kozlov R. Identification of the naturally occurring '^variant genes blaTEM-ld and blaTEM-70 encoding broad-spectrum TEM-type beta-lactamases //

162. Abstracts of 10th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2000. -P. 278.

163. Randegger C.C., Keller A., Irla M., el al. Contribution of natural amino acid substitutions in SHV extended-spectrum beta-lactamases to resistance against various beta-lactams // Antimicrob Agents Chemother. 2000. - V. 44. - No. 10. - P. 2759-2763.

164. Bauernfeind A., Casellas J.M., Goldberg M., et al. A new plasmidic cefotaximase from pa--"""Tients infected with Salmonella typhimurium // Infection. 1992. - V. 20. - No. 3. - P. 158-163.

165. Sabate M., Tarrago R., Navarro F., et al. Cloning and sequence of the gene encoding a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase (CTX-M-9) from Escherichia coli in Spain // Antimicrob Agents Chemother. -2000. V. 44. - No. 7. - P. 1970-1973.

166. McKimm-Breschkin J.L. The use of tetramethylbenzidine for solid phase immunoassays // J Immunol Methods.-1990.-V. 135.-No. 1-2.-P. 277-280.

167. Yatsimirskaya E.A., Gavrilova E.M., Egorov A.M. Detection system for membrane immunoassay based on the trapping of a highly colored intermediate of the peroxidase reaction // Anal Biochem. 1993. - V. 211. - No. 2. - P. 274-278.

168. Conyers S.M., Kidwell D.A. Chromogenic substrates for horseradish peroxidase // Anal Biochem. 1991,-V. 192.-No. l.-P. 207-211.

169. Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro //Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - No. 21. - P. 6409-6412.

170. Grimm V., Susa M., Knabbe C., et al. Microarray and method for genotyping SHV beta-lactamases // Patent US 2006/0210999.

171. Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Murrell J.C., et al. Development and validation of a diagnos-•^Tic microbial microarray for methanotrophs // Environ Microbiol. 2003. - V. 5. - No. 7. - P.566.582.

172. Connors T.D., Burn T.C., VanRaay T., et al. Evaluation of DNA sequencing ambiguities using tetramethylammonium chloride hybridization conditions // Biotechniqucs. 1997. - V. 22. -No. 6.-P. 1088-1090.

173. Mir K.U., Southern E.M. Determining the influence of structure on hybridization using oligonucleotide arrays //Nat Biotechnol. 1999. - V. 17. -No. 8. - P. 788-792.

174. Guo Z., Guilfoyle R.A., Thiel A.J., et al. Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports // Nucleic Acids Res. -1994. V. 22. - No. 24. - P. 5456-5465.

175. Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., Marky L.A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. - V. 83. - No. 11. - P. 3746-3750.

176. Lee I., Dombkowski A.A., Athey B.D. Guidelines for incorporating non-perfectly matched oligonucleotides into target-specific hybridization probes for a DNA microarray // Nucleic Acids Research. 2004. - V. 32. - No. 2. - P. 681 -690.

177. Werntges H., Steger G., Riesner D., Fritz H.J. Mismatches in DNA double strands: thermos-dynamic parameters and their correlation to repair efficiencies //Nucleic Acids Res. — 1986. V.14.-No. 9.-P. 3773-3790.

178. Martinez-Martinez L. Extended-spectrum beta-lactamases and the permeability barrier // Clin Microbiol Infect. 2008. - V. 14 - P. 82-89.\ \

Информация о работе

Уляшова, Мария Морисовна
кандидата химических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы