Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium

Козырева, Варвара Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium"

На правах рукописи

005053925

КОЗЫРЕВА ВАРВАРА КОНСТАНТИНОВНА

МЕХАНИЗМЫ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ SALMONELLA ENTERICA СЕРОВАР TYPHIMURIUM

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 О KT 2012

Смоленск-2012

005053925

Работа выполнена в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Козлов Роман Сергеевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Игорь Андроникович Шагинян. заведующий лабораторией молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

доктор медицинских наук, профессор, Кветная Ася Степановна, руководитель отдела микроэкологии человека ФГБУ «Научно-исследовательский институт детских инфекций ФМБА России».

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится « 2£» октября, 2012 г. на заседании диссерта-

ционного совета Д 208.130.01 ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан « » иимя£р&- 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук, профессор

Е.В.Русакова.

Актуальность проблемы. Сальмонеллез является актуальной проблемой здравоохранения для всех стран без исключения: это миллионы случаев заражения и тысячи смертей в год по всему миру [WHO, 2005]. Клиническое проявление инфекции, вызванной нетифоидными сальмонеллами вида S. enterica подвид I, может сильно варьировать: от бессимптомного носитель-ства и нетяжелой диареи, не требующей антимикробной терапии, до тяжелой инвазивной инфекции, когда назначение антимикробных препаратов является необходимым [Darby, 2008]. Большая часть таких осложнений приходится на долю нозокомиальных инфекций [Campo, 1997; Fernandez Guerrero, 1997; Вепса, 2007]. Штаммы сальмонелл, распространяющиеся в госпитальной среде, как правило, отличаются от внебольничных изолятов множественной лекарственной устойчивостью (полирезистентностью). При этом, более чем в 80% случаев нозокомиальная форма сальмонеллеза вызвана штаммами серо-типа Typhimurium [Акимкин, 2002; Акимкин, 2010].

На фоне глобального роста резистентности S. Typhimurium к ампициллину, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу, тетрациклину, сульфаниламидам и ряду других антимикробных препаратов [Targant, 2010; dos Reis, 2011; Yu, 2011] особенно большую тревогу вызывает появление и распространение полирезистентных штаммов, устойчивых также к цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму, цефтриаксону) и фторхинолонам- препаратам выбора для лечения инвазивных сальмонеллезов [Arlet, 2006; Butaye, 2006].

До недавнего времени было несколько сообщений о распространении резистентных к цефалоспоринам S. Typhimurium в России и Беларуси. Крупные вспышки нозокомиального сальмонеллеза, вызванного полирезистентными штаммами были зарегистрированы в 1994-2003 гг. в Москве, Санкт-Петербурге, Смоленской, Минской, Гомельской, Гродненской и Витебской областях Эйдельштейном и соавт. В Гомельской области выделение цефотак-симорезистентных штаммов, продуцирующих ß-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС) СТХ-М-5, отмечалось позднее в 2007 г и было зафиксировано Тапальским и соавт. Кпональное распространение полирезистентных штаммов S. Typhimurium в разных странах и регионах мира широко описано в литературе [Butaye, 2006; Wasyl, 2006; Yu, 2011], однако, популя-ционная структура и эпидемиология нозокомиального сальмонеллеза, вызванного штаммами с множественной резистентностью, в России и соседних странах мало изучена.

Цель работы- Определить особенности молекулярной эпидемиологии и механизмы антибиотикорезистентности цефотаксимоустойчивых нозокомиальных штаммов S. Typhimurium, выделявшихся в ходе спорадических вспышек в стационарах на территории России, Беларуси и Казахстана с 1996 по 2009 гг.

Задачи исследования:

1. Оценить генетические связи между цефотаксиморезистентными нозокоми-альными штаммами S. Typhimurium, выделенными на территории Российской Федерации и сопредельных государств, с помощью методов молеку-лярно-генетического типирования (мультилокусного секвенирования-типирования (MLST), мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA) и пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE)).

2. Выявить генетические детерминанты, ответственные за формирование резистентности штаммов S. Typhimurium к ß-лактамам и хинолонам.

3. Определить локализацию генов приобретенных ß-лактамаз и их связь с мобильными генетическими элементами.

4. Исследовать штаммы S. Typhimurium на наличие фенотипа гипермутабельно-сти и оценить частоту возникновения мутаций резистентности к хинолонам.

Научная новизна. В представленной работе впервые:

1. установлена клональность цефотаксиморезистентных нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium, выделяемых на территории России, Беларуси и Казахстана, с использованием современных методов молекулярной эпидемиологии;

2. выявлены механизмы и распространение резистентности к ß-лактамам и хинолонам у штаммов, вызвавших вспышки нозокомиального сальмонел-леза в России, Беларуси и Казахстане;

3. охарактеризованы неизвестные ранее неавтоконъюгативные СТХ-М-5-кодирующие плазмиды, специфичные для описанной клональной группы S. Typhimurium.

4. показана гипермутабельность штаммов S. Typhimurium, циркулирующих в больничной среде на территории России и сопредельных государств.

Практическая значимость результатов. Результаты исследования позволили выявить клональный характер распространения нозокомиальных цефотаксиморезистентных штаммов S. Typhimurium, продуцирующих БЛРС-ферменты СТХ-М-5 типа, что позволяет сформировать рекомендации по рутинному определению чувствительности штаммов S. Typhimurium, выделяемых в стационарах, к цефалоспоринам III поколения, а также обосновать необходимость использования в практике современных генетических методов субвидового типирования для обеспечению должного контроля за распространением опасных клонов сальмонелл.

Полученные данные по распространенности и механизмам резистентности изолятов S. Typhimurium к хинолонам, а также факт выявленной гипермуга-бельносги у внутрибольничных штаммов дают возможность оптимизировать определение чувствительности S. Typhimurium к фторхинолонам и прогнозиро-

вать риск неэффективности фторхинолонов при терапии инфекций, вызванных штаммами, проявляющими фенотип гипермутабельности.

Связь работы с научными программами. Диссертация выполнена по плану НИР ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (№ гос. регистрации ВНТИЦ 01200951949).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Вспышки нозокомиального сальмонеллеза на территории России, Беларуси и Казахстана с 1996 по 2009 гг. были вызваны клонально родственными цефотаксиморезистентными штаммами S. Typhimurium.

2. Резистентность к цефалоспоринам III-IV поколений у нозокомиальных штаммов S. Typhimurium обусловлена продукцией ß-лактамазы расширенного спектра действия СТХ-М-5, ген которой находится в сцеплении с мобильным элементом ISEcpl на небольшой неконъюгативной, но мобилизи-руемой плазмиде.

3. Механизмом устойчивости нозокомиальных штаммов S. Typhimurium к хи-нолонам является возникновение мутаций области, определяющей устойчивость к хинолонам (QRDR), гена субъединицы А ДНК-гиразы (gyrA).

4. Независимое приобретение мутаций резистентности к хинолонам разными членами описанной клональной группы является следствием гипермутабельности изолятов.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты исследования внедрены в практику работы микробиологической лаборатории Федерального бюджетного учреждения здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии в Смоленской области" (г. Смоленск) в форме информационного письма «Рекомендации по эпидемиологическому типированию и определению чувствительности к цефалоспоринам III-IV поколений и хинолонам нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серо-вар Typhimurium», утвержденного в 2011 году. Выпущенное в 2012 году на основании результатов работы информационное письмо «О внедрении новых методических подходов в практику определения антибиотикочувстви-тельности и эпидемического типирования возбудителей нозокомиального сальмонеллеза Salmonella enterica серовар Typhimurium» явилось основой для внедрения соответствующих практических рекомендации в работу лабораторий антибиотикорезистентности и клинической бактериологии НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России. Также результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России и используются в программах циклов повышения квалификации врачей-бактериологов и се-

минарах для практических врачей, проводимых в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на 18-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона, 2008); Заседаниях проблемной комиссии по иммунологии, иммуноморфологии и иммунопатофизиологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Смоленск, 2008, 2012); X Международном конгрессе по антимикробной химиотерапии (Москва, 2008); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); XI Международном конгрессе MAKMAK/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2009); Республиканской конференции «Современные принципы рациональной антибиотикотерапии» (Якутск, 2009); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Межрегиональной научно-практической конференции «Современная антибиотико-терапия в клинической практике» (Саратов, 2010); XII Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2010); Региональной конференции «Современные подходы к лечению сепсиса» (Минск, 2010); III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); Конференции «Безопасность и эффективность антимикробной терапии: уроки доказательной медицины» (Санкт-Петербург, 2012); Международной научно-практической конференции «Молекулярно-генетические методы исследования в медицине и биологии» (Караганда, 2012); 52-ой Междисциплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Сан-Франциско, 2012); на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии, факультетской терапии, ЦНИЛ и НИИАХ ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Смоленск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ: 4- в зарубежной и 5- в отечественной печати (из них 2 работы опубликовано в рецензируемых ВАК журналах).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты, обсуждение), выводы, практические рекомендации и список литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 4 таблицами. Список литературы состоит из 207 источников, из них 48 отечественных и 159 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинические штаммы Salmonella Typhimurium. Первичная видовая и серологическая идентификация клинических нозокомиальных штаммов Salmonella enterica подвид enterica серовар Typhimurium проводилась в локальных микробиологических лабораториях в соответствии с принятыми стандартами. Повторно все штаммы идентифицировались в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России с помощью биохимических идентификационных систем API20E (bioMerieux) и наборов сывороток к О- и Н-антигенам Salmonella (BioRad).

Определение чувствительности к антибиотикам. Значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков были определены с помощью метода последовательных разведений в агаре Мюллера-Хинтон [CLSI, 2012] для следующих препаратов: ампициллин, амоксициллин-клавулановая кислота (2:1), азтреонам, цефотаксим, цефотаксим-клавулановая кислота (4 мг/л), цефтазидим, цефтазидим-клавулановая кислота (4 мг/л), цефепим, цефоперазон, цефоперазон-сульбактам (1:1), пиперацил-лин, пиперациллин-тазобактам (4 мг/л), гентамицин, ко-тримоксазол, имипе-нем, меропенем, эртапенем, дорипенем, налидиксовая кислота, ципрофлокса-цин (табл. 1).

Таблица 1

Критерии интерпретации чувствительности сальмонелл к антибиотикам по значению МПК.

Антибиотик Критерии интерпретации чувствительности (МПК) Организация, выпустившая рекомендации; редакция нормативного документа

«Ч» <, мг/л «Р» >, мг/л

Ампициллин 8 16 ЕиСАБТ; версия 2.0

Амоксициллин-клавулановая к-та 8/4 32/16 С!^; 2012

Пиперациллин 8 32 ЕиСАБТ; версия 2.0

Пиперациллин-тазобактам 8 32 Е11СА8Т; версия 2.0

Цефотаксим 1 4 ЕиСАБТ; версия 2.0

Цефотаксим-клавулановая к-та нет критериев интерпретации

Цефтазидим 1 | 8 | ЕиСАБТ; версия 2.0

Цефтазидим-клавулановая к-та нет критериев интерпретации

Цефепим 1 8 ЕиСАБТ; версия 2.0

Азтреонам 1 8 ЕЦСАЭТ; версия 2.0

Имипенем 2 16 ЕиСАБТ; версия 2.0

Дорипенем 1 8 ЕиСАЭТ; версия 2.0

Меропенем 2 16 ЕиСАБТ; версия 2.0

Эртапенем 0,5 2 ЕиСАБТ; версия 2.0

Гентамицин 2 8 ЕиСАБТ; версия 2.0

Ко-тримоксазол 2 8 ЕиСАБТ; версия 2.0

Налидиксовая к-та 16 32 СЬ51; 2012

Ципрофлоксацин 0,06 0,12 ЕиСАБТ; версия 2.0

Хлорамфеникол 8 16 ЕиСАБТ; версия 2.0

Тетрациклин 4 16 СЬБ!; 2012

Чувствительность к тетрациклину и хлорамфениколу была определена с помощью диск-диффузионного метода [CLSI, 2012]. Для контроля качества определения чувствительности были использованы штаммы Е. coli АТСС®25922 и Е. coli АТСС®35218.

Продукция БЛРС оценивалась с помощью фенотипических тестов, основанных на эффекте подавления активности БЛРС в отношении оксиимино-ß-лактамов в присутствии клавулановой кислоты: методом двойных дисков [CLSI, 2012], а также по снижению МПК цефотаксима или цефтазидима в присутствии клавулановой кислоты (4 мг/л) не менее чем в 8 раз. При выявлении БЛРС методом двойных дисков использовали 18-24-часовые культуры микроорганизмов, выращенные на агаризованных средах. Суспензии микроорганизмов плотностью 0,5 по стандарту МакФарланда, готовили в стерильном изотоническим растворе хлорида натрия (0,9%) и наносили плотным газоном на поверхность агара Мюллера-Хинтон (BBL). После этого на иноку-лированную поверхность агара в центр чашки помещали диск с амоксицили-ном/клавулановой кислотой (АшС 20/10 мкг), а на расстоянии 20 мм и 30 мм от него - диски с цефтазидимом (CAZ 30 мкг) и цефотаксимом (СТХ 30 мкг, BBL) (по два диска с каждым антибиотиком на разных расстояниях). Результаты теста учитывали после инкубации в течении 18-20 ч при 35°С. О продукции БЛРС судили по наличию расширения зон подавления роста между дисками с цефалоспоринами III поколения и диском, содержащим клавулано-вую кислоту.

Детекция генов ß-лактамаз и их генетического окружения. Гены ß-лактамаз, принадлежащих к группам ОХА-1, ТЕМ, SHV и СТХ-М определяли с помощью ПТТР в реальном времени с праймерами, перечисленными в таблице 2 [Mabilat, 1993; Nuesch-Inderbinen, 1997; Edelstein, 2004; Степанова, 2011].

Таблица 2

Использованные праймеры и условия амплификации

№ Наименование праймера Последовательность (5'-3') Назначение Условия амплификации

1 ТЕМ fwd gcaaatatgtatccgctcatgagacaataacc WOTEM 1)95°-15 мин 2) 35 циклов: 95°- 20 сек, 56°- 30 сек, 72°- 45 сек 3) 72°- 2 мин

2 TEMrev gacagttaccaatgcttaatca

3 SHV fwd cgccgggttattcttatttgtcgc blaSHV 1)95°-15 мин 2) 37 циклов: 95°- 30 сек, 72°- 90 сек 3) 72°- 3 мин

4 SHV rev tctttccgatgccgccgccagtca

5 OXA-1 fwd atgaaaaacacaatacatatcaac MOOXA-i 1)95°-15 мин 2) 40 циклов: 95°- 20 сек, 58°- 20 сек,72°- 30 сек 3) 72°- 3 мин

6 OXA-1 rev aaaggacattcacgcctgtg

Продолжение таблицы 2

7 CTX-M-Fext tttgcgatgtgcagtaccagtaa Ыастх-м 1)95°- 15 мин 2) 40 циклов: 95°- 15 сек, 58°-20 сек, 72°-15 сек 3) 72°- 2 мин

8 CTX-M-Rlc ccgctgccggtcttatc

9 СТХ-М( 1 -2)-RNest tgatctcaacgcgctgattta

10 CTX-M-Rext cgatatcgttggtggtgccata Генетическое окружение Wfcrx-м 1)95°- 15 мин 2) 40 циклов: 95°- 20 сек, 58°-20 сек, 72°-30 сек 3) 12°- 3 мин

11 ISEcpl-F tgtctggtataataagaatatcatc

12 ORF513 atccatcacagagtcgtctc

13 STGYRA1 tgtccgagatggcctgaagc ПЦР и секве-нирование QRDR GyrA 1)95°- 15 мин 2) 40 циклов: 95°- 20 сек, 64°- 30 сек, 72°- 60 сек 3) 72°- 3 мин

14 STGYRA12-GT cgttgatgacttccgtcaggt

15 pCTXM5-F gacacagagaagttgataggcga Типирование СТХ-М-5-кодирующих плазмид 1)95°- 15 мин 2) 30 циклов: 95°- 20 сек, 62°- 30 сек, 72°- 45 сек 3) 72°- 2 мин

16 pCTXM5-R ttccaaatagatccacggtgac

17 STTR3-F R6G R6G-ccccctaagcccgataatgg MLVA типирование 1)95°- 15 мин 2) 30 циклов: 95°- 30 сек, 63°- 30 сек, 12°- 30 сек 3)72°- 15 мин

18 STTR3-R tgacgccgttgctgaaggtaataa

19 STTR6-F FAM FAM-tcgggcatgcgttgaaa

20 STTR6-R ctggtggggaeaatgacteg

21 STTR5-F R6G R6G-atggcgaggcgagcagcagt

22 STTR5-R ggtcaggccgaatagcaesat

23 STTR9-F FAM FAM-agaggcgctgcgangacgata

24 STTR9-R cattttccacagcggcagtttttc

25 STTRIOpl-F ROX ROX-cgggcgcggctgeagtatttg

26 STTRIOpl-R gaaggggccgggcagagacagc

27 thrA seq F atcccggccgatcacatgat MLST типирование 1)95°- 15 мин 2) 40 циклов: 95°- 20 сек, 55°- 30 сек, 72°- 60 сек 3) 72°- 5 мин

28 thrA seq R ctccagcagcccctctttcag

29 aroC F cctggcacctcgcgctatac

30 aroC sR catatgcgccacaatgtgttg

31 dnaN F atgaaatttaccgttgaacgtga

32 dnaN sR ccatccaccagcttcgaggt

33 hemD Fl gaaucgttagtgagccgtctgcg

34 hemD R atcagcgaccttaatatcttscca

35 hisD sF gtcggtctgtatattcccgü

36 hisD sR ggtaatcgcatccaccaaatc

37 purE F atgtcttcccgcaataatcc

38 purE R1 cgagaacgcaaacttgcttc

39 sucA F agcaccgaagagaaacgctg

40 sucA R ggttgttgataacgatacgtac

Для выявления ассоциации генов 6/астх-м с известными мобильными элементами: ISEcpl или ISCR1 (ранее описанным как orfS13) использовали ПЦР-картирование [Edelstein, 2004]. В ПЦР смеси объемом 25 мкл стандартно использовали 0,2мМ дНТФ, 0,5 мкМ каждого праймера, 1,5мМ MgCl2, 2,5 Ед TaqF ДНК-полимеразы, 1х ПЦР-буфер (67 мМ Tris-HCl (рН=8,3), 17 мМ сульфат аммония, 0,1% Tween-20, 0,12 мг/мл БСА, 8% глицерин) (ИнтерЛаб-Сервис), 1 мкл раствора 1:1000 SYBR Green I в ДМСО (Amresco) и 2 мкл об-

разца ДНК, выделенной с помощью наборов InstaGene Matrix (Bio-Rad, США) в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводилось с помощью амплификационных праймеров, наборов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism® 310 (Applied Biosystems).

Определение мутаций в QRDR области гена gyrA. Амплификацию и прямое секвенирование внутреннего фрагмента гена gyrA проводили с помощью праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT (табл. 2) [Nakaya, 2003].

Анализ плазмнд, несущих А/«стх-м гены. Конъюгационный перенос плазмид от исследуемых штаммов в реципиентный штамм E.coli AB 1456 (RifR) [Kholodii, 2000] проводился при совместном культивировании клеток донора и реципиента в бульоне Мюллера-Хинтон с последующим рассевом на плотные среды, содержащие рифампицин (100 мг/л) в комбинации с ампициллином (100 мг/л) или цефотаксимом (1 мг/л). Эффективность конъюгации рассчитывали как отношение количества колоний трансконъюгантов на чашках с комбинацией двух антибиотиков к количеству колоний реципиента на чашках с рифампицином.

СТХ-М-кодирующие плазмиды были выделены у исследованных штаммов и их трансконъюгантов с помощью наборов Plasmid Midi Kit (QIAGEN). Полученной плазмидной ДНК был трансформирован компетентный лабораторный штамм Е. coli EPI300. Рестрикционный анализ плазмид, повторно выделенных от трансформантов, проводили с помощью эндонуклеаз Pstl (Promega) и PvuW (Amersham), которые использовали в соотношении 10 Ед на 1мкг ДНК и инкубировали 3 ч при 37°С. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически на приборе Ultraspec 3000 (Pharmacia Biotech). Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле.

Плазмиды, по одной из каждого описанного рестрикционного профиля, были выделены от трансформантов и секвенированы с помощью генетического анализатора ABI Prism® 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) и набора BigDye® Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit для Сэнгеровской реакции на базе лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" ФМБА России. Предсказание генов в последовательности отсеквенированных плазмид выполнено с помощью программного обеспечения Artemis Version 8 (Sanger Institute). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнено в программе CLC Main Workbench v 5.7.1 (CLC bio) и путем поиска гомологии BLASTN и BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

ПЦР-типирование СТХ-М-кодирующих плазмид выполнено с праймера-ми pCTXM5-F и pCTXM5-R (табл. 2), специфичными участку гипотетической открытой рамки считывания ORF-X, которая является частью консервативно-

го

го каркаса плазмид, кодирующих СТХ-М-5 БЛРС (координаты мишени для амплификации в последовательности # JX017306 в базе данных GenBank: 3393-4226пн). Реакционная ПЦР-смесь общим объемом 25мкл содержала 0,5мкМ каждого из праймеров, 1,5 Ед TaqF ДНК-полимеразы (AmpliSens), 1,5мМ MgS04, 0,2мМ каждого из дНТФ , 1мкл раствора 1:1000 SYBR Green I в ДМСО (Amresco), коммерческий 1х ПЦР-буфер (ИнтерЛабСервис) и 2мкл тотальной геномной ДНК, выделенной с помощью InstaGene Matrix (BIORAD). ПЦР реакция проводилась на термоциклере RotorGene 2000 (Corbett Research).

Типированне изолятов с помощью пульс-электрофореза макрорест-рикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE). Для анализа использовали наборы для выделения геномной ДНК GenePath Group 6 Reagent Kit (BioRad). Геномная ДНК была подвергнута рестрикции эндонуклеазой Xbal (MBI Fermentas) [Struelens, 1993]. Разделение фрагментов ДНК проводили на приборе CHEF DRIII (Bio-Rad) в 1% агарозном геле (PFGE Agarose; Bio-Rad) и lx TBE буфере (44,5 мМ Трис, 44,5 мМ борная кислота, 1 мМ ЭДТА-Ыа2) в течении 22 ч при температуре 10°С, угол 120°, градиент 6 В/см, начальное время переключения поля 2,16 сек, финальное время переключения 54,17 сек. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5мкг/мл).

Типированне изолятов с помощью мультнлокусного анализа тан-демных повторов (MLVA) выполнено с детекцией по пяти VNTR локусам (STTR3, STTR5, STTR6, STTR9, STTRlOpl) [Lindstedt, 2004] (табл. 2). Реакционная ПЦР-смесь общим объемом Юмкл содержала 0,5мкМ каждого из праймеров, 1 Ед TaqF ДНК-полимеразы (AmpliSens), 1,5мМ MgS04, 0,2мМ каждого из дНТФ, 1х ПЦР-буфер (ИнтерЛабСервис) и 1мкл тотальной геномной ДНК. Анализ соответствующих флуоресцентно-меченых ПЦР-продуктов был проведен с помощью генетического анализатора ABI Prism® 310 и программного обеспечения Peak Scanner Software v. 1.0 (Applied Biosystems). Кластерный анализ ML VA-профилей выполнен с помощью программного пакета BioNumerics Software v.6.1 (Applied Maths) с использованием алгоритма минимального остовного дерева (minimum spanning tree, MST) для категориальных значений.

Типированне изолятов с помощью мультнлокусного секвенирова-ния-типирования (MLST) проводилось по семи генам «домашнего хозяйства» {aroC, dnaN, hemD, hisD, purE, sucA, thrÄ) в соответствии с стандартной схемой MLST-типирования (http://mlst.ucc.ie1. Для амплификации и секвени-рования использовались единые праймеры (табл. 2). В состав ПЦР-смеси общим объемом 25мкл входили: 0,5мкМ каждого из праймеров, 2,5 Ед TaqF ДНК-полимеразы (AmpliSens), 1,5мМ MgS04, 0,2мМ каждого из дНТФ, 1х ПЦР-буфер (ИнтерЛабСервис) и 2мкл геномной ДНК [Harbottle, 2006]. Сек-

венирование полученных ПЦР-продуктов выполнено на генетическом анализатора ABI Prism® 310 (Applied Biosystems). Анализ последовательностей се-квенированных фрагментов и идентификация аллелей выполнен с помощью программного пакета BioNumerics Software v6.1 (Applied Maths).

Тест на мутабельность. Фенотип гипермутабельности клинических изолятов S. Typhimurium определяли с помощью скринирующего теста с диском налидиксовой кислоты (30 мкг) согласно методике предложенной Galán и соавт. [Galan, 2004], для чего суспензии тестируемых микроорганизмов в физиологическом растворе плотностью 2 по McFarland наносили с помощью тампонов на поверхность агара Мюллера-Хинтон и через 24 часа инкубирования при 35°С оценивали наличие отдельных колоний мутантов внутри зоны подавления роста налидиксовой кислоты. Частоту возникновения спонтанных мутантов, резистентных к налидиксовой кислоте, у исходно чувствительных изолятов определяли с помощью стандартного метода: суточные культуры микроорганизмов в разведении от 10"1 до 10"12 рассевали на агар с налидиксовой кислотой (32 мг/л) и без антибиотика; частоту спонтанных мутантов рассчитывали как соотношение количества колоний, выросших на чашках с налидиксовой кислотой, к количеству колоний, выросших на чашках без антибиотика. В качестве положительного и отрицательного контрольных штаммов использовали, соответственно, мутатор Е. coli GM2995 (mutDS) [Stepanova, 2008] и Е. coli АТСС®25922.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Всего исследовано 88 резистентных к цефотаксиму изолятов Salmonella enterica подвид enterica серовар Typhimurium, выделенных при вспышках и спорадических случаях нозокомиального сальмонеллеза в 15 населенных пунктах 10 регионов России, Беларуси и Казахстана в 1996-2009 гг. (табл. 3).

Таблица 3

Регион Количество изолятов Даты выделения

С.-Петербург, Россия 6 1996-1997,2003

Гомель, Беларусь 22 1997, 2006-2007

Москва, Россия 1 1998

Витебск, Беларусь 13 1999-2000

Иркутск, Россия 1 2003

Воронеж, Россия 5 2004

Ярославль, Россия 2 2004

Смоленск, Россия 26 2004, 2006, 2009

Караганда, Казахстан 9 2006-2007

Томск, Россия 3 2007-2008

Все изоляты были неповторяющимися (по одному от каждого пациента). В качестве контролен при оценке клональности в исследование были включены эпидемиологически несвязанные изоляты: цефотаксиморезистентный штамм CAS5 из Аргентины, продуцирующий БЛРС СТХ-М-2 [Bauernfeind, 1992], а также два чувствительных изолята из Смоленской и Гомельской областей, выделенные в тех же стационарах, откуда были получены резистентные штаммы S. Typhimurium, но от пациентов с внебольничной инфекцией.

Фенотипическое определение чувствительности цефотаксиморези-стентных нозокомиальных нзолятов S. Typhimurium. Результаты определения чувствительности исследованных нозокомиальных изолятов S. Typhimurium представлены в таблице 4.

Таблица 4

Чувствительность изолятов к антибиотикам_

Антибиотик МПК, мг/л Категория чувствительности

Диапазон 50% 90% Ч, изолятов (%) УР, изолятов (%) Р, изолятов (%)

Ампициллин £256 2256 2256 0 0 88 (100%)

Амоксициллин-клавулановая к-та 8-64 32 32 9(10,2%) 0 79 (89,7%)

Пиперациллин >256 2256 2256 0 0 88(100%)

Пиперациллин-тазобактам 2-2256 2256 2256 21 (23,8%) 1 (1,13%) 66 (75%)

Цефотаксим 128-2256 >256 >256 0 0 88 (100%)

Цефотаксим-клавулановая к-та 0,06-1 0,25 0,5 - . -

Цефтазидим 1-2256 8 16 2 (2,27%) 1 (1,13%) 85 (96,5%)

Цефтазидим-клавулановая к-та 0,25-1 0,5 0,5 - - -

Цефепим 8-2256 128 2256 0 0 88 (100%)

Азтреонам 8-2256 64 64 0 0 88 (100%)

Имипенем 0,06-0,5 0,25 0,25 88(100%) 0 0

Дорипенем 0,06-1 0,06 0,5 88(100%) 0 0

Меропенем 0,06-0,125 0,06 0,125 88(100%) 0 0

Эртапенем 0,06-0,5 0,06 0,06 88(100%) 0 0

Гентамицин 1-2256 16 32 11 (12,5%) 1 (1,13%) 76 (86,3%)

Ко-тримоксазол 0,125-2256 2256 2256 29 (32,9%) 0 59 (67%)

Налидиксовая к-та 4-2512 8 2512 50 (56,8%) 0 38(43,1%)

Ципрофлоксацин 0,03-0,5 0,03 0,5 51 (57,9%) 0 37 (42%)

Хлорамфеникол - - - 10(11,4%) 0 78 (88,6%)

Тетрациклин - - - 8 (9,09%) 0 80 (90,9%)

Все изоляты обладали высоким уровнем устойчивости к цефотаксиму, цефепиму и азтреонаму (МПК90 >256, >128 и >64 мг/л, соответственно) и пониженной чувствительностью к цефтазидиму (МПК90 = 16 мг/л) по сравнению с чувствительными в норме штаммами, для которых характерна МПК цефтазидима <2 мг/л.

При определении МПК и методом «двойных дисков» у всех изолятов был выявлен синергизм между оксииминоцефалоспоринами и клавулановой

кислотой, свидетельствующий о продукции БЛРС, что позволяет считать изо-ляты резистентными ко всем ЦС III-IV поколения и азтреонаму.

Устойчивость к ингибиторозащищенным пенициллинам была вариабельной: 89,7% и 75% изолятов были нечувствительны, соответственно, к амоксициллину-клавулановой кислоте и пиперациллину-тазобактаму. Все изоляты проявляли чувствительность к карбапенемам.

Ассоциированная устойчивость к одному и более He-ß-лактамным антибиотикам была отмечена у 85 (96,6%) изолятов. Резистентностью одновременно к пяти He-ß-лактамным антибиотикам обладали 22 (25%) изолята (профиль резистентности Tet-Chl-Gm-Sxt-Nal), к четырем — 44 (50%) (профили Tet-Chl-Gm-Sxt - 34 (38,6%) или Tet-Chl-Gm-Nal - 10(11,4%)), к трем препаратам - 10 (11,4%) (профили Tet-Chl-Gm- 7(8%), Tet-Chl-Nal - 2 (2,3%) или Gm-Sxt-Nal - 1(1,1%)), к двум - 7 (8%) (профили Tet-Chl — 3 (3,4%), Tet-Sxt -2 (2,3%) или Gm-Nal - 2 (2,3%)), к одному препарату (гентамицин или нали-диксовая кислота)— резистентны 2 (2,3%) изолята. Только 3 изолята (3,4%) не имели добавочной резистентности к He-ß-лактамным антибиотикам.

В соответствии с критериями CLSI устойчивость к налидиксовой кислоте была выявлена у 38 (43,1%) изолятов, большинство из которых также проявляло нечувствительность к ципрофлоксацину согласно последним рекомендациям EUCAST и CLSI 2012 года для Salmonella spp. (МПК ципрофлок-сацина >0,06 мг/л) [Leclercq, 2011; EUCAST, 2012]. Единственный изолят имел пограничные значения МПК ципрофлоксацина (МПК = 0,06 мг/л) и был формально отнесен к фторхинолоночувствительным.

Субвидовое типирование изолятов. Типирование с помощью метода PFGE было проведено для 14 изолятов, выделенных в России и Беларуси до 2003 г. Эпидемиологически несвязанный штамм S. Typhimurium из Аргентины, продуцирующий СТХ-М-2, был использован для сравнения. Метод позволил отнести российские и белорусские цефотаксиморезистентных изоляты к одному из семи макрорестрикционных профилей (А1-А7), которые проявляли выраженное сходство с различием максимум по 3 полосам (Рис. 1), что согласно критериям предложенным Tenover и соавт. [Tenover, 1997], свидетельствует об вероятной генетической родственности изолятов. Аргентинский штамм CAS5 обладал уникальным профилем (В1), который отличался от профилей А1-А7 четырьмя полосами.

i »

• • 11

t ♦

t S * к л

Рис. 1. Генетическое родство цефотаксиморезистентных штаммов 5. Typhimurium на основании сравнения профилей PFGE.

Белорусские изоляты (дорожки 1-12): 1- SE006/Vt-1358; 2 - SE007/Re-27; 3 -SE008/Vt-1603; 4 - SE009/Vt-6570; 5 - SE010/Vt-3078; 6 - SEO11 /Us-13205; 7 - SE012/Or-13935; 8 - SE013/Us-1845; 9 - SE014/Vt-14533; 10 - SE015/Vt-13526; 11 - SE019/Vt-700; 12-SE018/Us-16753;

Российские штаммы (дорожки 13-14): 13 - SE004/Sp-891; 14 - SE020/Mo-20;

Аргентинский штамм- дорожка 15 - SE021/Ar-CAS5.

М - маркер молекулярной массы бактериофаг X.

Все цефотаксиморезистентные изоляты, включая более «поздние» по времени выделения культуры из России, Беларуси и Казахстана, были также типированы с помощью мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA). MLVA типирование позволило отнести все изоляты к 17 типам. Несмотря на большое количество выявленных MLVA-типов, все цефотаксиморезистентные изоляты были отнесены к одной клональной группе в результате кластеризации MLVA профилей с использованием как алгоритма минимального остовного дерева (MST) (Рис. 2); соответствующие MLVA-профили отличались друг от друга на 1 -2 VNTR-локуса. Чувствительные к цефалоспо-ринам штаммы отличались между собой и от наиболее близких изолятов из описанной клональной группы по 3 и более VNTR-локусам.

Рис. 2. Кластеризация МЬУА-профилей на основании алгоритма Минимального остовного дерева.

Каждому МЬУА-типу соответствует круг, обозначенный буквой латинского алфавита; названия городов, где были выделены изоляты, указаны рядом с соответствующими типами. Размер круга отражает количество изолятов, принадлежащих данному МЬУА-типу. Длина и тип соединительных отрезков отражает генетическое расстояние (число отличающихся УЫТЯ локусов) между двумя ближайшими типами: короткая непрерывная линия соединяет два МЬУА-типа, отличающихся друг от друга единственным УХТЯ ло-кусом, длинная пунктирная линия соединяет двухлокусные варианты. МЬУА-типы, отличающиеся не более чем на 2 локуса, объединены в клональные группы (выделены серым фоновым цветом). Различия на 3 локуса и более на диаграмме не отражены. Круги черного цвета соответствуют изолятам, чувствительным к цефалоспоринам III поколения.

Таким образом, результаты МЬУА-типирования также подтверждают данные РРОЕ для ранее выделенных изолятов (до 2003 г) и свидетельствуют о том, что все цефотаксиморезистентные изоляты сальмонелл, выделенные на территории России, Беларуси и Казахстана в ходе вспышек нозокомиального сальмонеллеза в период с 1996 по 2009 гг., представляют одну клональную группу, и существенно отличаются по совокупности молекулярно-генетических характеристик от чувствительных штаммов 5. ТурЫтилшп, выделенных в тех же стационарах. Изоляты, принадлежащие к 7 МЬУА-типам были получены как минимум из двух разных регионов, что наглядно отражает легкость распространения клонов, принадлежащих указанной кло-нальной группе. Профиль МЬУА СТХ-М-2-продуцирующего штамма Ту-рЫтипит из Аргентины отличался от ближайшего МЬУА-типа, найденного

в Смоленске, по двум локусам, что позволяет отнести его к описанной кло-нальной группе.

MLST -типирование пяти цефотаксиморезистентных изолятов, принадлежащих к основным MLVA-типам и выделенных в разных географических районах (MLVA-тип А- Санкт-Петербург, D- Москва, К- Иркутск, L- Кара-ганда^- Гомель), показало наличие у них идентичных аллельных профилей aroC-dnaN-hemD-hisD-purE-sucA-thrA (116-7-12-9-5-9-2), определяющих принадлежность к сиквенс-типу 328 (ST328). ST328 отличается единственной мутацией в гене агоС от сиквенс-типа ST19 (10-7-12-9-5-9-2), к которому был отнесен взятый для сравнения штамм из Аргентины (MLVA-тип Т). Таким образом, MLST типирование подтвердило генетическую родственность СТХ-M-5-продуцирующих штаммов S. Typhimurium, показанную с помощью MLVA. Поскольку распространенный в России, Беларуси и Казахстане сик-венс-тип ST238 является однолокусным вариантом сиквенс-типа ST19, отдаленная родственность наших изолятов и аргентинского штамма, выявленная с помощью MLVA, также была подтверждена MLST-типированием.

Таким образом, результаты всех трех использованных нами методов генетического типирования PFGE, MLVA и MLST свидетельствуют о клональ-ном характере распространения госпитальных штаммов S. Typhimurium, резистентных к современным цефалоспоринам.

Молекулярная характеристика детерминант резистентности к Р-лактамам. У всех исследованных изолятов методом ПЦР в реальном времени и последующего секвенирования были выявлены гены ¿>/астх-м-5, кодирующему ранее описанный у S. Typhimurium вариант БЛРС - СТХ-М-5. При амплификации с праймерами к внутренним последовательностям генов tnpA ISEcpl и Ыастх-м-5, У всех изолятов был получен характерный ПЦР-фрагмент длиной около 470 пн. ПЦР тест на наличие сцепления гена Ыастх-м с \SCR1 не дал положительных результатов ни для одного из исследованных изолятов, кроме CTX-M-2-продуцирующего штамма CAS-5 из Аргентины, взятого для сравнения. Таким образом, результаты ПЦР картирования свидетельствуют о наличии характерной для ¿>/аСтх-м-5 ассоциации с инсерционной последовательностью IS Ecpl [Bradford, 1998].

ПЦР-анализ на наличие генов других распространенных р-лактамаз молекулярных классов А и D выявил присутствие Ыа^вм У 4 (4,5%) и Ыаохл-г подобных генов у 66 (75%) изолятов. Гены SHV Р-лактамаз не были обнаружены. Наличие ОХА-1-подобных Р-лактамаз, которые проявляют устойчивость к ингибированию клавулановой кислотой и тазобактамом [Livermore, 1995], коррелировало с резистентностью к пиперациллину-тазобактаму.

Анализ СТХ-М-кодирующих плазмид. При конъюгативном переносе плазмид выявлено 2 типа трансконъюгантов, отличающихся по фенотипу ре-

зистентности. Трансконъюганты первого типа были получены от большинства исследованных изолятов при культивировании на среде с рифампицином и ампициллином с высокой частотой (103-10~4) и обладали резистентностью к пенициллинам, комбинациям пенициллинов с ингибиторами и не-Р-лактамным антибиотикам, но проявляли чувствительность к оксиимино-р-лактамам. С помощью ПЦР у трансконъюгантов данного типа были выявлены только гены ОХА-1-подобных пенициллиназ.

Трансконъюганты второго типа были получены всего от двух цефотак-симорезистентных изолятов ТурЫтипит на среде, содержащей рифампи-цин и цефотаксим, с гораздо меньшей частотой (10"7-10"8). Тем не менее, перенос плазмид, обеспечивающих резистентность к цефотаксиму, при конъюгации с низкой частотой свидетельствует о возможности их ко-мобилизации другими плазмидами. Эти неавтоконъюгативные плазмиды обеспечивали резистентность только к пенициллинам и оксиимино-цефалоспоринам, связанную с наличием в их составе генов БЛРС СТХ-М-5.

Плазмиды, кодирующие СТХ-М БЛРС, были также выделены от 26 изолятов из разных стационаров и перенесены в реципиетнтый штамм Е. соН ЕР1300 с помощью трансформации. Полученные цефотаксиморезистентные трансформанты обладали единственной низкомолекулярной плазмидой (размером около 7-8 тпн на электрофорезе). Рестрик-ционный анализ плазмид, выделенных от трансформантов, показал, что все они могут быть отнесены к одному из четырех типов (Рис. 3). Наиболее распространенный рестрикционный профиль А1 был характерен для 20 изолятов, 11 из которых были выделены в стационарах Беларуси, 8 - в России и 1 — в Казахстане. Плазмиды с остальными, минорными профилями А2, АЗ и А4 отличались от А1 единичными изменениями в сайтах рестрикции. То есть, все четыре типа СТХ-М-5-кодирующих плазмид являлись сходными между собой по данным рестрикционного анализа.

Рис. 3. Рестрикционный анализ СТХ-М-5-кодирующих плазмид: А) рестрикция эндонуклеа-зой Р.у/1, Б) рестрикция эндонуклеазой Г'\пЛ\. А1-А40 репрезентативные рестрикционные профили СТХ-М-5-кодирующих плазмид;

М- маркер молекулярной массы X/Вх/£11+риС 18/Нае\\\.

Рестрикционный прафкпь

Полное секвенирование последовательности четырех типов плазмид, выявленных с помощью рестрикционного анализа, подтвердило идентичность их генетического каркаса, включающего гены мобилизации (тоЪА, тоЪВ, тоЬС, тоЬП), инициации репликации, гипотетическую открытую рамку считывания (огЩ мобильного элемента \SEcpl и Р-лактамазы СТХ-М-5 (Рис. 4).

рСТХМ5-б37

РСТХМ5-1358

рСТХМ5-1845

тоЬСі /тяйв! |

птоРО. сайт репликации |ЫаСТХ-М-6

тойві і гооьО) сайт репликации |0аСТ*-М 5| |<тх>оА, I

лкАСі гпо&Ві І

«*оЬ0( сайт репликации

тоЬС) лкй>В| 1 тоЬО. сайт репликации.

рСТХМ5-891

Рис. 4. Сравнение нуклеотидных последовательностей СТХ-М-5-кодирующих плазмид.

Черные стрелки- предполагаемые кодирующие регионы и ключевые структурные элементы: консервативные гипотетический протеин (огрС), мобилизационные белки (тоЬА-й), сайт репликации, гены р-лактамаз (ЫаСТХ М 6/аТЕМ.,), инсерционные последовательности (\SEcpl, К/), транспозаза {ШрА) и резолваза (шрЩ транспозона ТпЗ. Серые стрелки- консервативная часть плазмид.

Отсутствие ¡га оперона, ответственного за конъюгационный перенос, при наличии полного набора генов мобилизации в консервативном каркасе описанных плазмид поддерживает наши данные о переносе СТХ-М-5-кодирующих плазмид от двух изолятов при конъюгации с низкой частотой и свидетельствует о том, что данные плазмиды являются неавтоконъюгативны-ми, но способными к ко-мобилизации другими плазмидами. Описанным плазмидам было присвоено название «рСТХМ5» в сочетании с номерами соответствующих изолятов. Полные нуклеотидные последовательности плазмид депонированы в базу данных ОепВапк. Плазмида рСТХМ5-637 (полная нуклеотидная последовательность депонирована в ОепВапк под номером

JX017306), с самым частым типом рестрикции AI, являлась наиболее простой и обладала наименьшим размером- 7438 пн. Плазмиды рСТХМ5-1845 (GenBank № JX017309) и рСТХМ5-1358 (GenBank № JX017308) с рестрикцион-ными профилями А2 и A3, соответственно, были крупнее (8215-8216 пн) и отличались от рСТХМ5-637 вставкой ^/-подобных элементов, нуклеотидные последовательности которых незначительно варьировали. Наиболее крупная плазмида рСТХМ5-891 (GenBank № JX017307) с профилем рестрикции A4 отличалась от рСТХМ5-637 наличием транспозона TnJ-типа, который нес в своем составе ген ТЕМ-1 ß-лактамазы. Наиболее распространенная плазмида рСТХМ5-637 может считаться предшественником других типов плазмид и эволюционировала путем приобретения мобильных элементов IS/ (в случае рСТХМ5-1358 и рСТХМ5-1845) или TnJ (рСТХМ5-891).

ПЦР-типирование CTX-M-5-кодирующих плазмид позволило детектировать специфическую последовательность, соответствующую консервативному каркасу плазмид рСТХМ5-типа у 80 (90,9%) цефотаксиморезистентных изолятов. Однако, у восьми цефотаксим-резистентных изолятов (3 изолята из Томска; 2- из Караганды; 1- из Иркутска; 1 - из С.-Петербурга; 1- из Витебска), имеющих ген è/aCTX-M-5, сцепленный с ISEcpl, не удалось детектировать наличие плазмид путем ПЦР-типирования, а также осуществить выделение и перенос рСТХМ5-плазмид путем трансформации или конъюгации, что можно объяснить IS Ecpl- опосредованной транслокацией гена è/астх-м на хромосому, примеры которой были описаны в ряде публикаций [Hopkins, 2006; Mendonca, 2007; Fabre, 2009; Sun, 2010]. ПЦР-типирование показало отсутствие плазмид рСТХМ5-типа у эпидемиологически несвязанных изолятов: цефотаксимочувствительных внебольничных изолятов S. Typhimurium и у CTX-M-2-продуцирующего аргентинского штамма CAS-5.

Таким образом, локализация генов Ыасгх-м-5 на схожих, не поддающихся самостоятельному переносу плазмидах поддерживает данные о клональном распространении цефотаксиморезистентных нозокомиальных штаммов S.Typhimurium. Более того, описанные плазмиды являются специфичными для данной клональной группы S. Typhimurium и, покуда, не были найдены у штаммов S. Typhimurium других генетических линий.

Молекулярная характеристика детерминант резистентности к хино-лонам. У исследованных нами изолятов S. Typhimurium резистентность к хи-нолонам во всех случаях была вызвана различными точечными мутациями приводящими к аминокислотным заменам в QRDR области субъединицы А ДНК-гиразы (GyrA): Asn-87, Gly-87, Туг-87 и Phe-83 (Рис. 5). При этом, у чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов соответствующие мутации не были обнаружены. Таким образом, фенотип чувствительности к налидиксовой кислоте строго коррелировал с генотипом gyrA.

|Туг-«7 Og¡»8" ШРЬв-83 nvUT

16 32 128 МПК (NAL), мг/л

0.06 0,125 0,25 МПК (CIP), мг/л

Мутация Количество (%) изолятов Диапазон МПК, мг/л

NAL CIP

Нет (WT) 50 (56,8%) 4-16 <0,03 - 0,06

Asn-87 25 (28,4) 128 - >512 0,125 - 0,5

Gly-87 3 (3,4%) 256->512 0,06 - 0,5

Tyr-87 2 (2,3%) 128 - 256 0,125-0,25

Phe-83 8(9,1%) >512 0,25 - 0,5

Рис.5. Распределение исследованных изолятов S.Typhimurium по МПК нали-диксовой кислоты (NAL) и ципрофлоксацина (CIP) в зависимости от характера мутаций в QRDR GyrA.

Большинство штаммов с характерными мутациями в QRDR GyrA также проявляли устойчивость низкого уровня к ципрофлоксацину, однако один изолят с заменой Gly-87 формально сохранял чувствительность к ципрофлоксацину (МПК 0,06 мг/л). Данное наблюдение свидетельствует, на наш взгляд, о том, что налидиксовая кислота является более чувствительным маркером для выявления хромосомно-опосредованной резистентности к хинолонам.

Выявленные в ходе данного исследования мутации в 83 и 87 позиции GyrA являются типичными для хинолонорезистентных клинических штаммов разных видов семейства Enterobacteriaceae. Эффект данных мутаций хорошо изучен и для штаммов сальмонелл. Наиболее часто у исследованных нами изолятов встречались замены на Asn (аспарагин) в 87 позиции (28,4%) и на Phe в 83 (9,1%). Мутация Phe-83, как и было показано ранее, была связана с более высокими значениями МПК как налидиксовой кислоты (>512мг/л), так и ципрофлоксацина (>0,25мг/л).

Ввиду показанной нами клональной родственности исследованных изолятов, было бы логично предположить, что мутации в хромосомном гене gyrA должны быть одинаковыми у всех штаммов, резистентных к хинолонам. Однако, данные кластерного анализа штаммов, выполненного по результатам

МЬУА-типирования (Рис. 6), свидетельствуют о том, что распространение резистентности к хинолонам в изучаемой генетической линии 5. ТурЫтипит лишь отчасти носит клональный характер и в значительной мере связано с независимым приобретением мутаций в %угА исходно чувствительным штаммом.

Asn87

Phe83

Рис. 6. Разнообразие мутаций (ЗЯБЛ внутри клональ-

ной группы цефотаксиморези-ш стентных изолятов

5. ТурЫтипит.

Кластеризация МЬУА-профилей на основании алгоритма Минимального остовного дерева. МЬУА-типы, отличающиеся не более чем на 2 локуса, объединены в одну клональную группу (выделена серым фоновым цветом). Заливка круга отражает доли изолятов с разными мутациями (2МЖ принадлежащих данному МЬУА-типу.

Генотип дугА

WГ

Тест на гипермутбельность. У исследованных нами изолятов частота спонтанных мутаций устойчивости к налидиксовой кислоте составила приблизительно 1 х 10° (соответствует увеличению частоты мутаций на 4 порядка по сравнению с обычными штаммами [Levy, 2004]), что позволило считать их гипермутабельными.

Также при постановке скринирующего теста с диском налидиксовой кислоты у всех штаммов S. Typhimurium, не проявляющих резистентность к налидиксовой кислоте, аналогично с контрольным штаммом-мутатором E.coli GM2995 (jnutDS), наблюдался рост многочисленных мутантных колоний внутри зоны подавления роста. Подобного роста у немутабельного контроля не замечено (Рис. 7). У произвольно выбранных мутантов, полученных in vitro, методом секвенирования было установлено наличие мутаций в QRDR gyrA, идентичных выявленным у хинолонорезистентных клинических изолятов.

Рис. 7. Примеры выявления фенотипа гипермутабельности с помощью быстрого теста с диском налидиксовой кислоты

А, Б - Клинические изоляты S. Typhimurium; В - отрицательный контроль - Е. coli АТСС®25922; Г - положительный контроль - Е. coli GM2995. Стрелкой отмечены мутант-ные колонии внутри зон подавления роста.

Фенотип гипермутабельности наблюдался у всех исходно чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов, относящихся к разным MLVA-субтипам внутри одной клональной группы и, тем самым, разнородность мутаций резистентности к фторхинолонам не противоречит результатам субвидового типирования, а свидетельствует о распространении единого гипермутабельного клона.

Таким образом, в течение долгого времени в стационарах на обширной территории Российской Федерации и сопредельных государств циркулирует успешный полирезистентный клон S. Typhimurium, устойчивый к цефалоспо-ринам III-1V поколений, благодаря продукции плазмидно-кодируемой БЛРС СТХ-М-5. Причем, неавтоконъюгативные CTX-M-5-кодирующие плазмиды являются важной характеристикой описанного клона и не были обнаружены у изолятов S. Typhimurium неродственных генетических линий. Значительная доля изолятов принадлежащих данному клону резистентна к фторхинолонам, и существует высокая вероятность дальнейшего роста фторхинолонорези-стентности среди изолятов внутри клональной группы вследствие их гипермутабельности, которая облегчает приобретение мутаций устойчивости. Большинство изолятов данной группы проявляют ассоциированную устойчивость к антибиотикам разных классов за счет комбинации дополнительных плазмидных и хромосомных детерминант резистентности.

выводы

1. По данным молекулярно-генетического типирования методами мультило-кусного секвенирования-типирования (MLST), мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA) и пульс-электрофореза макрорестрикцион-ных фрагментов геномной ДНК (PFGE) цефотаксиморезистентные штаммы Salmonella Typhimurium, вызвавшие вспышки сальмонеллеза в стационарах на территории России, Беларуси и Казахстана с 1996 по 2009 гг., принадлежат к одной клональной группе.

2. Резистентность нозокомиальных штаммов S. Typhimurium к цефалоспори-нам III-IV поколения и азтреонаму обусловлена наличием у них генетических детерминант, кодирующих ß-лактамазы расширенного спектра действия СТХ-М-5, тогда как устойчивость к ингибиторозащищенным пеницил-линам связана с генами ß-лактамаз ОХА-1 типа.

3. Ген приобретенной ß-лактамазы СТХ-М-5 связан с инсерционным элементом ISEcpl и находится в составе ранее не описанных сходных между собой неавтоконъюгативных плазмид, которые способны к мобилизации другими конъюгативными плазмидами.

4. Резистентность к хинолонам во всех случаях является результатом единичных аминокислотных замен в области, определяющей устойчивость к хинолонам (QRDR), А-субъединицы ДНК-гиразы (Asn-87, Phe-83, Gly-87, Tyr-87)

5. Штаммы Salmonella Typhimurium описанной клональной группы являются гипермутабельными и характеризуются высокой частотой возникновения спонтанных мутаций резистентности к налидиксовой кислоте (~1х10"5), что способствует независимому приобретению устойчивости к хинолонам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с широким распространением ß-лактамаз расширенного спектра действия, необходимо проводить регулярное определение чувствительности штаммов Salmonella Typhimurium, выделяемых в стационарах, к цефа-лоспоринам III поколения.

2. Для адекватной оценки чувствительности штаммов сальмонелл к ципроф-локсацину рекомендуется использовать обновленные критерии Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) 2012 г. (ципрофлоксацин «чувствительный» < 0,06 мг/л; «нечувствительный»>0,06 мг/л). Дополнительное определение чувствительности к налидиксовой кислоте является наиболее надежным способом выявления устойчивости к фторхинолонам, связанной с мутациями в хромосомном гене gyrA ДНК-гиразы.

3. Для изучения региональной и национальной эпидемиологии сальмонеллеза оптимальным является метод мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA), а для целей глобальной эпидемиологии- сочетание метода ML VA и мультилокусного секвеннрования-типирования (MLST).

4. Выявленная нами гипермутабельность нозокомиального клона Salmonella Ту-phimurium способствует приобретению мутаций резистентности к ципроф-локсацину, в связи с чем назначение фторхинолонов в стационарах должно быть ограничено случаями инвазивного сальмонеллеза у взрослых при невозможности использования цефалоспоринов III поколения по причине резистентности возбудителя к ним или аллергических реакций у пациента.

5. Скрининговый тест с диском налидиксовой кислоты для выявления фенотипа гипермутабельности может явиться полезным инструментом для рутинного предсказания повышенной вероятности приобретения вторичной резистентности к фторхинолонам штаммами Salmonella Typhimurium и связанной с этим клинической неэффективности применения ципрофлоксаци-на для терапии инвазивной сальмонеллезной инфекции.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Козырева В.К., Эйдельштейн М.В., Тапальский Д.В., Азизов И.С., Романов A.B., Козлов P.C. Клональное распространение СТХ-М-5-продуцирующих нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium в России, Беларуси и Казахстане // КМАХ. - 2012. -Т.14, №1. - С. 38-50.

2. Козырева В.К., Эйдельштейн М.В., Тапальский Д.В., Азизов И.С., Козлов P.C. Независимое приобретение резистентности к хинолонам у клонально-родственных нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium вследствие гипермутабельности // КМАХ. - 2012. - Т. 14, №2. - С. 153-161.

Другие публикации по теме диссертации:

1. Kozyreva V., Tapalski D., Azizov I., Edelstein M. Independent emergence of quinolone resistance in CTX-M-5 ß-lactamase-producing isolates of Salmonella typhimurium from Russia, Belarus and Kazakhstan. 18th ECCMID, Barcelona, 19-22 April 2008, abstr. N: 086.

2. V. Kozyreva, E. Ilina, A. Carattoli, M. Edelstein, R. Kozlov. CTX-M-5-Coding Plasmids of Nosocomial Salmonella Typhimurium Clone Circulating for a Long Time in Russia, Belarus, and Kazakhstan. 52nd ICAAC, San Francisco, 9-12 September 2012, abstr. N C2-697. Accepted for presentation.

3. Егорова C.A., Кафтырева JI.A., Козырева B.K., Забровская A.B. Устойчивость сальмонелл, выделенных из различных источников, к хинолонам // XIV Междунар. конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии: Тез. №1827. - М„ 23-25 мая 2012. - С. 15-16.

4. Егорова С.А., Кафтырева Л.А., Козырева В.К., Войтенкова Е.В. Устойчивость к хинолонам штаммов S. Typhi- возбудителей брюшного тифа, зарегистрированного на территории РФ // Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации: Материалы X съезда ВНПОЭМП- М., 2012. - Т. 2, № 1 -2. - С. 261.

5. Забровская А.В., Егорова С.А., Козырева В.К., Селиванова Л.В., Валькова И. А. Сельскохозяйственные животные как источник детерминант резистентности к антимикробным препаратам // Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации: Материалы X съезда ВНПОЭМП- М., 2012. - Т. 2, № 1-2. - С. 263-4.

6. Stepanova M.N., Pimkin М., Nikulin А.А., Kozyreva V.K., Agapova E.D., Edelstein M.V. Convergent In Vivo and In Vitro Selection of Ceftazidime Resistance Mutations at Position 167 of CTX-M-3 P-Lactamase in Hypermutable Escherichia coli Strains // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2008. -Vol. 52, N.4. -P.1297-1301.

7. Sukhorukova M., Kozyreva V., Ivanchik N., Edelstein M., Kozlov R. Five-year trends in the prevalence and types of ESBLs and antimicrobial susceptibility of ESBL-producing nosocomial strains of Enterobacteriaceae in Russia. 20th ECCMID, Vienna, 10-13 April 2010, abstr. 964. Accepted for presentation.

БЛРС ДНК

мпк

МПК50

мпк90

пн

ПЦР

тпн

CLSI

EUCAST

ISCR1 MLST ML VA MST PFGE

Список использованных сокращений

Р-лактамазы расширенного спектра действия дезоксирибонуклеиновая кислота минимальная подавляющая концентрация

минимальная подавляющая концентрация для 50% исследованных штаммов

минимальная подавляющая концентрация для 90% исследованных штаммов пар нуклеотидов полимеразная цепная реакция тысяч пар нуклеотидов

Институт клинических и лабораторных стандартов Европейский комитет по оценке антибиотикочувствительности инсерционная последовательность инсерционные последовательности с общим регионом 1 мультилокусное секвенирование-типирование мультилокусный анализ тандемных повторов минимальное остовное дерево

пульс-электрофорез макрорестрикционных фрагментов геномной

ДНК

QRDR область, определяющая устойчивость к хинолонам

STTR тандемный повтор Salmonella Typhimurium

VNTR участок ДНК с переменным числом тандемных повторов

WT дикий тип

Антибиотики

Chi хлорамфеникол

Сір ципрофлоксацин

Gm гентамицин

Nal налидиксовая кислота

Rif рифампицин

Sxt ко-тримоксазол

Tet тетрациклин

Аминокислоты

Ala аланин

Asn аспарагин

Asp аспарагиновая кислота

Gly глицин

Phe фенилаланин

Ser серин

Туг тирозин

аланин

Формат 60x84/16. Тираж 100. Печ. листов 1. Заказ № 6652. Дата сдачи в печать 26.09.2012 г.

Отпечатано в ООО «Принт-Экспресс», г. Смоленск, проспект Гагарина, 21, т.: (4812) 32-80-70

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козырева, Варвара Константиновна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Номенклатура рода Salmonella.

Глава 2. Клиническое значение нетифоидных сероваров S. enterica и эпидемиология сальмонеллеза.

Глава 3. Применение антибиотиков для терапии инфекций, вызванных нетифоидными сероварами S. enterica.

Глава 4. Антибиотикорезистентность у сальмонелл.

Глава 5. Особенности эволюции генома сальмонелл и выбор методов исследования молекулярной эпидемиологии сальмонеллезов.

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 6. Материалы и методы исследования.

Глава 7. Результаты исследования.

Глава 8. Обсуждение.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium"

Сальмонеллез является актуальной проблемой здравоохранения для всех стран без исключения: это миллионы случаев заражения и тысячи смертей в год по всему миру [206]. Клиническое проявление инфекции, вызванной нетифоидными сальмонеллами вида S. enterica подвид I, может сильно варьировать: от бессимптомного носительства и нетяжелой диареи, не требующей антимикробной терапии, до тяжелой инвазивной инфекции, такой, как бактериемия, менингит или остеомиелит, когда назначение антимикробных препаратов является необходимым. Большая часть таких осложнений приходится на долю нозокомиальных инфекций. Штаммы сальмонелл, распространяющиеся в госпитальной среде, как правило, отличаются от внебольничных изолятов множественной лекарственной устойчивостью (полирезистентностью) [3, 5].

На фоне глобального роста резистентности S. Typhimurium к ампициллину, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу, тетрациклину, сульфаниламидам и ряду других антимикробных препаратов [83, 85, 181, 204] особенно большую тревогу вызывает появление и распространение полирезистентных штаммов, устойчивых также к цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму, цефтриак-сону) и фторхинолонам - препаратам выбора для лечения инвазивных сальмо-неллезов [52, 71].

Проблема нозокомиального сальмонеллеза в России обозначилась в 70-е годы XX века, пик заболеваемости пришелся на 1992 г. При этом, более чем в

80% случаев нозокомиальная форма сальмонеллеза вызвана штаммами серо-типа Typhimurium [4, 5, 113, 115]. В 1999 г. в России было зарегистрировано 32 вспышки нозокомиального сальмонеллеза, в которые в общей сложности было вовлечено 472 человека [5]. До недавнего времени было несколько сообщений о распространении резистентных к цефалоспоринам S. Typhimurium в России и Беларуси. Крупные вспышки нозокомиального сальмонеллеза, вызванного полирезистентными штаммами были зарегистрированы в 1994-2003 гг. в Москве, Санкт-Петербурге, Смоленской, Минской, Гомельской, Гродненской и Витебской областях Эйдельштейном и соавт. [89]. В Гомельской области выделение цефотаксиморезистентных штаммов, продуцирующих (3-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС) СТХ-М-5, отмечалось позднее в 2007 г и было зафиксировано Тапальским и соавт. [180]. Помимо этого, CTX-M-5-продуцирующие штаммы S. Typhimurium выделялись в Греции, Венгрии, Латвии и США [70, 182, 207].

Клональное распространение полирезистентных штаммов S. Typhimurium в разных странах и регионах мира широко описано в литературе [71, 194, 204], однако, популяционная структура и эпидемиология нозокомиального сальмонеллеза, вызванного штаммами с множественной резистентностью, в России и соседних странах мало изучена.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определить особенности молекулярной эпидемиологии и механизмы антибиотикорезистентности цефотаксимоустойчивых нозокомиальных штаммов 5. ТурЫтипит, выделявшихся в ходе спорадических вспышек в стационарах на территории России, Беларуси и Казахстана с 1996 по 2009 гг.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Оценить генетические связи между цефотаксиморезистентными нозо-комиальными штаммами ТурЫтипит, выделенными на территории Российской Федерации и сопредельных государств, с помощью методов молеку-лярно-генетического типирования (мультилокусного секвенирования-типирования (МЬБТ), мультилокусного анализа тандемных повторов (МЬУА) и пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (РЕвЕ)).

2. Выявить генетические детерминанты, ответственные за формирование резистентности штаммов 5. ТурЫтипит к (3-лактамам и хинолонам.

3. Определить локализацию генов приобретенных (3-лактамаз и их связь с мобильными генетическими элементами.

4. Исследовать штаммы 5. ТурЫтипит на наличие фенотипа гиперму-табельности и оценить частоту возникновения мутаций резистентности к хинолонам.

НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

В представленной работе впервые:

1. установлена клональность цефотаксиморезистентных нозокомиаль-ных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium, выделяемых на территории России, Беларуси и Казахстана, с использованием современных методов молекулярной эпидемиологии;

2. выявлены механизмы и распространение резистентности к ß-лактамам и хинолонам у штаммов, вызвавших вспышки нозокомиального сальмонеллеза в России, Беларуси и Казахстане;

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

3. Механизмом устойчивости нозокомиальных штаммов S. Typhimurium к хинолонам является возникновение мутаций области, определяющей устойчивость к хинолонам (QRDR), гена субъединицы А ДНК-гиразы (gyrA).

4. Независимое приобретение мутаций резистентности к хинолонам разными членами описанной клональной группы является следствием гипермута-бельности изолятов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования внедрены в практику работы микробиологической лаборатории Федерального бюджетного учреждения здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии в Смоленской области" (г. Смоленск) в форме информационного письма «Рекомендации по эпидемиологическому типированию и определению чувствительности к цефалоспоринам III-IV поколений и хинолонам нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium», утвержденного в 2011 году. Выпущенное в 2012 году на основании результатов работы информационное письмо «О внедрении новых методических подходов в практику определения антибиотикочувствительности и эпидемического типирования возбудителей нозокомиального сальмонелле-за Salmonella enterica серовар Typhimurium» явилось основой для внедрения соответствующих практических рекомендации в работу лабораторий антибио-тикорезистентности и клинической бактериологии НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России. Также результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России и используются в программах циклов повышения квалификации врачей-бактериологов и семинарах для практических врачей, проводимых в НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздравсоцразвития России.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Полученные автором результаты были представлены и обсуждены на 18-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона, 2008); Заседаниях проблемной комиссии по иммунологии, иммуноморфологии и иммунопатофизиологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Смоленск, 2008, 2012); XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); X Международном конгрессе по антимикробной химиотерапии (Москва, 2008); Международной конференции, посвященной памяти члена-корреспондента РАМН, профессора Л.С. Страчунского «Антимикробная терапия: сегодня и завтра» (Смоленск, 2008); Конференции региональной академии антибактериальной терапии (Новосибирск, 2008); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); XI Международном конгрессе МАКМАК/ЕБСМГО по антимикробной терапии (Москва, 2009); Республиканской конференции «Современные принципы рациональной антибиотикотера-пии» (Якутск, 2009); XIV Конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблему педиатрии» (Москва, 2010); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Межрегиональной научно-практической конференции «Современная антибиотикотера-пия в клинической практике» (Саратов, 2010); XII Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2010); Региональной конференции «Современные подходы к лечению сепсиса» (Минск, 2010); III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва,

2011); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); I Республиканской научно-практической конференции «Проблемы антибиотикорезистентности в многопрофильном стационаре» (Якутск, 2012); Конференции «Безопасность и эффективность антимикробной терапии: уроки доказательной медицины» (Санкт-Петербург, 2012); Международной научно-практической конференции «Молекулярно-генетические методы исследования в медицине и биологии» (Караганда, 2012); 52-ой Междисциплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Сан-Франциско,

2012); на совместном заседании сотрудников кафедр микробиологии, инфекционных болезней с эпидемиологией, инфекционных болезней у детей, поликлинической педиатрии, факультетской терапии, ЦНИЛ и НИИАХ ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Смоленск, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ: 4- в зарубежной и 5- в отечественной печати (из них 2 работы опубликовано в рецензируемых ВАК журналах).

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Козырева, Варвара Константиновна

ВЫВОДЫ

1. По данным молекулярно-генетического типирования методами мультило-кусного секвенирования-типирования (MLST), мультилокусного анализа тан-демных повторов (MLVA) и пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE) цефотаксиморезистентные штаммы Salmonella Typhimurium, вызвавшие вспышки сальмонеллеза в стационарах на территории России, Беларуси и Казахстана с 1996 по 2009 гг., принадлежат к одной клональной группе.

2. Резистентность нозокомиальных штаммов S. Typhimurium к цефалоспори-нам III-IV поколения и азтреонаму обусловлена наличием у них генетических детерминант, кодирующих ß-лактамазы расширенного спектра действия СТХ-М-5, тогда как устойчивость к ингибиторозащищенным пенициллинам связана с генами ß-лактамаз ОХА-1 типа.

5. Штаммы Salmonella Typhimurium описанной клональной группы являются гипермутабельными и характеризуются высокой частотой возникновения спонтанных мутаций резистентности к налидиксовой кислоте (~1 х Ю"5), что способствует независимому приобретению устойчивости к хинолонам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. Для адекватной оценки чувствительности штаммов сальмонелл к ципрофлок-сацину рекомендуется использовать обновленные критерии Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) 2012 г. (ципрофлоксацин «чувствительный» < 0,06 мг/л; «нечувствительный»>0,06 мг/л). Дополнительное определение чувствительности к налидиксовой кислоте является наиболее надежным способом выявления устойчивости к фторхинолонам, связанной с мутациями в хромосомном гене gyrA ДНК-гиразы.

3. Для изучения региональной и национальной эпидемиологии сальмонеллеза оптимальным является метод мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA), а для целей глобальной эпидемиологии- сочетание метода MLVA и мультилокусного секвенирования-типирования (MLST).

4. Выявленная нами гипермутабельность нозокомиального клона Salmonella Typhimurium способствует приобретению мутаций резистентности к ципроф-локсацину, в связи с чем назначение фторхинолонов в стационарах должно быть ограничено случаями инвазивного сальмонеллеза у взрослых при невозможности использования цефалоспоринов III поколения по причине резистентности возбудителя к ним или аллергических реакций у пациента.

5. Скрининговый тест с диском налидиксовой кислоты для выявления фенотипа гипермутабельности может явиться полезным инструментом для рутинного предсказания повышенной вероятности приобретения вторичной резистентности к фторхинолонам штаммами Salmonella Typhimurium и связанной с этим клинической неэффективности применения ципрофлоксацина для терапии ин-вазивной сальмонеллезной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козырева, Варвара Константиновна, Смоленск

1. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2010 году: Государственный доклад Электронный ресурс. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. URL: http://rospotrebnadzor.ru/.

2. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2007 году: Государственный доклад Электронный ресурс. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. URL: http://rospotrebnadzor.ru/.

3. Акимкин, В.Г. Нозокомиальный сальмонеллез как самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998. - № 4. - С. 106-110.

4. Акимкин, В.Г. Современные клинико-эпидемические аспекты нозокомиального сальмонеллеза // Медицинский алфавит. Эпидемиология и санитария. 2010. - № 3. - С. 4-9.

5. Акимкин, В.Г., Покровский, В.И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. М.: Издательство РАМН, 2002. - С. 35-72.

6. Ахметова, Л.И., Розанова, С.М. Чувствительность к антимикробным препаратам штаммов шигелл и сальмонелл, выделенных в Екатеринбурге // КМАХ. 2000. - Т. 2, № 3. - С. 58-62.

7. Беляева, Т.В., Кожухова, Е.А., Кафтырева, Л.А. Чувствительность к антимикробным препаратам возбудителей, выделенных при остромшигеллезе и сальмонеллезе // Казанский медицинский журнал. 2009. -№ 3. - С. 395-399.

8. Бродов, Л.Е., Ющук, Н.Д., Малеев, В.В. Диагностика и лечение острых кишечных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997.- № 4. С. 4-6.

9. Голубев, А.О., Милютина, Л.Н. Современные данные об особенностях иммунного ответа при сальмонеллезах // Инфекционные болезни. 2010.- Т. 8, № 2. С. 62-67.

10. Горелов, A.B., Малеев, В.В., Милютина, Л.Н., и др. Эмпирическая антибиотикотерапия острых кишечных инфекций у детей // Антибиотики и химиотерапия. 2001. - № 10. - С. 19-24.

11. Дворецкая, С.А. Особенности современного течения сальмонеллезной инфекции у детей раннего возраста в зависимости от типа возбудителя // Педиатрия. 1994. - № 5. - С. 98-99.

12. Дмитраченко, Т.И., Семенов, В.М. Резистентность S.typhimurium к антибактериальным препаратам // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - № 3. - С. 12.

13. Егорова, С.А., Кожухова, Е.А., Кафтырева, Л.А., и др. Клинико-микробиологическая характеристика сальмонеллеза и шигеллеза в Санкт-Петербурге // Medline.ru. 2006. - Т. 7, № 1. - С. 531-540.

14. Егорова, С.А., Макарова, М.А., Забровская, A.B., и др. Многообразие механизмов антибиотикорезистентности сальмонелл // Инфекция и иммунитет. 2011. - Т. 1, № 4. - С. 303-310.

15. Захарова, И.Н., Андрюхина, E.H., Дмитриева, Ю.А. Инфекционные и неинфекционные диареи у детей: алгоритм диагностики и лечения // Вопросы практической педиатрии. 2009. - Т. 4, № 6. - С. 40-46.

16. Иванов, A.C. Современные представления об антибиотикорезистентности и антибактериальной терапии сальмонеллезов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2009. - Т. 11, № 4. - С. 305-326.

17. Кафтырева, JI.A., Егорова, С.А., Кожухова, Е.А., и др. Резистентность энтеробактерий к антимикробным препаратам выбора при лечении острых кишечных инфекций // Казанский медицинский журнал. 2009. -Т. 90, № 5. - С. 699-704.

18. Кафтырева, JI.A., Кожухова, Е.А. Течение острой кишечной инфекции, вызванной S. Enteritidis, у взрослых и характеристика циркулирующих в Санкт-Петербурге штаммов // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2009. - Т. 11, № 3. - С. 94-102.

19. Козлов, P.C. Нозокомиальные инфекции: эпидемиология, патогенез, профилактика, контроль // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. - Т. 2, № 1. - С. 16-30.

20. Козлова, Н.С., Гладин, Д.П., Липатова, Л.А. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных в Санкт-Петербурге и Ленинградской области в 1992-2000 гг. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - № 3. - С. 20.

21. Лобзин, Ю.В. Опыт применения офлоксацина для лечения острых кишеных инфекций // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - Т. 41, № 9.- С. 96-98.

22. Милютина, Л.Н., Горелов, A.B. Сальмонеллезы у детей // Детский доктор. 1999. - № 3. - С. 10-12.

23. Милютина, Л.Н., Рожнова, С.Ш., Цешковский, И.С. Клинические аспекты лекарственной резистентности сальмонелл // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1998. - № 1. - С. 33-37.

24. Милютина, Л.Н., Рожнова, С.Ш., Цешковский, И.С. Лекарственная резистентность сальмонелл и ее значение в клиническом сальмонеллезе у детей // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 1997. - № 4. - С. 37.

25. Минсбург, Ц.Я. Сальмонеллез тифимуриум / Под ред. В.И. Покровского.- Кишинев: «Штиинца», 1984. 161 с.

26. Новокшонов, A.A., Мазанкова, JI.H., Соколова, H.B. Патогенетическое обоснование оптимальной терапии острых кишечных инфекций у детей // Детские инфекции. 2002. - № 1. - С. 32-38.

27. Пак, С.Г., Хохлова, Т.О., Далина, A.M. Адгезивные свойства сальмонелл в динамике инфекционного процесса // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1989. - № 11. - С. 33-36.

28. Покровский, В.И., Килессо, В. А., Ющук, Н.Д. Сальмонеллезы: этиология, эпидемиология, клиника, профилактика. Ташкент: «Медицина», 1989. - 344 с.

29. Покровский, В.И., Рише, X., Килессо, В.А. Распространение устойчивости к антибиотикам у штаммов S. typhimurium, выделенных при разных эпидемических ситуациях // Журн. микробиол. 1982. - № 12. - С. 60-65.

30. Постовит, В.А., Иванов, К.Н. Особенности клинического течения сальмонеллеза у больных пожилого и старческого возраста // Врач. дело. 1982.-№3.-С. 111-114.

31. Раков, A.B., Шубин, Ф.Н., Иванис, В.А. Сравнительная характеристика сальмонеллеза, вызванного различными плазмидоварами Salmonellaenteritidis H Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 5. - С. 50-54.

32. Рожнова, С.Ш. Микробиологический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за сальмонеллезами: Автореф. дис. д-ра мед. наук: 14.00.30 / ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. М., 1993. - 57 с.

33. Рожнова, С.Ш. Сальмонеллезы: проблемы и решения // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. - № 2. - С. 39-41.

34. Рожнова, С.Ш., Кафтырева, JI.A. Значение плазмид в эволюции возбудителей и эпидемического процесса внутрибольничных сальмонеллезов // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 2000. - № 5. - С. 2527.

35. Салихов, В.М. Случай острого сальмонеллезного менингита у ребенка 5 месяцев // Педиатрия. 2002. - № 6. - С. 105-106.

36. Сидоренко, C.B. Ципрофлоксацин в лечении кишечных инфекций бактериальной природы // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, № 6. - С. 26-33.

37. Сидоренко, C.B., Тишков, В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биологической химии. 2004. - Т. 44. - С. 263306.

38. Солодовников, Ю.П., Лыткина, И.Н., Филатов, И.И. Сальмонеллезы в Москве: эпидемиологическая характеристика и задачи профилактики // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - № 4. - С. 46-49.

39. Степанова, М.Н. Мутационная изменчивость СТХ-М b-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.02.03/ СГМА. Смоленск: СГМА, 2011. - 119с.

40. Улуханова, Л.У., Идармачев, A.M., Саидов, М.З., и др. Современные клинические особенности течения сальмонеллеза Salm. Typhimurium у детей // Педиатрия. 2008. - Т. 87, № 5. - С. 150-151.

41. Хахарева, Т.П., Белова, Т.Н., Шевлягина, Т.П. Биологическая характеристика сальмонелл тифимуриум различного происхождения // Острые кишечные инфекции. 1982. - Т. 6. - С. 76-80.

42. Эйделыптейн, М.В. ß-лактамазы аэробных грамотрицательных бактерий: характеристика, основные принципы классификации, современные методы выявления и типирования // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т. 3, № 3. - С. 223-242.

43. Эйделыптейн, М.В. Выявление ß-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерий с помощью фенотипических методов. Методические рекомендации // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т. 3, № 2. - С. 183-189.

44. Ющук, Н.Д. Сальмонеллез // Российский медицинский журнал. 1996. -№ 3. - С. 19-23.

45. National prevalence survey of hospital acquired infections: definitions. A preliminary report of the Steering Group of the Second National Prevalence Survey // J Hosp Infect. 1993. - Vol. 24, Issue 1. - P. 69-76.

46. Aarestrup, F.M., Wiuff, C., Molbak, K., et al. Is it time to change fluoroquinolone breakpoints for Salmonella spp.? // Antimicrob Agents Chemother. 2003. - Vol. 47, Issue 2. - P. 827-829.

47. Anil, M., Helvaci, M., Ozkalay, N., et al. Salmonella typhimurium outbreak in a neonatal unit in Turkey // Indian J Pediatr. 2009. - Vol. 76, Issue 6. - P. 629-633.

48. Arlet, G., Barrett, T.J., Butaye, P., et al. Salmonella resistant to extended-spectrum cephalosporins: prevalence and epidemiology // Microbes Infect. -2006. Vol. 8, Issue 7. - P. 1945-1954.

49. Baucheron, S., Tyler, S., Boyd, D., et al. AcrAB-TolC directs efflux-mediated multidrug resistance in Salmonella enterica serovar typhimurium DTI04 // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - Vol. 48, Issue 10. - P. 3729-3735.

50. Bauernfeind, A., Casellas, J.M., Goldberg, M., et al. A new plasmidic cefotaximase from patients infected with Salmonella typhimurium II Infection. 1992. - Vol. 20, Issue 3. - P. 158-163.

51. Bell, R.L., Gonzalez-Escalona, N., Stones, R., et al. Phylogenetic evaluation of the 'Typhimurium' complex of Salmonella strains using a seven-gene multilocus sequence analysis // Infect Genet Evol. 2011. - Vol. 11, Issue 1. - P. 83-91.

52. Beltran, P., Plock, S.A., Smith, N.H., et al. Reference collection of strains of the Salmonella typhimurium complex from natural populations // J Gen Microbiol. 1991. - Vol. 137, Issue 3. - P. 601-606.

53. Blazquez, J. Hypermutation as a factor contributing to the acquisition of antimicrobial resistance // Clin Infect Dis. 2003. - Vol. 37, Issue 9. - P. 1201-1209.

54. Bonnet, R. Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - Vol. 48, Issue 1. - P. 1-14.

55. Boonmar, S., Bangtrakulnonth, A., Pornruangwong, S., et al. Significant increase in antibiotic resistance of Salmonella isolates from human beings andchicken meat in Thailand // Vet Microbiol. 1998. - Vol. 62, Issue 1. - P. 7380.

56. Bouchrif, B., Paglietti, B., Murgia, M., et al. Prevalence and antibiotic-resistance of Salmonella isolated from food in Morocco // J Infect Dev Ctries. 2009. - Vol. 3, Issue 1. - P. 35-40.

57. Boyd, D., Cloeckaert, A., Chaslus-Dancla, E., et al. Characterization of variant Salmonella genomic island 1 multidrug resistance regions from serovars Typhimurium DTI04 and Agona // Antimicrob Agents Chemother. -2002. Vol. 46, Issue 6. - P. 1714-1722.

58. Bradford, P.A. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat // Clin Microbiol Rev. 2001. - Vol. 14, Issue 4. - P. 933-951, table of contents.

59. Bradford, P.A., Yang, Y., Sahm, D., et al. CTX-M-5, a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase from an outbreak of Salmonella typhimurium in Latvia II Antimicrob Agents Chemother. 1998. - Vol. 42, Issue 8. - P. 19801984.

60. Butaye, P., Michael, G.B., Schwarz, S., et al. The clonal spread of multidrug-resistant non-typhi Salmonella serotypes // Microbes Infect. 2006. - Vol. 8, Issue 7.-P. 1891-1897.

61. Chiu, C.H., Wu, T.L., Su, L.H., et al. The emergence in Taiwan of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serotype choleraesuis // N Engl J Med. 2002. - Vol. 346, Issue 6. - P. 413-419.

62. Chopra, I., O'Neill, A. J., Miller, K. The role of mutators in the emergence of antibiotic-resistant bacteria // Drug Resist Updat. 2003. - Vol. 6, Issue 3. - P. 137-145.

63. Cloeckaert, A., Chaslus-Dancla, E. Mechanisms of quinolone resistance in Salmonella//Vet Res. 2001. - Vol. 32, Issue 3-4. - P. 291-300.

64. Cloeckaert, A., Schwarz, S. Molecular characterization, spread and evolution of multidrug resistance in Salmonella enterica Typhimurium DTI04 // Vet Res. 2001. - Vol. 32, Issue 3-4. - P. 301-310.

65. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. -Wayne, PA, USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012. 184p.

66. Cohen, J.I., Bartlett, J.A., Corey, G.R. Extra-intestinal manifestations of salmonella infections // Medicine (Baltimore). 1987. - Vol. 66, Issue 5. - P. 349-388.

67. Didelot, X., Bowden, R., Street, T., et al. Recombination and population structure in Salmonella enterica II PLoS Genet. 2011. - Vol. 7, Issue 7. - P. el002191.

68. Dierikx, C., van Essen-Zandbergen, A., Veldman, K., et al. Increased detection of extended spectrum beta-lactamase producing Salmonella enterica and Escherichia coli isolates from poultry // Vet Microbiol. 2010. - Vol. 145, Issue 3-4. - P. 273-278.

69. Doublet, B., Lailler, R., Meunier, D., et al. Variant Salmonella genomic island 1 antibiotic resistance gene cluster in Salmonella enterica serovar Albany // Emerg Infect Dis. 2003. - Vol. 9, Issue 5. - P. 585-591.

70. Drahovska, H., Mikasova, E., Szemes, Т., et al. Variability in occurrence of multiple prophage genes in Salmonella Typhimurium strains isolated in Slovak Republic // FEMS Microbiol Lett. 2007. - Vol. 270, Issue 2. - P. 237244.

71. Edwards, R.A., Olsen, G.J., Maloy, S.R. Comparative genomics of closely related salmonellae // Trends Microbiol. 2002. - Vol. 10, Issue 2. - P. 94-99.

72. EUCAST. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Электронный ресурс. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2012. URL: www.eucast.org.

73. Foley, S.L., Lynne, A.M. Food animal-associated Salmonella challenges: pathogenicity and antimicrobial resistance // J Anim Sei. 2008. - Vol. 86, Issue 14 Suppl. - P. E173-187.

74. Galan, J.C., Tato, M., Baquero, M.R., et al. Fosfomycin and rifampin disk diffusion tests for detection of Escherichia coli mutator strains // J Clin Microbiol. 2004. - Vol. 42, Issue 9. - P. 4310-4312.

75. Gay, K., Robicsek, A., Strahilevitz, J., et al. Plasmid-mediated quinolone resistance in non-Typhi serotypes of Salmonella enterica II Clin Infect Dis. -2006. Vol. 43, Issue 3. - P. 297-304.

76. Gilbert, G.L. Using MLVA to type strains of Salmonella Typhimurium in New South Wales //NSW Public Health Bull. 2008. - Vol. 19, Issue 1-2. -P. 29-31.

77. Giraud, A., Radman, M., Matic, I., et al. The rise and fall of mutator bacteria // Curr Opin Microbiol. 2001. - Vol. 4, Issue 5. - P. 582-585.

78. Gniadkowski, M. Evolution and epidemiology of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and ESBL-producing microorganisms // Clin Microbiol Infect. 2001. - Vol. 7, Issue 11. - P. 597-608.

79. Gunell, M., Webber, M.A., Kotilainen, P., et al. Mechanisms of resistance in nontyphoidal Salmonella enterica strains exhibiting a nonclassical quinolone resistance phenotype // Antimicrob Agents Chemother. 2009. - Vol. 53, Issue 9. - P. 3832-3836.

80. Hall, L.M., Henderson-Begg, S.K. Hypermutable bacteria isolated from humans- a critical analysis // Microbiology. 2006. - Vol. 152, Issue Pt 9. - P. 2505-2514.

81. Heisig, P. High-level fluoroquinolone resistance in a Salmonella Typhimurium isolate due to alterations in both gyrA and gyrB genes // J Antimicrob Chemother. 1993. - Vol. 32, Issue 3. - P. 367-377.

82. Herikstad, H., Hayes, P., Mokhtar, M., et al. Emerging quinolone-resistant Salmonella in the United States // Emerg Infect Dis. 1997. - Vol. 3, Issue 3. -P. 371-372.

83. Heyndrickx, M., Pasmans, F., Ducatelle, R., et al. Recent changes in Salmonella nomenclature: the need for clarification // Vet J. 2005. - Vol. 170, Issue 3.-P. 275-277.

84. Hopkins, K.L., Batchelor, M.J., Liebana, E., et al. Characterisation of CTX-M and AmpC genes in human isolates of Escherichia coli identified between 1995 and 2003 in England and Wales // Int J Antimicrob Agents. 2006. -Vol. 28, Issue 3.-P. 180-192.

85. Hopkins, K.L., Peters, T.M., de Pinna, E., et al. Standardisation of multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) for subtyping of Salmonella enterica serovar Enteritidis // Euro Surveill. 2011. - Vol. 16, Issue 32.

86. Horst, J.P., Wu, T.H., Marinus, M.G. Escherichia coli mutator genes // Trends Microbiol. 1999. - Vol. 7, Issue 1. - P. 29-36.

87. Kam, K.M. Serotype epidemiology and patterns of antibiotic susceptibilities of salmonellae isolated in Hong Kong 1983-93 // Chin Med J (Engl). 1996. -Vol. 109, Issue4.-P. 276-281.

88. Keddy, K.H., Dwarika, S., Crowther, P., et al. Genotypic and demographic characterization of invasive isolates of Salmonella Typhimurium in HIV co-infected patients in South Africa // J Infect Dev Ctries. 2009. - Vol. 3, Issue 8.-P. 585-592.

89. Kholodii, G., Yurieva, O., Mindlin, S., et al. Tn5044, a novel Tni family transposon coding for temperature-sensitive mercury resistance // Res Microbiol. 2000. - Vol. 151, Issue 4. - P. 291-302.

90. Kidgell, C., Reichard, U., Wain, J., et al. Salmonella Typhi, the causative agent of typhoid fever, is approximately 50,000 years old // Infect Genet Evol. 2002. - Vol. 2, Issue 1. - P. 39-45.

91. Kobryn, K., Chaconas, G. The circle is broken: telomere resolution in linear replicons // Curr Opin Microbiol. 2001. - Vol. 4, Issue 5. - P. 558-564.

92. Koskiniemi, S., Hughes, D., Andersson, D.I. Effect of translesion DNA polymerases, endonucleases and RpoS on mutation rates in Salmonella typhimurium // Genetics. 2010. - Vol. 185, Issue 3. - P. 783-795.

93. Krauland, M.G., Marsh, J.W., Paterson, D.L., et al. Integron-mediated multidrug resistance in a global collection of nontyphoidal Salmonella enterica isolates // Emerg Infect Dis. 2009. - Vol. 15, Issue 3. - P. 388-396.

94. Lan, R., Reeves, P.R., Octavia, S. Population structure, origins and evolution of major Salmonella enterica clones // Infect Genet Evol. 2009. - Vol. 9, Issue 5.-P. 996-1005.

95. Lartigue, M.F., Poirel, L., Nordmann, P. Diversity of genetic environment of ¿>fo(CTX-M) genes // FEMS Microbiol Lett. 2004. - Vol. 234, Issue 2. - P. 201-207.

96. LeClerc, J.E., Li, В., Payne, W.L., et al. High mutation frequencies among Escherichia coli and Salmonella pathogens // Science. 1996. - Vol. 274, Issue 5290. - P. 1208-1211.

97. Leclercq, R., Canton, R., Brown, D.F., et al. EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing // Clin Microbiol Infect. 2011. - doi: 10.111 l/j.1469-0691.2011.03703.x.

98. Lindstedt, B.A. Genotyping of selected bacterial enteropathogens in Norway // Int J Med Microbiol. 2011. - Vol. 301, Issue 8. - P. 648-653.

99. Litrup, E., Torpdahl, M., Malorny, В., et al. DNA microarray analysis of Salmonella serotype Typhimurium strains causing different symptoms of disease // BMC Microbiol. 2010. - Vol. 10. - P. 96.

100. Liu, W.B., Liu, В., Zhu, X.N., et al. Diversity of Salmonella isolates using serotyping and multilocus sequence typing // Food Microbiol. 2011. - Vol. 28, Issue 6. - P. 1182-1189.

101. Livermore, D.M. beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance // Clin Microbiol Rev. 1995. - Vol. 8, Issue 4. - P. 557-584.

102. Llanes, C., Kirchgesner, V., Plesiat, P. Propagation of TEM- and PSE-type beta-lactamases among amoxicillin-resistant Salmonella spp. isolated in France // Antimicrob Agents Chemother. 1999. - Vol. 43, Issue 10. - P. 2430-2436.

103. Mammeri, H., Nazic, H., Naas, T., et al. AmpC beta-lactamase in an Escherichia coli clinical isolate confers resistance to expanded-spectrum cephalosporins // Antimicrob Agents Chemother. 2004. - Vol. 48, Issue 10. -P. 4050-4053.

104. Martinez-Martinez, L., Eliecer Cano, M., Manuel Rodriguez-Martinez, J., et al. Plasmid-mediated quinolone resistance // Expert Rev Anti Infect Ther. -2008. Vol. 6, Issue 5. - P. 685-711.

105. Martinez-Martinez, L., Pascual, A., Jacoby, G.A. Quinolone resistance from a transferable plasmid // Lancet. 1998. - Vol. 351, Issue 9105. - P. 797-799.

106. McQuiston, J.R., Parrenas, R., Ortiz-Rivera, M., et al. Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC,fljB, and flpA from Salmonella // J Clin Microbiol. 2004. - Vol. 42, Issue 5. - P. 1923-1932.

107. Medalla, F., Sjolund-Karlsson, M., Shin, S., et al. Ciprofloxacin-resistant Salmonella enterica Serotype Typhi, United States, 1999-2008 // Emerg Infect Dis. 2011. - Vol. 17, Issue 6. - P. 1095-1098.

108. Miriagou, V., Tzouvelekis, L.S., Rossiter, S., et al. Imipenem resistance in a Salmonella clinical strain due to plasmid-mediated class A carbapenemase KPC-2 // Antimicrob Agents Chemother. 2003. - Vol. 47, Issue 4. - P. 12971300.

109. Mmolawa, P.T., Willmore, R., Thomas, C.J., et al. Temperate phages in Salmonella enterica serovar Typhimurium: implications for epidemiology // Int J Med Microbiol. 2002. - Vol. 291, Issue 8. - P. 633-644.

110. Modrich, P., Lahue, R. Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology // Annu Rev Biochem. 1996. - Vol. 65. -P. 101-133.

111. Naas, T., Lezzar, A., Bentchouala, C., et al. Multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Senftenberg isolates producing CTX-M beta-lactamases from Constantine, Algeria // J Antimicrob Chemother. 2005. - Vol. 56, Issue 2. - P. 439-440.

112. Nakaya, H., Yasuhara, A., Yoshimura, K., et al. Life-threatening infantile diarrhea from fluoroquinolone-resistant Salmonella enterica Typhimurium with mutations in both gyrA and parC II Emerg Infect Dis. 2003. - Vol. 9, Issue 2. - P. 255-257.

113. Nelson, J.D., Kusmiesz, H., Jackson, L.H., et al. Treatment of Salmonella gastroenteritis with ampicillin, amoxicillin, or placebo // Pediatrics. 1980. -Vol. 65, Issue 6.-P. 1125-1130.

114. Nelson, K., Selander, R.K. Intergeneric transfer and recombination of the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene (gnd) in enteric bacteria // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. Vol. 91, Issue 21. - P. 10227-10231.

115. Nishino, K., Latifi, T., Groisman, E.A. Virulence and drug resistance roles of multidrug efflux systems of Salmonella enterica serovar Typhimurium // Mol Microbiol. 2006. - Vol. 59, Issue 1. - P. 126-141.

116. Noda, T., Murakami, K., Asai, T., et al. Multi-locus sequence typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis strains in Japan between 1973 and 2004 // Acta Vet Scand. 2011. - Vol. 53.- P. 38.

117. Nuesch-Inderbinen, M.T., Kayser, F.H., Hachler, H. Survey and molecular genetics of SHV beta-lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: two novel enzymes, SHV-11 and SHV-12 // Antimicrob Agents Chemother. -1997. Vol. 41, Issue 5. - P. 943-949.

118. O'Brien, S.J., de Valk, H. Salmonella "old" organism, continued challenges ! //Euro Surveill. - 2003. - Vol. 8, Issue 2. - P. 29-31.

119. Ochman, H., Lawrence, J.G., Groisman, E.A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation // Nature. 2000. - Vol. 405, Issue 6784. - P. 299-304.

120. Olsen, S.J., DeBess, E.E., McGivern, T.E., et al. A nosocomial outbreak of fluoroquinolone-resistant salmonella infection // N Engl J Med. 2001. - Vol. 344, Issue 21.-P. 1572-1579.

121. Orlen, H., Hughes, D. Weak mutators can drive the evolution of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli II Antimicrob Agents Chemother. 2006. - Vol. 50, Issue 10. - P. 3454-3456.

122. Orman, B.E., Pineiro, S.A., Arduino, S., et al. Evolution of multiresistance in nontyphoid salmonella serovars from 1984 to 1998 in Argentina // Antimicrob Agents Chemother. 2002. - Vol. 46, Issue 12. - P. 3963-3970.

123. Pang, S., Octavia, S., Reeves, P.R., et al. Genetic Relationships of Phage Types and Single Nucleotide Polymorphism Typing of Salmonella enterica Serovar Typhimurium // J Clin Microbiol. 2012. - Vol. 50, Issue 3. - P. 727734.

124. Prabha Adhikari, M.R., Baliga, S. Ciprofloxacin-resistant typhoid with incomplete response to cefotaxime // J Assoc Physicians India. 2002. - Vol. 50. - P. 428-429.

125. Ramisse, V., Houssu, P., Hernandez, E., et al. Variable number of tandem repeats in Salmonella enterica subsp. enterica for typing purposes // J Clin Microbiol. 2004. - Vol. 42, Issue 12. - P. 5722-5730.

126. Robicsek, A., Strahilevitz, J., Jacoby, G.A., et al. Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase // Nat Med. 2006. - Vol. 12, Issue 1. - P. 83-88.

127. Robins-Browne, R.M., Rowe, B., Ramsaroop, R., et al. A hospital outbreak of multiresistant Salmonella Typhimurium belonging to phage type 193 // J Infect Dis. 1983. - Vol. 147, Issue 2. - P. 210-216.

128. Rossi, A., Lopardo, H., Woloj, M., et al. Non-typhoid Salmonella spp. resistant to cefotaxime // J Antimicrob Chemother. 1995. - Vol. 36, Issue 4. -P. 697-702.

129. Savard, P., Gopinath, R., Zhu, W., et al. First NDM-positive Salmonella sp. strain identified in the United States // Antimicrob Agents Chemother. 2011. - Vol. 55, Issue 12. - P. 5957-5958.

130. Strahilevitz, J., Jacoby, G.A., Hooper, D.C., et al. Plasmid-mediated quinolone resistance: a multifaceted threat // Clin Microbiol Rev. 2009. -Vol. 22, Issue 4. - P. 664-689.

131. Struelens, M.J., Rost, F., Deplano, A., et al. Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae bacteremia after biliary endoscopy: an outbreak investigation using DNA macrorestriction analysis // Am J Med. 1993. -Vol. 95, Issue 5. - P. 489-498.

132. Su, L.H., Chiu, C.H. Salmonella: clinical importance and evolution of nomenclature // Chang Gung Med J. 2007. - Vol. 30, Issue 3. - P. 210-219.

133. Summers, A.O. Generally overlooked fundamentals of bacterial genetics and ecology // Clin Infect Dis. 2002. - Vol. 34, Suppl. 3. - P. 85-92.

134. Sun, Y., Zeng, Z., Chen, S., et al. High prevalence of bla(CTX-M) extended-spectrum beta-lactamase genes in Escherichia coli isolates from pets and emergence of CTX-M-64 in China // Clin Microbiol Infect. 2010. - Vol. 16, Issue 9. - P. 1475-1481.

135. Swaminathan, B., Barrett, T.J., Hunter, S.B., et al. PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States // Emerg Infect Dis. 2001. - Vol. 7, Issue 3. - P. 382-389.

136. Tamang, M.D., Nam, H.M., Kim, A., et al. Prevalence and mechanisms of quinolone resistance among selected nontyphoid Salmonella isolated from food animals and humans in Korea // Foodborne Pathog Dis. 2011. - Vol. 8, Issue 11. - P. 1199-1206.

137. Tapalski, D., Hendriksen, R.S., Hasman, H., et al. Molecular characterisation of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium isolates from Gomel region, Belarus // Clin Microbiol Infect. 2007. - Vol. 13, Issue 10. -P. 1030-1033.

138. Tassios, P.T., Gazouli, M., Tzelepi, E., et al. Spread of a Salmonella Typhimurium clone resistant to expanded-spectrum cephalosporins in three European countries // J Clin Microbiol. 1999. - Vol. 37, Issue 11. - P. 37743777.

139. Tenover, F.C., Arbeit, R.D., Goering, R.V., et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing // J Clin Microbiol. 1995. - Vol. 33, Issue 9. - P. 2233-2239.

140. Threlfall, E.J. Antimicrobial drug resistance in Salmonella: problems and perspectives in food- and water-borne infections // FEMS Microbiol Rev. -2002. Vol. 26, Issue 2. - P. 141-148.

141. Threlfall, E.J., Skinner, J.A., Graham, A., et al. Resistance to ceftriaxone and cefotaxime in non-typhoidal Salmonella enterica in England and Wales, 199899 // J Antimicrob Chemother. 2000. - Vol. 46, Issue 5. - P. 860-862.

142. Tindall, B.J., Grimont, P.A., Garrity, G.M., et al. Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella // Int J Syst Evol Microbiol. 2005. - Vol. 55, Issue Pt 1. - P. 521-524.

143. Torpdahl, M., Sorensen, G., Ethelberg, S., et al. A regional outbreak of S. Typhimurium in Denmark and identification of the source using MLVA typing // Euro Surveill. 2006. - Vol. 11, Issue 5. - P. 134-136.

144. Turner, A.K., Nair, S., Wain, J. The acquisition of full fluoroquinolone resistance in Salmonella Typhi by accumulation of point mutations in the topoisomerase targets // J Antimicrob Chemother. 2006. - Vol. 58, Issue 4. -P. 733-740.

145. Velge, P., Cloeckaert, A., Barrow, P. Emergence of Salmonella epidemics: the problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple antibiotic resistance in other major serotypes // Vet Res. 2005. - Vol. 36, Issue 3. - P. 267-288.

146. Wasyl, D., Sandvang, D., Skov, M.N., et al. Epidemiological characteristics of Salmonella Typhimurium isolated from animals and feed in Poland // Epidemiol Infect. 2006. - Vol. 134, Issue 1. - P. 179-185.

147. Weigel, L.M., Steward, C.D., Tenover, F.C. gyrA mutations associated with fluoroquinolone resistance in eight species of Enterobacteriaceae II Antimicrob Agents Chemother. 1998. - Vol. 42, Issue 10. - P. 2661-2667.

148. Whichard, J.M., Gay, K., Stevenson, J.E., et al. Human Salmonella and concurrent decreased susceptibility to quinolones and extended-spectrum cephalosporins // Emerg Infect Dis. 2007. - Vol. 13, Issue 11. - P. 16811688.

149. Yan, J.J., Chiou, C.S., Lauderdale, T.L., et al. Cephalosporin and ciprofloxacin resistance in Salmonella, Taiwan // Emerg Infect Dis. 2005. -Vol. 11, Issue 6. - P. 947-950.

150. Yan, J.J., Ko, W.C., Chiu, C.H., et al. Emergence of ceftriaxone-resistant Salmonella isolates and rapid spread of plasmid-encoded CMY-2-like cephalosporinase, Taiwan // Emerg Infect Dis. 2003. - Vol. 9, Issue 3. - P. 323-328.

151. Yang, B., Zheng, J., Brown, E.W., et al. Characterisation of antimicrobial resistance-associated integrons and mismatch repair gene mutations in Salmonella serotypes // Int J Antimicrob Agents. 2009. - Vol. 33, Issue 2. -P. 120-124.

152. Yates, C., Amyes, S. Extended-spectrum beta-lactamases in non-typhoidal Salmonella spp. isolated in the UK are now a reality: why the late arrival? // J Antimicrob Chemother. 2005. - Vol. 56, Issue 2. - P. 262-264.

153. Yates, C.M., Brown, D.J., Edwards, G.F., et al. Detection of TEM-52 in Salmonella enterica. serovar Enteritidis isolated in Scotland // J Antimicrob Chemother. 2004. - Vol. 53, Issue 2. - P. 407-408.

154. Yu, F., Chen, Q., Yu, X., et al. High prevalence of extended-spectrum beta lactamases among Salmonella enterica Typhimurium isolates from pediatric patients with diarrhea in China // PLoS One. 2011. - Vol. 6, Issue 3. - P. el6801.

155. WMabilat, C., Goussard, S. PCR detection and identification of genes for extended-spectrum b-lactamases // Diagnostic molecular microbiology: principles and applications. 1993. - P. 553-562.

156. WHO. Drug-resistant salmonella. Fact sheet №139 Электронный ресурс. -2005. URL: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fsl39/en/.

Информация о работе

Козырева, Варвара Константиновна
кандидата биологических наук
Смоленск, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Механизмы антибиотикорезистентности и молекулярная эпидемиология нозокомиальных штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы