Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование экспрессии генов защитных белков в клубнях картофеля при ответе на стресс и после обработки индукторами устойчивости

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование экспрессии генов защитных белков в клубнях картофеля при ответе на стресс и после обработки индукторами устойчивости"

На правах рукописи УДК 581.198 + 577.21: 632.938

ЛОМОВА Лариса Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ОТВЕТЕ НА СТРЕСС И ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ИНДУКТОРАМИ УСТОЙЧИВОСТИ

клеточная биология — 03.00.25

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1995

I

Работа выполнена в Институте онтологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научные руководители: академик РАН Р.И. Салганик,

Институт антологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Г.Н. Дымшиц, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор P.A. Цильке, Аграрный университет, г.Новосибирск

кандидат биологических наук Е.В. Дейнеко,

Институт онтологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Ведущее учрехдение: Институт биоорганической химии

СО РАН, г. Новосибирск

Зашита диссертации состоится

на __заседании диссертационного совета Д-002.11.01

по »щите диссертации на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан "/¿fl"___1996 г.

Ученый секретарь 'диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Перспективным способом защиты растений является их иммунизация с помощью биогенных индукторов устойчивости. Обработка растений такими индукторами приводит к сенсибилизации растительных тканей, т.е. способности быстрее и интенсивнее реагировать на последующее заражение патогеном или механическое повреждение (Метлидкий, Озерецковская, 1985). Молекулярные механизмы индуцированной устойчивости до сих пор остаются не ясны. Понимание этого вопроса является актуальным для поиска новых эффективных средств защиты сельскохозяйственных культур от неблагоприятных условий окружающей среды.

Как известно, реакции растений на инфицирование или раневой стресс связаны с индукцией генов, кодирующих защитные белки. Эти гены принято называть генами защиты ("defense genes") (Lamb et al., 1986). Характер экспрессии разных генов защиты как вида-, так и органоспецифичен. И хотя индукция генов, кодирующих защитные белки, описана для ряда растительных систем, до последнего времени мало было известно о подобных генах в клубнях картофеля.

Существует предположение, что индуцированная устойчивость растений связана с активацией транскрипции генов защиты (Ryals et al., 1994). Однако вопрос об участии защитных генов картофеля в поддержании устойчивости иммунизированных с помощью биогенных индукторов клубней да сих пор оставался открытым.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении влияния биогенных индукторов устойчивости на экспрессию генов защитных белков в клубнях картофеля.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1) выяснение возможности индукции генов защитных белков: ги-дроксипролинбогатого гликопротеина (ГБГП), фенилаланинаммоний-лиазы (ФАЛ) и /?-1,3-глюканазы (Гл) — в картофельных клубнях при стрессовых воздействиях (поранении, инфицировании) ;

2) исследование экспрессии перечисленных выше генов в интакт-ных клубнях, иммунизированных с помощью биогенных индукторов устойчивости: липогликопротеидного комплекса из мицелия Phytoph-thora infestara (Mont.) de Вагу (ЛГП-комплекса) и арахидоновой кислоты (АК);

3) сравнение экспрессии генов ГБГП, ФАЛ и Гл при стрессовом ответе в иммунизированных и необработанных индукторами клубнях.

Научная новизна. В результате исследований впервые показано накопление мРНК, кодирующих гидроксшгроливбогатые гликопро теины, в клубнях картофеля при раневой стрессе. Продемонстрировано, что инфицирование растительной ткани патогенным грибом Р. infestons характеризуется более высоким, чем при поранении, уровнем ГБГП мРНК. Обнаружено, что спектры транскриптов, синтезированных при разных стрессовых воздействиях, различаются.

Выявлено, что раневой стресс и заражение картофельных клубней индуцируют накопление мРНК, кодирующих фенилаланннаммоний-лиазу и Д-1,3-глкжаназу. Выявлены различия в динамике накопления мРНК, кодирующих защитные белки.

Впервые показано, что индуцированная устойчивость картофеля связана с повышенным содержанием в растительных тканях ГБГП мРНК. Обнаружены различия в уровнях активности ФАЛ, а также содержания мРНК, кодирующих гидроксипролинбогатые гликопро-теины, фенил ал анинаммонийлиазу и /?-1,3-глюканазу, после стрессовых воздействий на ткани обработанных и необработанных индукторами клубней.

Предложена гипотетическая схема развития системной устойчивости в клубнях картофеля, индуцированной биогенными элиситорами.

Практическая ценность. Практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов естественного фитоиммунитета и индуцированной устойчивости растений. Знание этих механизмов необходимо для успешного решения практических задач селекции растений на устойчивость к болезням и поиска новых средств защиты растений.

Знания о генах защиты, индуцируемых стрессом в картофельных клубнях, могут быть использованы при проведении генно-инженерных работ но переносу в растения генов, повышающих их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

Результаты, касающиеся изменений экспрессии генов защитных белков в иммунизированной ткани, могут найти применение при испытании новых индукторов устойчивости растений.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на II Всесоюзной конференции "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (Пущино, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990); результаты исследований докладывались на Всесоюзном совещании "Физиолого-биохи-

мические основы иммунитета к грибным болезням"(Уфа, 1988), Конференции молодых ученых КазГУ (Алма-Ата, 1989), IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), на межлабораторном семинаре по клеточной и молекулярной биологии Института цитологии и генетики СО РАН (1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано в работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов Исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 наименований. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков.

Автор выражает искреннюю благодарность соавторам статей по теме диссертации: Дударевой Н.А., Ильинской Л.И., Озерецков-ской O.JI.

Материалы и методы

Объектами исследования служили клубни картофеля сорта Темп с геном фитофторбустойчивости Ri, а также совместимая раса 1.3 возбудителя фитофтороза P. infestans, предоставленные сотрудниками лаборатории индуцированной устойчивости Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Раневой стресс вызывали вырезанием из зоны внутренней флоэмы клубней дисков (диаметр 16 мм, высота 5 мм), которые выдерживали в темноте во влажной атмосфере при комнатной температуре.

При инфицировании на поверхность дисков наносили 0,05 мл суспензии зооспор P. infestans плотностью 10 зооспор/мл.

Клубни картофеля обрабатывали ЛГП-комплексом в концентрации 5-10 мкг/мл или АК в концентрации Ю-8 — Ю-7 М (индукторы устойчивости получены в лаборатории индуцированной устойчивости Института биохимии им. А.Н. Баха РАН) и выдерживали 1-4 недели до наступления иммунизации при +10° С.

Плаэмида pDC5Al была предоставлена доктором Варнером (Dr. I.E. Varner, Washington University, США); pPAL5 — доктором Эдвард-сом (Dr. K.I. Edwards, Imperial Chemical Industries, Англия); pGL43 — доктором Майнсом (Dr. F.G. Meins, Friedrich Miescher-Institut, Швейцария). i

з

Культивирование Е. coli, трансформацию клеток, выделение плаз-мидной ДНК провсщили как описано (Маниатис и др., 1984).

Выделение суммарной ДНК из клубней картофеля проводили по модифицированной методике Рокитко (1981) и очищали дифференциальным центрифугированием в градиенте плотности CsCl, как описано (Дрэйпер, Скотт, 1991).

Суммарную РНК из клубней картофеля выделяли по модифицированному методу Stiekema et al. (1987).

Очистку поли(А)мРНК проводили на поли(У)-сефарозе (Клеменс, 1987).

Блот-гибридизацию ДНК, дот- и блот-гибридизацию РНК осуществляли в соответствии с методиками, описанными Маниатисом и др. (1984) и Мазиным и др. (1990).

Активность фенилаланинаммонвйлиазы в картофельных клубнях определяли по методу Zucker (1968).

Результаты и обсуждение

В работе исследовали экспрессию генов гидроксипролинбогатых гли-копротеинов, фенилаланинаммонийлиазы и ß-1,3-глюканазы.

В качестве гетерологичных гибридизационных зондов использовали EcoRI-фрагмент геномного клона pDC5Al, содержащий полную последовательность ГБГП гена моркови (Chen, Vamer, 1985), Pstl-фрагмент pPAL5, соответствующий кДНК ФАЛ гена фасоли (Edwards et al., 1985) и Pstl-фрагмент pGL43, соответствующий кДНК Гл гена табака (Mohnen et al., 1985).

Выявление фрагментов геномной ДНК картофеля, гомологичных генам ГБГП и ФАЛ. Последовательности ДНК в геноме картофеля, гомологичные генам гидроксипролинбогатых гликопро-теинов моркови и фенилаланинаммонийлиазы фасоли, анализировали с помощью метода блот-гибридизации по Саузерну.

Как видно на рис. 1, [32Р]-меченные последовательности ГБГП гена и ФАЛ кДНК гибридизуются с несколькими фрагментами суммарной ДНК картофеля, гидролизованной разными рестриктазами.

Маловероятно, что в пределах одного гена существует такое количество сайтов рестрикйии. Скорее всего, в геноме картофеля содержатся несколько генов, кодирующих ФАЛ, и несколько генов, кодирующих ГБГП.

I

в

Ч

t¿fc -

f '

В Р Е

Рис. 1: Б лот-гибридизация по Саузерну суммарной ДНК из клубней картофеля, гидролизованной эндонукле&зами рестрикции BamHI (В), EcoRI (Б) и Patl (Р), с [33Р]-меченны»« Pstl-фрагкентом pPAL5 (А) и EcoRI-фрагиеитом pDC5Al (Б). Слева указаны размеры фрагментов гидролиза ДНК фага Л эняонуклеазой рестрикции HindlII.

Предположение о наличии семейства ГБГП генов в геноме картофеля подкрепляется данными о существовании нескольких видов картофельных гидроксипролинбогатых гликопротеинов с общими чертами строения (Varner, Cooper, 1982; Millar, 1992). Вероятно, гены, кодирующие эти белки, имеют общее происхождение и содержат гомологичные последовательности.

Недавно появилось сообщение о том, что еще два типа защитных белков — хитиназы и /?-1,3-глюканазы, кодируются в геноме картофеля мультигенными семействами. Оба типа генов расположены в геноме кластерами (Kombrink et al., 1994).

Возможно, разные гены, относящиеся к одному семейству, по-разному регулируются и индуцируются в ответ на разные стрессовые воздействия. С другой стороны, одновременная индукция нескольких генов, кодирующих одинаковые защитные белки, могла бы усиливать реакцию защиты.

23,1 9,4 6,6 4,4

2,3 -2,0 -

тыс. п.н.

ВЕР

Индукция генов защиты в картофельных клубнях в условиях стресса. Показано, что раневой стресс или обработка элисито-ром вызывают в картофельных клубнях изменения генной экспрессии (Giroux et al, 1987; Logemann et al., 1988). Несколько генов, индуцируемых поранением или элиситором, были клонированы (Marineau et al, 1987; Logemann et al., 1988; Stanford et al, 1989). Однако функции продуктов этих генов неизвестны.

Среда генов, индуцируемых стрессовыми воздействиями, могут быть гены гидроксицролинбогатых гликопротеинов, фенилаланинам-монийлиазы и /?-1,3-глюканазы. Об участии соответствующих белков в защитных реакциях растений свидетельствуют многочисленные литературные данные. ГБГП накапливаются в клеточных стенках растений при ответе на стресс и могут выступать в качестве структурных барьеров и (или) специфических агглютининов для микробных патогенов (Lamb et al., 1986). ФАЛ — фермент, катализирующий начальный этап синтеза фенилпрапаноидных соединений, многие из которых токсичны для патогенов, а конечные продукты этого биосинтетического пути — лигнин и суберин — служат для укрепления клеточных стенок растения (Ward, 1986). /?-1,3-глюканаза — это гидролаза, способная расщеплять клеточные стенки патогенных микроорганизмов (Boiler et al., 1983).

Для того, чтобы проверить предположение об участии генов ГБГП, ФАЛ и Гл в защитных реакциях картофельных клубней, мы изучали изменения в уровне соответствующих мРНК после раневого стресса и инфицирования клубней патогенным грибом P. infestons.

Как показали результаты молекулярной гибридизации суммарной РНК с последовательностями генов ГБГП, ФАЛ и /?-1,Зглюканазы, в интактных клубнях не обнаруживаются мРНК, кодируемые этими генами. Механическое повреждение растительных тканей вызывает накопление соответствующих тракскриптов, выявляемых при гибридизации.

Обнаружены существенные различия в динамике накопления мРНК, кодирующих разные защитные белки (рис. 2). Транскрипты ГБГП генов обнаруживаются в растительной ткани уже через 3 часа после раневого стресса, уровень их постепенно повышается, достигая максимума примерно через сутки после поранения, затем количество ГБГП мРНК уменьшается. Уровень ФАЛ мРНК также повышается после раневого стресса, однако максимум содержания данных транс-криптов наблюдается уже через 9 часов. Максимальный уровень Гл !

/

Рас. 2: Динамика накоплен« ыРН К защитных белков в клубнях картофеля после раневого стресса.

Приведены относительные уровни мРНК в % от максимального значения. Количество ГБГП, ФАЛ и Гл мРНК оценивали по результатам дот-гибридн-зацми суммарной РНК из клубней картофеля

с ["Р] -меченными ЕсоЩ-фрагментом рОС5А1 .(ген ГБГП), РвИ-фрагмен-том рРАЬ5 (кПНК гена ФАЛ) и Рв1 [-фрагментом рОЛЗ (кДНК гена Гл). Флюорограммы девсито-метрировали.

мРНК наблюдается примерно в то же время, что и для ФАЛ мРНК, но содержание мРНК, кодирующих /?-1,3-глюканазу, снижается не так быстро, как мРНК, кодирующих ФАЛ.

Накопление мРНК, кодирующих защитные белки, в растительной ткани объясняется, вероятно, активизацией транскрипции соответствующих генов. С другой стороны, нет доказательств того, что изменения в содержании мРНК не связаны с повышением стабильности транскриптов.

Различия в динамике содержания мРНК, транскрибируемых с разных генов, вероятно, связаны с разными функциями кодируемых ими белков и, возможно, отражают существование нескольких путей регуляции экспрессии разных генов защиты.

Представленные результаты согласуются с описанной индукцией генов раневого ответа в других растительных системах (Edwards et al, 1985; Corbin et al., 1987; Lawton, Lamb, 1987).

Накопление в растительной ткани транскриптов, гибридизующих-ся с последовательностями генов ГБГП, ФАЛ и Гл, было обнаружено также после инфицирования дисков из клубней картофеля грибным патогеном P. infestans. Причем содержание таких мРНК в инфици-

рованной ткани выше, чей в пораненной.

Поскольку при инфицировании дисков из клубней картофеля споры гриба наносятся на раневую поверхность, первоначальное накопление мРНК, копирующих защитные белки, может быть связано с раневым стрессом. В процессе своего развития патогенный гриб поражает новые слои растительных клеток, индуцируя в них гены защиты. В связи с этим общее количество мРНК, транскрибируемых с этих генов, после заражения оказывается выше, чем в пораненных, но неин-фицированных дисках, где идет процесс репарации.

Не исключено, что при инфицировании выделяются дополнительные стимулы, активирующие гены защиты, в результате чего интенсивнее транскрибируются гены, индуцированные поранением, либо индуцируются другие гомологичные гены, кодирующие подобные белки.

Методом Нозерн блот-гибридизации мы анализировали содержание в картофельных клубнях ГБГП мРНК после раневого стресса и после заражения дисков P. infestons.

Как показали результаты гибридизации суммарной РНК, выделенной из картофельных клубней через 24 ч после поранения, с последова-тельностыо гена ГБГП (рис. 3), раневой стресс вызывает накопление в растительной ткали по крайней мере двух транскриптов размерами менее 1,9 тыс. п.н. В суммарной РНК, выделенной из картофельных дисков, инфицированных несовместимой расой P. infestons, обнаруживаются как те же ГБГП мРНК, что и после поранения, так и дополнительные, слабо гибридизующиеся с последовательностью гена ГБГП транскрипты больших размеров (один из транскриптов имеет размеры больше 3,6 тыс. п.н., другой — между 1,9 и 3,6 тыс. п.н.). Возможно, эти мРНК кодируются другими генами семейства ГБГП, экспрессирукхцимися в ответ на внедрение патогена. Не исключено также, что появление новых транскриптов является следствием изменений регуляции транскрипции тех же генов ГБГП.

Изменения экспрессии генов ГБГП и ФАЛ в клубнях картофеля в условиях стресса изучались также американскими исследователями (Butler et al.,' 1990; Rumeau et al., 1990). Результаты, полученные нами независимо, в целом согласуются с данными этих авторов.

Таким образом, механическое повреждение или заражение клубней картофеля патогеном индуцируют экспрессию в растительных тканях генов гидроксипролинбогатых гликопротеинов, фенилаланинам-монийлиазы и 7?-1,3-глюканазы, что позволяет говорить об участии I

Рис. 3: Ноэерн блот-гмбр»-дизами» суммарно* РНК, выделенной яз клубяей картэфепа после поранения (А) ■ ияфмди-рованжа Р. 1п/еа<ат (Б), с Р3Р]-мечевяым ЕсоШ-фрагментам рОС5А1.

1 — фильтр, экспонированный с рентгеновской пленкой 5 ч;

2 — фильтр, э*стюнжравлины4 с рентгеновской пленкой 24 ч. Слева указаны размеры рРНК (в тыс. п.н.). Стрелками указано положение ГБГП транс-криптов.

данных генов в реакциях защиты. Различия в динамике накопления ыРНК, кодирующих разные защитные белки, после раневого стресса, а также дифференциальная экспрессия генов защиты при действии разных по природе стрессовых факторов, возможпо, свидетельствуют о нескольких путях внутриклеточной передачи индуцирующего сигнала и разной регуляции генов, участвующих в защитных реакциях растения.

Влияние биогенных индукторов устойчивости на экспрессию генов защитных белков. Устойчивость картофеля к патогенам может быть повышена с помощью ЛГП-комплекса, выделенного из мицелия Р. Iп/ез£впз (Метлицкий и др., 1985). Индуцирующая способность этого элиситора связана с присутствием в его составе ара-хидоновой и эйкозалентаеновой кислот (Озерецковская и др., 1987). Обработка клубней низкими дозами ЛГП-комплекса или арахидоно-вой кислоты вызывает системную устойчивость растительных тканей, сохраняющуюся на протяжении длительного периода времени. Предполагалось, что индуцированная устойчивость связана со стабильными изменениями в экспрессии генов зашиты.

В работе исследовали содержание мРНК, транскрибируемых с генов ГБГП, ФАЛ и /?-1,3-глюканазы, в иммунизированных с помощью ЛГП-комплекса или АК клубнях картофеля.

РНК для анализа выделяли из клубней через 2-4 недели после обработки элиситорами. Как показано, за этот период сенсибилизиру-

ются все ткани клубней (Метлипкий и др., 1985).

Методой дот-гибридизации суммарной РНК картофеля с [примеченными последовательностями гена ГБГП, кДНК гена ФАЛ и кДНК гена ß-1,3-глюканазы не было обнаружено соответствующих мРНК в иммунизированных, во не подвергавшихся стрессовым воздействиям клубнях, так же, как и в интактных клубнях, обработанных водой. Однако результаты данного эксперимента не свидетельствуют о полном отсутствии мРНК защитных белков в растительной ткани, а могут быть следствием недостаточной чувствительности метода.

При использовании для гибридизационного анализа фракции по-ли(А)мРНК, выделенной из обработанных элиситором или ведой клубней, было показано, что в интактных иммунизированных клубнях содержатся мРНК, гибридизующиеся с радиоактивно меченной ДНК гена ГБГП (рис. 4). мРНК, гибридизующихся с р2Р]-меченными кДНК генов ФАЛ и Гл, не было обнаружено.

Растительные ткани клубней, обработанных ведой или индукторами устойчивости, по-разному реагируют на стресс.

Как показали результаты дот-гибридизаций РНК картофеля с меченными [®2Р] кДНК генов ГБГП, ФАЛ и /3-1,3-глюканазы, уровень соответствующих мРНК через сутки после поранения в иммунизированных клубнях достоверно выше, чем в контрольных (рис. 5). В инфицированных совместимой расой P. tn/esfans дисках, вырезанных из обработанных элиситором клубней, содержание мРНК, кодирующих ГБГП, ФАЛ и Гл, оказывается ниже, чем в зараженных дисках из контрольных клубней.

В работе исследовали также влияние иммунизации на уровень ферментативной активности фенилаланпнаммонийлиазы.

Активность ФАЛ в интактных клубнях не регистрируется спек-трофотометрически, однако значительно повышается после раневого стресса, что хорошо согласуется с литературными данными (Friend et al., 1973; Shaw et al., 1990). Уровень активности фермента остается недетектируемым и в иммунизированных клубнях, не подвергавшихся стрессу. Через 24 ч после поранения активность ФАЛ на

Рис. 4: Дот-гибридизация поля(А)мРНК, выделенной из клубней картофеля через 2 недели (А) к 4 недели (Б) после обработки водой (1) или ЛГП-коыплексом (2), с ["Р]-мечеиным ЕсоШ-фрагыентом pDC5Al. Слева указано количество нанесенной на фильтр РНК (в шсг).

Рис. 5: Дот-гибридизация суммарной РНК, выведенной из клубней картофеля после раневого стресса, с ["Р^меченным ЕсоЩ-фрагмеятом pDC5Al. На фильтр нанесены ДНК pDC5Al (1), суммарная РНК Е. coli (2), суммарная РНК из клубней картофеля, обработанных водой (3) или ЛГП-комплексом в концентрациях S мкг/мл (4) и 10 мкг/мл (5). Справа указано количество нанесенной на фильтр РНК (в мгг).

ед. акт. мг белка

20015010050-

Рис. 6: Активность ФАЛ в клубнях картофеля через 24 ч после раневого стресса.

1 — контроль

2 — обработка АК

1 2

30% оказывается выше в обработанных А К клубнях по сравнению с контрольными (рис. б).

Итак, в тканях картофельных клубней, иммунизированных с помощью биогенных индукторов устойчивости, не накапливается значительного количества мРНК, кодирующих ФАЛ и Гл, но такие ткани приобретают способность интенсивнее реагировать на раневой стресс активацией экспрессии генов защиты. Ббльшее содержание мРНК, кодирующих ГБГП, ФАЛ, /?-1,3-глюканазу, после инфицирования в контрольных клубнях, по сравнению с обработанными индуктором, объясняется, по-видимому, тем, что в иммунизированных ткапях замедляется вовлечение в инфекционный процесс новых слоев растительных клеток. Можно предположить, что большее содержание мРНК, кодирующих

защитные белки, в контрольных клубнях отражает большее количество клеток, в которых экснрессируются гены защиты.

Явление индуцированной системной устойчивости известно давно и продемонстрировано на множестве примеров (Киё, 1983; Озерецков-ская, 1994; Ryals et al., 1994). Согласно модели, предложенной Ward, Ryals et al. (Ward et al., 1991; Ryals et al., 1994), индуцированная устойчивость растительных тканей связана с постоянной экспрессией в них генов защиты, в то время как в обычном состоянии подобные гены активируются лишь после поранения или инфицирования растения. Данная гипотеза подтверждается рядом работ по исследованию индуцированной устойчивости табака, огурца, арабидопсиса и томата (Pan et al., 1991; Raamussen et al., 1991; Cohen et al., 1994; Ryals et al., 1994). С другой стороны, есть примеры, которые плохо согласуются с предложенной схемой. Так, системная устойчивость риса, приобретенная после инфицирования первого листка проростка, не сопровождается повышением активности ФАЛ, конеферилалко-гольдегидрогеназы, псроксидазы, /7-1,3-глюканазы и хитиназы (Sith, Mdtraux, 1991). По-видимому, в разных системах молекулярные механизмы индуцированной устойчивости могут отличаться.

В случае системной устойчивости клубней картофеля, индуцированной с помощью биогенных элиситоров, в ннтактных растительных тканях на активируются реакции защиты, наблюдаемые обычно после стрессовых воздействий. Обработка клубней низкими дозами ЛГП-комплекса или АК не вызывает некротизации растительных тканей и накопления в них ФА (Озерецковская и др., 1994), в этих клубнях не повышается активность ФАЛ, не накапливаются мРНК, транскрибируемые с генов защитных белков: фенил ал анинаммоний-лиазы и /?-1,3-глюкавазы. Но ответ иммунизированных тканей на поранение или заражение патогеном отличается от реакций необработанных элиси тором клубней.

Вероятно, иммунизация картофельных клубней не привадит к прямой индукции генов защиты и накоплению в тканях защитных белков.

Возможно, обработка клубней низкими дозами элиситоров индуцирует экспрессию лишь некоторых генов, продуктами которых могут быть промежуточные соединения, участвующие в передаче сигнала, индуцирующего гены защитных белков. В частности, в иммунизированных тканях могут накапливаться рецепторы, взаимодействующие с индуцирующими сигналами. Кандидатами на роль рецепто-

ров в клетках картофельных клубней являются лектины (Любимова, Щербухин, 1991; Озерецковская и др., 1993). Как известно, лектины картофеля относятся к семейству гццроксипролинбогатых гликопро-теинов (ЮеЬгетгаЫ е! а!., 1994). Следовательно, повышение уровня ГБГП мРНК в иммунизированных тканях может отражать усиление транскрипции лектиновых генов и косвенно свидетельствовать в пользу гипотезы о накоплении рецепторов.

Обобщая литературные данные и результаты представленной работы, мы предлагаем следующую схему развития индуцированной с помощью биогенных элиситоров системной устойчивости клубней кара феля (рис. 7).

АК и ЭГГК, содержащиеся в ЛГП-комплексе, проникают в паренхиму клубней через глазки и депонируются в мембранах повехност-ных слоев клеток в составе адиллипидов, в основном фосфолипвдэв. Фосфолипазы постепенно высвобождают АК и ЭПК, замещая их ли-нолевой и линоленовой кислотами. Свободные АК и ЭПК окисляются с помощью липоксигеназы или полпоксигеназ. Продукты окисления этих кислот либо другие вещества, опосредованные ими, распространяются по тканям клубня, выступая в качестве сигнальных молекул. В системной передаче сигнала, возможно, принимают участие оли-госахарины клеточных стенок картофеля. (Механизмы распространения индуцирующего сигнала описаны в работах Озерешговской с соавт., 1994).

Вероятно, существует несколько путей внутриклеточной передачи сигнала, изменяющего генную экспрессию. В результате ингибирует-ся экспресия одних генов и активируется экспрессия других. В числе ингибированЕЫХ могут быть гены, кодирующие ферменты синтеза стеринов, необходимых для развития некоторых патогенов (снижение уровня стеринов в иммунизированных тканях картофельных клубней показало Озерецкозской и др., 1994). Возможно, индуцируются гены, кодирующие рецепторные белки или же промежуточные соединения, участвующие в активации защитных генов. Нельзя исключать также вероятность того, что некоторые защитные вещества могут накапливаться в неактивной форме.

Иммунизированные ткани быстрее и интенсивнее реагируют на поранение или инфицирование, т.к. могут содержать большее количество мембранных рецепторов, взаимодействующих с элиситорами патогена, а также (или) других соединений, участвующих в пути передачи сигнала, активирующего гепы защиты, или же уже предсуще-

АК и ЭПК, встроенные в мембрану в составе ФосФолипидов

ФосФолипаза

Свободные АБ ЭИВ в цитоплазме

липоксигеназа или полиоксигеназы

Продукты окисления АК и ЗПК

Транспорт в соседние клетки

Ингибирование Индукция Накопление Накопление

синтеза синтеза промежуточных защитных

стеринов рецепторов соединений для веществ

активации в неактивной

генов защиты Форме

Инфекция или поранение

Недостаток Быстрое Быстрая Активация

стеринов. распознавание активация защитных

необходимых патогена генов защиты реакций

для патогена. и индукция

. Быстрый генов защиты

синтез ФА

Ингибирование патогена и залечивание повреждений

Рас. 7: Схема развали индуцированной системной устойчивости в клубни картофеля

ствуюпщх защитных веществ, которые активируются и участвуют в реакциях защиты. В результате интенсивнее протекают процессы залечивания поврежденных тканей и быстрее ип активируется патоген.

Выводы

1. На основании блот-гибрндиз анионного анализа фрагментов геномной ДНК картофеля с последовательностями генов ГБГП и ФАЛ высказано предположение о том, что гидроксипролинбогатые г лихо-протеины и фенил ал алинамионийли аза кодируются в геноме картофеля семействами генов.

2. Установлено, что при отаете растения на стресс (поранение или инфицирование картофельных клубней) усиливается экспрессия генов, кодирующих ФАЛ, ГБГП и /3-1,3-глхжаназу. Динамика накопления мРНК, кодирующих разные защитные белки, отличается, что может свидетельствовать о существовании нескольких путей передачи сигнала, индуцирующего генную экспрессию.

3. Показано, что спектры ГБГП транскриптоз, индуцируемых разными стрессовыми воздействиями (поранением или заражением клубней Р. 1п/ез1апз), различаются. Инфицирование клубней вызывает накопление новых транскрпптов ГБГП дополнительно к мРНК, индуцируемым раневым стрессом.

4. Обнаружено, что в клубнях, обработанных индукторами устойчивости, повышается содержание ГБГП мРНК. Иммунизированные ткани приобретают способность реагировать на стресс более интенсивным накоплением мРНК, кодирующих ГБГП.

5. Выявлены различия в содержании мРНК, кодирующих защитные белки, а также в уровне активности ФАЛ в обработанных и необработанных индукторашг устойчивости клубнях после стрессовых воздействий.

0. Предложена гипотетическая схема развития индуцированной биогенными элиситорами устойчивости картофельных клубней.

Список работ по теме диссертация

[1] Горбачева (Ломова) Л.А., Дударева H.A., Юргааова Л.А., Озеред-ковская О Л., Салганик Р.И. Усиление экспрессии генов, кодирующих белки устойчивости к патогенам, в результате предобработки картофеля биогенными элиситорами // Тезисы докладов Совещания "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням", Уфа, 1988. С. 15-16.

[2] Неклюдова И.А., Горбачева (Ломова) Л.А. Изменения экспрессии генов защитных белков картофеля в результате раневого стресса // Тезисы докладов Конференции молодых ученых и студентов КазГУ, Алма-Ата, 1989. С. 53.

[3] Горбачева (Ломова) Л.А., Дударева H.A., Салганик Р.И., Чалова Л.И., Озерецковская О.Л. Индукция гена оксипролинбогатого гли-копротеида в клубнях картофеля и устойчивость растений к паг тогенам под действием элиситоров // Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990. С. 136-137.

[4] Горбачева (Ломова) Л.А., Дударева H.A., Чалова Л.И., Озерецковская О.Л., Салганик Р.И. Длительное изменение способности к стресс-индуцируемой экспрессии гена оксипролинбогатого глико-протеида картофеля под действием биогенных элиситоров // Доклады АН СССР. 1990. Т. 312. Н. 5. С. 1263-1265.

[5] Горбачева (Ломова) Л.А. Влияние биогенных элиситоров на экспрессию генов защитных белков картофеля / / Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, Минск, 1990. С. 25.

[6] Горбачева (Ломова) Л.А., Дударева H.A., Салганик Р.И. Молекулярные механизмы устойчивости растений к патогенам // Успехи современной биологии. 1991. Т. 111, в. 1. С. 122-136.