Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фитостерины и иммунизация картофеля

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фитостерины и иммунизация картофеля"

российская академия наук институт биохиши им. а.н.баха

ФИтостЕРйны и ишгаиэяш картофеля

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

на правах рукописи

КАНЕВА ИРИНА ¡¿АРКСОВНА

УДК 632.938.2

Москва - 1932

Работа выполнена в лаборатории индуцированной устойчивости

растений Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор О.Л.Озерецковская,

доктор биологических наук Н.И.Васшова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Б.А.Пасешниченко,

кандидат биологических наук А.М.Носов Ведущая организация: Институт фитопатологии Российской

в 10 ч на заседании специализированного совета (К.002.96. по присуждению ученой степени кандидата наук в Инстот биохимии им. А.Н.Баха РАН (Москва, Ленинский проспект, корпус 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологиче литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корпус I)

Академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Га. а з

Общая характеристика работы. Состояние проблемы. Современное сельскохозяйственное проззводство диктует необходимость изыскания новых средств заидты растений, которые были бы не только эффективны, но и экологически безопасны. Альтернативой защиты растений с помощью токсических фунгицидов является метод иммунизации или индуцирования устойчивости растительных тканей (Метлицкяй, Озерецковская, 1985; Ильинская, Озерецковская, 1991). Метод основан на активировании естественных механизмов резистентности растений в результате их обработки биогенными индукторами или элиеиторами, выделенными из фитопатогенных микроорганизмов. Основой для разработки принципа иммунизации послужили биогенные алиситоры, выделенные из возбудителя фитофтороза картофеля - лидагликопротеидннй комплекс (ЛГП-комплекс ), арахидоновая (АК) и эйкозапентаеновая кислоты (ЭПК) (Метлицкяй и др.,1978; Озерецковская и др., 1986).

Вызываемый с помощью этих элиситоров защитный эффект является продолжительным и системным. Последнее означает, что фитофтороустойчивость приобретают не только растительные ткани, непосредственно соприкасающиеся с элиситором, но и ткани, удаленные от места его нанесения, что свидетельствует о наличии некоего системного сигнала иммунизации, последовательно распространящегося по тканям картофеля (Озерецковская и др., 1986; Чалова и др.,1989).

Ранее показано, что возбудитель фитофтороза (Pbytophthora lnfestans (Mont.) de Вагу) является ауксотрофом в отношении стеринов (Метлицкяй и др., 1976), хотя последние облигатно необходимы этому патогену для образования спор (Васвкова и др., 197? з,Ь). Потребность в стэрзнах граб восполняет способностью поглощать их как из культуральной среда, так и из тканей растения-хозяина - картофеля, в результате чего процесс репродукции восстанавливается. Особенно эффективными в атом отношении являются у5-ситостэрш (Басюкова и др., 1977 Ь) и изофукостерин (Elliott,1972).

Таким образом, отсутствие или ингибирование спорообразования возбудителя фитофтороза является одним из показателей нзблагопряятньт для паразита изменений з качественном и количественном составе фитостеринов (ФС). А поскольку в Еглуяизгровакшы клубнях картофеля, . согласно наблюдениям диссертанта, спорообразование возбудителя фитофтороза рззко

подавлено (Канева и др.,1991), возникло предположений, что одной из причин этого является изменение стероидного биогенеза в иммунизированных клубнях картофеля в сторону, неблагоприятную для развития патогена. Предположение казалось тем более перспективным, что давало надежду понять механизмы иммунизации растений, сведения о которых к настоящему времени крайне ограничены.

К тому же стерины, как известно, принадлежат к числу биологически активных веществ, функциональная роль которых всегда привлекала внимание исследователей (Hertmann 1977; 1984; Пасешничвнко, 1987, 1992).

Б свете сказанного настоящая работа имеет целы) определить, происходят ли в иммунизировнном картофеле изменения в содержании и составе стеринов, и могут ли они быть ответственны за индуцированную фитофтороустойчивость клубней.

В качестве биогенного эляситорз использовали АК. Ранее показано, что АК вызывает системную иммунизацию клубней картофеля лишь в определенных концентрациях (порядка IO"ö-IO-7M), тогда как в концентрации порядка 10 -Ю-4М, наоборот, ингибирует иммунный статус растительных тканей (Озерецковская и др., 1987; Чалова и др.,1989).

Научная новизна работы. Установлен один из механизмов индуцирования фитофтороустойчивости клубней картофеля с помощью низких иммуностимулирувднх концентраций биогенного элиситора -АК. Механизм заключается в сокращении уровня общих ФС в иммунизированных клубнях и уменьшении в них доли фаворитных для возбудителя фитофтороза индивидуальных стеринов, что крайне неблагоприятно сказывается на развитии стеринзависимого гриба P.lnXestans. Начальный период иммунизации характеризуется подъемом и последуицпм спадом содержания iC, которые последовательно во времени распространяются по тканям клубня, начиная от места нанесения элиситора, свидетельствуя о наличии системного сигнала иммунизации. Впервые удалось рассчитать скорость распространения по тканям клубней такого сигнала, которая составляла 0,2-0,25 мм/ч или 2-3 клетки/ч.

Установлено, что механическое поранение растительных тканей, которое имеет место при инфицировании картофеля возбудителем фитофтороза, индуцирует временное увеличение уровня ФС. В этот

период удается зарегистрировать значительные количества циклоартенола, не регистрирующегося в интактных тканях, а также наблвдается повышение доли кзофукостерша.

На основе проделанной работы выдвинуто предположение о наличия пяти • последовательных этапов инуягоац®- клубней картофеля низкими концентрациями биогенного элиситора.

Практическая зкачгность работа. Подученные результаты позволяют вести целенаправленный поиск биогенных элиситоров, изменяющих метаболизм К картофеля в сторону, неблагоприятную для паразита. Выявление одного из механизмов икыунизации картофеля сдуггть базой для селекционной работа, направленной на выведение фитофтороустойчивых сортов картофеля.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции "Фитонциды. Бактериальные болезни растений" (Львов, 1990), на IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Минск, 1991), на XY International Congress of Biochemistry,(Jerusalem, Israel, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

i. материалы и методы исследования

Обьектзия исследования служили клубни картофеля сорта Теми с геном фитофтороустойчивостя Rj- н расы возбудителя фатофтороза (P.lntestans), различаодяеся по генам вирулентности: несовместимая с используемым сортом картофеля - 3,4 и совместимая -1,3.

Расн гриба выращивали в течение IQ дней на стерильноЗ овсяно-агаровой среде. Для инфт-щированяя картофеля использовали суспензию зооспор плотностью 5*10 зооспор/мл. Помимо возбудителя фатофтороза в ряде экспериментов картофель инфицировали также возбудителем ризоктониоза (Rhizoctonia solanl).

Из зоны центральной паренхимы клубней картофеля вырезали диски диаметром 16 ж и высотой 5-7 мм, которые инфицировали суспензией зооспор. В ряде случаев за 2 ч перед инфицированием на поверхность дисков наносили до 50 мкл водного раствора АК ("Merck", Германия) в различных концентрациях.

Оценка результатов шфщирования осуществлялась с помощью метода биотестирования (Чаленко и др. 1980). Микроскопически

оценивали: I. число клеток клубней картофеля, некротазирущихся (инфицированных) в ответ на проникновение несовместимой расой гриба; 2. глубину распространения гиф совместимой расы патогена до тканям дисков клубней; 3. интенсивность спороношения патогена на инфицированной поверхности. Данные микроскопических наблюдений обрабатывали статистически.

Модели экспериментов, использованные в работе, представлены на рис.1.

Рис.1. Модели экспериментов.

(Заштрихованные ткани подлежат исследованию).

Нанесение АК или воды | I

Инфицирование

I-

Модель дисков

5 > ■щ

щшииниш

< 1с

•«-Верхний кслой ^Подлежа-^щий слой . Средний слой

2-

V Модель f цилиндров

3-

► Модель клубней

Выделение свободных стеринов осуществляли по методу Метлицкого (Метлицкий и да., 1976),' вклшчащего экстракцию К смесью н-гексан : 1535 КОН в 70Ж-яом этанола (соотношение 1,5:1) (500 мл смеси на 100 г сырой ткани) на водяной бане при 90° в токе азота 3 ч при постоянном помешивании, осавдение стеринов из липидной фракции в виде дигитонидов с последующим разрушением комплекса дигитонидов и экстракцией стеринов гексаном. Полученные

фракции ствридав анализировали с помощью ГЖХ и ГЖХ-масс-спектромбтрии. - -

ГХХ проводили на хроматографе Chrom-5, Laboratornl prlstreje (ЧСФР), снабженным пламенно-ионизационным детектором. Для анализа использовали стеклянную колонку, заполненную 3%-тм 0V-I7 на хроматоне NAWBKCS ( размер частиц 0,16-0,20 кэш). Скорость тока азота составляла 55 c.vfVran, водорода - 20 см3/мин, воздуха -300-400 сМ®/мин. Температура колонки, испарителя и детектора -270°. Стерши вводила в колонку в растворе этилацетата. Идентификации соединений осуществляли по сопоставлении времени их удерживания со временем удергтегтттт.т сзцдатохз2: хашстарина, стигмастерзыа, ситостерина.

Идентификацию стеринов с помоцью ГЖХ-йС проводили за хромато-масс-спектрометре KRAT0S HS-25-RFA (Великобритания) в виде ацетатов. Для анализа использовали стеклянную капиллярную колонку (25 м i 0,2 мм), заполненную 1%-иим 0V-I. Температурный режим: 200-290° при возрастании температуры 2°/мин. Энергия ионизации 70 эВ.

Количественное определение стеринов проводили методом внутреннего стандарта (ацетат дегэдропрегкеяолопа). На диаграммах и в таблице приведены средние арифметические из 3-х биологических проб, определенных в 3-х аналитических повтордастях.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ й ИХ 0БСУ2ДЕНИЕ

2.1. ВЛИЯНИЕ АК НА РОСТ МИЦЕЛИЯ It ИНТЕНСИВНОСТЬ СП0Р0Н0ШЕНИЯ P.lniestans И R.solanl В ТКАНЯХ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

Полученные результаты показали, что иммунизация клубней картофеля АК в низких концентрациях (10-8-10-7М) значительно сильнее подавляла спороношение возбудителя фатофтороза, чем рос? его мицелия (рас.2): развитие мицелия подавлялось менее чем на 40Я, тогда как образование зооспор оказалось полностью ингибироввнным.

Поскольку P.lniestans является ауксотрофом в отношении сторпнов, iai сочли необходимым провести аналогичные исследования на другом патогене картофеля - R.solanl, процесс спороношения которого на зависит от наличия стеринов в среде обитания (Wood, Gottlieb, 1978 а, Ь). Для этого диски из иммунизированных клубней

- е

Рис.2. .

Влияние АК на рост мицелия (I) и споро-ношение (2) возбудителя фитофтороза на дисках клубней картофеля, (рис. I, модель I).

Концентрация АК, М

картофеля инфицировали этим патогеном, а затем учитывали рост его мицелия и интенсивность спороношения.

Как и ожидалось, тмунизация картофеля в равной мере сказывалась как на распространении мицелия й. Бо1ап1 по тканям клубня, так и на процессе спороношения патогена (подавление и в том, и в другом случае составляло 33-3955).* Избирательного ингибирования процесса спорообразования, как это имеет место у Р.ЗлГезгапз, у Я.Бо1ап1 не наблвдалось. Обнаруженный факт лишний раз подтвердил правомочность нашего предположения о наличии дефицита стеринов в иммунизированных клубнях картофеля и подтвердил необходимость исследования их качественного и количественного состава.

»Подавление развития Н.Бо1ап1 в тканях иммунизированных клубней объясняется индуцированием общей неспецифической устойчивости, основанной на активации защитных систем растений-хозяина, направленной на подавление развития многих болезней, вызываема грибными и бактериальными патогенами (Метлицкий идо., 1978).

- 7 -

2.3. ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА И СОДЕРЖАНИЯ ФС КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ В ПРОЦЕССЕ РАНЕВОЙ РЕПАРАЦИИ

Прежде чем приступить к изучению качественного и количественного состава ФС в иммунизированных тканях клубней картофеля, ка ставили своей целью исследовать влияние раневого стресса на интересупцие нас параметры. Дело в том, что инфицирование растений ({ито патогенами, в том числе и заражение картофеля возбудителем фитофтороза, неразрывно связано с поранением растительных тканей. Кроме того, известно, что раневой стресс оказнвввт значительнее вхиятаа на разнооорчотне процзсск катаболизма, протекаиздие в растениях (Bostock, ¿termer, 1989). Предполагается, что большинство этих изменений может быть связано с биогенезом мембран (Hartmann, Benvenlste 1974; Waring, Laties, 1977), происходящим вследствие возобновле,пя меристематической активности клеток в зоне поранения и образования раневой перидермы. Стерины же считаются универсальным компонентом цитоплазматических мембран высших растений и часто рассматриваются как их маркеры (Grunwald, 1970; Hartmann et al.,1973).

Для того, чтобы адекватнее воспроизвести процессы, протекающие в инфицированных растительных тканях, мы использовали в качестве модельной системы разрезанные пополам и залечешшс во влажной камере клубни картофеля. Через 12, 24 и 60 часов залечивания из половинок клубней вырезали цилиндры (рис.1, модель 2). Различные по удаленности от пораненной поверхности слои цилиндров анализировали на содержание стеринов. В качестве контроля использовали соответствующие тканн интактных клубней.

С помощью ГЖХ и ГЖХ-масс-спектроматрии удалось подтвердить ранее полученные данные о том, что свободные стерины интектныг клубней картофеля в основном представлены л-ситостерином, изофукостерином, стишастерином, холестерином и кампестарином (Васшова и др.,1У77 a; Duperon et al., 1984; Brlndle et al., 1988).

В процессе раневой репарации происходили существенные изменения в колете ственном содержания 4С (рис.3). Уровень стеринов резко возрастал, достигая максимума примерно через 24 ч, а затем через сутки начинал падать и к GO часам после поранения возвращался к исходному уровню.

в к ей

- «

я о

Шо,

я

п< а <»

ы и о -ч. и

РИС.3.

Содержание сте-ринов в различных слоях цилиндров из клубней картофеля в процессе раневой репарации. £33 -Верхний

слой В| -Подлежащий слой -Средний слой

О 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Бремя репарации, ч

Интересно отметить, что подобное временное увеличение уровня ФС, вызванное поранением клубней картофеля, обнаруживалось не только в тканях, непосредственно прилегающих к месту повреждения (верхний слой), но и в тканях, удаленных от него: подлежащем и среднем слоях (рис.3). При этом увеличение уровня ФС во всех исследуемых слоях начиналось , достигало максимума и завершалось практически в одно и то же время.

Для раневой репарации характерно не только увеличение количества стеринов, но и качественные изменения в их составе (рис. 4). Если в интактных тканях картофеля превалировал уз-ситостерин, то в процессе репарации его относительное содержание уменьшалось, и ведущим стерином исследуемой (Цзакции становился изофукоетерин. .С течением времени доля изофукостерина падала, однако, и к 60 ч после поранения он продолжал оставаться основным стерином фракции.

В период максимального подъема уровня ФС в ответ на поранение в клубнях картофеля в заметных количествах было обнаружено соединение стероидной природы, которое не регистрировалось методом Ж в интактных клубнях ( * 6 на рис.4). В более поздние сроки раневого залечивания это вещество вновь не удавалось уловить. Проведенная с помощью ГЖХ-масс-сшктромэтрин идентификация показала, что обнаруженное вещество аналогично циклоартенолу.

Рис. 4.

Содержание отдельных ФС в верхнем слое цилиндров из клубней картофеля в течение рзнавой репарации.

1- холестерин;

2- кампастерин;

3- стпгмастврпн;

4- /з-ситостернн;

5- изофукостерян;

6- циклоартенол.

О

12 24 60

Время репарации, ч

Поскольку циклоартенол является нервам циклическим предшественником в биосинтезе ФС, то изменения в его содержании на фоне резкого возрастания уровня ФС свидетельствуют об активации биосинтеза стеринов, происходящей в тканях картофеля в процессе раневой репарации.

2.3. ВЛИЯНИЕ АК НА СОСТАВ И УРОВЕНЬ ФС В ЦИЛИНДРАХ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ. 2.3.1. Действие АК в иммуностимулирущих концентрациях не содержание стеринов

Моделью исследования в настоящем, как и в предыдущем разделе, служили цилиндры, полученные из разрезанных пополам клубней картофеля, раневая поверхность которых обрабатывалась АК (10 М). Спустя 12,24 и 60 часов из половинок клубней вырезали цилиндры, различные слои которых исследовали на содержание стеринов (рис.I, модель 2).

Обработка механически поврезденной поверхности клубней картофеля АК в иммуностимулирующей концентрации вызывала увеличение содержания 4С в тканях верхнего слоя цилиндров еще более сильное, чем при поранении. Так, если при раневой репарации зарегистрированный наш максимальный уровень ФС в ответ па поранение лишь вдвое превышал исходный (рис.3), то в случае использования АК в тгхунизируыцей концентрации он превосходил его

.Чо менее, чем в пять раз (рис.5). Быстрое возрастание содержания стеринов через 12 часов после обработки АК в верхнем слое сменялось столь же резким его падением.

Подобная картина имела место и в нижерасположенных слоях цилиндров (подлежащем и среднем). Однако протекающие здесь процессы отставали по времени. В каждом из этих слоев происходил подъем, а затем спад содержания стеринов, причем тем быстрее, чем ближе к поверхности обработки АК находился этот слой. Так, если максимальное количество стеринов в верхнем слое приходилось на 12 ч, то в подлежащем слое - на 24 ч. В среднем слое, судя по характеру кривой, максимальный уровень ФС соответствовал примерно 36-40 ч с момента нанесения на диски АК (рис.5).

» х

3 ЕН ¡0

а гз

Он О

<ю а

м з

о о

1800 1600 1400 1200 1000

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Время инкубации, ч

Рис. 5.

Содержание стеринов в различных слоях цилиндров из клубней картофеля, обработанного АК (10"7М).

1- Еа

слой

2- вн -Подлежа-

щий слой

3- к® -Средний

слой

С нашей точки зрения, чрезвычайно интересны Данные, характеризующие содержание стеринов по слоям к 60 ч после обработки поверхности АК в иммуностимулирующей концентрации. Судя по характеру кривых, в результате обработки АК содержание стеринов после временного подъема не возвращалось к исходной норме, как это имело место при поранении (рис.3), а продолжало падать. В результате количество ФС в верхнем слое цилиндров к 60 ч составлял лишь ЗОЖ от контроля. Что касается подлежащего и особенно среднего слоев, реакция которых на обработку элиситором запаздывала, то к 60 ч определения, они, вероятно, еще не успевали достигнуть низкого конечного уровня содержания стеринов.

По-видимому, в результате обработки раневой поверхности

луояей картофеля АК (ХСГ'М) в их тканях возникает некий сигнал, ницйируиций резкий подъем и последующий спад уровня стеринов, оторта последовательно волнообразно распространяются от овврхноста обработки вглубь цилиндра. Не исключено, что подобное влекие - одно из проявлений системного сигнала иммунизации.

.3.2. Действие АК в иммуноингибирувцах концентрациях на содержание стеринов

Ваше ухе упоминалось, что обработка клубней картофеля АК в осокой концентрации (10_4М) усиливала их "оря^тго зсзйудатедам итофторозя. Проведенное нами определение количества стерзнов в азличных слоях цилиндров, вырезанных из половинок клубней артофеля, поверхность которых обрабатывали АК в ммуноингибирущей концентрации, позволило получить данные, редставлевнне на рис.6. Оказалось, что в поверхностных тканях шшндров после обработки АК содержание стеринов возрастало, даако это повышение было существенно слабее, чем в тканях,

_7

бработанных АК (10 М): уровень стеринов превосходил исходный ишь в 3 раза. Однако главное отличие зоздойствия имуноингиоируэдей концентрации АК от хммуностздулирущей аявилось к 60 часам после обработки. Так, если при воздействии ■С (10~7М) уровень ФС после временного подъема резко падал, ричем ниже исходного уровня (верхний слой), то при воздействии { (Ю~4М) содержание свободных ФС почти не уменьшалось, так что шэ к 60 ч после обработки их количество в 2,5 раза превышало держание в контроле.

| Рис. 6

Содержание стеринов в различных слоях цилиндров из клубней картофеля, обработанного АК (Ю_4М).

1-

2-

1400

1200

в 1000

«

а 800

я

-н

а

в« 1 о 600

ха,

э я

* о ) 400

и

(ч 200

X

Я

0

слой

-Подлежащий слой

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 ъО Время инкубации, ч

Изменение содержания стеринов в тканях подлежащего ело носило сходный характер, только было несколько сдвинуто в времени: максимум ФС приходился на 24 ч с момента нанесения ДК.

2.3.3. Влияние АК на содержание фаворитных для возбудителя фитофтороза стеринов.

Как упоминалось выше, наиболее благоприятствуют развита Р.1пГеэгапз изофукостерин и л-ситостерин. _ Проведении исследования показали, что характер изменения содержания эти стеринов под влиянием обработки АК максимально соответствова характеру изменения общих стеринов. Использование иммунизирующе концентрации ¿К вызывало резкий подъем и не менее резки последующий спад уровня изофукостерина в исследуемых тканях, так что его конечное содержание оказывалось значительно ниже контро! (рис.7). Напротив, применение высоких концентраций АК не толь» не приводило в конечном итоге к спаду уровня изофукостерина, не наоборот, вызывало постепенное повышение его содержания обработанных тканях. Аналогичную картину мы наблюдали и отношении изменения уровня гз-ситостерина. Иными слова! иммунизация тканей картофеля вызывает уменьшение содержав фаворитных для фитофторы стеринов, тогда как обработка картофе. АК в иммуноиягибирухщих концентрациях ведет к повышению 1 уровня..

1.8

Изменение содержания изофукосте рина в вер нем слое и линдров г клубней кг тофеля пс влиянием А

1-АК (Ю-'

2-водой;

3-АК (10"'

Обра бот* .»и /тгГ^

Рис. 7.

г

о

О 12 24 36 48 .60 Время инкубации, ч

Вполне естественно, что наблвдаеше изменения в уровне и >ставе ОС в тканях картофеля под воздействием АК не могут не гразиться на _ развитии в обработанных тканях стеринзавасимого )збуднтеля фатофтороза, вызывая подавление развития паразита в .?<уяизированной ткани и стимулируя его при обработке тканз» АК в ¿сокой концентрацзи.

2.4.ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ АК НА СОДЕРЖАНИЕ

И СОСТАВ ФС

Для того, чтобы проверить справедливость нашего рид1,ютиаа о взаимосвязи прчйяюняя/ииияялия Зтафгоро-стс-йчзвссти клубнай картофеля с уменьшением/увеличением уровня еобходимых для фитофторы ФС,, мы провели сериию экспериментов на одели, исключающей поранение - на целых клубнях картофеля рис.1, модель 3).

Преимущество целых клубней состояло также в возможности роведения длительных экспериментов (сроком до 4 месяцев), что евозможно при использовании модели дисков, цилиндров и даже оловинок клубней.

Клубни картофеля с поверхности обрабатывали АК в различных онцвнтрацнях. Анализировала дайся, вырезанные из центральной

рис. 8.

Содерааниэ стеранов (кривая) и развитие Р-шГезгапэ (столбики) в тканях дисков из клубней картофеля .(Диски вырезаны из клубней картофеля через 7 дней посла обработки АК).

¡3 -количество кекротизиро-ванпых клеток (несовместимая раса); и -глубина проникновения совместимой расы; — -интенсивность споро-ношеная совместимой расы.

аренхима, не соприкасавшиеся с элиситором.

Н20 10"4 Ю-5 10"7 Ю"8

Концентрация АК, М

Как и следовало ожидать, нанесение АК в высоких концентрациях снижало резистентность тканей картофеля к возбудителю фитофтороза. Низкие иммунизирующие концентрации вызывали прямо противоположный эффект: развитие обеих рас патогена в иммунизированных тканях оыло подавлено, что особенно хорошо видно по ингибированию спороношения совместимой расы патогена. Спороношение патогена на дисках из клубней, обработанных АК (Ю_8М) вообще отсутствовало. Поскольку исследованию подвергались диски, вырезанные из центральной паренхимы клубней, не соприкасавшиеся с АК, то наблвдаемый на них! защитный аффект, является системным.

Определения показали, что более интенсивному развитию патогена на клубнях картофеля, обработанных АК в высоких концентрациях, соответствовал повышенный уровень ФС, тогда как повышение фитофтороустойчивости сопровождалось пониженным их содержанием (рис.8).

2.5. СОДЕРЖАНИЕ И СОСТАВ СТЕРИНОВ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ В ПЕРИОД ИММУНИЗАЦИИ

Если в предыдущей части работы изучался состав и уровень ФС в начальный период иммунизации, в момент ее индуцирования и системного распространения устойчивости по тканям клубней, то задачей настоящего раздела было исследовать содержание и состав ФС на фоне уже наступившей пролонгированной иммунизации, а затем при выходе из нее. Сравнительным вариантом здесь, как и в предыдущих опытах, служил вариант иммуноингибирования клубней (обработка АК (10~4М)).

Клубни картофеля, обработанные водой (контроль), а также АК в концентрациях (Ю-4 и Ю-8!!), хранили в течение 120 сут, периодически отбирая часть их для анализа. Параллельно в каждый срок контролировали степень иммунного статуса клубней, о чем судили по интенсивности спороносения возбудителя фитофтороза на исследуемых тканях.

Судя по данным биотестирования, иммунизация наступала на 7-е сутки после обработки АК (10-7М), продолжалась в течение 4 месяцев, а затем постепенно исчезала (рис.9). В период иммунизации спороношение совместимой расы возбудителя фитофтороза было подавлено. Спустя 4 месяца способность патогена образовывать

юры на ранее иммунизированных клубнях начинала постанавливаться. Изменение количества с те рилов в тканях эртофеля в эти сроки полностью соответствовало изменении *муяизируицих свойств.

Иная зависимость обнаружена при обработке клубней «уноингибируищей дозой АК. Уже на 7 сутки после обработки сражение картофеля совместимой расой патогена вдвое превышало знтроль. Соответственно резко возрастало содержанке ФС (рис. 9). ргда эффект высоких доз АК исчезал (120-ые сутки), уменьшался и ровень стершов.

250

7 30 45 90

Время после обработки, сут

120

Ряс. 9.

Уровень стери-нов в клубнях картофеля и интенсивность спороношения Р.1п1езгаш на них в разные сроки после обработки клубней АК.

1-количество стеринов

(АК (Ю~4Ы));

2-интенсивность спороношения

(АК (Ю"4М));

3-количество стерипов

(АК (10~'м));

4-интенсивность спороношения

(АК (10~7М));

В иммунизированных клубнях картофеля наш обнаружены и чественные изменения в составе ФС: доля уэ-ситостеряна и офукостерина, наиболее соответствувдих пищевым потребностям збудителя фитофтороза, в период иммунизации картофеля оказалась вое пониженной по сравнению с контролем (таблица I). В это же змя наблвдалось повышение доли кампестерина, который, как зестно (Elliott, 1972), не соответствует пищевым потребностям збудаггеля фитофтороза. Подобные изменения в качественном ;таве <К наряду с уменьшением их общего количества создают Шгоприятные условия для развития патогена в иммунизированных

тканях картофеля. По мере выхода тканей из состояния иммунизаци соотношение отдельных компонентов фракции ФС восстанавливалось.

АК в иммуноингибирувдих концентрациях (10_4М) такого эффект не вызывала: содержание стеринов в этих тканях возрастало, н соотношение их отдельных компонентов почти не изменялась.

Таблица.I

Содержание кампестерина, ситостерина и изофукостерша в клубня] картофеля в различные сроки после их обработки АК (% от общег|

содержания)

СТЕИШЫ ОБРАБОТКА КЛУБНЕЙ

Вода (контроль) АК. и Вода (контроль) АН, М

Ю-4 Ю-8 Ю"4 Ю-8

Чарез 7 суток через 120 суток

кампестерин 1,0 4,0 24,7 4,5 7,0 ?,Е

ситостерин + изофукостерин 88,0 85,5 49,5 60,6 74,4 73,£

3.ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проделанная нами работа позволяет полагать, что превращен] стеринов играют ключевую .роль в системной продолжительна фитофгороустойчивости картофеля, индуцированной биогенн элиситором - АК. Уменьшение количества стеринов (в яесколь раз), сопровождаться изменением их состава в сторон неблагоприятную для патогена, вероятно, служит одной из прич подавления развития Р.1ггГезгапз и особенно процесса е воспроизводства в иммунизированных клубнях картофеля. Последа представляет особый интерес, поскольку не только сдержим развитие инфекции на конкретном клубне картофеля, но препятствует ее распространению спорами ю всей масс хранящегося картофеля.

Нам представляется, что выполненное исследование позволите

шестноя мере расширить наши представления о биохимических (хаяизмах индуцирования устойчивости растений оиогенными аиситорами фитопатогенов вообще. Однако мы отдаем себе отчет в )м, что использованная нами модель, не может быть сстранслирована на другие растения и другие злиситорц, поскольку га ограничена рядом особенностей, присущих только использованным ами объекатам: картофелю, АК в качестве биогенного элиситора и терянзависимому возбудителю фитофтороза. Точнее было бы сказать, то полученные данные позволяют понять один из механизмов ммунизации картофеля с помощью АК.

Одним из интереснейших моментов индуцирования устойчивости

^астгтельпш тканая является вопрос о наличии системного сигнала ммупязацяи, природа которого до сих пор неизвестна. Полученные в аботе данные не только подтвердили наличие такого сигнала, но (аже позволили примерно оценить скорость его распространения, 'ак, если принять, что временный подъем биосинтеза стеринов, о гатором речь шла раньше, является одним из показателей )аспространения системного сигнала иммунизации, то анализируя :двиги во времени максимальных уровней ФС в различных слоях [илиндров, возможно оценить скорость распространения такого сигнала. Поскольку содержание стеринов в верхнем слое цилиндров ; 1—3 мм от поверхности обработки) достигало максимального уровня й 12 ч с момента нанесения элиситора, в подлежащем слое (4-6 мм) ■ за 24 ч, в в среднем слое (9-11 мм) - ориентировочно за 40 ч, ■о скорость распространения системного сигнала составляла ),2-0,25 мм/ч. Зная, что средний размер клеток центральной гаренхимы клубней картофеля сорта Темп - 80 мкм, можно (пределить, что системный сигнал проходит примерно 2-3 клетки за :ас.

Близкие результаты можно получить на основе ранее ыполиенных работ (Озерецковская и др.,1986) при расчете скорости аспространония сигнала, индуцирунцего распространение системной атофтороустойчивости после обработки клубней картофеля АК в ммунизирупцей концентрации.

Совпадение расчетных значений интересно с двух позиций: о-первых, благодаря им, впервые, насколько нам известно, удалось досчитать скорость распространения системного сигнала ммунизации; во-вторых, полученные данные свидетельствуют о том, то временный подъем биосинтеза стеринов, сопровояййищяй начало

- 18 -

процессе иммунизации, может служить его маркером.

На основе проделанной работы мы сочли возможным предложил несколько последовательных этапов иммунизации клубней картофел{ (рис.10).

Рис.

в:

я о к

я м я о.

Ю. Последовательные этапы иммунизации и соответствующие им изменения уровня ФС в клетках картофеля, обработанного

АК

(10"8-10-7М).

Контроль

иммунизированная ткань

1- Формирование сигнала иммуниза

ции.

2- Распрос гранение сигнала иммунизации.

3- Начало иммунизации.

4-Собствен-во иммунизация.

5- Выход из состояния иммунизации.

12 3 4 5

Этапы иммунизации

1. Период от нанесения элиситора до формирования сигнала иммунизации. Как известно, АК в тканях картофеля не удается зарегистрировать далее I мм от места ее нанесения ^егтег, Возгоск, 1987). Это говорит о том, что сама по себе АК не не сеч на себе функции сигнала иммунизации, а скорее индуцирует егс возникновение. О длительности этого процесса пока судить трудно.

2. Период от формирования сигнала до его получения растительно! тканью. Длительность этого периода прямо пропорциональнг удаленности ткани от места нанесения элиситора: чем дальш: расположена ткань, тем длившее путь сигнала. В этом случае сложнс говорить о длительности этого периода, а лишь о скорост! распространения сигнала иммунизации, о чем было сказано выше.

3. Период перестройки обмена и структуры растительной ткани, длящейся от получения сигнала до наступления иммунизации. ; картофеля он продолжается от 48 до 96 ч (возможно и более) 1

:шочается в радикальной перестройке ультраструктуры клеток латонова и др., 1986), возрастании активности ряда ферментов и цитннх веществ, нзмепопии конфигурации кеморан. Все это исходит нэ фоне временного подъема я последующего спада уровня зринов.

Период собственно иммунизации, которая в зявнсжвстл от стоятвльств мохет продолжаться от нескольких недоль до года, ровень ФС в это время минимален).

Период постепенного выхода из состояли иммунизации, когдв :ань возвращается к исходному состоянии. Длительность этого риода предположительно измеряется неделями. Содержание и состав ¿¿извращаемся к исходной норда.

6.ВЫВОДЫ.

1.Установлен один из механизмов индуцирования фитофторо-тойчивости клубней картофеля биогенным злиситором - АК. Он ¡сличается в сокращении уровня общих ФС и уменьшении доли воритных для возбудителя фитофтороза индивидуальных стеринов, э неблагоприятно сказывается на развитии стеринзавистаой 1пГезтапз.

2.Начальный период иммунизации харгктеризуется временным сгьемом а последующи* спадом содержания ФС, которая во врага пи следовательно распространяется по тканям клубней картофэля, шная от места нанесения злисятора.

3.Полученные данные подтвердили наличие системного сигнала |унизации а впервые позволили рассчитать скорость его ;простраиения, которая составляла 0,2-0,25 им/ч или 2-3

!тхи/ч.

4.Механическое поранение растительных тканей, которое [ровоздает инйщироввнго картофеля возйудзтэгам' фитофтороза. ¡уцирует временное увеличение уровня свободных ФС, в точение ■орого регистрируется Еначлтельша количества циклоартенола, ■орый не удается зарегистрировать в интактных тканях, овременно повышается доля изофукостерина.

5. Подавление фитофтороустойчипости клубней хяртсфэля, вботвнних АК (10""*!.() может объясняться возрастанием содержания

что благоприятствует развитии патогена.

- 20 -

6.На основе проделанной работы предложена схем последователльных этапов иммунизации клубней картофеля низким концентрациями ¿К.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1) Канова U.U., Чаленко Г.И., Васшова H.H., Озерецковская О.Л. Стериш иммунизированных клубней картофеля // Физиология растений. 1991, Т.38., N 6, С. II88-II97.

2) Канева И.М., Чаленко Г.К. Стерины иммунизированных клубней картофеля // Тезисы IX Всесоюзного совещания по иммунитету! растений к болезням и вредителям Минск, 1991. Т. 2, С. 235.

3) Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Караваева К.А., Канева И.М Характер супрессии фитоалексинообразования при совместимо! взаимодействии расы возбудителя фатофтороза и сорта картофеля /. Прикладная биохимия и микробиология . 1993, N I. с.

4) Канева И.М., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л., Курапов П.Б Стерины в процессе раневой репарации клубней картофеля/. Прикладная биохимия и микробиология . 1993, N 2.

5) O.l.Ozeretskovskaya, N.I.VasJukova, I.M.Kaneva Potat terpenoid biogenesis under stress condition // Thesis of XY International Congress ol Biochemistry, 1991, Jerusalem, Israel, p.49.

Зак.5241Р Тир.125 экз. Уч-изд.л. 1,2

10.12.92 г.

Отпечатано на ротапринте в 0Н1И ПНЦ РАН