Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ РАДИОЗАЩИТНЫХ ОБЛИДИНЕНИЙ ИЗ КЛАССА ЗАМЕЩЕННЫХ САЛИЦИЛАНИЛИДОВ НА МЕМБРАНЫ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ РАДИОЗАЩИТНЫХ ОБЛИДИНЕНИЙ ИЗ КЛАССА ЗАМЕЩЕННЫХ САЛИЦИЛАНИЛИДОВ НА МЕМБРАНЫ"

З Г ¡8

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ПШ СОВЕТЕ МИНИСТРОВ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСЮЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи

ЧЕНГИЩЕВ Владимир Васильевич

УЖ 577.352.3

ИССЛЕДОВАНИЕ » , ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ РАДИ03А11ЩН^.«Г0ЕДШЕН№-» ИЗ КЛАССА ЗАМЕЩЕННЫХ САЛШИЯАНИВДДОВ НА МВ5БРАНН

( 03.00.01 - Радиобиология )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 1990 г.

Гйбога выполнена в Институте биологической йжзики АН СССР

Научные руководители; доктор биологических наук»

профессор И.Г.Акоев,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.Ф.Кожокару

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор З.А.Вударков,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.С.Шевченко

Ведущая организация: Московский Государственный

Университет им.М.В.Ломоносова

Защита состоится " !/ " fo^/tó-^990 г. в " Ч"часов на заседании Специализированн^гЧуровета по радиобиологии Д 120.81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Го с ноше си к rio продовольствию и закупкам при Совете Министров СССР по адресу: г.Москва, Волков пер.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного нвогчно-исслеломтвльского института сельскохозяйственной радиологии.

Отзывы просьба направлять по адресу: 249020,г.Обнинск, Калужской области, ВНИИСХР, Специализированный совет Д 120.91.01.

Автореферат разослан " Ь " 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета .'ЕЧдидат биологических наук

Н.И. Сатарова

ОБЩАЯ ХАРАКТ ¡ИСТИНА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение факторов,определяющих радиочувствительность клетки,а также их модификация химическими соединениями являются одними из центральных проблем радиобиологии.

При изучении механизмов радиационной гибели клеток,внимание и сс ледователей-радиобмолотов,наряду с клеточным ядром и ядерным хроматином направлено на клеточные,в частности,на плазматические мембраны и митохокдрии,игращие определенную,а в ряде случаев и определяющую роль в реакции клеток на облучение.

Острая потребность в более эффективных и менее токсичных рздиоггротекторак,необходимость в их целенаправленном поиске и с я нт ез е,выя с нение механизмов радиозащитного действия и вклада структурных перестроек и проницаемости для ионов мембранных систем клетки,в реализацию радиозащитного эффекта стимулировали работы по исследованию разнообразных синтетических и природных соединений^ том числе и соединений фенольного ряда. -

Состояние мембран определяет многие процессы метаболизма клетки,от которых,б конечном итоге,зависит устойчивость самой клетки к облучению.Исследование изменений в мембранах,происходящих под действием замеченных с алк цилани лидо в (ЗСА)-синтетических соединений фенольного рдца,обладающих по предварительным данным (Кококару и др.,1982,1983) радиозащитной активностью и мембрано-тропными свойствами,позволило бы выяснить каким образом,воздействуя на мембрану химическими соединениями,модифицируя ее,молено добиться увеличения рздиоустойчивости клетки,а также выделить существенные для радиорезистентности эффекты,которые можно обозначить как факторы радиозащитного действия соединений данного класса.

В настоящей работе исследовано действие II соединений из класса ХА на некоторые свойства модельных и биологических мембран и на окислительное фосфорилирование СОФ) в ми тохо ндри ях.Завершающи м этапом являлось исследование токсичности и некоторых радиозащитных характеристик ХА на животных (белые беспородные мыши-самцы).

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование молекулярного механизма действия потенциально радиозащитных соединений из новоеннтезированного класса биологически активных замещенных салнциланилидов на модельные и клеточные мембраны.Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

I.Экспериментально исследовать действие ЗСА на различные

мембранные системы.

ЦЕНТРАЛЬ! 'Л Л

НАУЧплЯ и. .^д;ОТЕКА Моек, еелосясхоз, г-кйд^.'^н им К. А- 'м-рлгева

ал___

Г', ф

2.Определить связь' химической структуры препаратов с их действием на эти объекты.

З.Исследовать радиозащитную эффективность ЗСА в опытах с обручением животных и установить связь ее с биофизическими характеристиками действия ЗСА на мембраны.

При постановке целей и задач настоящей работы учитывались имеющиеся данные о наличии радиозащитной активности у различных феноль-ных соединений (Оа1гутр1е еъ 1967,гманузль,1968,Бурлакова и др., 1975,Барабой,1976,1984) и о связи иротонофорной активности некоторых соединений из класса одно- и двухосновных кислот,бензимидаз о-лов,природных флавоноидов,аминотиолов и других веществ, юс способностью разобщать окислительное фосфорилирование с радиозащитной активностью.

Научная новизна. Б работе впервые показано:

Исследуемые ЗСА индуцируют протонную проводимость в бислойных липидных мембранах (КИМ), стимулируют или ингибируют дыхание в митохондриях, разобщая ОФ. Эффективность их действия определяется химической структурой, наличием гидроксильной, группы и галогенными заместителями в молекуле препарата,

ЗСА, эффективные на БЛМ как протонофоры, более эффективно подавляют Са- и К-токи соматической мембраны моллюска.

Под действием ЗСА может снижаться микровязкость мембран. С величиной снижения микровязкости может быть связано наличие или отсутствие радиозащитной эффективности препаратов.

Большинство из исследуемых ЗСА нетоксичны вплоть до концентрации 10-3М в организме. Исследуемые ЗСА снижают гибель животных, облученных в летальной и сверхлетальной дозе гамма-облучения. Фактор изменения дозы наиболее эффективного препарата Г-992 равен 1,54.

Установлена связь радиозащитной эффективности ЗСА на животных с их протонофорной активностью на КЕМ,в нетоксичной концентрации КГ^М.

Практическая значимость. Результаты работы позволяют дать практические рекомендации, связанные с использованием некоторых из изученных ЗСА для защиты человека и животных от ионизирующей радиации, а также расширить представления о механизме их радиозащитного действия, ранее предложенном Кожокару (1983). Механизм радиозаштного действия ЗСА может Сыть полезен и для понимания механизмов радиозащиты протекторами из других классов веществ, а также механизмов действия ЗСА и их аналогов при использовании их в качестве противо-бактерищдных, фасциолошщных и фунгицидных средств.

Подтверждена возможность использования комплексного биофизического экспресс-метода, примененного в данной работе, для скри-

нинга новых протонофоров с целью оценки их потенциальной радиозащитной активности и токсичности (Колсокару и др,,1982,1983), который заключается в поэтапном исследовании радиопротекторов: первичный отбор препаратов, основанный на анализе их структуры, проверка их активности на различных модельных и биологических мембранных системах, изучение радиопротекторов на животных.

Результаты диссертационного исследования могут быть также полезны и для направленной модификации препаратов фенольного ряда с целью получения эффективных и менее токсичных радиопротекторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

Препараты из класса замещенных салициланилидов, эффективно защищаздие животных от гамма-радиации, разобщают окислительное фосфорилирование в митохондриях при концентрациях 10""-10"% и ин-гийируют дыхание при концентрациях 10"^-10"%.

Разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях обусловлено протонофорной активностью препаратов.

ЗСА, обладающие радиопротекторным действием в радиозащитней концентрации 10"%, снижают мшсровязкость мембран на 0,5-1,0 сПз, в то время как ЗСА, не обладающие радиопротекторным действием, не влияют на этот параметр мембраны.

Исследованные ЗСА обеспечивают радиопротекторное действие в основном за счет создания внутриклеточной гипоксии, а также за счет задержки клеточного цикла на стадиях интерфазы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на первой республиканской конференции по биофизике (Кишинев,1984),на третьем Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Пущино,ГЭ84), на пятой и шестой конференциях молодых ученых Института биологии КФАН СССР (Казань,1985,1938),на Всесоюзной научной конференции, посвященной 50-летию Института ботаники АН Азерб.ССР (Баку,1985),на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Путно,1986), на Всесоюзной совещании по транспортным АТФазам (Иркутск,1987) и на первом Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва,1989).

Публикации. Основные результаты диссертационного исследования изложены в 9 публикациях, список которых приведен в конце реферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения. В конце работы предлагается механизм радаозащитного действия исследуешх соединений, приводится заключение и выводы. Список цитированной лите-

ратуры включает 179 источников.Работа изложена на 157 страницах, содержит: 25 рисунков и 2 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВислоИные липидше мембраны СБДМ) формировали по методу Миллера и др.( Киеller et al ,1962) из общих липидов бычьего мозга (ОЛБМ) в н-декане.

Липосомы из синтетического липвда дипальмитоиллецитина (ДНИ) получали озвучиванием на диепергаторе УЗДН-I (время озвучивания 10 мин.сила тока-0,4 А,частота-22 кГц).

Тени эритроцитов получали по методу Доджа и др. (Dodge et ai, 1963).

Нейроны июллюска Limnaea Stagnalis вцделяли по методу Костенко и др, ( Kostenko et ai ,1974) с некоторыми модификациями.

Электропроводность НИМ определяли дутем сравнения падения напряжения на БЛМ с падением напряжения на известном сопротивлении.Напряжение сравнения усиливалось с помощью усилителя с большим входным сопротивлением и регистрировалось автоматическим электронным потенциометром,подключенным к выходу усилителя.

Скорость дыхания митохондрий определяли полярографическим методом по скорости уменьшения содержания кислорода в реакционной среде,Установка была собрана на основе полярографа Lp-7 с самописцем Е2-7 и герметической ячейки из оргстекла объемом I мл.

Са- и К-токи через соматическую мембрану нейрона измеряли методом внутриклеточного диализа (Костюк и др.,1961),позволяющим осуществлять полную заме^ внутриклеточной среды в изолированных клетках через разрушенный участок поверхностной мембраны.

Спектры флуоресценции зовдов 2-толуидинонафталин-6-сульфона-та (2,6-ТНС),4-диметиламинохалкона (ДМХКпирена и 1,6-дифенил-Г,3,5-гексатриена (ДФГТ) снимали на спектрофлуориметре KRF-44B фирмы Perkin-Elmoг (США).Длины волн возбуждения и флуоресценции составляли,соответственно,для 2,6-ТНС- 360 нм и 430 нм,для ДМХ-420 нм и 495 нм.для пирена- 337 нм и 400 нм,для ДФГГ- 350 нм и 420 нм.

Температуру фазового перехода ДПЛ-липосом определяли по флуоресценции зонда 2,6-ТНС при плавном нагреве со скоростью 2 град/ мин,диапазон исследуемых температур- 30-55°С.

Микровязкость мембран (ty) теней эритроцитов в области локализации зоцца ДФГГ рассчитывали с учетом флуоресценции для меченных зондом проб при параллельном и перпендикулярном расположении поляроидов.

Ойчее однократное гамма-облучение животных (белых беспородных

Химическая структура и шифр исследуемых ЗСА

ТаблД,

СП

мышей) проводили на установке 1УБЭ,заряженной радиоизотопом Со в дозах 6-П Гр,Мощность доэы равнялась 2,92 Гр/мин.В опытах использовались половозрелые мыши-самцы весом 20-22 г.Исследуемые препараты »растворенные в ДМСО, вводили мышам подкожно по 0,2 мл раствора за I час до облучения.В сштах было использовано свыше 3,5 тыс,животных.Облучение опытных и контрольных животных проводили а один день.Статистическая обработка результатов по исследовании вязкости мембран и радшоэашты проводилась по критерию Стьвде-нта.Величина ошибки во всех экспериментах не превышала 10%,

Исследованные соединения и растворитель. Б работе исследованы известный в ветеринарии антигельминтный (противофасциолеэный) препарат-тегалид и десять его аналогов, отличающихся галогенными заместителями в бензольных кольцах и количеством бензольных колец. Исследованные препараты относятся к классу замещенных сали-циланилидов и были синтезированы Михайлициным Ф.С. в ИМ! и ТМ им Е.И.Марциновского.Химическая структура и шифры исследованных ХА приведены в таблице I.

В качестве растворителя для исследуемых препаратов применялся. диметилсульсЬоксид (ДМСО) фирмы "Мегс1(п,ФрГ.Выбор ДМСО обусловлен его низкой токсичность» на животных и хорошей растворимость«) в нем препаратов.Объем растворителя в среде не превышал 2 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И Ш ОБСУЖДЕНИЕ

Структурно-функциональныв изменения мембран в присутствии замещенных салициланияидо в.

Влияние препаратов на электропроводность ЕДМ, Специфическая структура исследуемых препаратов из класса замещенных салицилани-лидов (наличие 0Н~-груты во втором положении первого бензольного кольца) позволила предположить,что ХА будут индуцировать протонную проводимость в бислойных липидных мембранах (ЕМ) ^увеличивая их электропроводность.Эксперименты на ВДМ,в которых исследуемые ХА,растворенные в ДМСО,добавляли в водный раствор трис-НС1,омывающий мембрану, показали,что все препараты в разной степени,в зависимости от концентрации, повышают удельную электропроводность (Ом) БЛМ.Так,если препараты Г-970 и Г-1057 (рис.1а,крив.1,2) увеличивают &м всего на порядок при концентрации 10~®М (концентрация, при которой для большинства препаратов наступает насыщение электропроводности ЕИМ),то препараты Г-947,Г-082 (рис.1а,крив.3,4) и Г-992 (рис.16,крив.1) при этой концентрации увеличивают См на 34 порядка,Остальные препараты (рис.1а,крив.5,6) и (рис.164крив. 2,3,4,5) увеличивает &м на 5-6 порядков.

Эффективность действия ЗСА на НИМ зависит от наличия ОН--

Рис.1. Зависимость электропроводности EJIM от концентрации ЗСА.

а) 1-Г-970, 2-Г-Ю57, З-Г-947, 4-Г-882. 5-Г-10Й4. 6-тегалид (данные по тегалиду взяты из работы К0Е0кару,1983).

б) T-T-99S, 2-Г-1021, 3-Г-ТСЙ8, 4-Г-986, 5-Г-968. п

Среда исследования: 20 wM трио-НСI, рН 7,5, Т=20-24иС.Препарата добавлялись по обе стороны мембраны.

группы,а также от вида и количества галогенных заместителей в первом бензольном кольце,которые по эффективности составляют ряд I> Вг> CI>СНд,Обнаруженная з авис имо ст ь,по-видимому,может быть полезна для синтеза Стольных соединений с заранее заданными прото-то-донорными или прото но-акцепторными свойствами.

Природа ионной проводимости ЗСА. Для выяснения

природы ионной проводимости ЕДМ,иццуцируе^Й ЗСА, бши поставлены опыты,в которых изучалось изменение электропроводности мембраны, модифищфованной исследуемыми препаратами от концентрации протонов в среде (т.е. от рН среды!.Результаты этих опытов для прегтара-тов,различавшихся по своей активности,показывают,что зависимость электропроводности БЯМ от концентрации протонов имеет "кугтолооб-paaí^yn" форму (рис.2) .Уже один только этот факт указывает на то, что данные соединения (исключение составляет препарат Г-Ю57,у которого 0Н~-групла заменена на ОООСН^-группу)являются протоно-форами.Правильность сделанного вывода подтверждает и измерение нернсговского потенциала при создании десятикратного градиента ионов водорода на ЕЛМ (мВ).

Для суждения о возможной физиологической роли этих соединений в условиях in vivo были поставлены опыты,в которых методом

буферной емкости были определены коэффициенты диссоциации (рК) для исследуемых соединений.Они приходятся на значения pH,равные 5,0-8,0,следовательно,ЗСА будут сохранять эту максимальную активность и Б условиях in vivo ♦

Рис,2. Зависимость электропроводности ЕЛМ от pH среды,

1-Г-1057 СI0~^ií),2-Г-970 СЮ"4»),

З-Г-992 (Ю_5М),4-Г-882 СЮ"4«). Среда исследования: 20 мМ цитрат-фосФат-борат натрия,t*20-24uC.Препараты добавлялись по обе стороны мембраны.

Действие ЗСА на дыхание митохондрий и на репродуктивную функцию клеток. Экспериментальные данные, полученные на ЕЛМ,указывают на то, водородный показатель среды VT0 исследуемые ЭСА являются прото-нофорами,следовательно,они должныразобцать окислительное фосфори-лирование в митохондриях (Mitchell ,1966),шунтируя митохондри-альную мембрану по протону, и приводить,таким образом,к утечке энергии»необходимой для синтеза АТФ.Результаты экспериментов.поставленных на сопряженных митохондриях печени крыс (состояние 4).показывают, что исследуемые соединения (рис.3) стимулируют дыхание митохондрий при малых концентрациях (I0~7-I0~6M)l! ИНГИ-бируют при более вн-соких (10"5-Ю-4М).

Таким образом, эксперимент альные результаты свидетельствуют о том,что исследуемые вещества являются разобщителями окислительного фосфорилирования.Разобщение 0Ф приводит к снижению синтеза АТФ в митохондриях (Ли берм ан,1968, Скулачев,19б9, 1972) и к уменьшению энергетического обеспечения клеток, что, по -8

Рис.3. Изменение скорости потребления кислорода митохондриями печени крыс с концентрацией: а) Г-970, б) Г-882, в) Г-992, Г>-Г-1057.Концентрация митохоедриального бедна равнялась 6-8 мг/мл,Среда инкубации: 241 мМ сахарозы,20 мМ сущинатаЛмМ роте-нонаЛ мМ Фосфата калия,2 мМ хлорида маг-ния,1 мМ 9ДТА,56 мМ трис-НС1,рН 7,5.

видимому,вызовет угнетение обмена веществ и скорости пролиферации клеток.Результаты опытов с замещенным салициланилидом-гегали-

ДОМ На КЛеТКаХ СИНХРОННОЙ КУЛЬТурЫ МИКСОМИЦета Ehyearum polycepha-

lu» показывают,что XA в концентрациях 10*"^-10"% могут снижать скорость репродуктивной функции клеток (деление ядер),существенно уменьшая включение тимидина в ДЩ и удлиняя интерфазу клеточного цикла.Задержка клеточного цикла на стадиях интерфазы удлиняет время,необходимое для осуществления процессов репарации,повышает ее эффективность,что будет способствовать увеличению радиоустойчивости клетки и организма в целом,

С другой стороны, разобщение ОФ может приводить к временному снижению содержания кислорода в клетках, что также будет способствовать увеличению их радаоустойчивости.

Митохондрии, выделенные из печени крыс, которым предварительно за 0,5-1,0 чае до декапитащщ вводился препарат, были в наибольшей степени разобщены, "Через 3-5 (максимально через 7-8) часов, в зависимости от активности и концентрации препарата, после введения препарата in vivo разобщение 05 уже не обнаруживается, то есть изменение энергетики клетки носит временный и обратимый характер. Влияние ХА на К- и Са-токи мембраны нейрона моллюска. Опыты на БЛМ показали,что ЭСА индуцируют протонную проводимость в мембранах.Об этом свидетельствуют и данные о разобщении ОФ в митохондриях под действием исследуемых препаратов,Исследование влияния ХА на транспорт других ионов через клеточнув мем-

Рис.4.Изменение Са-тока нейрона относительно контроляСЮвд с концентрацией исследуемых

І-ГІ882, 2-Г-992, З-Г-970,

За 100% принята величина Са-тока в отсутствии препарата.

брану и,в частности.ионов К*и

проводилось на соматических мембранах нейронов моллюска Limnaea Stagnalis .Исследовалось влияние ЗСА на входящий кальциевый и выходящий быстрый калиевый токи через мембрацу нейрона.

Подобные исследования представляют интерес и с точки зрения выяснения влияния ХА,исследуемых как потенциальные радиопротекторы,на нервную систему организма,под контролем которой находятся многие важные процессы.

I0"8 ІСГ7 І0Г6 ІСГ5 ІСГ4 концентрация препарета в молях

Результаты экспериментов показывают,что ХА,эффективные как протонофоры на БПМ (Т>992 и др.), значительно сильнее подавляют Са-ток (рис.4). Препараты же.неэффективные на ЕЛМ (Г-970 и др.), действуют на Са-ток слабее.Влияние исследуемых препаратов на К--ток было в 50-60 раз меньше.

После отмывания нейронов от ХА Са- и К-токи восстанавливаются практически до первоначального уровня,что свидетельствует об обратимости связывания ХА с мембранами.

При добавлении эффективных протонофоров к нейронам в концентрации ІСГ^М и вше, увеличивается в 1,5-2,0 раза ток утечки через мембрану нейрона.Появление тока утечки,вероятно,обусловлено переносом протонов через мембрану.

Обнаруженное влияние ХА на ионные токи мембраны нервной клетки позволяет сделать предположение об участии нервной системы в формировании радиорезистентного состояния организма.

Исследование структурных перестроек в мембранах. Изменение транспорта К+,Н*,Сай+ через мембрану под действием ХА, по-видимому,может быть связано со структурными перестройками,которые изучали по изменению интенсивности флуоресценции зондов 2,6-ТНС, ДМХ и пирена,величине микровязкости в области локализации зонда ДОГТ и изменению пиков температурных фазовых переходов.

В опытах на тенях эритроцитов показано, что под действием ХА тушение флуоресценции 2,6-ТНС,имеющего непосредственный контакт со средой,происходит монотонно-медленно,а тушение ДМХ и пи-рена,расположенных глубже в мембране,имеет характер медленного, а затем быстрого снижения интенсивности флуоресценции.Различный характер тушения флуоресценции ЛМХ.пирена и 2,6-ТНС в присутствии ЗСА указывает на уменьшение величины потенциального барьера на границе мембрака/среда и на изменение структуры липидной фазы мембран эритроцитов, причем в большей степени фазы с низкой полярностью; доказано, что эти зонды не взаимодействуют с препаратами, 0 струк-

Рис.5.Зависимость вязкости мембран эритроцитов в области локализации зонда ДФГТ от концентрации препаратов.

І-Г-882, 2-Г-992, 3-Г-970, 4-Г-І057. Среда: 15 мМ фосфатный буфео, рН 7,4, * =52иС. Каждая точка на графике соответствует результатам 6 экспериментов,

концентрация препарата в молях

турной перестройке липидной фазы мембраны свидетельствовало также то,что микровязкость этой фазы в области локализации зондаДфГГ снижалась на 0,5-1,0 сПз при введении в образец препаратов (Г-992.Г-882 и др.),обладающих радио протекторным действием {рис. 5,крив.1,2).Введение ЗСА,не обладающих радиопротекторным действием (Г-1057,Г-970 и др.), практически не изменяло этот параметр во всем интервале исследуемых концентраций.С изменением вязкости мембран сопряжен и Фазовый переход типа "гель-жидкий кристалл". Результаты экспериментов с тегалидом на ДШГ-липосомах показывают,что ЗСА в концентрациях 10~7-10-;:>М снижают высоту и увеличивают ширину интенсивности пика температурного фазового перехода, а также едвигают его на 3-Б°С в сторону меньших температур, при Х0~5-Ю~4М устраняют фазовое разделение липидов на всем протяжении исследуемых температур (25-50°С>.

Токсичность и радиоэащитное действие ЭСА.

Исследование токсичности показало,что концентрация, равная ІО'Чі в организме,для всех исследуемых ЗСА при подкожном введении мышам оказалась не токсичной.30 % токсичности наблюдалось для некоторых препаратов,введенных в концентрации Ю~^М,в то же время препараты Г-992,Г-882,Г-947 оказались не токсичными и при введении их в концентрации 10 Сравнение химической структуры препаратов Г-1028,Г~98б и Г-І02І и препаратов Г-968 и Г-992 (см.табл.1) позволяет предположить,что метилирование третьего бензольного кольца делает препарат нетоксичным вплоть до концентрации 10*"% в организме (430-650 мг/кг живого веса).

Радиозащитнал эффективность ЗСА определялась по выживаемости

мышей в течение 30 суток с введенными подкожно за Г час до обучения в дозе 10 Гр препаратами в концентрации 10"% в организме (рис.6).Время,равное I ча-

Рис.ба.Радиоэащитное действие замещенных салицила-нилидов.

1-контроль (0,2 мл волы),

2-ДМСО (0,2 мл). З-Г-970, 4-Г-І024, 5-Г-І028, 6-Г-832, 7-Г-992.

Препараты вводились подкож-

но

_ ---- раствореннымисв ДМСО _

5 10 15 20 25 30 концентрации 10"% за I

время после облучения,сутки іо^0 ой^чения Б д0зе

^80

Рис.66.Радиозащитное действие замешенных салишл&гелидов .1-Г-9в§,2-Г-1057,3-Г-9вб,4-Г^ 947,5-Г-1СЙ1,6- тегалид.Ю М (данные получены Кожокару А.Ф.). Препарата вводились подкожно раствореннымцев ДМОО в концентрации 10 М,за I час до облучения в дозе 10 Гр.

су,было выбрано на основе результатов экспериментов с те-галидом и Г-992,которые показали наибольщую радио защиту животных при введении их за I

_______ час до облучения.Концентра-

5 10 15 20 25 30 ция препарате в, равная 10 wí в время после облучения,сутки организме,была выбрана исходя из того,что при этой концентрации для большинства из исследуемых ЗСА наступает насвдение электропроводности БПМ,наблюдается максимальное разобщение или небольшое ингибирование 0$ в митохондриях,начинает снижаться вязкость мембран и отсутствует токсичность в опытах на животных.Результаты экспериментов (рис.6) показывают,что все исследуемые препараты в той или иной мере зачищают животных,облученных гамма-радиацией,и сдвигают их гибель на более поздние сроки после облучения,Наиболее эффективными оказались препараты Г-882 и Г-992,показавшие 65 и 70% защиты,соответственно,а наименее эффективными - Г-970.Г-968 и Г-1057.

Оптимальные рапирзащитные концентрации ЗСА определяли по выживаемости мышей,оСлученных в дозе 10 Гр,в течение 30 суток при введении ЗСА в концентрациях 10 (рис.7).Такой концентра-

цией для препарате» в,эф-

Рис.7.Зависимость выживаемости мышей от концентрации некоторых ЗСА,введенных за I час ж» облучения в возе 10 Гр. 1-Г-970,2-Г-968,З-Г-882, 4-Г-992.

фективно защищающих животных от облучения (Г-992,Г-882 и др.).является концентрация препервте в молях концентрация 10~т4 (4-5

мр/кг живого веса).

Фактор изменения дозы (ФЙД) для некоторых препаратов,существенно отличавшихся своей радиозащитгой эффективностью в пре-

Д00

1СГ6 10 5 I0"4

дьздуцих опытах, определяли экспериментально,исследуя зависимость гибели мышей от дозы облучения,с введенными препаратами в концентрации 10~®М в организме,за Г час до облучения.Результаты экспериментов,представленные в пробит-координатах (для определения полулетальных доз) на рис.8, позволяют с достаточной точностью оп-

доза облучения,Гр. Рис,8.Зависимость гибели мышей от дозы облучения в присутствии некоторых ЗСА и ДМСО.

1-контроль (0,2 мл воды), 2-ДМСО (0,2 мл), З-Г-970, 4-Г-І028,

5-Г-992. ___с

Для всех препаратов концентрация в организме равнялась 10 '"X Объем вводимого раствора препарата в ДМСО был равен 0,2 мл на мышь.Препараты вводили за I чае до облучения,На графике представлены результаты 3-х экспериментов.

ределить величин ІіД5(уз0 (в контроле ЛІЦо/зо^, 12 Гр, для ДМС0-8,6 Гр, для Г-992- II Гр, для Г-І028- 10 Гр и для Г-970- 9 Гр), а также по наклону кривой судить о скорости изменения эффекта с возрастанием дозы.Исходя из определенных ЛД50/30 для контроля (0,2 мл воды) и ЛД50/30 для препаратов и растворителя, был определен ФИД,который для ДМСО равен 1,21,для Г-970- 1,25,для Г-І028-1,41 и для Г-992- 1,54.Оценка протекторного индекса для ХА(эффективно защищающих животных,показала значения большие 15,что характеризует их как высокоэффективные радиопротекторы.

Связь радиопротектоиного действия ЗСА с их влиянием на биофизические характеристики мембран и дыхание митоховдрий.Предполагаемый механизм рздиозащитного действия исследуемых соединений.

.Анализ радиозащитной эффективности (рис.6) и протонофорной активности (рис.І) ХА при одинаковой концентрации на БЛМ и в организме животного,равной показал наличие связи между этими двумя параметрами (рис.9).Так»увеличение электропроводности мембран (связанное с ивдуцированием препаратами протонной проводимости) от 10"^до 10 См/см^,соответствует увеличению радиозащитной эффективности препаратов от 10 до 70 Дальнейшее увели-

пробити

Рис.9.Связь радиозащитной эффективности ЗСА,выявленной в опытах с облучением животных,с их протонСиїюр-ной активностью на БЫ.

І-Г-970. 2-Г-І057, 3-Г-Э47. 4-Г-882 , 5-Г-992, 6-тегалкд (І0-6Ш, 7-Г-І02І, 8-Г-І028, 9-Г-986, І0-Г-І024, II-Г-988,

Концентрация всех исследуемых препаратов в организме животного и на ЕЛМ (за исключением тегалида) равна

10"5М.

.О-6 Ю'7 ю-6 ю-5 ИГ* £ электропроводность мембраны,См/см

чение электропроводности мембран от Ю-4 до 10"^ См/см^ соответствует быстрому снижению радиозащиты от 70 до 10^,

Исследуемые ЗСА в радиозащитной концентрации стимулиру-

ют или слабо ингибируют дыхание митохондрий, разобщая ОФ (рис.3).

Препараты,показавшие в опытах с облучением животных низкую радиозащиту,не изменяют, а препараты,показавшие высокую радиозащиту, снижают в концентрации ЮМ микровязкость мембран на 0,5-1,0 сПз (рис.5).Увеличение концентрации ЗСА до 10*"% для большинства препаратов приводило к снижению микровяэкости на 2 сПз. Препараты становилась токсичными,их радиозащтн&я эффективность сильно уменьшалась.

Наличие связи радиозащитной эффективности ЗСА с их протонофор-ной активность» позволяет сделать предположение о том, что радиоза-щитнбе действие исследуемых соединений, прежде всего, связано с их про тон спорными свойствами, с разобщением окислительного фосфорили-рования в митохондриях и, как следствие, со снижением концентрации кислорода в клетке к моменту облучения; то есть оно реализуется через гипсксический механизм зашиты от ионизирующих излучений.

С другой стороны, результаты, полученные на клетках синхронной культура миксомвдета РЬузагиш ро1усевЯа1ит, свидетельствуют о том, что радиоэащита ЗСА может быть связана со снижением скорости репродуктивной функции клеток и удлинением стадии интерфазы клеточного цикла, контролируемыми цШФ(АТФ)-зависимым сигнальным путем передачи внутриклеточной информации (Кудряшов,Соболев,1977,Берридж,1988).

Снижение в небольших пределах микровяэкости мембран под действием ЗСА в радиозащиткой концентрации, обладающих радиопротекторными свойствами, и отсутствие влияния препаратов,не обладающих радиозащитной эффективностью, на этот параметр мембран позволяет также предположить, что в реализацию радиоэащитного действия исследуемых

препаратов определенный вклад может вносить и небольшое снижение микровязкости мембран. Влияние радиозавдтных ЗСА на К- и Са-токи соматической мембраны нейрона моллюска позволило нам сделать предположение об участии нервной и гуморальной систем в формировании ЗСА радиорезистентного состояния организма. Поскольку были показаны изменения структуры и фазового состояния мембран при действии ЗСА, которые должны приводить к изменению системы регуляции, вклю-чаодей рецепторы,G-белки,аденилатциклазу,и активностей многих мембранных и клеточных ферментов, мы не исключаем значение к других факторов в радиозащте, в частности, эндогенных аминов и тиолов.

основные швода

1. Показано.что новосинтезированные препараты из класса замещенных салшшланилидов (ЗСА)(кроме Г-І057),увеличивая электропроводность бислойных липидкых мембран(ЕЛМ),являются протонофораш.Установлено, что их протонофорное действие определяется наличием 0К-группы я отрицательным индукционным зфйектсж за счет галогенных заместителей в бензольных кольцах и убывает в ряду: 1>Вг>С1>СН3. Методом буферной емкости определены коэффициенты диссоциации, они приходятся на значения ря,близкие к физиологическим (5,0-8,0).Следовательно .исследуемые ЗСА будут эЩЬективш' и в условиях iu vivo,

2. Показано, что ЗСА влияют на дыхание митохондрий. В этих опытах in vitro они ускоряют дыхание при низких концентрациях

и ингибируют при высоких ІС -Ї0- . В опытах in vivo максимальное разобщение окислительного íос-гіог-ішіро вания (00) имело место через 0,5-1,0 часа после введения препарата животным, однако уже через некоторое время, в зависимости от активности и концентрации препарата,' разобщение ОФ не обнаруживается, что свидетельствовало о временном и обратимом действии ЗСА.

3. Из данных,полученных с помощью флуоресцентных зондов 2,6-ШС.ДМХ и ггарена»следует,что ЗСА изменяет температуру фазового перехода и вызывают структурные перестройки липидной фазы мембран.изменяют величину потенциального барьера на границе мембрана/среда.С помощью зонда ДФГТ показано снижение микровяэкости мембран на 0,51,0 сПз при действии 10~5,М активных радиозащитных ЗСА(Г-992,Г-882), отсутствие практически влияния ЗСА с низкой радщозаштоЙ(Г-970,Г-988).

4. Показано, что эффективные протонофоры более эффективно подавляют Са- и К-токи соматической мембраны нейрона» После отмывки нейрона от препарата средой тони восстанавливаются практически до уровня контроля, что свидетельствует об обратимости связывания препаратов с клеточной мембраной.-

5. В экспериментах с гамма-облучением показано, что все ис-

15

слелуеше препараты сдвигают гибель животных (белых беспородных мышей-самцов) на более поздние сроки после облучения. Препараты Г-832 и Г-992 ищ низких концентрациях 4,0-5,0 иг/кг защищают 65705 аавотннх, облученных в сверхлетальной дозе 10 Гр, ФИД для наиболее эффективного препарата Г-992 равен 1,54.

3. Установлена связь радаозащитиой эффективности ЗСА на животных э нетоксичной радаозакмтноМ концентрации с их прото-HCräopiiGi актавкостыо на Б.Ш. Предполагается, что радиозацитное действие элективных лротонофоров из исследованного класса веществ обусловлено кх влиянием на свойства мембранных структур клетки и связано, прежде всего, с разобщением 03 в митохондриях, ведущего к снижений концентрашта кислорода в клетке к моменту облучения и к залерже клеточного цикла на стадиях интерфазы,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБДШВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. ЧертищеЕ 3.В.,Кожокару А.Ф. Модификация радиационного поражения замененными салициланилидами // Материалы 6-ой научн. конф. молодых ученых Казанского Ин-та биологии КФАН СССР / £еп. 2888-Е85 ВИНИТИ,1968.

2. ножокару А,5.,Чертит;ев В.В.,Фомкина М.Г. О возможности модификации радиационного поражения эт.теиеннтги с а"и ци л ели л ид an// Тезиск докл. Всесовдзн. радиобиологический съезд. М., 1989, -Т. III, - С. 722-723.

3. Кошкатту А.Ф. »Чертхтдев З.В.,Фомкина М.Г. Исследование ионной проницаемости и структурных перестроек биомембран под влиянием различных физическртх,химических и фармакологических факторов // Материалы 5-ой научн, конЬ. молодых ученых Казанского Ин-та биологии КФАН СССР / Деп. ¡5 2888-Б86 ВИНИТИ, 1986.

4. Кожокару А.Ф.,Чертщев В.В..Алексеев С.И. Исследование действия некоторых химических модификаторов на К- и Са-токи мембран шллюска // Тезисы докл. Всесоюэн, совещания по транспортным АТФазем. Иркутск. 1987, - С. 43-44.

5. Кожокару А.Ф.,Ким Ю.А.,ЧертищеЕ В.В.,&омнина М.Г. Изучение структурных перестроек мембран в присутствии протонофоров с помощью флуоресцентных зондов // Тезисы докл. Всесогсзн. симп. Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена. Пущино, 1986, - С. 83-64.

6. Чертщев З.В.,Кожокару А.Ф.,Фомкина М.Г,,МихаЙлицин Ф.С. Исследование протонофордаго действия производных тегалида на бислойные липиднне мембраны // Тезисы докл. I-оЙ Республиканской конференции по биофизике. Кишинев, 1964, - С, 49-50.

7. Кожокару А.Ф,,Фомкина М.Г.,Чертищев В.В.,Ким Ю.А.,Кожокару Н.Л..Музафаров E.H.,НазароЕа Г.Н. Механизм действия натехи-нов чая и синтетических фенольшх соединении на бислойные липидные и нативные мембраны // Свойства флавоноидов и их функции в метаболизме клетки. Пущино, ДНЦ Ш АН СССР, 1966, - С. 47-75.

8. Кожокаиу А.Ф.,Ким ¡O.A. .Фомкина М.Г.,Чертищев В.В. Исследование действия тегалида и битионола на биологические мембраны с^помо^ъю ф^уо^ес^ентных зондов // Радиобиология, 1986, - Т.

9. Кожокару А Ж.Фомкина М.Г,.Чертищев В,В,.Кожокару Н.Л., Муэафаров E.H.,Назарова Г.Н.- Механизм действия некоторых dte-нольных соединений на мембранные системы и на метаболизм клетки // Растительность и пути регуляции ее жизнедеятельности, Баку, ЗЛЫ, 1986, - С. 96-98.

Т-02579 19.02.90 г. Зак, E4I4P !йи>. 125 экз. Уч.иц.л.-1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ІЩЕИ