Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование антиген-антитело взаимодействия при использовании биоаффинных и биомимических мембран

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование антиген-антитело взаимодействия при использовании биоаффинных и биомимических мембран"

с>

О

г

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1нститут молекулярноТ бюлош та генетики

На правах рукопису

ПАНАСЮК Тетяна Леондавна

ДОСЛ1ДЖЕННЯ АНТИГЕН-АНТИТ1ЛО ВЗАСМОДП ПРИ ВИКОРИСГАНН1БЮАФ1ННИХ ТА БЮМ1М1ЧНИХ ПОЛ1МЕР1В

03.00.03 - молекулярна бюлопя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертац/Т на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТв -1997

Дисертацюю е рукопис.

Робота виконана у вщцьгн механ!зм1в трансляцй' генетичноУ ¡нформацп 1нотитуту молекулярноТ бюлогм та генетики HAH УкраТни (м.КиТ'в).

Науковий кер|'вник:

доктор бюлопчних наук, лрофесор, академк HAH УкраТни Г.В.Сльська

ОфЩмж опоненти:

доктор бюлопчних наук, професор М.Я. Ствак доктор х'|м':чних наук, Ю.В.Танчук

Провщна установа:

КиТвський Уншерситет ¡м. Тараса Шевченка кафедра мшробюлогн та загальноТ

(MMVMOnOrfl

/7

Захист дисертацн вщбудеться ¿£)ßttrUj 1997 р. о год. на

засзданж слец|'ал1зованоУ ради Д 01.86.01 Ыституту молекулярноТ' бюлопТ та генетики HAH УкраТни за адресою: 252143, м.Ки'Тв-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат дисертацн роздано аУ f/ACfUJ<! 1997 р.

Вчений секретар Спец^алЬовано! Ради кандидат бюлопчних наук

Лукаш л.л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальт'сть проблеми. Молекулярне розтзнання е одн1ею ¡з сучасних проблем у цшому ряд! наукових галузей, що включають молекулярну бюлопю, бгахМю, физику тощо. Класичним I найбшьш вивченим прикладом е розшзнання субстрату вщповщним ферментом. В останьп десятир!ччя поряд з продовжэнням роб!т у цьому напрямку отримали широке розповсюдження дослщження по вивченню мехамзмш молекулярного розп!знання при взаемодп антиген-антитто та рецепторчжанд. Вивчення взаемодп компонента ¡муножмнних реакцм мае особливе значения осюльки ця реакц|'я знайшла широке застосування не ттьки при фундаментальных дослщженнях, а й при д1агностиц1 р1зноманп"них захворювань за рахунок високоТ специфмносп та селективност! природних антитт, я и виробляються практично до вах речовин, що мають не одну антигенну детерминанту. Методи, що використовуються для реестраци ¡мунореакцн працемютю та потребують складного I дорогоц|'нного обладнання [Туэзеп Р., 1983]. Багато лабораторш св!ту працюють над проблемою Тх спрощення, що особливо важливо при масовому скришнгу. Одним з перспективних п!дход1в вважаеться створення ¡муносенсорт. Б(лышсть таких пристро'ш базуеться на непряма д!агностиц| антиген-антитшо взаемодп, де один ¡з компонент^ ¡мунореакцм м1чений [ЭМгтис! И.О., 1988]. Саме ця мпгка генеруе безпосередньо (електрох1м;чно-активна) чи при додатковш хмчнм реакцп (ферментна) сигнал. Така реестрзцЫ мае як певн1 переваги, так I сво'Г недол1ки. Великий ¡нтерес викпикае завдання створення метод1в та пристроТв для прямо/ реестраци компонент^ ¡мунологмно7 реакцп. Але за рахунок малих змм у результат! ц|еТ взаемодп такий пщхщ не отримав широкого росповсюдження. Виршення щ'с'Г задачI можпиво через гармоншне посднання ф]зико-х1ммних властивостей

пол1мерних пл!вок, електрод'ш тощо з високою специфичною антиген-антитшо взаемодн.

Поряд з природними рецепторними структурами (фермент, антитшо тощо), яга використовуються при вивченн1 молекулярного розгйзнання, великий ¡нтерес викликае створення, так званих, бюм1м|'чних пол1мер1в, що здатн1 до моделювання рецепторно'1 функц» б'шив [Wulff G., 1995]. Перевагами такого ш'дходу, перш за все, е Ух висока стабильность та можливють створення структур з високою афмжстю практично до любоТ речовини. Так, використовуючи методи ximмного конструювання пол1мерних матер!ал1в можна отримати погимерн"! структури, що здатш до ¡мгацм активного центру антитт. Проте ц1 дослщження знаходяться на початковому eTani розаитку.

Отже, актуальним е розробка шдхсдв експресно'1 реестрацп антиген-антитшо взаемодн, використовуючи властивосп бюафмних пот'мерних aniBOK та мембран, що ¡м:тують активний центр антит1л спецмф|чних до гаптен'ш.

Мета та задач1 дослшження. Метою даноТ роботи була розробка гндходв ревстрацй антиген-антитнто взаемодн на основ! процесу формування сенсорного вщгуку при застосуванн: бюафшних та бюмтачних мембран.

Основними завданням роботи були:

1) Пошук бюсумюних пол1мер1в та умов формування пористих мембран з метою подальшого використовування Тх для реестрацГ|" антиген-антитшо взаемодн.

2) Вивчення шляжв ¡ммобмзацп антитш на поверхн! отриманих noniwiepia.

3) Розробка П1'дход1В анализу ¡мунохшчних реакцм за допомогою пдрофшьних та пдрофобних мембран.

4) Вивчення можпивого мехатзму формування сенсорного вщгуку, що ¡ндукуеться при Аг-Ат взаемоди на поверхн! полшерних плавок.

5) Вивчення шлях:в огримання бюм!м|'чних мембран, що моделюють рецепторну структуру антитш.

6) Анап13 природи субстратно']' специфнносп пол1мерш, сформованих матричною пол!меризац1ега на основ1 вивчення Гх сенсорного вщгуку.

Наукова новизна та практична щнжсть роботи

В робол вперше:

- проведено дооп1дження можливостей використання бюаф!нних мембран для дете-кцп компоненлв ¡мунноТ реакцм, один з яких фксований в порисп'й структур! ГТСЛ1МСру.

- залролановано слойб регуляци топохмн процесу ¡ммоботзаци антитш (антиген!В), я кий надав можпив1сть пщвищити чутливють анал1зу за рахунок локал1заци проходження ¡мунореакцГГ саме в порах мембрани.

- використано пористу поверхню пол!мерних пдрофтьних та п'дрофобних огнвок як основу чутливого елементу при реестрацн антиген-антитшо взаемодн; створено лабораторну модель ¡муного сенсору на основ! зазначених вище бюафжних матер1ал1"в.

- вивчено шляхи огримання пол|'мер!'е, що ¡м|'тують рецепторну структуру антитш, на основ! фотопол1меризуючих композиц'й; створено лабораторну модель матричного сенсору для визначення концентраци 1_-РЬе-ОЕ1.

Практична цжж'сть роботи полягае у тому, що отримаш в ш'й результати св1дчать про гтринципову можливють створення макелв та промислових вар1анлв ¡мунних сенсор!в прямо!' дн для визначення концентраций рюномаштних антигежв як у медичн'|й практиц], так "1 при проведенж еколопчного мониторингу

навколишнього середовища, зокрема, для анагнзу y-mo6ynÍHÍB, герб1цид|'в тощо у водних та ф'зюлопчних розчинах. Вони можуть бути основою при розробц'1 та налагоджеш промыслового випуску вимфювальних приладв для 6¡oxím¡4ho'í диагностики.

Апробашя роботи. Результати дослщжень доповщались на 9-iü М1Жнародн1й конференци по СН1Ду (Берлин, Шмеччина, 1993), ICOM (Хайдельберг, Нмеччина, 1993), сп'шьнм робоч1й нарад'| "Н'1меччина-СНД" (Мюнстер, Шмеччина,1993), 7-ому мЬкнародному cnMno3ÍyMÍ "Синтетичн'| мембрани в науц1 та промисповостГ (Тюбжген, Шмеччина, 1994), конференци "бвросенсори VIII" (Тулузи, Франц1я,1994), симпозиум! "Свромембрани '95" (Басс,

4 г-!-. ___, »5 г. ______,_________.-..Г?___...

ГЛП[ J ИЛ, I Ilprlnrmil ItSvífl ПС* IV11 <2 MCI П CC1IVlllU¿iylV] oofjuivimviupclhin OI

(Tвенте, Голланд1я, 23-27 червня, 1997).

Публжацм. За матер,¡anaми дисертаци опублковано 11 po6¡T у в1тчизняних та ¡ноземних журналах.

Структура та об'см роботи. Дисертац1я складаеться з вступу, огляду Л1тератури, опису MaiepianÍB та методов дослдження, еспериментально'1 частини, яка включае виклад результате та обговорення з використанням 29 шлюстрацм та 5 таблиць, висновюв, а також списку лтератури, який складаеться ¡з 153 публ;,кац1й.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ

В po6oT¡ використовували таю реакгиви: метил-п-толуолсульфонат-1-циклогексш-3-(2-морфол1но-4-етил)карбодйм1'д, Tb¡h-20, Tb¡h-80, 25 % розчин глутарового альдепду (ГА) ("Serva", Шмеччина); сироватковий альбумж бика (БСА) та ¡муноглобул'н G кроля (IgG) (Д1АМ Лтд., Москва, Рос1я), антитша кози

проти ¡муноглобулЫу G кроля (анти-lgG), пероксидазний коньюгат антитт кози проги ¡муноглобулму G кроля (Sigma, США); пол1акрилоштрильна (ПАН-100) та полшЫлхлоридна мембрани (ПВХ) вщ "Хмволокно" (Санкт-Петербург, Росш); акрилон!трил (АН), акрилова кислота (АК), д и метил форма м ¡д (ДМФА) виробництва заводу юмнних реактива м. Шостки (УкраТна), глщидтметакрилат (ГМА) 1нституту MOHOMepiB для синтетичного каучука (м. Ярославль, Рост), олтоуретанакрилат (1нститут xivifi високомолекулярних сполук HAH УкраТни).

Формування мембран здшснювали вщливкою з пол1мерного розчину, який noTiM при формуванн! мокрим способом осаджували в рщинах (нерозчинниках), або висушували на noßiTpi при формуванн1 мембран сухим способом.

РСЗД!Л!<?>ОЧ| Х^р 2 мембран ВС7'ЗНОЗЛ!С22Л11 22 ШВ!*ДКОСТ ЯМИ

трансмембранного потоку при переход! вщ низьких до бтьш високих робочих тисгав ¡з застосуванням ультраф1льтрац1йно|' комфки.

Для створення бгаафЫних noniwepie використовували три способи ¡ммоб|л1зац|'Г антитт на ix поверхню: ацилювання в присутносл карбодимщу (карбодймщний cnociö), глутаральдепдний cnociö та |'ммо6т1зац1ю за рахунок адсорбцшноТ взаемодГГ б1лка i пол!мера-ноая.

Для оценки ефективносп' ¡ммобш'/зацп ¡муноглобутнжв на поверхн1 пол1мерних мембран проводили метод прямого твердофазного ¡муноферментного анал1зу з використанням пол*мерних мембран як твердоТ фази.

Кондуктометричн1 вим1рювання проводили в електрожммнм KJiiTHHi, яка 5ула роздтена синтетичною пол!мерною мембраною. В одну з ком1рок юитини зводили речовину, що тестуеться (IgG, тр|'азин, L-Phe-OEt, тощо) в р|'зних отнцентрацшх. Взаемодш цих речовин з модифкованою поверхнего пол!мерноТ иембрани викликала змшу ff електропровщносп". Неспециф|'чний вихщний сигнал,

контролюваш завдяки проведения вим1рюеань з неспециф|чним бшком (БСА). Bei виифи проводили при юмнатнж температур! та перемшуваннК РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Незважаючи на широкий спектр запропанованих метод'ш реестраци антиген-антитшо взасмоди лишаеться велика потреба в Ух спрощенж. Так, одним ¡з шляхю ТУ вир'ниення може бути створення датчиюв в яких компонента ¡мунореакцГТ могли б навпряму тестуватися. Трудной^, що пов'язаж з Ух конструюванням, в основному, обумозлен! мапими елсктрох1М1чними зммами, що мають Micqe в лроцес! антиген-антитшо взаемодП, а в)дпов1дно i з проблемами Ух реестраци [Aizawa М., 1994]. Майже в yeix роботах де була представлена Ух дя при поясными! можпиаих мехзжзнш виникнення сенсорного в'щгуку, так чи жакше, автори спиралися на прояв ефекту Доннана, чи приводили пояснения у рамках теорн мембранного потенц1алу пористих мембран з ф'тсованими електричними зарядами Теорелпа, Мейера та CiBepca (модель-ТМС) [Helfferich F., 1962; Kobatake Y., 1978]. Саме неможпивють впливу цих ефеетТв на зм1ну електропротдност'/ ¡муносенсору на основ/ польового транзистору поставила гид сумн1в подальшу ¡MOBipHicTb його використання [Schasfoort R.B.M., 1990а].

При розробф шляхт створення безм'1Точних ¡муносенсорю важливо враховувати Ух специф1ку. Реестрац1я антиген-антитшо взаемодп сенсорами такого типу прямо детектуеться поверхнею перетворювача. Тому лопчно, що на процес утворення сигналу може впливати enoeiö ¡ммобмзацп одного з компонента ¡мунореакцГТ, характеристики пщпожки та перетворювача, метод реестраци. Так, при конструюванш сенсору на ocHosi пол(мерноУ мембрани значну роль мае вдогравати ТУ заряд, розм!р пор тощо.

В робел розглядаеться можливють реестраци антиген-антитшо реакцп використовуючи нов! гндходи у створенж бгаафЫних мембран у поеднанж з кондуктометричним типом вимфювання. Також пропонуеться метод локап!зац!Т антиген-антитшо реакцП' в поровШ структур! мембрани. За Ц!е"Г умови мал1 електрох1м1чн1 зм1ни, спричинен1 ц!ею реакц1ею, можуть бути зафжсован! пристроем за рахунок ¡снування та в деяких м1сцях навггь перекривання подвмних електричних шарш.

1. Розробка кондуктометричного методу реестрацГГ антиген-антитшо взасмоди на основ! бюафЫних пол1мер|'в

1.1.1муносенсори на основ! г/дрофтьних полшериих матер1ал!в

Для зстснсзязння рол! фя.кгор'в у формування

сенсорного в|'дгуку були проведен! дослщження на лол!мерних мембранах з р!зними характеристиками пористоУ структур«, густини поверхневого заряду, пдрофтьно-пдрофобних властивостей тощо. Як пол1мери, що утворюють наги'впроникн! мембрани, були обран! сп!впол1мери акрилон!трилу. Вони характеризуются чудовими пл1вкоутворюючими властивостями. Акрилон!трил сп!впол!меризуеться з широким спектром вшшьних та акрилових мономерю, що дозволяе регулювати молекулярну структуру мембраноутворюючо'|' пл!вки. Сп!впол!мери акриложтрилу легко обробляються за розчинною технолопею з можлив!стю отримання як пористих (з р!зним розм1ром пор) так ! непористих мембран.

В таблиц! 1 наведен! характеристики сери мембран ¡з сп!впол!меру акрилон!трилу з акриловою кислотою, що були одержан! мокрим способом. Зм!на умов формування дозволила одержати мембрани з р!зними продуктивностями \

затримуючими здатностями. Отже, ц1 мембрани мають р1зн1 морфолопчж характеристики.

1з збшьшенням процентного вм!сту пол ¡меру у вщливочному розчиж утворюються бшьш тонколоритсл мембрани, яю характеризуються бтьшою густинога поверхневого заряду.

Таблиця 1

У моей формуеання та характеристики мембран /з сп'тпотмеру

акрилоштрила з акриловою кислотою.

Плша Ствпо- Масова Н|ж, Осаджу- ! Об'ем- Коеф|'ц1ент

л^мер ДОЛЯ мм вальна I ний пет к затримки БСА

пол1меру, ванна | води, при при 0,1 МПа

% I 0.2 МПа,

М1 АН-АК 18 0.3 ДВ | 110 < 0.89

М2 АН-АК 18 0.2 ДВ I 180 I 0.94

МЗ АН-АК 16 0.3 ДВ | 180 0.75

АН-АК = акриложтрил з акриловою кислотою, ДВ= дистильована вода.

При цьому мембрани, що одержана з бшьш тонкого шару Б1Дливочкого розчину (МЗ) е бшьш тонкопористою (бшьша затримуюча здатнють). Кр1м того, для ц!еУ мембрани можна оч1кувати бтьшу асиметричнють пористоТ структури по ТГ товщинк Очевидно така мембрана мае бшьш тонкий поверхневий селективний шар, що забезлечуе бшьшу продуктивнеть, незважаючи на менший розм1р пор. Тага результати е наслщком впливу оргёнтуючоУ ди п¡дкладки на процес формування. Для в ах одержаних мембран спостер|'гався сенсорний вщгук при антиген-антитшо реакци. Модельною парою б1лгав, що використовували в подальших екслериментах були взял учмуноглобулжи кроля (1дС) та антитта

кози проти IgG кроля (анти-lgG). Характер smíhh електропровщносп системи Bifl концентрацп антигену був аналопчним для bcíx мембран (Рис.1), але абсолюта

Рис.1. Залежнють сенсорного < в'/дгуку eid концентрацп специфичного (IgG) та неспециф/'чного бтку (БСА) при використаннi анти-lgG вм'ниуючих мембран на основi cnie-noniMepy акрилоштрилу з акриловою кислотою. Умови вимЬювання: 25

lio i4о

мМ Na-фосфатному буферi, pht-7,5.

мл

значения вщгуку залежапи вщ типу мембрани. Враховуючи, що молекулярна структура цих мембран однакова, bíamihhoctí в значениях електропровщносл можуть бути викликан! впливом пористо! структури на процес ¡ммоби-нзацн, проходження ¡мунноТ реакцГГ та на електроповерхнев! характеристики самоУ мембрани.

Ефективн1сть ¡ммоб1л1зацп та проходження ¡мунореакци на таюй мембраж контролгавали ¡муноферментним анал1зом (Рис.2). Мембрани з малими та великими розм/рами пор (М2, МЗ) проявляють меншу ефекгивжсть при ¡муний реакцП'. Для широких пор характерне зменшення внутршньоУ поверхн!, ¡ як наслщок юльюсть зв'язаного антитта для таких мембран зменшуеться. Зменшення розм|'ру пор мембрани забезпечуе бшьш розвинуту поверхню, що

S 3501

О w

s 3001 * 250Н

М 1 М 2 М 3 сМ

я 200-a X

S 150-| V S

5 юо-

о)

со

20 4*0 60 ' 80 II [Б1лок1, Н1

М 1 М 2

м з

5 ' 20 100 200 300 500 1000 [IgG-HXl, нг/мл

Рис.2. ELISA-mecm для визначення сорбцшноТ ефективностi мембран, отриманих ¡з сп'тпопмеру акрилош-трилу з акриловою кислотою; М1, М2, МЗ - анти-lgG вм1'щуючг мембрани; IgG-ПХ - кон'югат IgG кроля з пероксидазою хршу.

по od ординат - оптична густина А при 405 нм продукту пероксидазного окисления ABTS перекисем водню.

дозволяв збтьшувати юльюсть ¡ммобт!зовзного ¡мунореагенту. Але для проходження ¡мунноТ реакцГУ важпиво, щоб пориста структура не створювапа стеричних перешкод для транспорту ¡мунореагенту. Очевидно, цей фактор > викликае зменшення ефективносл ¡мунноТ реакцм на найбшьш тонкопориспй мембран!.

Б наведеному приклад! спостер^аються симбадш змжи ефективносп' ¡мунноТ реакцГУ ! абсолютного значения вщгуку вщ пористоУ структури мембрани. Отже, вплив пористоУ структури може бути пояснений в межах впливу на ефективжсть ¡мунноУ реакцп. Але, безумовно, певну роль повинен вдегравати ! вплив пористоУ структури на електроповерхнев! характеристики мембрани. Так, зменшення розм1ру пор веде до збшьшення товщини подвмного електричного шару, що в свою чергу впливае на пщвищення електропровщних властивостей такоУ мембрани.

1.2. /муносенсори на основ!гЮрофобних полшерних штер'шпт.

3 метою вивчення можпивосл" одержання сенсорного вщгуку на незарядженм матриц), а разом з тим ) спрощення процесу ¡ммобш'гааци антитт нами були взял мембрани з пдрофобними властивостями. Це означае, що таким мембранам притаманна вщсутжсть поверхневого заряду.

В робол були використаж пол1мери на основ1 пол1вштхлориду. Виходячи з попередн1х даних, пориста структура мае значний вплив на характер та величину сенсорного вщгуку, що генеруеться. Ми використовували найб^льш тонкопорисл пол1з1ншхлоридт мембрани з класу мжроф!Льтрафйних з розм1ром пор 0,1 мкм.

Пдрофобш мембрани не змочуються водою, але при обробц! в розчин1 з поверхнево-акгивними речовинами пдроф^зщя вщбуваеться пошарово, вщ поверхевих шар!в, до внутр1шн1х. Там особливосл пдрофМзацм можна використати для одержання мембран з пдрофльною поверхнею та пдрофобними порами, що може дозволити регулювання топох1мн процесу ¡ммобт!зац1Т. При ¡ммобтЬацн бшкових молекул на таких мембранах бшок зв'язуеться виключно внутршньою пдрофобною поверхнею пор, а не на поверхш мембрани. Отже, бшков! молекули пюля ¡ммобМзацн знаходяться тшьки в порах мембрани.

Як поверхнево-активна речовина використовувався Тв1н-80. Це неюногенна сполука, отже, ТГ адсорбцю на поверхж не призводить до формування поверхневого заряду. За допомогою ¡муноферментного анал1зу було проведено вивчення характеру сорбцн 1дС кроля модифкованими пол1вЫлхлоридними мембранами (Рис.4). Встановлено, що сорбц1йна ефектившсть поверхж

пол!в1ншхлоридноТ мембрани змжюеться в залежносл вщ часу и обробки в 0.1% розчин1 Тв1н-80.

1,01- Рис.4. ELISA-mecm для визначення

змши сор5ц1~йно1 ефектиеност! ПВХ мембран в лроцеа обробки ix 0.1% розчином Твшу-80. BuxidHa концен-трац/я антит'ш кози проти IgG кроля становипа 0.5 мг/мл; розее-дення кон'югату IgG кроля з перо-ксидазою xpiHy було 1:3000. по oci ординат - оптична густина А

rirnt U>* П^г^гЬ^л'г*!)!

'-----J""'J "-I--

ксидазного окисления ABTS пере-кисем водню.

5 10 15 20 25

Час обробки,хв.

В перил хвилини витримки мембрани у зазначеному розчиж ПАР ефективнють сорбцй' на и" поверхн! може пор1внюватись ¡з сорбц1ею на поверхж полютирольного планшету. При подальше обробц|, коли розчин ¡з антитшами мае можлив1сть вже проникати \ ¡ммобш1зуватися в поровм структур! мембрани, за рахунок лдроф'тЬаци и поверх^ сорбцмна ефективнють такоТ мембрани пщвищуеться. Максимум спостер1гаеться в межах 7-8 хв обробки 1 пот)м швидко спадае досягаючи практично фоновоТ величини сорбцм июля 25-30 хв обробки. Тут можна константувати факт ловноТ пдрофт'|зацП' поверхнк Таким чином, для використання пдрофобноУ поверхн! пор необхщно проводите обробку полгёитхлоридноУ мембрани у 0,1% розчин'| ТвЫ-80 не бтьше 10 хв.

Оптимальний час витримки ПВХ мембрани у розчин1 Тв[ну-80 був встановлений також I незалежно в1д даних ¡муноферментного анал1зу. Пщ час

обробки абсолютно сухо! пдрофобноУ пористоТ мембрани розчином поверхнево активноТ речовини пдроф№ащя загальноТ поверхж вщбуваеться поступово. Спочатку пдрофМзуеться зовшшня поверхня мембрани, а поп'м - поверхня П пор. Якщо суха ПВХ мембрана практично не електропровщна у буферному розчиж, то в процес! витримки м в розчиж Твшу-80 електропровщжсть и збшьшуеться. На протяз1 перших 10 хв. вона зм!нюеться повшьно, а при чаа обробки 25-30 хв виртнюеться з епектропровщнютю буферного розчину. АналЬуючи даж 1муноферментного анал1зу та зм1ни електропровщносл пдрофобноУ ПВХ мембрани було встановлено, що 7-8 хв. витримки ТТ у розчиж Тв!н-80 б оптимальним часом.

Так, ¡ммобмзащю антитш ми проводили на попередньо обробленш ПАР мембраж I для пщтвердження доцшьносл цього етапу на необробленм. 3 Рис. 5

200 400 600 800 1000

[Бьчок], нг/мл

Рис.5. Залежн'ють сенсорного в!'дгуку вЮ концентрацП' специфЫного (1дв) та

нсспециф/чного б'тку (БСА) при вшористаню анти-1дО вмщуючоТ ПВХ мембрани (необроблено)). Умови вишрювання: 25 мМ Л/а-фосфатний буфер, рН=7,5.

та Рис 6 видно, що оброблена мембрана вщр!зняетъся бтьшою чутливютю (5нг/мл) та величиною вщгуку. Час вимфювання становив 4-6 хв. Неспециф1чний

сигнал, однак, бшьший по вщношенню до неспециф'шного на пдрофтьних мембранах, але, не дивлячись на це, вж суттево в'щрЬняеться вщ специф1чного сигналу. 12001

Рис.6. Залежн/сть сенсорного

&дгуку ей концентрацн

специфЫного (1дв) та

неспециф/чного бшку (БСА) при

еикористанн/ анти-1дО вмщуючо/'

ПВХ мембрани, оброблено7 0.1%

розчином Тешу-80 на протяз/ 7

хе. Умови вим'/рювання: 25 мМ №20 40 60 80 100 120 140

,„. , , фосфатний буфер, рН=7,5.

[Б1ЛОК], нг/мл

Для встановлення можливого мехашзму утворення сенсорного вдгуку при використанн! пористо! поверхш пол|'мерних мембран було проведено вим|'рювання мембранного потенц1апу до! шсля взаемод» Тх з бшками.

Так, р1вноважну р!зницю потенфалш (потенциал Нернста-Доннана) ми встановлювали за допомогою нановольтметру, з'еднаного з розчинами через електроди. 3 Рис. 7 видно, що напочатку незаряджена мембрана набувае заряду в процес'| обробки и бшками. Це заключения можна зробити на основ! утворення та зм1ни мембранного потен Ц1апу, що спостер1гаеться на цьому рисунку.

Для встановлення величини електричного заряду, що створюе мембранний потенц1ал, можна скористатася вщомою формулою, зпдно з якою заряд конденсатору доршнюе добутку його емносп на напругу. Прийнявши мембранний

2,5

Рис.7. Змша мембранного

потенщалу ПВХ мембрани: ПВХ -

необроблено/ мембрани, ПВХАт -

ПВХ мембрани з ¡ммобт/зованими

анти-1дв, ПВХАт.А* - анти-1дв

вм!'щуючо1 ПВХ мембрани пюля

и 20 40 60 80 100 120 взаемодПз 1дв. Час, сек.

потенц1ап р!вним 2 мВ (2 • 10"3 В), а емнють мембрани - 1 мкФсм"2 (10 6 Ф ■ см'2) [Котык А., 1980], ми отримаемо заряд «2 • 10"э Кл см"2.

Таким чином, на основ] отриманних даних можна зробити заключения про те, що в нашому випадку мембрани на основ'| полш'жтхлориду мають бтьшу чутливють шж мембрани на основ! похщних гюл1акрилон'1трилу. Можливо, це пов'язано з тим, що при використанн! пдрофобноТ мембрани ми маемо можливють модиф!кувати поверхнють Тв1н-80, частково не торкаючи пори. В цьому випадку топох1м1я реакцГГ антиген-антилло встановлена I проходить в поров!й структура Це призводить до змЫи заряду, який локатзований в лорТ На вщмшу вщ цього, мембрана на основ! сш'впол1меру акрилон1трилу з акриловою кислотою заряджена \ на фон! значного заряду самоТ мембрани внесок зм1ни поверхневого заряду в результат! реакцм антиген-антилло виявляеться менше н!ж у випадку незарядженоТ пдрофобноТ мембрани.

2. Розробка сенсорщ на основ! пол1мер1в, що ¡м1тують активний центр антитш

В нацш робот! була зроблена перша спроба використання ол!гоуретанових матер!ап!в для отримання матричних мембран. Серю мембран була отримана на основ! ол!гоуретанакрилат!в з р!зним ступенем зшивки, р1зною товщиною та р!зними фотожщшорами (пришитими (макро ¡н!ц!атор) та неприиштими до ол'1гомеру).

Так, добре вщмиту вщ матричноУ речовини мембрану помщали в електрох!ммну ком!рку. Проводили кондуктометричж вим1рювання у буферному розчину (рН=7.5) при юмнатнж температур!. Визначапи м!крограмов! юлькост! 1_-РЬе-ОЕ1 та ¡нших ам!нокислот \ фксували змжи, що в!дбувапися у вим!рювальн:й систем!.

Вивчаючи характер сенсорного вщгуку на ЬРЬе-ОЕ!, при використанн! ол"|гоуретанових мембран ¡з слабким та середн'|м ступенями зшивки, було вщм!чено, що неспециф!чний в!дгук у раз! використання Тгр навпъ був бшьшим за специфмнии (на введения [_-РЬе-ОЕ1). Це можна пояснити гнучистю полмиерних ланцюпв, що особливо виявляеться у м!сцях формування специф!чних каверн. При вимиванж з таких каверн молекул формувач'[в за рахунок свое"! гнучкост! пол!мер швидко "забуваь" |Х, що ¡мовярно \ призводить до великого неслециф!чного сигналу.

В подальших експериментах вже ¡з максимально зшитою олгоуретанакрилатною мембраною було помнено, що при використанн!' непришитого ¡нратору фотопол!меризацп, незважаючи на багато кращ! вщгуки н!ж при використанн! попередньо описаних мембран, високоТ селективност! досягти не

вдалося (Рис.8). 1мов1рно це пов'язано з тим, що ¡жц'|атор вимиваючись разом з матрицею стае додатковим матричним компонентом.

500

Я 200 ?

5 100

т

Рис.8. Запежн'ють сенсорного

в/дгуку е/'д концентрацй' специ-

фмноУ (1.-РНе-ОЕ1) та неспеци-

ф'мноТ (Тгр) ам'мо кислоти при

використанш високозшито) мат-

ричноТ ол1'гоуретанакрилатно1

мембраны. ФотоМщащя здш-

смюйапась у прнсутност! напри-

шитого Ыи/атору. Умови вшмрю-100 200 300 400 500

[Амшоки слота], м кг/и л еання: 25 мМ ^а-фосфатний

буфер, рН~7,5.

_ Ь-РЬе-ОЕ1( т

/ ■ Тгр

/

/ / //' //

/ /

о

Тому, при вимфюванн) величини вщгуку на введения 1.-Р'пе-ОЕ1 та Тгр, як неспецифнноТ амшокислоти, мав м1сце досить значний неспециф1чний вщгук за рахунок похибки, яку вносив вимитий ¡нщштор.

При робот! з пол1мером в якому гвд час процесу фотопол'1меризацГ|" використовувався макро ¡жфатор була досягнута досить велика селективнють (Рис.9). У цьому випадку ¡жц1атор не вимивався з утвореного пол|'меру I' не вносив похибки при вим"|рюваннк В такому раз'| неспециф'1чний вщгук у значив м'|р1 вдознявся вщ специф|чного.

Рис.9. Залежнють сенсорного е/дгуку ей концентрацн специфЫно)' (L-Phe-OEt) та неспецифмно! (Тгр) ам'мо кислоти при використанш високозшито'/ матричноГ onizoype-танакрилатно)' мембрани. На cmadii фотомЦацй використовували макро imujamop. Умови вим'/рювання: 25 мМ Na-фосфатний буфер, рН=7,5.

Використовуючи мембрани pi3Ho! товщини було встановлено, що при товщиж 0,5 мм вдаеться пщвищити швидга'сть вимфювання. Так ¡з 16 -18 хв., що затрачувались на вим1рювання сенсорного вщгуку при використанж олгоуретановоУ мембани товщиною 1мм, вдалося перейти до 8 -10 хв. при 0,5мм мембраж. Це легко пояснюеться дифузмною природою мембранного транспорту через тай мембрани. Час проходження матрично? речовини i вщповщно час вим1рювання сенсорного вщгуку тим менший чим менша товщина мембрани.

Мехажзми сенсорних вщгую'в матричних мембран обговорюються зараз в nireparypi [Sellergren В., 1993; Piletsky S.A., 1995]. Проте остаточно не доведено, яю саме процеси вщбувагаться п'и час взаемодм речовини матриц! з вщповщною кавернею noniMepy. 3 метою наблизитись до найбтьш точного пояснения цього мехажзму нами була проведена спроба BHMipy мембранного потенщалу матричноТ олтоуретанакрилатноТ мембрани. Для цього була використана юшина,

0 ' 10Ö 20Ö 300 400 500

[Амшокислота], мкг/мл

Величина в^дгуку, мкСм

РЬе-СО на протяа 1 години. 3 рисунку 11 видно, що при витримц!' ол1гоуретанакрилатноТ мембрани в розчиж з матрицею мембранний потенц1ап зммюеться. Для контролю отриманих результата був вимфян мембранний потенц'1ал нематричноТ ол1гоуретанакрилатноТ мембрани (Рис. 12),

0 1 2 3 4 5 6 7

Час, год.

Рис.12. Встановлення

мембранного потенцюлу

нематричнб! ол!гоуре-гпано#оТ пл'нзки: I - само)' мембрани; II - п!сля шубацИ з розчином 1.-РЬе-ОЕ1 (0,5 мг/мл) на протяз/1 години.

що пщтвердило ефект змЫи потенц!алу титьки в присутносп матриц!. 3 цього можна зробити заключения, що П1сля взаемоди матричноУ речовини з вщповщною каверною зммюеться величина загапьного заряду самоТ мембрани, а це в свою черту не може не вплинути на м електропровщжсть, а отже, I на сенсорний вщгук.

висновки

1. Проведено пошук та встановлено умови формування бюсумюних пдрофщьних та пдрофобних пл1вок з рйними ф1зико-х1ммними властивостями. Продемонстрована можлиа1сть використання Ух лористоУ структури при реестрацП' антиген-антит'1ло взаемодГУ.

2. Вперше розроблено новий споЫб регулювання TonoxiMiï процесу ¡ммобш1"зацГ| антитш (антигежв), який надав можлив1сть пщвищити чутливють анатзу за рахунок локашзацп проходження ¡мунореакцн сама в порах мембрани.

3. Розроблено метод реестрацГГ компоненте ¡мунних реакцм на основ! cniBnoniMepiB акрилом'трилу з акриловою кислотою, акриложтрилу з глщидтметакрилатом та полонтхлориду з чушвистю 5 нг/мл i часом вим1рювання 3 -5 хв.

4. Показано, що основним фактором, що впливае на величину сенсорного вщгуку при використанж бюафЫних noniMepÎB була ïx заряджежсть та розм1р пор. Так, тонкопорист'| пол1в1жлхлоридж мембрани характеризуются ш'двищеною

"M— " tA~ ............"f — "'f-V —........ > *,, О

вщбуваеться в порах.

5. Запропановано можливий мехажзм формування сенсорного вщгуку, що ¡ндукуеться при взаемодм антиген-антитто реакциТ на поверхн1 пористо! мембрани. Встановлено, що мембранний потенц!ал ПВХ мембрани змжюеться люля ¡MMo6mi3auiï антипп та люля реакцн' з вщповщним антигеном. Процес пов'язаний з перерозподшом загапьного заряду, який спричинюе виникнення змж в електропровщнооп само! мембрани.

6. Отримано мембрани, що ¡м)'тують активний центр антитша, на ochobî блок-сопол1меризацп метилметакрилату та олгоуретану в присутносп' молекул-формувач!в. Встановлено, що висока зшивка та використання макрожщгатору на перцш стадм процесу е необхщними умовами високоТ селективносл та стабтьносп матричних ол1гоуретанакрилатних мембран, а значить i сенсору на ïx ochobî.

7. Показано дивовижну аналопчнють у характер! вщгуку мембран, що мютять бтки-рецептори (антит'та, D1-6inoK тощо), та мембран, що моделюють рецепторну структуру. Переваги цих двох niflxoflis можна усшшно застосовувати для отримання бюафшних мембран з метою подальшого Т'х використання в сенсорнм технолопТ.

Список po6iT, опублжованих за темою дисертацп

1. Starodub N., Piletsky S., Panasyuk Т. A new approuch for express registration of specific antibodies II Proc. of the "IX International Conference on AIDS", Berlin. -1993.-P.256.

2. Starodub N.F.,Panasyuk T.L., Piletsky S.A. A new membrane sensor for detection of

t_ mo'J p a A

LHI 1UU llj ICQWUIIO I' nusu avyL IWWlvl, I luuwwvl^. - iWb/tS. - r. Kj.^r.

3. Piletsky S.A.,Parhometz Yu.P.,Lavryk N.V., Panasyuk T.L., El'skaya A.V. Sensors for low weight organic molecules based on molecular imprinting technique // Sensors & Actuators: B.Chemical. - 1994. - V.19, No.1-3. - P.629-631.

4. S.A.Piletsky,Yu.P.Parhometz,N.V.Lavryk, T.L.Panasyuk, A.V.EI'skaya. Template sensors// CIS-German workshop biosensors, Munster, 1993. - P.24.

5. Panasyuk T.L, Piletsky S., Nigmatullin R., Bryk M. Immunoresponive membrane based on acrylonitrile copolymers// Preprints of 7th International Symposium on "Synthetic Membranes in Science and Industry", Tubingen. -1994. - P.458-461.

6. S.Piletsky, N.Lavryk, T.Panasyuk, Y.Parhometz. Molecular imprinting technique for pesticides detection// Abstract of Eurosensors VIII Conference, Toulouse. - 1994. -P.383.

7. S.Piletsky, A.EI'skaya, T.Panasyuk. A new method for thrombin inhibitors assayИ Abstract of Eurosensors VIII Conference,Toulouse. - 1994. - P.377.

8. T, Panasyuk, S.Piletsky, R. Nigmatullin, M.Bryk. Methacrylic membranes and their application for the detection of binding reaction// Abstract of Eurosensors VIII Conference, Toulouse. -1994. - P.379.

9. T.L.Panasyuk, S.Piletsky, R.Nigmatullin, M.Bryk.Using of acrylonitrile membranes for elaboration of immunosensor// Proceedings of "Euromembrane'95", Bath. - 1995. -Vo.ll - P.394-398.

10. Панасюк Т.Л., Мгматулл'м P.P., Птецький C.A., Брик M.T. Мембрани в сенсорнш технологи // Функцюнальш матерали. - 1995. - Т.2, N3. - С. 322-327.

11. Piletsky S.A., Piletskaya E.V., Yano К., Kugimiya A, Elgersma A., Levi R., Kahlow U„ Takeuchi Т., Panasyuk T.L., El'skaya A.V., Karube I. A biomimetic receptor system for sialic acid based on molecular imprinting// Analit. Letter. - 19ЭВ. - V. 29, N2. -P. 157-170.

АНОТАЦ1Я

Panasyuk T.L. Investigation of antigen-antibody interaction using of bioaffinity and biomimetic membranes.

Thesis for a degree of Doctor of Phyiosophy (PhD) in Bioiogy, Special Option -Molecular Biology, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1997.

The thesis contains the results on investigation of the antigen-antibody interaction based on bioaffinity polymeric films and biomimetic membranes. The registration of immunoreagents carried out using of modified acrylonitrile or polyvinyl chloride polymers and imprinted olygourethane membranes. Such polymeric materials able to change its ions permeability during immunochemical reaction. They are responsible for both molecular recognition and signal generation.

The electrical conductivity of the system with the Ab-bound membrane increases in the presence of Ag allowing to detect its concentration. The sufficient sensitivity (5ng/ml for bioaffmity and 50 цд/m for biomimetic membranes) and response time (3-5 min. and 6-10 min.correspondingly) were achieved.

Панаскж Т.П. Исследование антиген-антитело взаимодействия при использовании биоаффинных и биомимических мембран.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, Киев, 1997.

В диссертационной работе представлены результаты исследования антиген-антитело взаимодействия при использовании свойств биоаффинных полимерных плёнок и мембран, имитирующих активный центр антител специфичных к гаптенам. Регистрацию компонентов иммунной реакции проводили с применением модифицированого акрилонитрильного или поливинил хлоридного полимера и матричной олигоуретановой мембраны. Такие полимерные материалы способны изменять свою электропроводность в процесе иммунохимической реакции. Они отвечают как за молекулярное распознавание, так и за генерацию сигнала.

Електропроводность системы с антитело-содержащей мембраной увеличивалась в присутствии антигена, что и позволяло определять его концентрацию. Была достигнута достаточно высокая чувствительность анализа (5 нг/мл для биоафинных и 50 мкг/мл для биомимичных мембран) и время отклика (3-5 мин. и 6 -10 мин. соответственно).

Ключов! слова: антиген-антитшо взаемодя, бюафжж пол1мери, 6ioMiMi4Hi мембрани, ¡муносенсор, кондуктометричний метод.

" £

( " L