Использование репортёрных генов (GFP и LacZ) для изучения эффективности генетической трансформации животных

Покровская, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование репортёрных генов (GFP и LacZ) для изучения эффективности генетической трансформации животных
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Использование репортёрных генов (GFP и LacZ) для изучения эффективности генетической трансформации животных"

На правах рукописи

ПОКРОВСКАЯ МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕПОРТЁРНЫХ ГЕНОВ (вЕР и ЬасЯ) ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2005

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

академик РАСХН Эрнст Лев Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дьяконов Лев Петрович; доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится 2& 2005 года, в/0Д>часов,

на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНИИЖа.

Автореферат разослан « 2,0 » _2005 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических н

В.П. Губанова

ítem

S940U

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы. Генная инженерия многоклеточных организмов является одной из областей современной биотехнологии.

Использование при создании трансгенных организмов генов маркерных (репортёрных) белков, таких как ß-галактозидаза кишечной палочки Escherichia coli или зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP) медузы Aequorea victoria, позволяет изучить эффективность генетической трансформации животных, установить функциональную активность различных клонированных промоторов.

В течение многих лет эксперименты по трансгенезу насекомых проводились в основном на дрозофилах Drosophila meianogaster с помощью рекомбинантных Р-элементов - подвижных генетических структур (мобильных элементов, м. э.), обнаруженных у этого вида (Rubin et al., 1982).

Успешная генетическая трансформация насекомых, не относящихся к семейству drosophilidae, в последние годы стала возможна в результате создания учёными генных конструкций на основе м. э., обнаруженных у насекомых разных видов (Handler A.M., 2001). Подвижный элемент комнатных мух Musca domestica L. - Hermes (Warren et al., 1994) - относится к группе транспозонов, которые наиболее часто используются в качестве вектора для генетической трансформации насекомых (Handler A.M., 2001).

При проведении экспериментов по созданию трансгенных насекомых наряду с выбором генноинженерного вектора большое внимание уделяется таким генетическим маркерам, которые обеспечивают эффективный отбор трансгенных особей в потомстве микроинъецированных особей. В настоящее время наиболее эффективными прижизненными селективными маркерами являются гены флуоресцирующих белков, выделенные из медуз и кораллов, а также мутантные формы этих генов, в том числе улучшенный GFP (Enhanced GFP, EGFP) (Handler A.M., 2001).

Предварительным этапом получения трансгенных сельскохозяйственных млекопитающих (Брем и др., 1996; Эрнст JI.K., 2003, 2004) является анализ интеграции и тканеспецифической экспрессии чужеродных генов у модельных животных, в качестве которых, в основном, используют лабораторных мышей Mus Musculus L. Короткий промежуток времени, необходимый для смены генераций (65-70 дней) и высокая плодовитость мышей облегчают проведение

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* MRJ» ПОТЕКА

с.я«т»»>т

»Mg PK

экспериментов по трансгенезу этих животных, обуславливая получение достоверных результатов.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в создании новых моделей генетически трансформированных животных на основе использования репортёрных генов.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

— провести трансформацию клеток зародышевого пути Musca domestica методом микроинъекции в ранние эмбрионы рекомбинаншых Р и Herraes мобильных генетических элементов, содержащих в качестве маркерного гена ген бета-галактозидазы (LacZ) и ген зелёного флуоресцирующего белка (EGFP);

~~ провести анализ генетической трансформации в первом и втором поколении комнатных мух, подвергшихся микроинъекции, по наличию экспрессии указанных репортёрных белков;

— провести ПЦР-анализ ДНК комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии развития, и их потомков на наличие трансгена;

— провести ПЦР-анализ ДНК лабораторных мышей, полученных в результате микроинъекции в пронуклеусы зигот генетической конструкции, содержащей ген EGFP под контролем промотора гена белка промежуточных филаментов кератина шерсти овец (К2.10), на содержание последовательностей трансгена;

— провести молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в первом и втором поколении трансгенных мышей;

— исследовать экспрессию гена EGFP в клетках коркового вещества волос у полученных трансгенных мышей.

1.3. Научная новизна работы. В ходе выполнения диссертационной работы впервые при проведении экспериментов по 1енетической трансформации комнатных мух с использованием гена улучшенного зелёного флуоресцирующею белка медузы A. victoria под контролем промотора гена hsp70 (гена белка теплового шока) Drosophila melanogaster подтверждена возможность селекции трансгенных особей на эмбриональной стадии развития.

При проведении исследований на мышах впервые получены трансгенные особи, экспрессирующие зелёный флуоресцирующий белок под контролем последовательности промотора, контролирующего у овец ген белка промежуточных филаментов кератина шерсти второго типа (К2.10).

f я -

I, ■ ■> '

О » ■

} — Í

1.4. Практическая значимость. Показана принципиальная возможность использования гена EGFP - мутантной формы гена GFP медузы Aequorea victoria - в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития.

Определена функциональная активность последовательности промотора гена бежа промежуточных филаментов второго типа (IF II) кератина шерсти овец (К2.10) длиной 735 пар нуклеотидов.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

• Возможность использования репортёрного гена EGFP под контролем промотора Кег5 и промотора гена hsp70 для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных Mus Musculus L. и Musca domestica L.

• Локализация экспрессии гена EGFP в корковом веществе волос у мышей, трансгенных по Ker-EGFP.

• Отклонение фактического расщепления по трансгену Ker-EGFP в первом поколении и подтверждение менделевского расщепления по тому же трансгену во втором поколении трансгенных мышей.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на 49-й научной конференции аспирантов и молодых учёных «Достижения молодых учёных в области животноводства», проходящей 6 июля 2000 года в ВГНИИЖе; на отчётных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа 2001,2002,2003 и 2004 года.

1.7. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

1.8. Структура и объём работы. Диссертация написана на 140 машинописных листах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 249 источников, в том числе 197 на иностранных языках. Работа содержит 8 таблиц и 29 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Схемы исследований.

Эксперименты по генетической трансформации комнатных мух проводились в отделе биотехнологии Всероссийского государственного НИИ животноводства в 1995, 1996 гг. и в 2000-2003 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы. Принципиальная схема этих исследований представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Схема исследований генетической трансформации комнатных

мух.

Для исследований использовали комнатных мух лабораторной популяции BI НИИЖа, в ранние эмбрионы которых (первые 60-90 мин развития) методом микроинъекции вводили 100-200 пкл раствора ДНК, представляющего собой смесь вектора и плазмиды помощника в соотношении 5:1 и концентрации 0,2 мг/мл. Микроинъекции проводились по методике, применяемой на дрозофилах Drosophila melanogaster (Santamaría Р., 1986) и имеющей некоторые изменения.

Исследования трансгенеза у мышей были выполнены в 2004-2005 гг. в отделе биотехнологии Всероссийского государственного НИИ животноводства. Первичные животные, полученные в результате микроинъекции генной конструкции Кег-ЕвРР в мужские пронуклеусы зигот мышей, были предоставлены Институтом биологии гена РАН. Этапы исследований схематично изображены на рис. 2.

Рис. 2. Схема исследований генетической трансформации лабораторных мышей.

2.2. Молекулярная характеристика генных конструкций.

Генетическая конструкция Ker-EGFP - линейная форма плазмиды PKERSH~1.TXT, предоставленная Луниным В.Г. (Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН). Она содержит ген улучшенного зелёного флуоресцирующего белка медузы (Enhanced GFP, EGFP) под контролем промотора (Кег5) гена белка IF II кератина шерсти овец (К2.10) длиной 735 пар нуклеотидов (Rogers G.E., Powell B.C., 1993).

При проведении экспериментов по генетической трансформации комнатных мух были использованы следующие генетические конструкции: pwLacZ, pjr25wc, предоставленные Корочкиным Л.И. (Институт биологии гена РАН), и pHermNco-EGFP, pHlpHt, предоставленные Косоруковым B.C. (Научно-производственный биотехнологический центр по животноводству РАСХН).

Вектор pwLacZ, сконструированный на основе Р элемента дрозофилы, 1 содержит репортерный ген ß-галактозидазы Е. coli (LacZ) под контролем промотора гена S-эстеразы (Est-S) Drosophila virilis и укороченный ген white D. ( melanogaster с его собственной регуляторной областью длиной 300 пн.

Плазмида помощник pn2Swc. В её состав входит Р элемент D. melanogaster, содержащий ген Р транспозазы (я25), и имеющий делению 3'-концевого инвертированного повтора (Karess R.E., Rubin G.M., 1984; Пиррота В., 1991).

Генетическая конструкция pHermNeo-EGFP создана на основе м. э Hermes, обнаруженного у комнатных мух (Warren et al., 1994). Она содержит бактериальный ген устойчивости к генетицину (Neo1) и ген улучшенного зеленого флуоресцирующего белка (FGFP) Aequorea victoria под контролем промотора белка теплового шока hsp70 D melanogoster.

Плазмида помощник pHlpHt содержит ген транспозазы мобильного элемента Hermes под контролем промотора hsp70 D melanogoster.

2.3. Исследования интеграции и экспрессии чужеродных генов.

Анализ интеграции ДНК, микроинъецированной в зародышевые клетки экспериментальных животных, проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Saiki et al., 1985; 1988; Саики и др., 1990; Зиновьева и др., 1998). Для проведения ПЦР-анализа высокомолекулярная ДНК выделялась методами, применяемыми в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных ВГНИИЖа (Зиновьева и др., 1998; Гладырь и др, 2001) Выделение ДНК из взрослых комнатных мух осуществляли методом перхлоратной экстракции (Гладырь и др., 2001) с последующей преципитацией раствором полиэтиленгликоля: 24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCl (Ausubel et al., 1987) Для выделения ДНК из проб кожи мышей (около 1 мм3), полученных из отсечённых кончиков хвостов, использовали метод Кавасаки (Kawasaki E.S , 1990; Зиновьева и др., 1998).

Для выявления экспрессии гена LacZ в семявыносящих луковицах у самцов Musca domestica L. с помощью субстрата, содержащего 0,2 % X-gal, использовали методику, применяемую у дрозофил (Bellen et al., 1989).

Анализ экспрессии трансгена EGFP у экспериментальных животных (комнатных мух и мышей) проводили с помощью люминесцентного микроскопа OPTON с использованием соответствующего набора световых фильтров, имеющего «возбуждающий» фильтр - BP 450-490, «запирающий» фильтр - FT 510, LP 520.

У мух исследовали кладки яиц микроинъецированных особей. Препараты готовили на поздней эмбриональной стадии развития. Материал, предварительно прогретый при 37 или 40 "С, заключали под вазелиновое масло.

У мышей исследование экспрессии трансгена проводили на гистосрезах кожи и в образцах волос. Препараты готовили по обычной методике (Ромейс Б., 1953). Для выявления тканеспецифической экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка в волосяных фолликулах трансгенных мышей дополнительно применяли иммуногистохимический метод окрашивания с использованием авидин - биотинового комплекса (Волкова H.A., 2003; Хериет Э.Р., Гаттер К.С., 1999; Полак Д., Ван Норден С., 1987).

Измерение интенсивности флуоресценции исследованных объектов, анализ гистологических препаратов проводили с помощью компьютерной программы ImageScope Color (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Результаты генетической трансформации насекомых.

3.1.1. Результаты микроинъекции эмбрионов комнатных мух плазмидами pwLacZ и piüSwc.

В результате микроинъекции 229 добластодермных эмбрионов комнатных мух плазмидами pwLacZ и pTt25wc было получено II первичных насекомых (F0) - 7 самок и 4 самца, которые индивидуально спаривались с контрольными особями лабораторной линии ВГНИИЖа. При дальнейшем разведении экспериментальных насекомых и скрещивании особей первого поколения межу собой среди особей второго поколения одной из самок F0, были обнаружены насекомые с закрученными вверх крыльями. При их скрещивании между собой, все насекомые первого поколения имели

изменённую форму крыльев. Такая форма крыльев ранее не наблюдалась у комнатных мух лабораторной линии ВГНИИЖа.

Обнаруженная нами мутация была выделена в линию и названа curly. Она характеризовалась полной пенетрантностью и неоднородной экспрессивностью.

Среди спонтанных мутаций комнатных мух, затрагивающих форму крыла, загнутые вверх крылья (curly wings) является наиболее часто встречаемой мутацией (Hoyer R.F.,1966; Vanossi Este et al., 1967). В 1990 году она была обнаружена в стандартизированной немутантной линии Musca domestica Института зоологии швейцарского университета (г. Цюрих) и имела типичную локализацию в четвёртой хромосоме. Проведённый нами генетический эксперимент по изучению аллелизма мутаций «закрученные вверх крылья» у комнатных мух линии curly и швейцарской мутантной линии показал, что мутация curly является аналогом мутации curly wings, наблюдаемой в разные годы в других популяциях лабораторных комнатных мух.

При изучении наследования мутации curly с помощью критерия расхождения распределений (критерия согласия распределений) - (хи-квадрат) мы обнаружили достоверное отклонение фактического расщепления (3,07:0,93) от теоретически ожидаемого (3:1) (табл. 1). Это было обусловлено пониженной жизнеспособностью мутантных мух по сравнению с особями, имеющими нормальную форму крыльев (табл. 2). Проведённый нами опыт показал, что в одинаковых условиях на 100 особей линии с нормальными крыльями, благополучно проходящих развитие от оплодотворённого яйца до превращения куколки в муху, в среднем приходится 60 мух линии с закрученными вверх крыльями.

Таблица 1. Вычислениеу? (хи-квадрат).

Фенотипический класс (Ф) (Т) Ф-Т (Ф-Т)2 (Ф-Т)2/Т Х^факт «Ti о о" 11 QU о о" II О. о о о" II о.

Номальные крылья 2427 2375 52 2704 1,14 4,56 3,8 6,6 10,8

Загнутые вверх крылья 739 791 -52 2704 3,42

Примечание Ф фактическое число особей в каждом классе; Т -теоретически ожидаемое число особей в классе.

Таблица 2. Жизнеспособность комнатных мух.

Линия Продолжительность Выход куколок Выход имаго из Выход имаго

комнатных мух яйцекладки, дни из яиц, % куколок, % из яиц, %

Прямокрылые 27 79,0***±8,7 97,0'"=Ы,1 77,0"±9,0

curly 24 57,0**±8,7 81,0*"±5,3 47,0"±8,3

Примечание: - средняя арифметическая достоверна при уровне вероятности (Р) > 0,999; " - средняя арифметическая достоверна при Р > 0,99.

При выявлении экспрессии гена бета-галактозидазы Е. coli у экспериментальных насекомых исследовалась репродуктивная система самцов.

В результате окрашивания 50 препарированных особей первого поколения комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии развития, и пяти самцов мутантной линии curly с использованием субстрата, содержащего 0,2 % X-gal, активность экзогенной ß-галактозидазы в сесмявыносящих луковицах исследованных экземпляров не была выявлена.

При проведении молекулярного анализа интеграции трансгена в хромосомы комнатных мух с помощью ПЦР мы столкнулись с некоторыми трудностями ДНК, выделяемая нами первоначально из взрослых комнатных мух методом перхлоратной экстракции и осаждаемая 96 % этанолом, который обычно используется в лабораторной практике, была не пригодна для проведения полимеразной цепной реакции. При замене этанола на раствор полиэтиленгликоля и хлорида натрия (24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCI) полученные пробы имели достаточную степень чистоты, необходимую для амплификации с помощью Taq-полимерэзы в стандартных условиях ПЦР. В дальнейшем при выделении ДНК из имаго Musca domestica в качестве осаждающего агента мы использовали только указанный раствор полиэтиленгликоля.

С целью определения инсерции введенных последовательностей вектора pwLacZ у комнатных мух линии curly нами был проведён ПЦР-анализ ДНК мутантных особей с использованием олигонуклеотидных праймеров, подобранных к участку гена white Drosophila melanogaster. В качестве положительного контроля анализировалась ДНК, выделенная из клеток линии 67j25D дрозофилы D. melanogaster Oregon R. С.

Электрофореграмма продуктов ПЦР показала отсутствие экзогенной ДНК у насекомых с закрученными крыльями.

Таким образом, обнаруженная нами мутация комнатных мух curly (закрученные вверх крылья), не является результатом интеграции генно-инженерной конструкции pwLacZ в хромосомы указанных насекомых.

Поскольку мутация «закрученные вверх крылья» была нами обнаружена в ходе одного из экспериментов по трансформации комнатных мух с помощью рекомбинантного Р-элемента дрозофилы, мы предполагаем, что изменение в фенотипе экспериментальных насекомых было обусловлено мутагенным действием экзогенной ДНК. Транспозаза Р-элемента (плазмиды помощника), введённого вместе с вектором в добластодермные эмбрионы, могла обеспечить транспозицию эндогенных перемещающихся элементов генома комнатных мух.

3.1.2. Результаты микроинъекции эмбрионов комнатных мух плазмидами pHermNeo-EGFP и pHlpHL

Было проведено три эксперимента по микроинъекции эмбрионов комнатных мух смесью плазмид pHermNeo-EGFP и pHlpHt (табл. 3).

В экспериментах № 1 и № 3 после микроинъекции эмбрионы культивировались до стадии куколки при температуре 25-27 "С.

При проведении эксперимента № 2, с целью индуцирования транспозиции рекомбинантных элементов Hermes из инъецированных плазмид в хромосомы реципиента, микроинъецированные эмбрионы прогревались при 37 °С в течение 60 минут. Затем они развивались до стадии куколки при 2527 "С.

Селекцию трансгенных комнатных мух среди потомков микроинъецированных особей мы проводили без применения генетицина G418, используя EGFP как самостоятельный маркер генетической трансформации.

Поскольку меланизированная кутикула комнатных мух на стадии имаго мешает обнаружению приобретённой флуоресценции - свечению EGFP, выявление трансгенного потомства Fl осуществлялось на поздней эмбриональной стадии. После предварительного двойного прогревания в термостате при 37 °С и выдерживания 1 час при комнатной температуре между часовыми прогреваниями кладок яиц, полученных от мух F0, экспрессия EGFP выявлялась в результате просмотра эмбрионов в синем свете люминесцентного микроскопа OPTON (эксперимент № 1 и № 2).

При проведении третьего эксперимента эмбрионы первичных насекомых (БО) перед выявлением приобретённой флуоресценции в течение 30 минут прогревались при 40 °С.

В результате исследований 320 кладок яиц экспериментальных особей у трёх эмбрионов, полученных от одного из плодовитых самцов Р0 (эксперимент № 1), на фоне естественного желто-зеленого свечения желтка, хориона и других структур были обнаружены отдельные скопления клеток, имеющих зелёную флуоресценцию.

При просмотре в люминесцентном микроскопе яйцекладок, полученных от трёх контрольных самок, спаренных с единственным самцом Р1, выжившем из отобранных эмбрионов, зелёное свечение не наблюдалось.

Таблица 3. Трансформация комнатных мух плазмидами pHermNeo-EGFP и pHlpHt

Количество Количество имаго F0 Количество

Номер инъецированных эмбрионов F1,

эксперимента эмбрионов всего плодовитых трансформи- имеющих зелёную

рованных флуоресценцию

1 350 29 23 1 3

2 754 136 74 - -

3 762 44 26 - -

Итого 1866 209 123 1 3

ПЦР-анализ тотальной ДНК, выделенной из взрослых мух F0, с использованием олигонуклеотидных праймеров, подобранных к GFP, показал наличие экзогенных последовательностей у 30 плодовитых насекомых, микроинъецированных на эмбриональной стадии генно-инженерной конструкцией pHermNeo-EGFP (табл. 4).

Исследование хромосомной ДНК комнатных мух первого и второго поколения показало наличие репортёрного гена EGFP Aequorea victoria у трансформированного самца F1, имеющего зелёную флуоресценцию на стадии эмбриона, и отсутствие таковых у других проанализированных особей (см. табл. 4).

Таблица 4. Результаты ПЦР-анализа ДНК экспериментальных комнатных мух на содержание нуклеотидных последовательностей гена ЕвГР(чДНК).

Номер эксперимента F0 Fl F2

Всего проанализировано Количество особей, имеющих чДНК Всего проанализировано Количество особей, имеющих Всего проанализировано Количество особей, имеющих

особей всего плодовитых особей чДНК особей чДНК

1 29 9 8 52 1 50 -

2 136 21 17 75 - - -

3 44 7 5 23 - - -

Итого 209 37 30 150 1 50 -

Клетки насекомых, содержащие мобильные элементы имеют специфические механизмы регуляции их подвижности. Эндогенная система репрессии может снижать частоту трансформации.

Анализ результатов ПЦР при исследовании ДНК комнатных мух лабораторной популяции ВГНИИЖа на содержание эндогенных мобильных элементов Hermes с помощью олигонуклеотидных праймеров, подобранных к гену Hermes транспозазы, показал, что все проверенные особи (279 голов) имели нуклеотидные последовательности этого элемента.

Таким образом, низкая частота трансформации комнатных мух с помощью рекомбинантного мобильного элемента Hermes (4,35 %), наблюдаемая в эксперименте № 1 (см. табл. 3), могла быть обусловлена негативным влиянием эндогенных копий данного элемента, обнаруженных у лабораторных насекомых.

Флуоресценция EGFP, выявленная у первого поколения на эмбриональной стадии развития и отсутствие зелёного свечения и чужеродных нуклеотидных последовательностей у особей F2, вероятно, были обусловлены инсерцией вектора pHermNeo-EGFP в ДНК митохондрий зародышевых клеток микроинъецированного самца F0. Похожие случаи экстрахромосомной интеграции и экспрессии гена GFP наблюдались зарубежными учёными при получении трансгенных комнатных мух и трансгенных насекомых других видов (Tamura et al., 2000; Handler A.M., Harrell R.A., 2001; Hediger et al., 2001).

Высокая эффективность селекции трансформированных особей по наличию зелёной флуоресценции (100 %) свидетельствует о возможности

использования гена улучшенного зеленого флуоресцирующего белка Aequorea victoria (EGFP) в качестве маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития и получения трансгенных линий насекомых этого вида.

3.2. Получение трансгенных мышей.

3.2.1. Получение первичных трансгенных мышей.

В результате микроинъекций генноинженерной конструкции Ker-EGFP в мужские пронуклеусы зигот мышей было получено 99 первичных животных (F0), из которых 5 особей по результатам ПЦР-анализа ДНК оказались трансгенными.

Анализ волос трансгенных мышей F0, имеющих серую масть, в синем свете люминесцентного микроскопа показал отсутствие различий между спектром флуоресценции этих структур у трансгенных и нетрансгенных особей. Светло-серые волосы имели жёлтую люминесценцию, тёмно-серые -зеленоватую люминесценцию. С целью получения белых трансгенных особей, лишённых пигментации волос, первичные трансгенные мыши (F0) были спарены с белыми нелинейными животными. В дальнейшем мы исследовали волосы только белых мышей, полученных от скрещивания трансгенных сибсов первого поколения между собой или от скрещивания трансгенных и нетрансгенных особей первого поколения друг с другом.

3.2.2. Получение первого и второго поколения трансгенных мышей.

При проведении анализа наследования трансгена Ker-EGFP в первом

поколении первичных трансгенных животных, спаренных с нетрансгенными особями с помощью ПЦР, нами было обнаружено отклонение фактической частоты наследования трансгена (21** % ± 4,5 %) от теоретически ожидаемой частоты 50 %. При скрещивании трансгенных особей первого поколения с нетрансгенными мышами, частота наследования трансгена у потомков второго поколения (47*** % ± 2,2 %) приближалась к прогнозируемой величине (табл.

5),

Статистическая обработка полученных данных наследования трансгена показала достоверность разности (Р > 0,99) между средней арифметической по доли трансгенных особей в первом поколении и средней арифметической

величиной по доли трансгенных особей во втором поколении первичных трансгенов.

При сопоставлении эмпирических и теоретических частот наследования трансгена Кег-ЕОЕР с помощью критерия хи-квадрат (%2) отклонения расщепления в опыте от теоретически ожидаемого в первом поколении были достоверны (Р < 0,05), а во втором поколении были недостоверными и носили случайный характер (Р > 0,05) (см. табл. 5).

Таблица 5. Наследование трансгена Ker-EGFP в первом и втором поколении трансгенных мышей.

Номер и пол первичной трансген- Количество потомков первого поколения (F1), голов Доля трансгенных особей в F1, X2FI Количество потомков второго поколения (F2), голов Доля трансгенных особей в F2,

ной особи всего трансгенных % всего трансгенных %

780 с? 41 9 21,95 12,9 41 17 41,46 1,2

750 с? 50 17 34,00 5,1 51 26 50,98 0,02

161 $ 16 2 12,50 - - - - -

129 9 11 1 9,09 - 38 18 46,31 0,1

177? 8 2 25,00 - 12 6 50,00 -

итого 126 31 24,6 16,3 142 67 47,18 0,5

При спаривании гемизиготных трансгенных сибсов первого поколения друг с другом доля трансгенных животных во втором поколении потомков от самца № 780 и самца № 750 составила 86 % и 67,5 % соответственно, что подтверждает менделевский характер наследования трансгена Ker-EGFP у экспериментальных животных.

3.2.3. Анализ экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка Aequorea victoria у трансгенных мышей.

Среди 32-х трансгенных белых мышей, полученных во втором поколении экспериментальных особей, у семи потомков самца № 780 были обнаружены отдельные ярко светящиеся волосы (рис. 1, а). Спектр и интенсивность флуоресценции этих волос соответствовали оттенку и яркости

фотолюминесценции трансформированных бактерий Escherichia coli, экспрессирующих EGFP, которых мы использовали в качестве эталона флуоресценции EGFP.

При просмотре волос контрольных белых мышей в синем свете люминесцентного микроскопа была выявлена незначительная естественная люминесценция (рис. 1, б), которая существенно отличалась от флуоресценции трансформированных бактерий и ярко светящихся волос трансгенных мышей.

Рис. 1. Флуоресценция волос белых трансгенных (а) и белых нетрансгенных (б) мышей (стрелками отмечены волосы с интенсивной зелёной люминесценцией)

а б

При статистической обработке результатов измерений яркости 77 интенсивно флуоресцирующих и 157 слабо светящихся волос у трансгенных

белых особей (рис. 2) были получены средние арифметические, которые достоверно (Р > 0,999) различались между собой. Эти величины с высокой степенью достоверности (Р > 0,999) превышали среднюю арифметическую по яркости естественной флуоресценции (аутофлуоресценции) 199 волос контрольных мышей белой масти (рис. 3).

При использовании зелёного цветового канала компьютерной программы ImageScope Color интенсивность зелёного спектра флуоресценции слабо флуоресцирующих волос трансгенных по Ker-EGFP и контрольных белых мышей, а так же нетрансформированных бактерий Escherichia coli была равна нулю (рис 4, 3). Яркость зелёной флуоресценции трансформированных бактерий (рис. 4, 2) была достоверно (Р > 0.999) меньше интенсивности зелёного спектра флуоресценции волос у трансгенных белых мышей (рис. 4,1), что, вероятно, было обусловлено разными размерами исследованных объектов.

Рис. 2. Вариационные кривые интенсивности флуоресценции волос белых мышей.

35 т

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 138 14« 154 162 170 178 186 192

яркость флуоресценции волос (условных единиц) • полигон распределения частот слабо светящихся вол о* у трансгеиной по Krr-EGFP особи. » полигон распределения частот интенсивно светящихся волос у трансгенноА по Ker-EGFP особи, полигон распределения частот у нетрансгенных особей.

Рис. 3. Гистограмма яркости флуоресценции трансформированных бактерий Escherichia coli (4), слабо (2) и интенсивно флуоресцирующих (3) волос трансгенной по Ker-EGFP белой особи, волос белых нетрансгенных мышей (1).

■ минимальное значение яркости флуоресценции в средняя арифметическая интенсивности флуоресценции Ш максимальное значение яркости флуоресценции

Рис. 4. Гистограмма интенсивности зелёной флуоресценции (1 -волосы трансгенных по Кег-ЕвГР мышей, 2 - трансформированные бактерии, 3 - контроль).

шгтенсивность флуоресценции (условных единиц)

максимум средняя арифметическая минимум

значения признаю!

Ш минимум

■ средняя арифметическая

□ максимум

При иммуногистохимическом окрашивании серии парафиновых срезов кожи четырёх белых взрослых трансгенных особей специфическое связывание моноклональных антител с антигеном (ЕОРР) наблюдалось у трансгенного животного, на участке кожи, имеющем старые и сменяющие их новые волосы, в корневой части формирующегося волоса. Среди отобранных для иммуногистохимических исследований трансгенных животных именно у этой особи при просмотре препаратов волос в синем свете люминесцентного микроскопа были обнаружены экземпляры, имеюшие интенсивную зелёную флуоресценцию.

Гены белков промежуточных филаментов кератина млекопитающих активируются в период формирования и роста волос, в функциональных дифференцированных клетках коркового вещества волосяного стержня. При рождении мышата не покрыты шерстью, и волосяной покров начинает формироваться с 4 дня после рождения. Для выявления экспрессии ЕОРР в фолликулах растущих волос трансгенных мышей, мы исследовали парафиновые срезы кожи трансгснных и нетрансгенных особей третьего поколения, полученные на 2. 4 и 6 день после рождения.

В результате проведённого исследования фолликулов растущих волос зелёная флуоресценция и специфическое иммуногистохимическое окрашивание внутрикожной части отдельных волосяных стержней были обнаружены только на срезах кожи, полученных от трансгенных мышат.

Таким образом, интенсивная зелёная флуоресценция отдельных волос, наблюдаемая нами у белых трансгенных мышей, была обусловлена мозаичностью экспрессии EGFP в волосяных фолликулах, что согласуется с полученными результатами по иммуногистохимическому окрашиванию препаратов кожи трансгенных особей и опубликованными данными по трансгенезу мышей (Keough et al., 1995).

4. ВЫВОДЫ.

1. Ген зелёного флуоресцирующего белка медузы Aequorea victoria (EGFP) является эффективным маркером для селекции трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития. Результаты проведённого ПЦР-анализа подтвердили содержание гена EGFP в ДНК особи, отобранной по наличию зелёной флуоресценции на стадии яйца.

2. Отсутствие интеграции экзогенной ДНК у потомков экспериментальных насекомых (Musca domestica L.), микроинъецированных на стадии эмбриона рекомбинантными Р-элементами дрозофилы, указывает на нецелесообразность использования этих транспозонов в качестве векторов генетической трансформации для получения трансгенных комнатных мух.

3. Достоверное отклонение фактического генетического расщепления трансгена Ker-EGFP (0,8 : 3,2) от теоретически ожидаемого (1 : 1) у потомков первого поколения трансгенных мышей (Р < 0,05), полученных при спаривании трансгенных и нетрансгенных особей, свидетельствует об избирательном взаимодействии генной конструкции и реципиентных структур подопытных животных.

4. Соответствие эмпирической частоты наследования трансгена Ker-EGFP (47*** % ± 2,2 %) теоретической частоте (50 %) у потомков второго поколения мышей, полученных при спаривании трансгенных и нетрансгенных особей, свидетельствует о моногенном наследовании трансгена у исследованных животных.

5. Достоверное различие между средними арифметическими по яркости флуоресценции интенсивно светящихся волос белых трансгенных особей и

волос белых контрольных мышей. 154*** усл. ед. ± 1,5 усл. ед. и 60*** усл. ед. ± 1,0 усл. ед. соответственно (Р > 0,999), свидетельствует о наличии зелёного флуоресцирующего белка медузы А. victoria в волосяном покрове трансгенных особей.

6. Обнаруженная тканеспецифическая экспрессия гена EGFP в дифференцирующихся клетках коркового вещества волос трансгенных мышей подтверждает функциональную активность промотора Кег5 длиной 735 пар нуклеотидов, регулирующего ген белка промежуточных филаментов II типа кератина шерсти овец (К2.10).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Рекомендуем в биотехнологических лабораториях использовать последовательность промотора Кег5, регулирующего ген белка IF II кератина шерсти овец (К2.10), для создания генно-инженерных конструкций и получения трансгенных млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантные белки в корковом веществе волос.

2. Для молекулярно-генетических лабораторий рекомендуем с целью оптимизации условий выделения ДНК из насекомых при перхлоратном методе экстракции использовать раствор полиэтиленгликоля (24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCl) в качестве осаждающего агента.

Список опубликованных работ по теме диссертацви.

1. Фролкина М.В., Кпецко Н.Г, Барминцев В.А., Какпаков В.Т., Эрнст Л.К. Анализ ДНК комнатных мух Musca domestica L. мутантной линии curly на содержание экзогенных последовательностей // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркирование признаков сельскохозяйственных животных»; Всерос гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2001. - С. 121-122.

2. Фролкина М.В., Шихов И.Я.. Зиновьева H.A., Косоруков B.C., Эрнст Л.К Использование гена зелёного флуоресцирующего белка (GFP) в качестве маркера для получения трансгенных комнатных мух Musca domestica L. // Материалы конф. «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - Быково. Моск. обл., 2001. - Вып 7. - С. 204-205.

3. Эрнст JI.K., Злочевский Ф.И., Фомичёв Ю.П., Ерастов Г.М., Зиновьева H.A., Багиров В.А., Какпаков В.Т., Фролкина М.В. Энтомологическая переработка органических отходов свиноводства и птицеводства и использование её продуктов в сельском хозяйстве; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2004. - 136 с.

4. Покровская М.В., Кадулин С.Г., Лунин В.Г., Шихов И.Я., Зиновьева H.A., Эрнст JI.K. Анализ наследования и экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка EGFP Aequorea victoria у трансгенных мышей // Материалы 4-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных»; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2004. - С. 82-

89.

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл, Подольский р-н, п Дубровицы Тел. (8-27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 16 05.2005 Подписано в печать 16 05 2005 Заказ № 14. Псч. л 1,1 Тираж 90 экз

РНБ Русский фонд

2005-4 29387

11 ИЮЛ 2005 ;

Wfjc.t^ájrprrу

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Покровская, Мария Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТИРАТУРЫ.

1.1. Использование промоторной области регуляторных генов в экспериментах по генетической трансформации.

1.1.1. Экспрессия стрессовых белков - белков теплового шока.

1.1.1.1. Промоторный район гена белка теплового шока 70 (БТШ70) в экспериментах по трансформации эукариотических клеток

1.1.2. Тканеспецифическая экспрессия генов медленной эстеразы у насекомых.

1.1.3. Регуляция экспрессии генов кератина волос у млекопитающих

1.2. Репортёрные гены - маркеры генетической трансформации.

1.2.1. Ген ß-галактозидазы Escherihia coli.

1.2.2. Флуоресцирующие белки кишечнополостных.

1.2.2.1. Зелёный флуоресцирующий белок Aequorea victoria.

1.2.2.1.1. Особенности пространственной структуры GFP.

1.2.2.1.2. Хромофор GFP.

1.2.2.1.3. Спектральные характеристики GFP и его мутантных форм

1.2.2.1.4. Физико-химические свойства GFP.

1.3. Генетическая трансформация насекомых.

1.3.1. Первые эксперименты по трансгенезу насекомых.

1.3.2. Мобильные элементы - векторы генетической трансформации насекомых.

1.3.2.1. Характеристика мобильных элементов.

1.3.2.2. Р-элемент дрозофилы.

1.3.2.2.1. Механизм интеграции мобильных элементов в хромосомы насекомых на примере Р-элемента.

1.3.2.2.2. Трансформация насекомых с помощью Р-элементов.

1.3.2.3. Мобильный элемент Hermes - эффективный вектор для трансформации насекомых.

1.3.3. Микроинъекция эмбрионов - основной метод трансформации насекомых.

1.3.4. Маркеры генетической трансформации насекомых.

1.3.4.1. GFP - эффективный маркер генетической трансформации у насекомых.

1.3.5. Генетическая трансформация комнатных мух.

1.3.6. Мутагенное действие экзогенной ДНК.

1.4. Получение трансгенных мышей.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Схемы исследований.

2.3. Использованные векторы.

2.4. Получение генетически трансформированных животных.

2.4.1. Микроинъекция эмбрионов комнатных мух.

2.4.1.1. Микроинъектор и микроинструменты.

2.4.1.2. Проведение микроинъекции эмбрионов комнатных мух.

2.4.1.3. Получение потомства от комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии.

2.4.2. Получение трансгенных мышей.

2.5. Молекулярно - генетический анализ.

2.5.1. Выделение ДНК.

2.5.2. ПЦР-анализ.

2.5.2.1. Праймеры.

2.6. Анализ экспрессии чужеродных генов у трансформированных животных.

2.6.1. Выявление продуктов экспрессии гена ß-галактозидазы Е. coli. у комнатных мух.

2.6.2. Выявление экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка A. victoria.

2.6.2.1. Выявление экспрессии гена EGFP у комнатных мух.

2.6.2.2. Выявление экспрессии гена EGFP у мышей.

2.6.2.2.1. Определение флуоресценции EGFP у трансгенных мышей

2.6.2.2.2. Иммуногистохимическое выявление экспрессии гена

EGFP.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Результаты микроинъекций эмбрионов комнатных мух.

3.1.1. Получение и разведение взрослых комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии плазмидами pwLacZ и p7u25wc.

3.1.1.1. Результаты определения бета-галактозидазной активности у потомков Musca domestica L., микроинъецированных на эмбриональной стадии.

3.1.1.2. Анализ наследования формы крыльев у комнатных мух.

3.1.1.3. Сравнение жизнеспособности комнатных мух линии с нормальными (прямыми) крыльями и мух линии curly.

3.1.1.4. Аллелизм мутации curly у комнатных мух.

3.1.1.5. Молекулярный анализ хромосомной ДНК комнатных мух мутантной линии curly.

3.1.2. Микроинъекция эмбрионов комнатных мух плазмидами pHermNeo-EGFP и pHlpHt.

3.1.2.1. Исследование экспрессии гена EGFP у комнатных мух.

3.1.2.2. Молекулярный анализ ДНК комнатных мух, на содержание последовательностей рекомбинантных мобильных элементов Hermes.

3.1.2.3. Анализ ДНК комнатных мух на содержание эндогенных элементов Hermes.

3.2. Получение трансгенных мышей.

3.2.1. Получение первичных трансгенных мышей.

3.2.2. Получение первого и второго поколения трансгенных мышей.

3.2.3. Анализ экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка Aequorea victoria у трансгенных мышей.

3.2.3.1. Исследование флуоресценции волос у трансгенных особей.

3.2.3.2. Исследование флуоресценции гистологических препаратов кожи трансгенных мышей.

3.2.3.3. Иммуногистохимическое исследование тканеспецифической экспрессии гена EGFP.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование репортёрных генов (GFP и LacZ) для изучения эффективности генетической трансформации животных"

Актуальность проблемы

Генная инженерия многоклеточных организмов является одной из областей современной биотехнологии.

Трансгенные животные представляют собой удобную модель изучения механизмов регуляции ткане- и стадиеспецифической экспрессии, структуры и функциональной организации генов, заключительных стадий биосинтеза белка (Вайсман и др., 1988).

Наряду с изучением фундаментальных вопросов трансгенеза большое внимание привлекают работы по созданию трансгенных животных-продуцентов рекомбинантных белков, трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к заболеваниям или трансгенных животных, имеющих улучшенные продуктивные качества (Брем и др., 1996; Эрнст Л.К., 2003, 2004).

В течение многих лет эксперименты по трансгенезу насекомых проводились, в основном, на дрозофилах Drosophila melanogaster с помощью рекомбинантных Р-элементов - подвижных (мобильных) генетических структур, обнаруженных у этого вида (Rubin et al., 1982). Исследования по трансгенезу насекомых, не относящихся к семейству drosophilidae, часто заканчивались неудачно, что было обусловлено отсутствием эффективных генно-инженерных векторов (Crampton J.M., Eggleston P., 1994). Успешная генетическая трансформация насекомых в последние годы стала возможна в результате создания'учёными генных конструкций на основе транспозонов, обнаруженных у насекомых разных видов (Handler A.M., 2001). Среди этих структур большую популярность в качестве вектора генетической трансформации насекомых приобрёл мобильный элемент комнатных мух Musca domestica L. - Hermes (Warren et al., 1994).

При проведении экспериментов по созданию трансгенных насекомых наряду с выбором генно-инженерного вектора большое внимание уделяется таким селективным маркерам, которые обеспечивают эффективный отбор трансгенных особей среди потомков, полученных от подопытных животных. В настоящее время наиболее эффективными прижизненными маркерами являются гены флуоресцирующих белков, выделенные из медуз и кораллов, а также мутантные формы этих генов, в том числе улучшенный GFP (Enhanced GFP, EGFP) (Handler А.М., 2001).

Клонирование промотора одного из генов белков промежуточных филаментов (IF) кератина шерсти овец - К2.10 (Rogers G.E., Powell B.C., 1993) и синтез аналогов гена белка спидроина 1, обуславливающего прочность каркасной нити паутины крестовика Уемуры (Araneus uemura) (Дебабов В.Г., Богуш В.Г., 1999; Пирузян и др., 2003), обеспечивает возможность создания рекомбинантных генных конструкций для получения трансгенных овец с улучшенными механическими качествами шерсти.

Использование при создании трансгенных организмов генов маркерных (репортёрных) белков, таких как Р-галактозидаза Escherichia coli или зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP) медузы Aequorea Victoria, позволяет установить функциональную активность различных промоторов, обуславливающих экспрессию чужеродных белков в определённых тканях трансгенных животных.

Предварительным этапом получения генетически трансформированных сельскохозяйственных млекопитающих является анализ интеграции и тканеспецифической экспрессии чужеродных генов у трансгенных модельных животных, среди которых, в основном, используют лабораторных мышей Mus musculus L.

Короткий промежуток времени, необходимый для смены генераций (65-70 дней), высокая плодовитость мышей облегчают проведение экспериментов по трансгенезу этих животных и обуславливают получение достоверных результатов.

Цель и задачи исследований

Цель настоящей работы заключалась в создании новых моделей генетически трансформированных животных на основе использования репортёрных генов.

Для достижения намеченной цели перед нами были поставлены следующие задачи:

- провести трансформацию клеток зародышевого пути Musca domestica методом микроинъекции в ранние эмбрионы рекомбинантных Р и Hermes мобильных генетических элементов, содержащих в качестве маркерного гена ген бета-галактозидазы (LacZ) и ген зелёного флуоресцирующего белка (EGFP);

- провести анализ генетической трансформации в первом и втором поколении комнатных мух, подвергшихся микроинъекции, по наличию экспрессии указанных репортёрных белков;

- провести ПЦР-анализ ДНК комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии развития, и их потомков на наличие трансгена;

- провести ПЦР-анализ ДНК лабораторных мышей, полученных в результате микроинъекции в пронуклеусы зигот генетической конструкции, содержащей ген EGFP под контролем промотора гена белка промежуточных филаментов кератина шерсти овец (К2.10), и выявить первичных трансгенных животных;

- провести молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в первом и втором поколении трансгенных мышей;

- исследовать экспрессию гена EGFP в клетках коркового вещества волос у полученных трансгенных мышей.

Научная новизна

При проведении нами экспериментов по генетической трансформации комнатных мух с использованием гена улучшенного зелёного флуоресцирующего белка медузы Aequorea victoria под контролем промотора гена hsp70 (гена белка теплового шока) Drosophila melanogaster впервые подтверждена возможность получения трансгенных особей и их отбор на эмбриональной стадии развития.

При проведении исследований на мышах впервые были получены трансгенные особи, экспрессирующие зелёный флуоресцирующий белок (EGFP) под контролем промотора (Кег5), полученного из регуляторной области гена белка промежуточных филаментов (типа II) кератина шерсти овец (К2.10).

Основные положения, выносимые на защиту

• Возможность использования репортёрного гена EGFP под контролем промотора гена hsp70 и промотора Кег5 для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных: Musca domestica L. и Mus musculus L.

• Локализация экспрессии гена EGFP в корковом веществе волос у мышей, трансгенных по Ker-EGFP.

Практическая значимость

В результате проведённых исследований показана принципиальная возможность использования гена зеленого флуоресцирующего белка медузы Aequorea victoria (EGFP) в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития.

Тканеспецифическая экспрессия гена улучшенного зелёного флуоресцирующего белка (ЕОБР), наблюдаемая у трансгенных мышей, обуславливает возможность использования промоторной области гена К2.10 (735 пар нуклеотидов) в экспериментах по направленной экспрессии рекомбинантных белков в корковом веществе волос у трансгенных млекопитающих.

Апробация работы

Материалы диссертации были изложены на 49-й научной конференции молодых учёных и аспирантов ВГНИИЖа «Достижения молодых учёных в области животноводства», проходящей 6 июля 2000 года в ВГНИИЖе, п. Дубровицы, Подольского района, Московской области; на отчётных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа 2001, 2002, 2003, 2004 года.

Структура и объём работы

Диссертация написана на 140 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение (5 страниц), обзор литературы (42 страницы), материалы и методы исследований (20 страниц), результаты исследований (30 страниц), обсуждение (9 страниц), выводы (1,2 страницы), практические предложения (0,3 страницы).

Диссертация включает 8 таблиц и 29 рисунков. Список использованной литературы состоит из 249 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Покровская, Мария Владимировна

ВЫВОДЫ

5. Достоверное различие между средними арифметическими величинами по яркости флуоресценции интенсивно светящихся волос белых трансгенных особей и волос белых контрольных мышей: 154*** усл. ед. ± 1,5 усл. ед. и **

60 усл. ед. ± 1,0 усл. ед. соответственно (Р > 0,999), свидетельствует о наличии зелёного флуоресцирующего белка медузы A. victoria в волосяном покрове трансгенных особей.

6. Обнаруженная тканеспецифическая экспрессия гена ЕОБР в дифференцирующихся клетках коркового вещества волос трансгенных мышей подтверждает функциональную активность промотора Кег5 длиной 735 пар нуклеотидов, полученного из регуляторной области гена белка промежуточных филаментов II типа кератина шерсти овец (К2.10).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуем в биотехнологических лабораториях использовать последовательность промотора Кег5, полученного из регуляторной области гена белка 1Б II кератина шерсти Ьвец (К2.10), для создания генно-инженерных конструкций и получения трансгенных млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантные белки в корковом веществе волос.

Для молекулярно-генетических лабораторий рекомендуем с целью оптимизации условий выделения ДНК из насекомых при перхлоратном методе экстракции использовать раствор полиэтиленгликоля (24 % ПЭГ-6000, 3 М ИаС1) в качестве осаждающего агента.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Фролкина М. В., Клецко Н. Г., Барминцев В. А., Какпаков В. Т., Эрнст JL К. Анализ ДНК комнатных мух Musca domestica L. мутантной линии curly на содержание экзогенных последовательностей // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркирование признаков сельскохозяйственных животных»; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2001. - С. 121-122.

2. Фролкина М. В., Шихов И. Я., Зиновьева Н. А., Косоруков В. С., Эрнст JL К. Использование гена зелёного флуоресцирующего белка (GFP) в качестве маркера для получения трансгенных комнатных мух Musca domestica L. // Материалы конф. «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - Быково. Моск. обл., 2001. - Вып. 7. - С. 204-205.

3. Эрнст JI. К., Злочевский Ф. И., Фомичёв Ю. П., Ерастов Г. М., Зиновьева Н. А., Багиров В. А., Какпаков В. Т., Фролкина М. В. Энтомологическая переработка органических отходов свиноводства и птицеводства и использование её продуктов в сельском хозяйстве; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2004. — 136 с.

4. Покровская М. В., Кадулин С. Г., Лунин В. Г., Шихов И. Я., Зиновьева Н. А., Эрнст JI. К. Анализ наследования и экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка EGFP Aequorea victoria у трансгенных мышей // Материалы 4-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных»; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2004. - С. 82-89.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Покровская, Мария Владимировна, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Ален, Н. Получение трансгенных мышей / Н. Ален, Ш. Бартон, А. Сурани, В. Рейк // Биология развития млекопитающих. Методы; под ред. М. Манк. М. : Мир, 1990. - С. 278-298.

2. Асланян, М. М. Итоги науки и техники. Серия: Энтомология / М. М. Асланян; ВИНИТИ. М., 1990. - Т. 10. - 182 с.

3. Бедин, Д. П. Влияние состава рациона на плодовитость комнатной мухи / Д. П. Бедин, Ю. П. Александров, Н. М. Заводская // Переработка свиного навоза личинками сапрофагов / Труды Новосиб. с.-х. ин-та. -Новосибирск, 1976. Т. 98. - С. 12-14.

4. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии / Дж. Бейли, Д. Оллис; пер. с англ. в 2-х частях М.: Мир, 1989. - Ч. 1. - 692 с.

5. Брем, Готтфрид. Экспериментальная генетика в животноводстве: основы методов в биотехнологии / Готтфрид Брем, Хорст Кройслих, Геральд Штранцингер; пер с нем.; под ред. Н. А. Зиновьевой. М. : Изд-во РАСХН, 1996.-326 с.

6. Войников, В. К. Физиологический стресс и регуляция активности генома клеток эукариотов / В. К. Войников, Г. Г. Иванова // Успехи современной биологии. 1988. - Т. 105, вып. 1. - С. 3-16.

7. Волкова, Н. А. Иммуногистохимическое определение рекомбинантных белков в тканях трансгенных животных / Н. А. Волкова // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных:

8. Школа-практикум; под ред. Зиновьевой H.A. / Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. Дубровицы, 2003. - Вып. 2. - С. 7-11.

9. Вракин, В. Ф. Морфология сельскохозяйственных животных; анатомия с основами цитологии, эмбриологии и гистологии / В. Ф. Вракин, М. В. Сидорова. М. : Arpoпромиздат, 1991. - 528 с.

10. Газарян, К. Г. Индукция нестабильных мутаций у Drosophila melanogaster микроинъекцией онкогенных вирусов и их ДНК в ранние эмбрионы / К. Г. Газарян, С. Д. Набирочкин, А. К. Шахбазян, Е. Н. Шибанова // Генетика. 1984. - Т. 20, № 8. - С. 1237-1243.

11. Газарян, К. Г. Элементы генома, регулирующие транскрипцию структурных генов у эукариот / К. Г. Газарян, В. 3. Тарантул // Онтогенез. -1985. Т. 16, № 4. - С. 325-345.

12. Гершензон, С. М. Вызывание направленных мутаций у Drosophila melanogaster / С. M. Гершензон // Доклады АН СССР. 1939. - Т. 25. -С. 224-227.

13. Гершензон, С. М. Мутагенное действие ДНК и вирусов у дрозофилы / С. М. Гершензон, Ю. Н. Александров, С. С. Малюта. Киев : Наук, думка, 1975. - 107с.

14. Глаголев, П. А. Анатомия сельскохозяйственных животных с основами гистологии и эмбриологии / П. А. Глаголев, В. М. Ипполитова. -М. : Колос, 1977. 480 с.

15. Глебов, О. К. Генетическая трансформация соматических клеток / О. К. Глебов. Л.: Наука, 1989. - 351 с.

16. Гловер, Д. М. Клонирование ДНК / Д. М. Гловер; пер. с англ. -М.: Мир. 1988. 540с.

17. Гольдман, И. Л. Получение трансгенных овец-продуцентов молока, содержащего физиологически активные белки в условиях племенной фермы / И. Л. Гольдман, Л. К. Эрнст, Г. Брем и др. // Сельскохозяйственная биология. 1994.-№ 6.-С. 46-53.

18. Дебабов, В. Г. Природные волокна для будущего / В. Г. Дебабов, В. Г. Богуш // Природа. 1999. - № 2. - С. 5-16.

19. Дербенёва-Ухова, В. П. Мухи и их эпидемиологическое значение /

20. B. П. Дербенёва-Ухова. М.: Медгиз, 1952. - 271с.

21. Диомидова, Н. А. Развитие кожи и шерсти у овец / Н. А. Диомидова; атлас рисунков. М.: Изд-во АНСССР, 1961.-151 с.

22. Ениколопов, Г. Н. Молекулярная организация мультигенного семейства эстераз ОгозорЫ1а ушИб. Тканеспецифическая экспрессия гена еБ18 в ходе развития В. ушИб / Г. Н. Ениколопов, Р. Г. Хечумян, Б. А. Кузин и др. //Генетика. 1989. -Т. 25, № 3. - С. 406-416.

23. Зиновьева, Н. А. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н. А. Зиновьева, А. Н. Попов, Л. К. Эрнст и др., Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. Дубровицы, 1988. - 47 с.

24. Иванов, И. Ф. Цитология, гистология и эмбриология / И. Ф. Иванов, П. А. Ковальский. -М.: Колос, 1976. 448 с.

25. Корочкин, JI. И. Клонирование, экспрессия, регуляция тканеспецифических генов у дрозофилы / JI. И. Корочкин // Генетика. 1995. -Т. 31, №8.-С. 1029-1042.

26. Кулаева, О. Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу / О. Н. Кулаева // Соросовский образовательный журнал. 1997. -№2.-С. 5-13.

27. Лабас, Ю. А. Флуоресцирующие и цветные белки / Ю. А. Лабас, А. В. Гордеева, А. Ф. Фрадков // Природа. 2003. - № 3. - С. 34-43.

28. Лукин, Е. И. Зоология / Е. И. Лукин. М. : Агропромиздат, 1989. -384 с.

29. Мерфи, Д. Получение трансгенных мышей путём микроинъекции клонированной ДНК в оплодотворённые яйцеклетки / Д. Мерфи, Д. Хэнсон // Новое в клонировании ДНК. Методы; под ред. Д. Гловера. М. : Мир, 1989. -С. 308-352.

30. Набирочкин, С. Д. Микроинъекции ДНК онкогенных вирусов в полярную плазму ранних эмбрионов Drosophila melanogaster: Эмбриологические и генетические эффекты: Автореф. дисс. канд. биол. наук. / Набирочкин Сергей Дмитриевич. М., 1984. - 15 с.

31. Наградова, Н. К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков / Н. К. Наградова // Соросовский образовательный журнал. 1996. - № 7. - С. 10-18.

32. Пирс, Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс. -М. : Изд-во иностр. литературы, 1962. 962 с.

33. Полак, Д. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы / Д. Полак, С. Ван Норден; пер. с англ. М.: Мир, 1987. - 74 с.

34. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс; пер с нем.; под ред. И. И. Соколова. М.: Изд-во иностранной литературы, 1953. - 718 с.

35. Росс, Г. Энтомология / Г. Росс, Ч. Росс, Д. Росс; пер. с англ. В. В. Белова; под ред. Г.А. Мазохина-Поршнякова. М.: Мир, 1985. - 576 с.

36. Саики, Р. Полимеразная цепная реакция / Р. Саики, У. Гиленстен, Г. Эрлих // Анализ генома. Методы: пер. с англ.; под ред. К. Дейвиса. -М.: Мир, 1990. -С. 176-190.

37. Скворцов, Г. Е. Микроскопы / Г. Е. Скворцов, В. А. Панова, Н. И. Поляков, JI. А. Федин. JI. : Машиностроение, 1969. - 512 с.

38. Сухова, М. Н. Синантропные мухи/ М. Н. Сухова. М. : Изд-во Академии наук СССР, 1951. - Вып. 3. - 213 с.

39. Успенский, И. И. Сравнительный анализ карбоксилэстеразы в различных органах репродуктивной системы самцов Drosophila подгруппы melanogaster / И. И. Успенский, М. 3. Людвиг, J1. И. Корочкин // Журн. общ. биологии. 1988. - Т. 49, № 4. - С. 601-610.

40. Хериет, Э. Р. Иммуноцитохимия: световая микроскопия / Э. Р. Хериет, К. С. Гаттлер // Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ.; под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. М. : Мир, 1999. -С. 20-90.

41. Хесин, Р. Б. Непостоянство генома / Р. Б. Хесин. М. : Наука, 1984. -472 с.

42. Эрнст, JI. К. Получение трансгенных комнатных мух Musca domestica / JI. К. Эрнст, В. С. Косоруков, Т. А. Антипова и др. // Доклады РАН. 1999. - Т. 367, № 3. - С. 430-432.

43. Эрнст, JI. К. Современное состояние и перспективы биотехнологии в животноводстве / JI. К. Эрнст // Достижения науки и техники АПК. — 2003. -№ 10. С. 2-6.

44. Amsterdam, A. The Aequorea victoria green fluorescent protein can be used as a reporter in live zebrafish embryos / A. Amsterdam, S. Lin, N. Hopkins // Dev. Biol. 1995.-Vol. 171.-P. 123-129.

45. Atkinson, P. W. In vivo expression of two highly conserved Drosophila genes in the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina / P. W. Atkinson, D.A. O'Brochta // Insect Biochem. Molec. Biol. 1992. - Vol. 22. - P. 423-431.

46. Atkinson, P. W. The hobo transposable element of Drosophila can be cross-mobilized in houseflies and excises like the Ac element of maize /

47. P. W. Atkinson, W. D. Warren, D. A. O'Brochta // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1993. Vol. 90. - P. 9693-9697.

48. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology / F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston et al. New York : John Wiley & Sons, 1987.

49. Bashkirov, V. Analysis of the family of tissue specific esterase genes in the experiments on transgenic Drosophila / V. Bashkirov, V. Panin, P. Sergeev et al. // Онтогенез. 1994. - Т. 25, № 4. - С. 53-54.

50. Bawden, С. S. Expression of a wool intermediate filament keratin transgene in sheep alters fibre structure / C. S. Bawden, В. C. Powell, S. K. Walker, G. E. Rogers // Transgenic Research. 1998. - Vol. 7. - P. 1-15.

51. Bellen, H. J. P-mediated enhancer detection: a versatile method to study development in Drosophila / H. J. Bellen, С. J. O'Kane, C. Wilson et al. // Genes and development. 1989. - Vol. 3, N 9. - P. 1288-1300.

52. Berghammer, A. J. A universal marker for transgenic insects / A. J. Berghammer, M. Klinger, E. A. Wimmer // Nature. 1999. - Vol. 402. -P. 370-371.

53. Black, D. M. KP elements repress P induced dysgenesis in Drosophila melanogaster / D. M. Black, M. S. Jackson, M. G. Kidwell et al. // EMBO J. -1987.-Vol. 6.-P. 4125-4135.

54. Blackman, R. K. Identification of a fully functional hobo transposable element and its use for germ-line transformation of Drosophila / R. K. Blackman, M. Macy, D. Koehler et al. // EMBO J. 1989. - Vol. 8. - P. 211-217.

55. Blackman, R. K. The transposable element hobo of Drosophila melanogaster / R. K. Blackman, W. M. Gelbart // Mobile DNA; ed. D. E. Berg, M. M. How / American Society for Microbiology. 1989. - P 523-529.

56. Borenfreund, E. Studies of DNA-induced hereditable alteration of mammalian cells / E. Borenfreund, Y. Honda, M. Steinglass, A. Bendich // J. Expl. Med. 1970. - Vol. 132. - P. 1071-1089.

57. Brejc, K. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein / K. Brejc, T. K. Sixma, P. A. Kitts et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 2306-2311.

58. Brinster, R. L. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjection eggs / R. L. Brinster, H. Y. Chen, M. E. Trumbauer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol. 82. -P. 4438-4442.

59. Calvi, B. R. Evidence for a common evolutionary origin of inverted repeat transposons in Drosophila and plants: hobo, Activator, and Tam3 / B. R. Calvi, T. J. Hong, S. D. Findley, W. M. Gelbart // Cell. 1991. - Vol. 66. -P. 465-471.

60. Caspari, E. A method to demonstrate transformation in Ephestia / E. Caspari, S.Nawa//Z. Naturforsch. 1965. - Vol. 206. - P. 281-284.

61. Casper, S. Expression of the green fluorescent protein-encoding gene from a tobacco mosaic virus-based vector / S. Casper, C. Holt // Gene. 1996. -Vol. 173.-P. 69-73.

62. Catteruccia, F. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi /F. Catteruccia, T. Nolan, G. Thanalis et al. //Nature. 2000. -Vol. 405.-P. 959-961.

63. Chalfie, M. Green fluorescent protein as a marker for gene expression / M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen et al. // Science. 1994. - Vol. 263. - P. 802-805.

64. Chattoraj, M. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: Multiple states and proton transfer / M. Chattoraj, B. King, G. Bulbitz, S. Boxer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 8362-8367.

65. Coates, C. J. Mariner transposition and transformation of yellow fever mosquito, Aedes aegypti / C. J. Coates, N. Jasinskiene, L. Miyashiro, A. A. James // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 3742-3751.

66. Cody, C. W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein / C. W. Cody, D. C. Prasher, W. M. Westler et al. // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - P. 1212-1218.

67. Constantini, F. Introduction of a rabbit P-globin gene into the mouse germ line / F. Constantini, E. Lacy // Nature. 1981. - Vol. 294. - P. 92-94.

68. Cormack, B. P. FASC optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) / B. P. Cormack, R. H. Valdivia, S. Falkow // Gene. - 1996. -Vol. 173.-P. 33-38.

69. Crampton, J. M. Transgenic insects / J. M. Crampton, P. Eggleston // Animals with novel genes; ed. N. Maclean. Cambridge University Press, 1994. -P. 21-62.

70. Cubitt, A. B. Understanding, improving and using green fluorescent proteins / A. B. Cubitt, R. Heim, S. R. Adams et al. // Trends Biochem. Sci. 1995. - Vol. 20. - P. 448-555.

71. Curtis, D. Nanos is evolutionarily conserved organizer of anterior-posterior polarity / D. Curtis, J. Apfeld, R. Lehmann // Development. 1995. -Vol. 121,N6.-P. 1899-1910.

72. Daniels, S. B. Evidence for horizontal transmission of the P transposable element between Drosophila species / S. B. Daniels, K. R. Peterson, L. D. Strausbaugh, M. G. Kidwell // Genetics. 1990. - Vol. 124. - P. 339-355.

73. Davis, I. A nuclear GFP that marks nuclei in living Drosophila embryos; maternal supply overcomes a delay in the appearance of zygotic fluorescence / I. Davis, C. H. Girdham, P. H. O'Farrel // Dev. Biol. 1995. - Vol. 170. -P. 726- 729.

74. Delagrave, S. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein / S. Delagrave, R. Hawtin, C. Silva, et al. // Bio/Technology. 1995. -Vol.13.-P. 151-154.

75. Di Domenico, B. J. The heat shock response is self-regulated at both the transcriptional and posttranscriptional levels / B. J. Di Domenico, G. E. Bugaisky, S. Lindquist// Cell. 1982. - Vol. 31, N 3. - P. 593-603.

76. Dopf, J. Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein / J. Dopf, T. Horiagan // Gene. 1996. - Vol. 173. - P. 39-44.

77. Dunn, S. M. Regulation of a hair follicle keratin intermediate filament gene promoter / S. M. Dunn, R. A. Keough, G. E. Rogers, В. C. Powell // J. Cell Sci. 1998. - Vol. 111. - P. 3487-3496.

78. Edwards, K. A. GFP-moesin illuminates actine cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis / K. A. Edwards, M. Demsky, R. A. Montague, et al. // Dev. Biol. 1997. -Vol. 191.-P. 103-117.

79. Ehrig, T. Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra / T. Ehrig, D. O'Kane, F. Prendergast // FEBS Lett. 1995. -Vol. 367.-P. 163-166.

80. Endow, S. A. Centrosome and spindle function of the Drosophila Ned microtubule motor visualized in live embryos using Ncd-GFP fusion proteins / S. A. Endow, D. J. Komma // J. Cell Sci. 1996. - Vol. 109. - P. 2429-2442.

81. Engels, W. R. P elements in Drosophila / W. R. Engels // Mobile DNA; ed. D. Berg, M. Howe. Washington. DC : American Society for Microbiology, 1989.-P. 437-484.

82. Engels, W. R. The P family of transposable elements in Drosophila / W. R. Engels//Annu. Rev. Genet. 1983. - Vol. 17. - P. 315-344.

83. Evgen'ev, M. B. Penelope, a new family of transposable elements and its possible role in hybrid dysgenesis in Drosophila virilis / M. B. Evgen'ev, H. Zelentsova, N. Shostak et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. -P. 196-201.

84. Fedoroff, N. V. Isolation of the transposable elements Ac and Ds / N. V. Fedoroff, S.Wessler, M. Shure // Cell. 1983. - Vol. 35. - P. 243-251.

85. Feldmar, S. The ORFa protein, the putative transposase of maize transposable element Ac, has a basic DNA binding domain / S. Feldmar, R. Kunze // EMBO J. 1991. - Vol. 10. - P. 4003-4010.

86. Finnegan, D. J. Eukaryotic transposable elements and genome evolution / D. J. Finnegan // Trends Genet. 1989. - Vol. 5. - P. 103-107.

87. Fox, A. S. DNA induced transformation in Drosophila: Locus specificity and the establishment of transformed stocks / A. S. Fox, S. B. Yoon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1970. - Vol. 67. - P. 1608-1615.

88. Fox, A. S. Specific genetic effects of DNA in Drosophila melanogaster / A. S. Fox, S. B. Yoon // Genetics. 1966. - Vol. 53. - P. 897-911.

89. Franke, W. W. Different intermediate-sized filaments distinguished by immunofluorescence microscopy / W. W. Franke, M. Osborn, K. Weber // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75. - P. 5034-5038.

90. Franz, G. Minos, a new transposable element from Drosophila hydei, is a member of the Tc-l-like family of transposons / G. Franz, C. Savakis // Nucl. Acids Res. -1991. Vol. 19. - P. 6646.

91. Franz, G. Mobile Minos elements from Drosophila hydei encode a two-exon transposase with similarity to the paired DNA-binding domain / G. Franz, T. G. Loukeris, G. Dialektaki et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 4746-4750.

92. Fridell, Y. W.-C. Vermilion as a small selectable marker gene for Drosophila transformation / Y. W.-C. Fridell, L. L. Searles // Nucl. Acids Res. -1991.-Vol. 19.-P. 5082.

93. Garza, D. Introduction of the transposable element mariner into the germline of Drosophila melanogaster / D. Garza, M. Medhora, A. Koga, D.L. Hartl //Genetics. 1991. -Vol. 128. - P. 303-310.

94. Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA / S. Germeraad // Nature. 1976. - Vol. 262. - P. 229-231.

95. Gloor, G. B. Type I repressors of P element mobility / G. B. Gloor, C. R. Preston, M. D. Johnson-Schlitz et al. // Genetics. 1993. - Vol. 135. -P. 145-150.

96. Goldberg, D. Correct developmental expression of a cloned alcohol dehydrogenase gene transduced into the Drosophila germ line / G. B. Gloor, C. R. Preston, M. D. Johnson-Schlitz et al. // Cell. 1983. - Vol. 34. - P. 59-73.

97. Gordon, J. W. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA / J. W. Gordon, G. A. Scangos, D. C. Plotkin et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol. 77. - P. 7380-7384.

98. Hagemann, S. Identification of a complete P-element in the genome of Drosophila bifasciata / S. Hagemann, W. J. Miller, W. Pinsker//Nucl. Acids Res. -1992.-Vol. 20.-P. 409-413.

99. Hammer, R. E. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection / R. E. Hammer, V. G. Pursel, C. E. Rexroad et al. // Nature. 1985. -Vol.315.-P. 680-683.

100. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation / A. M. Handler // Insect Biochem. Mol. Biol. 2001. - Vol. 31. - P 111-128.

101. Handler, A. M. A functional analysis of the P-element gene-transfer vector in insects / A. M. Handler, S. P. Gomez, D. A. O'Brochta // Arch. Insect Biochem. 1993. - Vol. 22. - P. 373-384.

102. Handler, A. M. A new hobo, Activator, Tam3 transposable element, hopper, from Bactrocera dorsalis is distantly related to hobo and Ac / A.M. Handler, S. P. Gomez//Gene. 1997. - Vol. 185.-P. 133-135.

103. Handler, A. M. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector / A. M. Handler, R. A. Harrell // Insect Mol. Biol. 1999. - Vol. 8. - P. 449-458.

104. Handler, A. M. Prospects for gene transformation insects / A. M. Handler, D. A. O'Brochta // Annu. Rev. Entomol. 1991. - Vol. 36. -P. 159-183.

105. Handler, A. M. The lepidopteran transposon vector, mediates germ line transformation in the Mediterranean fruit fly / A. M. Handler, S. D. McCombs, M. J. Fraser, S. H. Saul // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. -P. 7520-7525.

106. Handler, A. M. The piggyBac transposon mediates germ-line transformation in the Oriental fruit fly and closely related elements exist in its genome / A. M. Handler, S. D. McCombs // Insect Mol. Biol. 2000. - Vol. 9. -P. 605-612.

107. Handler, A. M. Transformation of the Caribbean fruit fly with a piggyBac transposon vector marked with polyubiquitin-regulated GFP / A. M. Handler, R. A. Harrell // Insect Biochem. 2001. - Vol. 31. - P. 201-207.

108. Hardy, M. H. The development of mouse hair in vitro with some observations on pigmentation / M. H. Hardy // J. Anat. 1949. - Vol. 83. -P. 364-384.

109. Hazelrigg, T. GFP expression in drosophila tissues: time requirements for formation of a fluorescent product / T. Hazelrigg, N. Liu, Y. Hong, S. Wang // Dev. Biol. 1998. - Vol. 199. - P. 245-249.

110. Hazelrigg, T. Transformation of white locus DNA in Drosophila, dosage compensation, zeste interaction, and position effects / T. Hazelrigg, R. L. Levis, G. M. Rubin // Cell. 1983. - Vol. 36. - P. 460-481.

111. Hediger, M. Germline transformation of the housefly Musca domestica with the lepidopteran derived transposon piggyback / M. Hediger, N. Niessen, E. A. Wimmer et al.//Insect Mol. Biol. 2001. - Vol. 10.-P. 113-119.

112. Heim, R. Improved green fluorescence / R. Heim, A. B. Cubbit, R.Y. Tsien // Nature. 1995. - Vol. 373. - P. 663-664.

113. Heim, R. Wavelength mutations and post-translational autoxidation of green fluorescent protein / R. Heim, D. C. Prasher, R. Y. Tsien // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 12501-12504.

114. Herdman, M. Mutations arising during transformation in the blue-green alga Anacystis nidulans / M. Herdman // Molec. Gen. Genetics. 1973. - Vol. 120. - P. 369-378.

115. Hilfiker-Kleiner, D. Genetic control of sex determination in the germ line and soma of the house fly, Musca domestica / D. Hilfiker-Kleiner, A. Duebendorfer, A. Hilfiker, R. Noethiger // Development. 1994. - Vol. 120. -P. 2531-2538.

116. Hiraizumi, Y. Spontaneous recombination in Drosophila melanogaster males / Y. Hiraizumi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. - Vol. 68. - P. 268-270.

117. Horn, C. A versatile vector for animal transgenesis / C. Horn, E. A. Wimmer // Dev. Genes Evol. 2000. - Vol. 210. - P. 630-637.

118. Horn, C. Highly sensitive,, fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis / C. Horn, B. Jaunich, E. A. Wimmer // Dev. Genes Evol. -2000. Vol. 210. - P. 623-629.

119. Hoyer, R. F. Some new mutants of the house fly Musca domestica, with notations of related phenomena / R. F. Hoyer // J. Econ. Entomol. 1966. -Vol. 59.-P. 133-137.

120. Ikawa, M. Green fluorescent protein (GFP) as a vital marker in mammals / M. Ikawa, S. Yamada, T. Nakanishi, M. Okabe // Curr. Top. Dev. Biol. 1999. -Vol. 44. - P. 1-20.

121. Jackson, M. S. Amplification of KP elements associated with the repression of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster / M. S. Jackson, D. M. Black, G. A. Dover// Genetics. 1988. - Vol. 120. - P. 1003-1013.

122. Jaenisch, R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virus / R. Jaenisch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1976. Vol. 73. - P. 1260-1264.

123. Jaenisch, R. Transgenic animals / R. Jaenisch // Science. 1988. -Vol. 240.-P. 1468-1473.

124. Kahana, J. Kinetics of spindle pole body separation in budding yeast / J. Kahana, B. Schapp, P. Silver // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. -P. 9707-9711.

125. Karess, R. E. Analysis of P transposable element functions in Drosophila / R. E. Karess, G. M. Rubin // Cell. 1984. - Vol. 38. - P. 135-146.

126. Kaytes, P. Hair-specific keratins: characterization and expression of a mouse type I keratin gene / P. Kaytes, A. R. McNab, T. J. Rea et al. // J. Invest. Dermatol. 1991. - Vol. 97. - P. 835-842.

127. Keough, R. A. Targeted expression of SV-40 T antigen in the hair follicleof transgenic mice produces an aberrant phenotype / R. A. Keough, B. C. Powell, G. E. Rogers // J. Cell Sci. 1995. - Vol. 108. - P. 957-966.

128. Kerrebrock, A. W. Mei-S332, a Drosophila protein required for sister-chromatid cohesion, can localize to meiotic centromere regions / A. W. Kerrebrock, D. P. Moore, J. S. Wu, T. L. Orr-Weaver // Gene. 1995. -Vol. 83.-P. 247-256.

129. Kidwell, M. G. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. A syndrome of aberrant traits including mutation, sterility and male recombination / M .G. Kidwell, F. Kidwell, J. A. Sved // Genetics. 1977. - Vol. 86, N 4. -P. 813-833.

130. Kidwell, M. G. The white gene as a marker in a new P element vector for gene transfer in Drosophila / M. G. Kidwell, F. Kidwell, J. A. Sved // Nucl. Acids Res. 1987. - Vol. 15. - P. 3947-3959.

131. Korochkin, L. Genetics of esterases in Drosophila. III. Influence of different chromosomes on esterase pattern in Drosophila / L. Korochkin, A. Aronshtam, N. Matveeva // Biochem. Genetics. 1974. - Vol. 12, № 1. -P. 9-24.

132. Korochkin, L. Genetics of esterases in Drosophila. IV. Slow-migrating S-esterase in Drosophila of the virilis group / L. Korochkin, E. Belyaeva, N. Matveeva et al. // Biochem. Genetics. 1976. - Vol. 14, № 2. - P. 128.

133. Lee, S. H. A P-element-homologous sequence in the house-fly, Musca domestica / S. H. Lee, J. B. Clark, M. G. Kidwell // Insect Mol. Biol. 1999. -Vol. 8.-P. 491-500.

134. Li, L. Nestin expression in hair follicle sheath progenitor cells / L. Li, J. Mignone, M.Yang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, № 17. -P. 9958-9961.

135. Lim, C. Thermosensitivity of a green fluorescent protein utilized to reveal novel nuclear-like compartments / C. Lim, K. Kimata, M. Oka et al. // J. Biochem. (Tokyo). 1995. - Vol. 118. - P. 13-17.

136. Lindholm, D.-A. The transposable element mariner mediates germline transformation in Drosophila melanogaster / D.-A. Lindholm, A. R. Lohe, D. L. Hartl // Genetics. 1993. - Vol. 134. - P. 859-868.

137. Lis, J. T. New heat shock puffs and P-galactosidase activity resulting from transformation of Drosophila with an hsp70-lacZ hybrid gene / J. T. Lis, J. A. Simon, C. A. Sutton // Cell. 1983. - Vol. 35. - P. 403-410.

138. Liu, C. P. Effects on eye color mediated by DNA injection into Drosophila embryos / C. P. Liu, R. A. Kreber, J. I. Valencia // Mol. Gen. Genet. -1979.-Vol. 172.-P. 203-210.

139. Lohe, A. R. Germline transformation of Drosophila virilis with the transposable element mariner / A. R. Lohe, D. L. Hartl // Genetics. 1996. -Vol. 143.-P. 365-374.

140. Loukeris, T. G. Gene transfer into the Medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element / T. G. Loukeris, I. Livadras, B. Area et al. // Science. 1995a. - Vol. 270. - P. 2002-2005.

141. Loukeris, T. G. Introduction of the transposable element Minos into the germ line of Drosophila melanogaster / T. G. Loukeris, B. Area, I. Livadras, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995b. - Vol. 92. - P. 9485-9489.

142. Lozovskaya, E. R. Germline transformation of Drosophila virilis mediated by the transposable element hobo / E. R. Lozovskaya, D. I. Nurminsky, D. L. Hartl, D. T. Sullivan // Genetics. 1996. - Vol. 142. - P. 173-177.

143. Matz, M. V. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species / M. V. Matz, A. F. Fradcov, Y. A. Labas et al. // Nat. Biotechnol. 1999. -Vol. 17.-P. 969-973.

144. Medhora, M. M. Excision of the Drosophila transposable element mariner: identification and characterization of the Mos factor / M. M. Medhora, A. H. MacPeek, D. L. Hartl // EMBO J. 1988. - Vol. 7. - P. 2185-2189.

145. Mergeay, M. Mutagenic effects of Streptomyces coelicolor DNA detected after streptomycin treatment of competent cultures of Bacillus subtilis / M. Mergeay // Molec. Gen. Genet. 1972. - Vol. 119. - P. 89-92.

146. Meyer, R. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food / R. Meyer, G. Hoffein, J. Luthy, U. Candrian // J. AO AC Intern. 1995. - Vol. 78, N6.-P. 1542- 1551.

147. Moll, R. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells / R. Moll, W. W. Franke, D. L. Schiller etal.//Cell.- 1982.-Vol. 31.-P. 11-24.

148. Morganelli, C. M. Transcription of Drosophila small hsp-tk hybrid genes is induced by heat shock and by ecdysterone in transfected Drosophila cells /

149. C. M. Morganelli, E. M. Berger, H. R. Pelham // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. Vol. 82, № 17. - P. 5865-5869.

150. Morin, J. Energy transfer in a bioluminescent system / J. Morin, J. Hastings //J. Cell Physiol. 1971. - Vol. 77. - P. 313-318.

151. Morise, J. G. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea / J. G. Morise, O. Shimomura, F. H. Johnson, J. Winant // Biochemistry. 1974. - Vol. 13. - P. 2656-2662.

152. Nawa, S. Hereditary change in Ephestia after treatment with DNA / S. Nawa, S. Yamada // Genetics. 1968. - Vol. 58. - P. 573-584.

153. Nover, L. Heat shock response of eukaryotic cells / L. Nover,

154. D. Hellmund, D. Neumann et al. // Biol. Zentr.-Bl. 1984. - Bd. 103, H. 4. -S. 357-435.

155. Nover, L. Heat stress proteins and transcription factors / L. Nover, K.-D. Scharf// CMLS. Cell. mol. life sci. 1997. - Vol. 53. - P. 80-103.

156. O'Brochta, D. A. Hermes a functional non-drosophilid insect gene vector from Musca domestica / D. A. O'Brochta, W. D. Warren, K. J. Saville, P. W. Atkinson // Genetics. 1996. - Vol. 142. - P. 907-914.

157. O'Brochta, D. A. Mobility of P elements in drosophilids and nondrosophilids / D. A. O'Brochta, A. M. Handler // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1988. Vol. 85. - P. 6052-6056.

158. O'Brochta, D. A. P element excision in Drosophila melanogaster and related drosophilids / D. A. O'Brochta, S. P. Gomez, A. M. Handler // Mol. Gen. Genet. 1991. - Vol. 225. - P. 387-394.

159. O'Brochta, D. A. Transformation of Stomoxys calcitrans with a Hermes vector / D. A. O'Brochta, P. W. Atkinson, M. J. Lehane // Insect Mol. Biol. -2000.-Vol. 9.-P. 531-538.

160. O'Brochta, D. A. Transposable elements and gene transformation in non-drosophilid insects / D. A. O'Brochta, P. W. Atkinson // Insect Biochem. Mol. Biol. 1996. - Vol. 26. - P. 739-753.

161. O'Hare, K. DNA sequence of the white locus of Drosophila melanogaster / K. O'Hare, C. Murphy, R. Levis, G. M. Rubin // J. Mol. Biol. 1984. - Vol. 180. - P. 437-455.

162. O'Hare, K. Structure of P-transposable elements and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome / K. O'Hare,

163. G. M. Rubin // Cell. 1983. - Vol. 34. - P. 25-35.

164. Ormo, M. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescentprotein / M. Ormo, A. Cubitt, K. Kalio et al. // Science. 1996. - Vol. 273. i1. P. 1392-1395.

165. Palmiter, R. D. Germ-line transformation of mice / R. D. Palmiter, R. L. Brinster// Annu. Rev. Genet. 1986. - Vol. 20. - P. 465-489.

166. Pelham, H. R. B. A synthetic heat-shock promoter element confers heat-inducibility on the herpes simplex virus thymidine kinase gene / H. R. B. Pelham, M. Bienz //EMBO J. 1982. - Vol. 1,№ ll.-P. 1473-1477.

167. Pelham, H. R. B. Activation of heat-shock genes in eukaryotes /

168. H. R. B. Pelham // Trends Genet. 1985. - Vol. 1. - P. 31-35.

169. Peloquin, J. J. Germline transformation of pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae) mediated by the piggyBac transposable element / J. J. Peloquin,

170. S. T. Thibault, R. Staten, T. A. Miller // Insect Mol. Biol. 2000. - Vol. 9. -P. 323-333.

171. Perkins, H. D., Howells A.J. Genomic sequences with homology to the P element of Drosophila melanogaster occur in the blowfly Lucilia cuprina / H. D. Perkins, A. J. Howells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. -P. 10753-10757.

172. Pinkerton, A. C. Green fluorescent protein as a marker in transgenic Aedes aegypti / A. C. Pinkerton, K. Michel, D. A. O'Brochta, P. W. Atkinson // Insect Mol. Biol. 2000. - Vol. 9. - P. 1-10.

173. Pirrota, V. Vectors for P-mediated transformation in Drosophila / V. Pirrota, // Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses; ed. R.L. Rodriguez, D.T. Denhardt. Stoneham, MA : Butterworths, 1988. -P. 437-456.

174. Plautz, J. D. Green fluorescent protein and its derivatives as versatile markers for gene expression in living Drosophila melanogaster, plant and animal cells / J. D. Plautz, R. N. Day, G. M. Dailey et al. // Gene. 1996. - Vol. 173. -P. 83-87.

175. Powell, B. C. Cyclic hair-loss and regrowth in transgenic mice overexpressing an intermediate filament gene / B. C. Powell, G. E. Rogers // EMBO J. 1990. - Vol. 9. - P. 1485-1493.

176. Powell, B. C. Regulation of keratin gene expression in hair follicle differentiation / B. C. Powell, A. Nesci, G. E. Rogers // Ann. NY Acad. Sci. -1991.-Vol. 642. -P. 1-20.

177. Powell, B. Hair follicle differentiation: expression, structure and evolutionary conservation of the hair type II keratin intermediate filament gene family / B. Powell, L. A. Crocker, G. E. Rogers // Development 1992. - Vol. 114.-P. 417-434.

178. Prasher, D. C. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein / D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward et al. // Gene. -1992.-Vol. 111.-P. 229-233.

179. Prasher, D. C. Using GFP to see the light / D. C. Prasher // Trends Genet. 1995.-Vol. 11.-P. 320-323.

180. Rexroad, C. E. Jr. Development of one-cell fertilized sheep ova following microinjection into pronuclei / C. E. Jr. Rexroad, R.J. Wall // Theriogenology. -1986.-Vol. 27.-P. 611-619.

181. Rexroad, C. E. Jr. Transferrin- and albumin-directed expression of growth-related peptides in transgenic sheep / C. E. Jr. Rexroad, K. Mayo, D. J. Bolt et al. // J. Anim. Sci. 1991. - Vol. 69. - P. 2995-3004.

182. Rio, D. C. Identification and purification of a Drosophila protein that binds to the terminal 31-base-pair inverted repeats of the P transposable element / D. C. Rio, G. M. Rubin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. -P. 8929-8933.

183. Ritossa, F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila / F. Ritossa // Experientia. 1962. - Vol. 18. - P. 571-573.

184. Rogers, G. E. Organization and expression of hair follicle genes / G. E. Rogers, B. C. Powell // J. Invest. Dermatol. 1993. - Vol. 101. - P. 50-55.

185. Rothman, J. E. Enzymatic recycling of clathrin from coated vesicles / J. E. Rothman, S. L. Schmid // Cell. 1986. - Vol. 46. - P. 5-9.

186. Rubin, G. M. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors / G. M. Rubin, A. C. Spradling // Science. 1982. - Vol. 218. -P. 348-353.

187. Rubin, G. M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations / G. M. Rubin, M. G. Kidwell, P. M. Bingham // Cell. 1982. - Vol. 29. - P. 987-994.

188. Rubin, G. M. Vectors of P element mediated gene transfer in Drosophila / G. M. Rubin, A. C. Spradling // Nucl. Acids Res. 1983. - Vol. 11. -P. 6341-6351.

189. Saiki, R. K. Enzymatic amplification of b-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / R. K. Saiki, S. J. Scharf, F. Faloona et al. // Science. 1985. - Vol. 230. - P. 1350-1354.

190. Saiki, R. K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-polymerase / R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel et al. // Science. 1988. - Vol. 239. - P. 487-491.

191. Santamaría, P. Injecting eggs / P. Santamaría // Drosophila: A practical approach; ed. D. B. Roberts. Oxford: IRL Press, 1986. - P. 159-173.

192. Sarkar, A. The Hermes element from Musca domestica can transpose in four families of cyclorrhaphan flies / A. Sarkar, C. C. Coates, S. Whyard et al. // Genetica. 1997. - Vol. 99. - P. 15-29.

193. Scavarda, N. J. Interspecific DNA transformation in Drosophila / N. J. Scavarda, D. L. Hard // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. - Vol. 81. -P. 7515-7519.

194. Schlesinger, M. J. Heat shock proteins: the search for functions / M. J. Schlesinger//J. Cell. Biol. 1986. - Vol. 103. - P. 321-325.

195. Schlesinger, M. J. The response of cells to heat shock / M. J. Schlesinger, G. Aliperti, P. M. Kelley // Trends Biochem. Sei. 1982. - Vol. 7. - P. 222-225.

196. Schlichter, D. Improvement of photosynthesis in zooxanthellate corals by autofluorescent chromatophores / D. Schlichter, U. Meier, H. W. Fricke // Oecologia. 1994. - Vol. 99. - P. 124-131.

197. Sergeev, P. Regulation of tissue-specific expression of the esterase S gene in Drosophila virilis / P. Sergeev, G. Yenikolopov, N. Peunova et al. // Nucl. Acids. Res. 1993. - Vol. 21, № 15. - P. 3545-3551.

198. Sheng, G. Direct regulation of rhodopsin 1 by Pax-6/eyeless in Drosophila: evidence for a conserved function in photoreceptors / G. Sheng, E. Thouvenot, D. Schmucker et al. // Genes Dev. 1997. - Vol. 11. - P. 1122-1131.

199. Shimomura, O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein / O. Shimomura // FEBS Lett. 1979. - Vol. 104. - P. 220-222.

200. Shimomura, O. The discovery of green fluorescent protein / O. Shimomura // The Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols; eds. M. Chalfie, S. Kain. New York : Wiley-Liss., 1998. - P. 3-15.

201. Simmons, M. J. Repression of P element-mediated hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster / M. J. Simmons, J. D.Baymond, K. E. Rassmusson et al. // Genetics. 1990. - Vol. 124. - P. 663-667.

202. Simonelig, M. A P element of Scaptomyza pallida is active in Drosophila melanogaster / M. Simonelig, D. Anxolabehere // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991.-Vol. 88.-P. 6102-6106.

203. Slotova, J. A contribution to the study of exogenous DNA action on the chromosomes of Vicia faba / J. Slotova, Z. Karpfel // Stud. Biophys. 1966. -Vol. l.-P. 241-248.

204. Smith, P. A. Drosophila transposable elements / P. A. Smith, V. G. Corces // Adv. Genet. 1991. - Vol. 21. - P. 229-300.

205. Sobels, J. C. Mutagenic effect of DNA in Aspergillus nidulans / J. C. Sobels // Aspergillus News Lett. 1965. - Vol. 6. - P. 11-12.

206. Sommer, H. The transposable element Tam3 of Antirrhinum majus generates a novel type of sequence alteration upon excision / H. Sommer,

207. R. Carpenter, B. Harrison, H. Saedler // Mol. Gen. Genet. 1985. - Vol. 199. -P. 225-231.

208. Spradling, A. C. P element-mediated transformation / A. C. Spradling // Drosophila: A practical approach; ed. D. B. Roberts. Oxford. Washington D. C. : IRL Press, 1986. - P. 175-197.

209. Spradling, A. C. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes / A. C. Spradling, G. M. Rubin // Science. 1982. -Vol.218.- P. 341-347.

210. Stearns, T. The green revolution / T. Stearns // Curr. Biol. 1995. -Vol. 5. - P. 262-264.

211. Steinert, P. M. Molecular and cellular biology of intermediate filaments / P. M. Steinert, D. R. Roop // Annu. Rev. Biochem. 1988. - Vol. 57. - P. 593-625.

212. Steller, H. P transposons controlled by the heat shock promoter / H. Steller, V. Pirrota// Mol. Cell. Biol. 1986. - Vol. 6. - P. 1640-1649.

213. Steller, H., Pirrotta V. A transposable P vector that confers selectable G418 resistance of Drosophila larvae / H. Steller, V. Pirrota // EMBO J. 1985. -Vol. 4.-P. 167-171.

214. Sundararajan, P. Transposable element interactions in insects: crossmobilization of hobo and Hermes / P. Sundararajan, P. W. Atkinson, D. A. O'Brochta // Insect Mol. Biol. 1999. - Vol. 8. - P. 359-368.

215. Takada, T. Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker / T. Takada, K. Iida, T. Awaji et al. // Nat. Biotechnol. 1997. - Vol. 15. - P. 458- 461.

216. Tamura, T. A piggyBac element-derived vector efficiently promotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L. / T. Tamura, T. Thibert, C. Royer et al. // Nature Biotech. 2000. - Vol. 18. - P. 81-84.

217. Tissieres, A. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs / A. Tissieres, H. T. Mitchell, U. M. Tracy // J. Mol. Biol. 1974. - Vol. 84. - P. 389-398.

218. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein / R. Y. Tsien // Annu. Rev. Biochem. 1998. - Vol. 67. - P. 509-544.

219. Vanossi, Este. New mutants isolated from laboratory strains of Musca domestica L. / Este Vanossi, G. Biscaldi, M. G. Franco // Insect. Toxicol. Inf. Serv. 1967.-Vol. 10. - P. 198-199.

220. Velazquez, J. M. Hsp 70: Nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery / J. M. Velazquez, S. Lindquist II Cell. 1984. - Vol. 36. - P. 655-662.

221. Walker, V. K. Gene transfer in insects / V. K. Walker II Advances in cell culture; ed. Maramorosch K. New York : Academic Press, 1990. - P. 87-124.

222. Walter, I. Rapid and sensitive detection of enhanced green fluorescent protein expression in paraffin sections by confocal laser scanning microscopy / I. Walter, M. Fleischmann, D. Klein et al. II Histochem. J. 2000. - Vol. 32. -P. 99-103.

223. Walters, M. C. Transcriptional enhancers act in cis to suppress position-effect variegation / M. C. Walters, W. Magis, S. Fiering et al. // Genes Dev. 1996. -Vol. 10.-P. 185-195.

224. Walton, J. R. Zygote viability in gene transfer experiments / J. R. Walton, J. D. Murray, J. T. Marshall, C. D. Nancarrow II Biol. Reprod. 1987. - Vol. 37. -P. 957-967.

225. Wang, S. Implications for bed mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis / S. Wang, T. Hazelrigg // Nature. 1994. - Vol. 369. - P. 400-403.

226. Wang, Y. Mutability, sterility and suppression in P.-M hybrid dysgenesis: the influence of P subline cross, chromosome, sex and P-element structure / Y. Wang, H. Baiter, M. Levitan, L. Margylies // Genet. Res. 1993. -Vol. 62.-P. 111-123.

227. Ward, W. Spectral perturbations of the Aequorea green-fluorescent protein / W. Ward, H. Prentice, A. Roth et al. // Photochem. Photobiol. 1982. -Vol. 35. - P. 803-808.

228. Ward, W. W. Energy transfer processes in bioluminescence / W. W. Ward // Photochem. Photobiol. Rev. 1979. - Vol. 4. - P. 1-57.

229. Ward, W. W. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein / W. W. Ward, S. H. Bokman // Biochemistry. 1982. - Vol. 21. - P. 4535-4550.

230. Ward, W. W. Spectrophotometric identity of the energy-transfer chromophores in Renilla and Aequorea green-fluorescent proteins / W. W. Ward, C. W. Cody, R. C. Hart, M. J. Cormier // Photochem. Photobiol. 1980. - Vol. 31. -P. 611-615.

231. White, L. D. An eye color gene for the detection of transgenic non-drosophilid insects / L. D. White, C. J. Coates, P. W. Atkinson, D. A. O'Brochta // Insect Biochem. Mol. Biol. 1996. - Vol. 26. - P. 641-644.

232. Yang, F. The molecular structure of green fluorescent protein / F. Yang, L. G. Moss, G.N. Philips Jr.//Nature Biotech. 1996. - Vol. 14. - P 1246-1251.

233. Yoshiyama, M., Honda H., Kimura K. Successful transformation of the house fly, Musca domestica (Diptera, Muscidae) / M. Yoshiyama, H. Honda, K. Kimura // Appl. Entomol. Zool. 2000b. - Vol. 35. - P. 321-325.

Информация о работе

Покровская, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
п. Дубровицы, Московской обл., 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Использование репортёрных генов (GFP и LacZ) для изучения эффективности генетической трансформации животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы