Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Романенкова, Майя Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом"

На правах рукописи

Романенкова Майя Леонидовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ И ЛИГАЗНОЙ

ЦЕПНЫХ РЕАКЦИЙ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2006

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии Наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Никоноров Юрий Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Маркушева Татьяна Вячеславовна

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится " 04 " июля 2006 г. в 14:00 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке УНЦ РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Проспект Октября, 71.

Автореферат разослан "31 " мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. С . Бикбулатова С. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эпидемические вспышки заболеваний, вызываемых хантавирусами, регистрируются в Российской Федерации примерно раз в три-четыре года, а один из самых крупных мировых очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) находится на территории Республики Башкортостан. Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), включающий в себя к настоящему времени более 25 серологически и генетически отличающихся друг от друга серотипов. Патогенны для человека хантавирусные серотипы Dobrava (DOB), Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU), из которых первые два вызывают тяжелую форму ГЛПС, остальные, соответственно, среднюю и легкую формы. Также патогенными являются серотипы Sin Nombre (SN), Black Crek Canal (BCC), ответственные за обнаруженное впервые в США в 1993 г. заболевание, получившее название "хантавирусный пульмонарный синдром" (Schmaljohn et al., 1995), Хантавирусы, выделенные в Башкортостане (Tkachenko et al., 1984), относятся к серотипу Puumala, инфицированность которым определяет сравнительно менее тяжелое течение заболевания. Однако в последние годы наблюдается тенденция к увеличению доли тяжелых форм ГЛПС, в некоторых случаях приводящих к летальному исходу. Так, в эпидемический сезон 19971998 гг., в Башкортостане было зарегистрировано 10 057 случаев заболевания ГЛПС, из них 34 случая (0,4%) смертельного исхода (Нургалеева и др., 1999).

Для диагностики ГЛПС в лабораторной практике используются методы, основанные на детекции специфических антител. В то же время достоверные результаты можно получить только при использовании техники амплификации нуклеиновых кислот. Уже ставший рутинным при проведении научных исследований метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала. Альтернативой традиционным методам может стать разработанная нами модификация метода ОТ-ПЦР, контролируемой в режиме

реального времени и использующей эффект резонансного переноса энергии флуоресценции для детекции продуктов амплификации.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования заключалась в создании прототипа эффективной тест-системы для быстрого и специфического выявления хантавирусной РНК в биологическом материале с использованием полимеразной и лигазной цепных реакций (ПЦР и ЛЦР) на основе эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции. Были поставлены следующие задачи:

1. Определить физико-химические свойства объекта исследования, провести компьютерный дизайн флуоресцентно меченых и немодифицированных олигонуклеотидных праймеров, необходимых для экспериментов с использованием ПЦР и ЛЦР.

2. Провести модельные эксперименты с выбранными праймерами с использованием ПЦР и ЛЦР с целью подбора оптимальных параметров реакции при максимальном сокращении затрат времени.

3. Определить эффективность использования синтезированных праймеров в ПЦР и ЛЦР, совмещенных с обратной транскрипцией, при использовании в качестве матрицы вирусной РНК, выделенной из культур клеток Vero Е6, крови больных людей и легочной ткани грызунов-переносчиков ГЛПС.

4. Определить возможность проведения ЛЦР непосредственно на РНК, исключив из реакции стадию обратной транскрипции.

Научная новизна и практическая значимость. Проведенные эксперименты показали возможность создания прототипа быстрого и эффективного диагностического теста на наличие хантавирусной РНК в биологических препаратах с применением методов ПЦР и ЛЦР, контролируемых в режиме реального времени.

Доказана возможность сближенного расположения на матрице олигонуклеотидных праймеров, используемых в процессе ПЦР и ЛЦР, с целью

обеспечения высокой эффективности переноса энергии флуоресценции в паре карбоксифлуоресцеин (FAM) - карбокси-Х-родамин (ROX).

Установлена возможность исключения стадии обратной транскрипции при проведении реакции ЛЦР с использованием РНК-матрицы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005); на 8-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005» (Пущино, 2005), на 2-ой Международной конференции «Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда» (Пущино, 2005).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 184 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 112 страницах и содержит 28 рисунков, 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследования была использована кДНК S-сегмента геномной РНК хантавируса CG-32/Moscow-95 (серотип Puumala), имеющей высокий уровень сходства по нуклеотидной последовательности с одним из геновариантов (Ufa 97.11), обнаруженным на территории РБ во время вспышки заболевания ГЛПС в 1997-98 гг. Для выделения вирусной РНК использовали отдельные пассажи культуры клеток Vero Е6, зараженных инфекционным материалом, полученным во время отлова зараженных грызунов в местах их

естественного обитания, препараты крови больных людей ,и легочную ткань грызунов-переносчиков ГЛПС. ■

Приготовление компетентных клеток Е. coli штамма XLl-Blue, их трансформацию, выделение и очистку плазмидной ДНК, а также анализ рекомбинантных клонов проводили по Sambrook. et al. (1989). Аналитический и препаративный гель-электрофорез, а также элюцию фрагментов ДНК из геля с помощью легкоплавкой агарозы проводили по Sealey и Southern (1982). Выделение и очистку тотальной клеточной РНК из аутопсийных тканей проводили экстракцией смесью гуанидинтиоционат-фенол-хлороформ (Chomczynski et al., 1987). ДНК, комплементарную вирусной геномной РНК (кДНК), получали при помощи фермента AMV-ревертазы (обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц, Frohman, 1988) и .Tth-полимеразы (термостабильной ДНК-полимеразы Thermus themiophilus, Гребенникова и др., 1995). Амплификацию вирусной кДНК с помощью методов полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени (ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ), а также определение температур плавления одинарных . и двойного дуплексов олигонуклеотидов проводили в амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ фирмы BioRad (США) в соответствии с протоколами прилагаемой к прибору программы. Анализ нуклеотидной последовательности гена нуклеокапсидного белка хантавируса, кодируемого S-сегментом геномной РНК, компьютерный дизайн олигонуклеотидных праймеров, расчет физических параметров ПНР и ЛЦР, а также физико-химических свойств образующихся продуктов проводили с использованием пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR, Ink., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Характеристика объекта исследований Филогенетический анализ, проведенный на основе компьютерного выравнивания первичных структур S-сегментов вирусной РНК,

зарегистрированных в электронном банке нуклеотидных последовательностей ОЕЫВА!ЧК (МСВ1, США), показал, что изоляты, выделенные на территории Республики Башкортостан занимают на соответствующей дендрограмме несколько обособленное положение от хантавирусных штаммов, выделенных примерно в те же годы в других регионах территории России (рис. 1). В связи с этим, при разработке диагностикума в качестве мишени был выбран один из наиболее консервативных участков Б-сегмента РНК хантавируса, кодирующего Ы-концевую часть нуклеокапсидного белка.

I- Izh/501-Hs/04_Izhevsk-2004

- I-Dosang/618_Astrakhan-2004

- -F-s808_Samara-2001

-CG39/N.Novgorod-97

--i- CGI820_Bashkiria-1990

J- P360_Russia-1993

--------------L_ K27_Russia-1993

I— CG17/Baslikiria-2001

---I-CG32/Moscow-95

I-Ufa97_l 1/Basli kiria-1997

-CG168_Omsk-2000

-Vranica-95 (Middle Europe)

11.1-1-1-1-[-1-1

10 8 6 4 2 0

Рис. 1. Филогенетические взаимоотношения между изолятами хантавирусов, выделенными на территории Российской Федерации в период с 1990 по 2004 гг. Масштаб — 2 замены на каждые 100 нуклеотидов. В качестве реперной использована последовательность S-сегмента РНК штамма Vranica-95 (регистрационный номер U14137).

2. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени (ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ)

При выборе схемы и параметров ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ руководствовались разработанным ранее в лаборатории методом сближенного расположения праймеров на мишени, удобного для использования их как в ПЦР, так и ЛЦР (рис. 2, 3). Если в процессе ЛЦР используются все 4 праймера, два из которых (HV1, HV2) комплементарны одной цепи ДНК мишени, а два других (HV3,

НУ4) - другой, то для проведения ПЦР достаточно двух праймеров (НУ1+НУЗ). Рассчитанная температура плавления продукта ПЦР/ЛЦР длиной 32 п.н. составляет 75.8°С при 37.5% ОС-пар, а температура отжига праймеров -42-47°С в стандартных условиях (табл. 1).

129 пн

НУ 7

НУ1 НУ2^

;кДНК

НУ4 НУЗ

^--и

32 пн

Рис. 2. Схема расположения праймеров по отношению к матрице и их нумерация.

В связи с небольшими размерами продукта ПЦР/ЛЦР продолжительность элонгации была сведена к минимально возможной (8-10 сек, именно столько времени требуется прибору для снятия показаний).

Таблица 1. Праймеры, специфичные к нуклеотидной последовательности гена нуклеокапсидного белка хантавируса.

Наименование Ориентация Температура Последовательность

праймера праймера плавления, ТсР праймера

НУ1 41.8 5 ,-taggtatggaaatgtc-3'

НУ1-РАМ 5 '-taggTatggaaatgtc-3' *

НУ2 47.4 5 '-cttgatgtaaatgcca-3'

НУ2-ЯОХ 5 '-cttgatgtaaaTgcca-3' * *

НУЗ «_» 47.4 5 '-tggcatttacatcaag-3'

НУЗ-ЯОХ 5 '-tggcaTttacatcaag-3' * *

НУ4 (Ь _ и 41.8 5 '^асаШсса(асс(а-3'

НУ4-РАМ 5 '^асаШссаТассЛа-З' *

* - заглавной буквой показано положение флуоресцентной метки -карбоксифлуоресцеина (РАМ)

** - заглавной буквой показано положение флуоресцентной метки - карбокси-Х-родамина (ЯОХ)

HV1

НУ2-ф. кДНК

+ SYBR Green I

HV1-FAM

кДНК

[МИД!

1 1 Г

У s PF i р

гетеродуплекс

Рис. 3. Лигазная (А) и полимеразная (Б) цепные реакции с переносом резонансной энергии от FAM к ROX или с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I.

Низкая температурная стабильность, присущая продукту амплификации вследствие невысокого содержания GC-nap, была подтверждена в экспериментах с заданным градиентом температуры денатурации. Было отмечено, что плавление двухцепочечного продукта ПЦР/ЛЦР происходит в интервале от 68 до 75°С, а димерные продукты, появляющиеся в результате неспецифических реакций, плавятся при температуре менее 50°С. В итоге была выбрана следующая схема проведения режима термоциклирования, которая использовалась и при ПЦР, и при ЛЦР: предварительная денатурация - 2 мин при 94°С; затем 25-35 циклов основной программы (денатурация при 75°С - 10 с, отжиг прайм еров - 10 с при 32°С, элонгация или дотирование при ЛЦР - 10 с при 65°С). Регистрацию флюоресценции проводили при 32°С и 65°С. Такой режим следует считать оптимальным для работы термостабильной лигазы из Thermus thermophylus (Tth-лигазы) и субоптимальным для термостабильной полимеразы из Thermus aquaticus (Taq-полимеразы).

Предварительные эксперименты с использованием в качестве мишени клонированной в плазмиде кДНК S-сегмента хантавируса и интеркалирующего красителя SYBR Green I показали хорошие результаты в плане скорости проведения реакции ПЦР-РВ (24-25 циклов, 40-45 мин) и достаточной величины регистрируемого сигнала при высокой концентрации искомой матрицы (103 копий на реакцию) (рис. 4). Однако некоторые свойства красителя SYBR Green I, интеркалирующего в любую двухцепочечную молекулу ДНК, ограничивают его применение в данной системе, поскольку снижается соотношение истинный сигнал/шум за" счет стимуляции образования неспецифических продуктов амплификации, преимущественно димеров праймеров.

К тому же, SYBR Green I способен заметно ингибировать работу некоторых ферментов, в частности ДНК—лигазы, что делает нежелательным его использование в лигазной полимеразной реакции (рис. 5).

1 1 j j |

1 1 1 1

1 I _ - У / -j-

i / i

1 i

1 1 /

1 i - А r

1 I |

1 / - -

1 1 ! | i

J-J R! - 1 -r4- 7|

! i 1 1 { -L

2 Ч 6 1 lt U lt lt » 20 22 » а it

K* AitWMM« « BM

Рис. 4. Динамика накопления продуктов ГЩР:

1- ампликон с праймерами HV1/HV3 и SYBR Green I

2- контроль (без матрицы)

,М 1

2 3 4

■М

1 w* J44

O22 2*»20 3a32343fi»4<M2 44««85OS2M

Cyd»

Рис. 5. Результаты ЛЦР-РВ в присутствии SYBR Green I. А - динамика накопления продуктов амплификации. Б - электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 10% ПААГе. 1, 2, 3 - продукты ЛЦР в присутствии 105, 104 и 103 копий матрицы

на реакцию соответственно; 4 - контроль (без матрицы);

М — фрагменты ДНК маркерной плазмиды pBluescript II SK:HpaII.

Поэтому в дальнейшем в наших исследованиях мы использовали детекцию целевых продуктов с использованием эффекта резонансного переноса энергии флюоресценции в паре карбоксифлуоресцеин (РАМ) - карбокси-Х-родамин (ШЭХ). Чувствительность предложенного метода с парой

флуоресцентных красителей РАМ-ЯОХ такова, что позволяет выявлять 102 копий мишени, взятых на реакцию, за 22-25 циклов (рис. 6).

Рис. 6. Результаты ПЦР-РВ с переносом энергии.

А - динамика накопления продуктов амплификации.

1,2- ампликоны с праймерами HV1-FAM/HV3-ROX и HV11-F АМЯТУЗ1 -ROX соответственно;

3, 4 - контроли (без матрицы);

Б - электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 10% ПААГе.

1 - фрагменты ДНК маркерной плазмиды pBSK:Hpa II;

2, 4 - ампликоны с праймерами HV1-FAM/HV3-ROX и HV11 -F AM/HV31-ROX соответственно;

3 и 5- контроли (без матрицы).

Так как система флуоресцентных красителей FAM-ROX обладает большей чувствительностью, то и соотношение полезный сигнал/шум, получаемый при использовании эффекта резонансного переноса энергии флюоресценции выше, чем при применении SYBR Green I (рис. 6, 7).

Важным моментом при оптимизации параметров реакции является подбор концентраций праймеров и матрицы. Избыточная концентрация матрицы, применяемая в модельных экспериментах, приводит к ухудшению разрешающей способности реакций ПЦР и ЛЦР.

10 12 М 16

1 2 3

Рис. 7. Результаты ЛЦР-РВ с переносом энергии.

А - динамика накопления продуктов амплификации.

Б - электрофоретический анализ продуктов ЛЦР в 10% ПААГе.

1 - ампликоны с праймерами НУ 1-РАМ, НУЗ-1ЮХ, НУ2ф. и НУ4ф.;

2 - ампликоны с праймерами НУ 1-РАМ, НУЗ, НУ2-ЯОХф. и НУ4ф.;

3 - контроль (без матрицы);

М - фрагменты ДНК маркерной плазмиды рШиеБспрг II 8К:Нра11.

При высоких концентрациях праймеров стимулируется образование димерных продуктов, приводящих к регистрации ложного сигнала в образцах, не содержащих искомой матрицы. С помощью варьирования концентраций матрицы и праймеров мы подобрали оптимальное их соотношение. Для биологических препаратов это 10 нг/мкл ДНК/РНК, а для праймеров - 0.15-0.3 пмоль/мкл. В модельных экспериментах с плазмидной ДНК или синтетической матрицей требуется очень высокая степень их разведения вследствие высокой концентрации искомой мишени.

Вследствие низкой температуры отжига 16-звенных праймеров снижается специфичность реакций ПЦР/ЛЦР при проведении реакций с увеличенным числов циклов (35-40) из-за появления продуктов димеризации праймеров. Для дальнейших исследований мы использовали более длинные, в 21 нуклеотид, праймеры (табл. 2). Праймер НУ72-РАМ был использован как отрицательно/положительный контроль в реакциях с переносом энергии, т. к. пара НУ72-Р АМ/НУЗ1 -КОХ дает продукт, в котором флуоресцентные

красители находятся на значительном расстоянии друг от друга, и перенос энергии не детектируется (рис. 8).

А Б

* 1 з. 2 - 5»

______________* "ЖВИЯ. .»-к 'т- ^Ы - . , _ -1

Г * J <*fl 'Чул I

10 12 14 16 18 Cydo

Рис. 8. Результаты ПЦР в реальном времени с переносом энергии. А - динамика накопления продуктов амплификации. Б - электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 10% ПААГе. 1,2, 3,4 - амппликоны с праймерами HV11-FAM/HV31-ROX в присутствии

10г, 103, 104 и 10 копий матрицы соответственно; 5 - отрицательно/положительный контроль с праймерами

HV72-FAM/ HV31-ROX (продукт размером 130 пн, но переноса энергии нет).

3. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетической матрице

Для постановки модельных экспериментов ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР в реальном времени на РНК-матрице был синтезирован 35-звенный рибоолигонуклеотид НУ1КЫА (ЗАО «СИНТОЛ», Москва), соответствующий консервативному участку Б-сегмента РНК хантавируса штамма СО-32/Мо8со\у-95 (серотип Риита1а):

5'-ШССАиииАСАиСААООАСАШиССАиАССиААОО-3\ Синтез кДНК инициировали комплементарными геномной минус-РНК праймерами: НУ1, НУ1-БАМ или НУ 11-РАМ, а для последующей амплификации полученной кДНК использовались пары праймеров НУ1/НУЗ, НУ 1-РАМ/НУ З-ЯОХ и НУ 11 -Р АМ/Н УЗ 1 ^ОХ соответственно. Для постановки лигазной цепной реакции использовались две пары праймеров: НУ1/НУЗ (НУ1-РАМ/НУЗ^ОХ) и фосфорилированные НУ2/НУ4 (HV2-ROX/HV4-FAM).

Синтез кДНК и последующая ПЦР проводились с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы ТЬегтив ЛегторЬПив — ТЛ-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск), т. к. она способна вести и полимеразную реакцию, и обратную транскрипцию. Нужно отметить, что ревертазной способностью Тйьполимераза обладает только в присутствии ионов Мп, а для полимеразной активности необходимы ионы Поэтому, при проведении реакции, после стадии построения кДНК в буферной системе, содержащей ионы Мп, в реакционную смесь добавлялись ионы Mg в достаточной для полимеразной активности фермента концентрации. Критической стадией при проведении данной реакции является стадия отжига праймера-затравки на рибоолигонуклеотидной матрице и последующее построение кДНК. Поэтому время для проведения этих операций было сознательно завышено и составило 5 мин на каждую стадию: первая стадия — отжиг праймера при 32°С - 5 мин, синтез кДНК при 50°С - 5 мин, затем в реакционную смесь добавляли М§СЬ до конечной концентрации 10 мМ и проводили вторую стадию - 25 циклов - 80°С -4 с, 32°С — 8 с. Вся реакция, включая и время на добавление в реакционную смесь ионов Mg, занимает менее одного часа.

Параллельно для наглядности и сравнения эффективности методов проводились ПЦР в реальном времени с кДНК, полученной с помощью двух разных обратных транскриптаз фирмы «Силекс» и фирмы «Ргогг^а». Время на проведение этой реакции — 1 час на синтез кДНК и 40 минут на ПЦР в реальном времени. В случае же опытов с обратными транскриптазами мы имеем значительное увеличение времени проведения анализа (так как только на построение кДНК уходит 1 час), и меньшую чувствительность ПЦР - почти вдвое меньшее накопление продукта за то же время анализа («Силекс») или почти та же величина накопления продукта, но за 34-35 циклов реакции вместо 25 («Ргоп^а»).

В ходе проведения экспериментов было отмечено, что эффективность переноса энергии от БАМ на ЛОХ в большей степени зависит от взаимного расположения молекул красителей на цепи ДНК. Так, при использовании пары

праймеров РР/1-РАМ/НУЗ-1ШХ, мы получали расстояние между красителями равное 20 нуклеотидам, что соответствует двум виткам спирали ДНК или 6,8 нм. В таком положении молекулы красителей располагались в одной плоскости, но по разные стороны спиральной молекулы ДНК. Перенос энергии при этом проходил удовлетворительно, но для получения более уверенного сигнала было решено синтезировать новые праймеры с другим расположением красителей (табл. 2, рис. 9).

Таблица 2. Праймеры с различной локализацией нуклеотидов, несущих флуоресцентную метку, использованные для амплификации кДНК.

Наименование праймера Ориентация праймера Температура плавления, Т(1° Последовательности праймер ПЦР продукт (пн)

НУПа-РАМ « + « 59.8 5' -aggcttaggtaTggaaatgtc-3' 42

НУ31а-1ЮХ и _ я 59.8 5 '-gtcaatggcattTacatcaag-3 *

НУ11Ь-РАМ « + м 59.8 5' -aggcttaggtatggaaaTgtc-3' 42

НУ31Ь-ЬЮХ «_« 59.8 5' -gtcaatggcatttacaTcaag-3 *

Пара праймеров НУ 11 а-РЛМ/НУЗ 1 а-ЯОХ позволяет получить фрагмент ДНК с расстоянием между красителями в 18 нуклеотидов, что соответствует расстоянию примерно 6,1 нм. Учитывая, что красители присоединены к основаниям на разных цепях молекулы ДНК, то в этом варианте молекулы флюорохромов также находятся практически в оппозитном положении относительно друг друга и уступают по интенсивности сигнала следующей комбинации праймеров (рис. 10). Пара праймеров НУ 11Ь-РЛМ/НУЗ1Ь-К.ОХ дает фрагмент ДНК с расстоянием между красителями в 8 нуклеотидов, значит, оба флюорофора находятся в пределах одного витка цепи ДНК (расстояние между красителями примерно 2,7 нм), а угол между ними близок к 90°. Такое расположение молекул красителей можно считать самым удачным из рассмотренных, потому что сигнал, полученный в реакции с этой парой праймеров, почти в два раза сильнее по сравнению с остальными комбинациями (рис. 10), но такое близкое расположение красителей не приемлемо для праймеров, используемых в реакции ЛЦР, так как молекулы

НУ11Ь-РАМ-НУ31Ь-Я0Х 8

Рис. 9. Расположение нуклеотидов с присоединенными флуорофорами в пределах образующегося в результате ПЦР/ЛЦР продукта.

красителей блокируют доступ ДНК-лигазы к субстрату, не давая ферменту достаточно места для присоединения к нужному участку цепи ДНК.

Рис. 10. Результаты ПЦР-РВ с праймерами с различным расположением красителей.

А - динамика накопления продуктов амплификации.

Б - электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 10% ПААГе.

1,2,3 - ампликоны кДНК в присутствии 102, 103 и 104 копий матрицы соответственно с праймерами НУ11а-РАМ/НУ31а-БЮХ;

5, б, 7 - ампликоны кДНК в присутствии 102, 103 и 104 копий матрицы соответственно с праймерами НУ1 ¡Ь-БАМ/НУЗ1Ь-1ЮХ;

4, 8 - минус контроли;

М - фрагменты ДНК маркерной плазмиды рВЭК:Нра II.

4. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК

Для подтверждения результатов, полученных на плазмидной и синтетической матрицах при применении разработанной нами диагностической системы с флюоресцентно мечеными праймерами, были взяты образцы РНК, выделенные из культур клеток Vero Е6, зараженных вирусом, крови больных ГЛПС и легочной ткани рыжих полевок. РНК выделяли с помощью реагента TRIZOL. После стадии построения к ДНК с немеченым праймером HV1 или HV11 в реакционную смесь добавляли пару меченых праймеров HV11-FAM/HV31-ROX. Режим реакции оставался тем -же, за исключением температуры отжига праймеров: отжиг на РНК праймера-затравки при 37°С - 5 мин, построение кДНК при 50°С - 5 мин, 25-30 циклов цепной реакции с отжигом при 42°С - 8 с и денатурацией при 75-80°С - 4 с. Результаты опытов полностью соотносятся с ожидаемыми. Динамика накопления продуктов ПЦР и последующий электрофоретический анализ подтверждают наличие в препаратах вирусной РНК (рис. 11).

А Б

М 12345678

Л"*

5 VjiííJ W

МЩ \Ü

i«ii W !»í ■

*П 4Í

О 20 22 • И 24 28 30 32

Рис. 11. Результаты амплификации вирусной РНК методом ПЦР-РВ.

А - динамика накопления продуктов амплификации.

Б - электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 10% ПААГе.

1,2- препараты, полученные из крови больных ГЛПС;

3 - препараты, полученные из зараженных вирусом клеток Vero Е6;

4-7 - препараты, полученные из легочной ткани грызунов-переносчиков ГЛПС;

8 - контроль (без матрицы);

М - фрагменты ДНК маркерной плазмиды pBluescript II SK:HpaII.

5. ЛЦР-РВ на РНК-матрице

Установленная по литературным данным способность некоторых ДНК-лигаз осуществлять реакцию, лигирования при использовании в качестве матрицы молекулы РНК стимулировала нас на определение возможности протекания лигазной цепной реакции непосредственно на РНК-матрице. Это позволило бы исключить при проведении реакции стадию обратной транскрипции. Модельную реакцию ЛЦР проводили, исключив стадию обратной "транскрипции, с праймерами НУ 1-РАМ, НУЗ-БЮХ, НУ2фосф. и НУ4фосф., в присутствии ТЛ-лигазы, Taq-лигaзы и Т4 ДНК-лигазы, в качестве матрицы использовали рибоолигонуклеотид НУПША.

эгоггмг&геэозгз*;

СусЬ

40 « 44 46 4В 50 53 54

Рис. 12. Динамика накопления продуктов ЛЦР-РВ на РНК с четырьмя праймерами:

1 - ампликоны, полученный с помощью ТШ-лигазы;

2 - ампликоны, полученный с помощью Тая-лигазы;

3 - ампликоны, полученный с помощью Т4 БЫА-лигазы;

М - фрагменты ДНК маркерной плазмиды рВЬеэспр! II БК/НраИ

Результаты проведенных экспериментов подтвердили возможность проведения ЛЦР на матрице РНК (рис. 12). Для более тщательной проверки были проведены эксперименты с праймерами, укороченными на один нуклеотид. Из-за отсутствия 5'-концевого нуклеотида на стадии отжига между соседними праймерами образуется просвет в один нуклеотид. Для того чтобы прошло яигирование, в реакционную среду добавляется недостающий

нуклеозид-трифосфат, полимераза, «вставляющая» этот нуклеозид-трифосфат, и ДНК-лигаза. Реакция проводилась в том же режиме, с праймерами НУ 1-РАМ/ НУ2фосф./ НУЗ-ШЭХ/ НУ4фосф. и НУ 1-БАМ/ НУ2сЗСфосф./ НУЗ-ЯОХ/ HV4dGфocф., соответствующими нуклеозидтрифосфатами (dCTP, dGTP), Taq-полимеразой и разными лигазами: ТЛ-лигазой, Taq-лигaзoй и Т4 ДНК-лигазой.

i »

Ь к

1 « J 30

TT"

Iii:

■ Ц| it

ли

mil

Iii

Uli

о а а 6 » Ю12 1*1б1его22гчгег?зозг»«эбэв«о«***б*ен}5754

СуеЬ

Tth- Taq-лигаза лигаза

М 1 2 3

1 2 3

Рис. 13. Результаты ЛЦР-РВ с разными праймерами и лигазами:

Т4 DNA- А - динамика накопления продуктов ЛЦР-РВ лигаза с Tth-лигазой;

1.,2 > I 3 7 Б - динамика накопления продуктов ЛЦР-РВ _ .—, с Xaq-лигазой;

< ; В - электрофореграмма продуктов ЛЦР-РВ

с разными праймерами и лигазами в 10% ПААГе: 1-с праймерами irVl-FAM, HV3-ROX, НУ2ф., НУ4ф.;

2 - с праймерами HV1-FAM, HV3-ROX, s HV2dCф., т^вф.;

| J / М »■ • М "

I 3 - контроли (без матрицы); w u "„■ %мг ^ t„t ^ t М - фрагменты ДНК маркерной плазмиды

pBluescript II SK/Hpall

Результаты проведенных исследований (рис. 13) подтвердили предполагаемую возможность осуществления реакции лигирования непосредственно на РНК-матрице и, соответственно, исключения стадии обратной транскрипции во время проведения лигазной цепной реакции. Можно также отметить, что ЛЦР с укороченными праймерами проходит более специфично, чем с обычными праймерами, а Tth-лигаза активнее Taq-лигазы почти вдвое и ее использование в ЛЦР предпочтительнее.

Таким образом, полученные результаты показали, что методы полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции могут быть применены для детекции вирусной РНК. И, хотя каждый метод требует соблюдения строгих условий, таких как подбор расстояния между флуорофорами и тщательно рассчитанный температурный режим, оба они отличаются высокой чувствительностью и минимальными затратами времени.

вывода!

1. Разработаны высокочувствительные методы детекции продуктов полимеразной и лигазной цепных реакций в режиме реального времени, использующие эффект резонансного переноса энергии -флуоресценции, обеспечиваемый оригинальной схемой максимально сближенного размещения олигонуклеотидных праймеров,

2. Предложены прототипы эффективных диагностических, систем, использующих методы ГТЦР и ЛЦР для быстрой и высокочувствительной диагностики хантавирусной РНК в биологических препаратах различного происхождения, в том числе и выделенных из крови больных ГЛПС.

3. Проведена оптимизация параметров реакций ПЦР и ЛЦР за счет подбора температурного режима и концентраций олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающая высокую чувствительность при сокращении общей продолжительности процессов.

4. Показана возможность исключения при проведении лигазной цепной реакции стадии конверсии РНК в ДНК,- за счет дотирования на них олигонуклеотидов при использовании в качестве матрицы непосредственно молекул РНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Романенкова MJL, Никоноров Ю.М., Чемерис A.B. Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК // Естествознание и гуманизм: сборник научных трудов. - Томск. - 2005. -Т. 2. - №4. - С. 53-55.

2. Романенкова M.JL, Никоноров Ю.М., Чемерис A.B. Модельные эксперименты для создания быстрого диагностического теста на хаптавируснуга РНК с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени // Биотехнология-2005: Материалы 8-го Международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов. - Пущино. - 2005. - С. 43-45.

3. Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Гарафутдинов P.P., Романенкова М.Л., Малеев Г.В., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Новые методы улучшенной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК в режиме реального времени с помощью цепных реакций нуклеиновых кислот - полимеразной (ПЦР), лигазной (ЛЦР) и гибридизационной (ГЦР) // Материалы III Съезда Общества биотехнологов России. - Москва. - 2005. - С. 19-20.

4. Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Магазова P.A., Жукова И.Ю., Романенкова M.JL, Чемерис A.B. Лигазная цепная реакция в режиме реального времени как альтернатива полимеразной цепной реакции в ДНК-диагностике инфекционных заболеваний // Здравоохранение Башкортостана. - 2005. - спец. вып. N°8. - С. 67-68.

5. Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Романенкова М.Л., Чемерис Д.А., Гарафутдинов P.P., Малеев Г.В., Алексеев Я.И., Вахитов В.А. Лигазная цепная реакция в реальном времени как альтернатива ПЦР в ДНК-диагностике. Новая жизнь старой реакции // Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда: Материалы 2-ой Международной конференции. - Пущино - 2005. - С. 111-113.

6. Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Гарафутдинов P.P., Матниязов Р.Т., Гималов Ф.Р., Романенкова М.Л., Вахитов В.А. ПЦР, ЛЦР и ГЦР - цепные реакции нуклеиновых кислот в режиме реального времени // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. - 2005. - Т. 1. - №2. -С. 5-14.

РОМАНЕНКОВА МАЙЯ ЛЕОНИДОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ И ЛИГАЗНОЙ

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 18.05.2006 г. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 '/16. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7 Тираж 100 экз. Заказ Ха 362.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романенкова, Майя Леонидовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

1.2. Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов.

1.2Л. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевам-переносчикам.

1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов.

1.2.3. Синтез вирусной РЖ и созревание вирионов.

1.3. Диагностика ГЛПС.

1.3.1. Метод флюоресцентных антител.

1.3.2. Иммуно-пероксидазное окрашивание.

1.3.3. Иммуноферментный анализ.

1.3.4. Иммунохроматографические тесты.

1.3.5. Полимеразная цепная реакция. 1.3.5.1. ОТ-ПЦР, «гнездовая» ОТ-ПЦР.

1.3.5.2. ПЦР в реальном времени.

1.3.5.3. ЛЦР в реальном времени.

Глава 2. Объект и методы исследований.

2.1. Краткая характеристика объектов исследований.

2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях. 2.4. Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей.

2.5. Синтез кДНК. 2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

2.7. Фосфорилирование 5'-концов олигонуклеотидных праймеров.

2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотидных дуплексов и определение их температуры плавления.

2.9. ЛЦР или ОТ-ЛЦР в режиме реального времени.

2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.11. Реактивы и материалы.

2.12. Составы использованных стандартных растворов.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Реакции с плазмидной ДНК.

3.1.1. Характеристика объекта исследований.

3.1.2. Проверка плазмиды pCRII на наличие вставки.

3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени.

3.1.4. Проведение ПЦР и ЛЦР с оптимизированными параметрами реакций.

3.2. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетической матрице. 67 ^ 3.2.1. ПЦР с SYBR Green I и FAM/ROX.

3.2.2. ЛЦР с SYBR Green I и FAM/ROX.

3.3. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК.

3.3.1. Реакции с построением кДНК.

3.3.1.1. ОТ-ПЦР с ST-pol.

3.3.1.2. ОТ-ПЦР с M-MLV-revertase/Tth-pol.

3.3.2. Реакции на РНК-матрице. 3.3.2.1. ЛЦР на РНК (четыре праймера).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом"

Актуальность темы. На территории Российской Федерации с периодичностью раз в три-четыре года происходят эпидемические вспышки заболеваний, вызываемых хантавирусами, а Республика Башкортостан является одним из самых крупных в мире районов-очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), которые подразделяются на несколько различных серотипов.

По данным литературы в настоящее время насчитывается более 25 различных серотипов хантавирусов. Из них патогенными для человека являются хантавирусные серотипы Dobrava (DOB), Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU), из которых первые два вызывают тяжелую форму ГЛПС, остальные, соответственно, среднюю и легкую формы. Также патогенными являются серотипы Sin Nombre (SN), Black Creek Canal (BCC), которые вызывают обнаруженное в США заболевание, получившее название "хантавирусный пульмонарный синдром" (Vapalahti, 1996; Schmaljohn et al., 1995; Xiao et al., 1994; Avsic-Zupanc et al., 1995; Chu et al., 1994; Schmaljohn et al., 1985). Изоляты, выделенные в Башкортостане (Tkachenko et al., 1984), относятся к серотипу Puumala, представители которого вызывают менее тяжелые формы ГЛПС, нежели, например, серотип Hantaan. Однако в последнее время все чаще наблюдается более тяжелое течение заболевания, сопровождаемое «стертыми» симптомами, что значительно затрудняет своевременную постановку точного диагноза. ГЛПС по заболеваемости занимает первое место среди природно-очаговых инфекций в Российской Федерации. Число зарегистрированных случаев в отдельные годы может достигать 20 тысяч и более, нередки летальные исходы (Морозов, 2001; Ткаченко, Дроздов, 2002).

Основными переносчиками ГЛПС являются мышевидные грызуны. Передача вируса от грызуна к человеку происходит, в основном, воздушно-капельным путем.

К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и лечения ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в Республике Башкортостан характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3-4 года. Подобные вспышки, вероятно, связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов хантавирусным серотипом РШ1, основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории Республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Самый высокий подъем заболеваемости ГЛПС за 40 лет с начала регистрации инфекции в Башкортостане пришелся на эпидемический сезон 1997-1998 гг., когда было зарегистрировано 10 057 случаев заболевания ГЛПС, из них 34 случая (0,4%) со смертельным исходом (Нургалеева и др., 1999). Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу РЦи, однако большой интерес представляла генетическая характеристика данного вируса.

Эффективность лечения любого заболевания определяется его правильной и ранней диагностикой. Для диагностики ГЛПС в лабораторной практике используются методы, основанные на детекции специфических антител. В то же время достоверные результаты можно получить только при использовании техники амплификации нуклеиновых кислот. Уже ставший рутинным при проведении научных исследований метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала. Альтернативой традиционным методам может стать разработанная нами модификация метода ОТ-ПЦР, контролируемой в режиме реального времени и использующей эффект резонансного переноса энергии флуоресценции для детекции продуктов амплификации.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени имеет несколько преимуществ перед обычной ПЦР (Klein, 2002; Tse, Capeau, 2003, Mackay, 2004):

1. возможность наблюдения за накоплением целевого продукта в данный момент на любой из стадий реакции амплификации

2. отсутствие постреакционных манипуляций для детекции образования целевого продукта (электрофоретический анализ и пр.), и, вследствие этого

3. сокращение времени от начала проведения ПЦР до получения конечного результата.

При этом, с применением термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilics (Tth-полимеразы), появилась возможность проводить построение кДНК и последующую ее амплификацию в одной пробирке (Myers, Gelfand, 1991), опять же, значительно сокращая время проведения реакции.

Цель и задачи исследования: Цель данного исследования заключалась в создании прототипа эффективной тест-системы для быстрого и специфического выявления хантавирусной РНК в биологических материалах на основе полимеразной и лигазной цепных реакций (ПЦР и ЛЦР) с использованием эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить физико-химические свойства объекта исследования, провести компьютерный дизайн флуоресцентно меченых и ^модифицированных олигонуклеотидных праймеров, необходимых для экспериментов с использованием ПЦР и ЛЦР.

2. Провести модельные эксперименты с выбранными праймерами с использованием ПЦР и ЛЦР, с целью подбора оптимальных параметров реакции при максимальном сокращении затрат времени.

Научная новизна и практическая значимость. Проведенные эксперименты показали возможность создания прототипа быстрого и высокочувствительного диагностического теста на определение хантавирусной РЖ в биологических препаратах с применением методов ПЦР и ЛЦР, контролируемых в режиме реального времени.

Доказана возможность сближенного расположения на матрице олигонуклеотидных праймеров, используемых в процессе ПЦР и ЛЦР, с целью обеспечения высокой эффективности переноса энергии флуоресценции в паре карбоксифлуоресцеин (FAM) - карбокси-Х-родамин (ROX).

В результате проведенных нами модельных экспериментов разработана методика проведения ПЦР и ЛЦР с помощью ферментов Tth-полимеразы и Tth-лигазы за максимально короткое время.

Показана возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Vero Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из крови мышей-переносчиков ГЛПС.

Показаны возможность исключения из ПЦР и ЛЦР стадии обратной транскрипции, что существенно сокращает время на проведение анализа, и, соответственно, возможность проведения ПЦР и ЛЦР непосредственно на РНК-матрице.

Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить детекцию хантавирусной РНК в минимальных концентрациях за максимально короткое время на любых стадиях ГЛПС.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005); на 8-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005» (Пущино, 2005), на 2-ой Международной конференции «Биотехнология - Биомедицина -Окружающая среда» (Пущино, 2005).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Романенкова, Майя Леонидовна

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны высокочувствительные методы детекции продуктов полимеразной и лигазной цепных реакций в режиме реального времени, использующие эффект резонансного переноса энергии флуоресценции, обеспечиваемый оригинальной схемой максимально сближенного размещения олигонуклеотидных праймеров.

2. Предложены прототипы эффективных диагностических систем, использующих методы ПНР и ЛЦР для быстрой и высокочувствительной диагностики хантавирусной РНК в биологических препаратах различного происхождения, в том числе и выделенных из крови больных ГЛПС.

4. Показана возможность исключения при проведении лигазной цепной реакции стадии конверсии РЖ в ДНК, за счет лигирования на них олигонуклеотидов при использовании в качестве матрицы непосредственно молекул РНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Актуальность проблемы ГЛПС обусловлена постоянным ростом заболеваемости, увеличением числа тяжелых клинических форм и регистрирующимися случаями смертности. Отдельную проблему составляет отсутствие в России вакцин, разработанных на основе региональных штаммов-возбудителей. Поэтому актуальной является разработка и внедрение в медицинскую практику новых эффективных методов ранней диагностики ГЛПС.

Нами были проведены модельные эксперименты ПЦР и ЛЦР с отработкой температурных условий проведения реакций, в результате чего созданы методики проведения ПЦР и ЛЦР для диагностики хантавирусов серотипа Пуумала с помощью ферментов Tth-полимеразы и Tth-лигазы.

С помощью тщательного подбора температур денатурации и элонгации время проведения ПЦР и ЛЦР существенно сокращено (до 35-40 минут). Этот показатель является немаловажным для клинической диагностики ГЛПС.

Нами была подтверждена возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Vero Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из легочной ткани мышей-переносчиков ГЛПС вне зависимости от давности взятых образцов. Важным обстоятельством является то, что разработанная система диагностикумов рассчитана на присутствие в исследуемых образцах даже обломков молекул РНК.

Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить высокочувствительную детекцию хантавирусной РНК за максимально короткое время на ранних стадиях ГЛПС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романенкова, Майя Леонидовна, Уфа

1. Берета JI.A., Елисова Т.Д., Воронкова Г.М. Детекция антител к хантавирусу в моче больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом // Вопросы вирусологии. 1993. - Т. 38(1). - С. 18-21.

2. Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК. Методы М.: Мир. - 1989. -346 с.

3. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А. Хантавирусы и хантавирусные инфекции // Вопросы вирусологии. 2004. - Т. 49(3). - С. 40-44.

4. Магазов Р.Ш., Кулагин В.Ф., Хайбуллина С.Ф. ГЛПС некоторые современные аспекты лечения и профилактики // В сборнике статей "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - пути решения проблемы". - Уфа. - 1995. - С. 5-9.

5. Морозов В.Г. Применение индуктора эндогенного интерферона амиксина для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом//РМЖ-2001.- Т. 9.- №15.-С. 656-660.

6. Морозов В.Г., Морзунов С.П., Ткаченко Е.А. // IV Всероссийская науч.-практ. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний»: Тезисы. М. - 2002. - С. 229.

7. Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ: общий обзор // В кн.: Иммуноферментный анализ: Пер с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир. 1988.-446 с.

8. Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика. М.: Медицина. - 1976. -316с.

9. Петров Р.В., Чередяев А.Н., Ковальчук JI.B. Принципы исследований иммунной системы // Сов. Мед. 1985. - №3. - С. 61-64.

10. Рощупкин В.И., Суздальцев А.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом Саратов. - 1990. - 102 с.

11. Смородинцев А.А., Альтшуллер И.С., Дунаевский М.И., и др. Этиология и клиника геморрагического нефрозо-нефрита. М.: Медгиз. - 1944. - 47 с.

12. Ткаченко Е.А., Дроздов С.Г. Хантавирусы и хантавирусные лихорадки // Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2002. - №6. - С. 14-18.

13. Фазлыева Р.М., Хунафина Д.Х., Камилов Ф.Х. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Республике Башкортостан. Уфа. - 1995.- 242 с.

14. Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С., Уайли Д., Ройзман Б., Холланд Д.Дж., Рэмиг Р.Ф., Шоуп Р., Кауфман Р., Пенмен Ш., Грин М., Лоуи Д.Р.: Вирусология. М.: Мир. - 1989. - 492 с.

15. Халберт С.П., Лин Т.М. Иммуноферментный анализ антител // В кн.: Иммуноферментный анализ: Пер с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир. 1988. -446 с.

16. Ahn С., Cho J.T., Lee J.G., Lim C.S., Kim Y.Y., Han J.S., Kim S., Lee J.S. Détection of Hantaan and Séoul viruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and restriction fragment length polymorphism

17. RFLP) in renal syndrome patients with hemorrhagic fever // Clin. Nephrol. -2000. V. 53.-P. 79-89.

18. Alexeyev 0., Elgh F., Zhestkov A., Wadell G., Juto P. Hantaan and Puumala virus antibodies in blood donors in Samara, an HFRS-endemic region in European Russia // Lancet. 1996. - V. 347. - P. 1483.

19. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Molecular characterization of the M genomic segment of the Seoul 80-39 virus: nucleotide and amino acid sequence comparisons with other hantaviruses reveal the evolutionary pathway // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 47-58.

20. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Nucleotide sequence and coding capacity of the large (L) genomic RNA segment of Seoul 80-39 virus a member of the hantavirus genus // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 59-66.

21. Antic D., Wright K.E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glycoprotein G1 and G2 // Virology. 1992a. - V. 189. - P. 324-328.

22. Antic D., Yong Kang C., Kristin S., Schamaljohn C., Vapalahti O., Vaheri A. Comparison of the deduced gene of the L, M, S genome segments of hantaviruses // Virus Res. 1992b. - V. 24. - P. 35-46.

23. Avsic-Zupanc T., Toney A., Anderson K., Chu Y.K., Schmaljohn C. Genetic and antigenetic properties of Dobrava virus: a unique member of the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2801-2808.

24. Baek L.J., Lee H.W., Hantavirus infection in wild birds and bats in Korea // Proceedings of the IXth International Congress of Virology. Glasgow, Scotland. - 8-13 Aug., 1993. - W52-2. - P. 84.

25. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991. V. 88. - P. 189-193.

26. Bengtsson M., Karlsson H.J., Westman G., Kubista M. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR // Nucl. Acids Res.-2003.-V. 31.-P. 45.

27. Botten J., Mirowski K., Ye C., Gottlieb K., Saavedra M., Ponce L., Hjelle B. Shedding and intracage transmission of Sin Nombre hantavirus in the deer mouse (Peromyscus maniculatus) model // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 7587-7594.

28. Bowen M.D., Kariwa H., Rollin P.E., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic characterization of a human isolate of Puumala hantavirus from France // Virus Res. 1995. - V. 38. - P. 279-289.

29. Cairns M.J., Turner R., Sun L.Q. Homogeneous real-time detection and quantification of nucleic acid amplification using restriction enzyme digestion // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2004. - V. 318. - P. 684-690.

30. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8790-8794.

31. Carey D.E., Reuben R., Panicker K.N., Shope R.E., Myers R.M. Thottapalayam virus: a presumptive arbovirus isolated from a shrew in India // Indian J. Med. Res. 1971. - V. 59. - P. 1758-1760.

32. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. -1987.-V. 162. P. 156-159.

33. Chow L, Shu P.Y., Huang J.H., Wang H.C, Chang S.F., Lu H.Y., Lin T.H. A retrospective study of hantavirus infection in Kinmen, Taiwan // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2005. - V. 38. - P. 343-349.

34. Chu Y.K., Jenning G., Leduc J.W., Lee H.W., Schmaljon C.S., Dalrymple J.M. Serological relationships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // Virology. 1994. - V. 198. - P. 196-204.

35. Crockett A.O., Wittwer C.T. Fluorescein-labeled oligonucleotides for realtime PCR: using the inherent quenching of deoxyguanosine nucleotides // Anal. Biochem. 2001. - V. 290. - P. 89-97.

36. Cvetko L., Markotic A., Plyusnina A., Margaletic J., Miletic-Medved M., Turk N., Milas Z., Avsic-Zupanc T., Plyusnin A. Puumala virus in Croatia in the 2002 HFRS outbreak // J. Med. Virol. 2005. - V. 77. - P. 290-294.

37. Dekonenko A., Ibrahim M.S., Schmaljohn C.S. A colorimetric PCR-enzyme immunoassay to identify hantaviruses. // Clin. Diagn. Virol. 1997. - V. 8. -P. 113-121.

38. Drosten C., Gottig S., Schilling S., Asper M., Panning M., Schmitz H., Gunther S. Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburg Viruses, Lassa Virus, Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,

39. Rift Valley Fever Virus, Dangue Virus and Yellow fever Virus by real-time reverse transcription-PCR. // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 23232330.

40. Elliot R.M. Molecular biology of the Bunyaviridae // J. Gen. Virol. 1990. -V.71-P. 501-522.

41. French D.J., Archard C.L., Brown T., McDowell D.G. HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination // Mol. Cell. Probes. 2001.-V. 15.-P. 363-374.

42. Frohman M.A., Dush M.K., Martin G.R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85, №23.-P. 8998-9002.

43. Galeno H., Mora J., Vilagra E., Fernandez J., Hernandez J., Mertz G., Ramirez E. First human isolate of Hantavirus (Andes virus) in the Americas. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - P. 657-661.

44. Garcin D., Lezzi M., Dobbs M., Elliot R.M., Schmaljohn C., Kang C.Y., Kolakofsky D. The 5-ends of Hantaan virus (Bunyaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign mechanism for the initiation of RNA synthesis // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 5754-5762.

45. Garin D., Peyrefitte C., Crance J.M., Le Faou A.,' Jouan A., Bouloy M. Highly sensitive Taqman PCR detection of Puumala hantavirus. // Microbes Infect. -2001. -V. 3. P. 739-745.

46. Gingeras T.R., Higuchi R., Kricka L.J., Lo Y.M., Wittwer C.T. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics // Clin Chem. 2005. - V. 51. - P. 661-671.

47. Gott P., Stohwasser R., Schnitzler P., Darai G., Bauts E.K. RNA binding of recombinant nucleocapsid proteins of hantaviruses // Virology. 1993. - V. 194.-P. 332-337.

48. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

49. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. -1992.-V.10.-P. 413-417.

50. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: realtime monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. -V. 11.-P. 1026-1030.

51. Hjelle B., Chavez-Giles G., Torrez-Martinez N., Yates S., Sarisky J., Webb J., Ascher M. Genetic identification of a novel hantavirus of the harvest mouse Reithrodontomys megalotis II J. Virol. 1994b. - V. 68. - P. 67516754.

52. Hooper J., Larsen T., Custer D., Schmaljohn C. A lethal disease model for hantavirus pulmonary syndrome // Virology. 2001. - V. 289. - P. 6-14.

53. Horling J., Lundkvist A., Persson K., Mullaart M., Dzagurova T., Dekonenko A., Tkachenko E., Niklasson B. Detection and subsequent sequencing of Puumala virus from human specimens by PCR // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 277-282.

54. Isegawa Y., Ohshima A., Sokawa Y., Yamanishi K. Strand-specific detection of Hantaan virus RNA sequences by in vitro DNA amplification // Microbiol. Immunol. 1994. - V. 38. - P. 905-908.

55. Kandimalla E.R., Agrawal S. "Cyclicons" as hybridization-based fluorescent primer-probes: Synthesis, properties and application in real-time PCR // Bioorg. Med. Chem. 2000. - V. 8. - P. 1911 -1916.

56. Kim E.C., Kim I.S., Choi Y., Kim S.G., Lee J.S. Rapid differentiation between Hantaan and Seoul viruses by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis // J. Med. Virol. 1994. - V. 43. - P. 245-248.

57. Kim G.R., Lee Y.T., Park C.H. A new natural reservoir of Hantavirus: isolation of hantaviruses from lung tissues of bats // Arch. Virol. 1994. -V. 134.-P. 85-95.

58. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations // Trends Mol. Med. 2002 - V. 8 - P.257-260.

59. Klempa B., Schmidt H.A., Ulrich R., Kaluz S., Labuda M„ Meisel H., Hjelle B., Kriiger D.H. Genetic interaction between distinct Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus agrarius and A. flavicolis in nature // J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 804-809.

60. Klempa B., Schiitt M., Auste B., Labuda M., Ulrich R., Meisel H., Kriiger D.H. First molecular identification of human Dobrava virus infection in Central Europe // J. of Clin. Microbiol. 2004. - V. 42(3). - P. 1322-1325.

61. Koo K., Jaykus L.A. Detection of single nucleotide polymorphisms within the Listeria genus using an 'asymmetric' fluorogenic probe set and fluorescence resonance energy transfer based-PCR // Lett. Appl. Microbiol. -2002. V. 35.-P. 513-517.

62. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1979. - V. 227. - P. 680-685.

63. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique. // Science. 1988. -V. 241. - P. 1077-1080.

64. Lee H.W., Baek L.J., Johnson K.M. Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever with renal syndrom in humans // Arch. Virol. Suppl. 1982. - V. 1. - P. 35-47.

65. Lee H.W., Lee P.W. Korean hemorrhagic fever. I. Demonstration of causative antigen and antibodies // Korean J. Internal Medicine. 1976. - V. 19.-P. 371-383.

66. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes // Nucl. Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 37613766.

67. Lee M.A., Siddle A.L., Page R.H. ResonSense®: simple linear fluorescent probes for quantitative homogenous rapid polymerase chain reaction // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 457. - P. 61-70.

68. Lee P.W., Amyx H.L., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T., Goldgaber D., Gibbs CJ. New hemorrhagic fever with renal syndrome-related virus in rodents in the United States // Lancet. 1982. - V. 2. - P. 1405.

69. Lee P.W., Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests // J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 22. -P. 940-944.

70. Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Arar K., Fach P. Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5-nuclease PCR assays // Mol. Cell Probes. -2003. -V. 17. P. 307-311.

71. Li Q., Yang Z.Q., Qu H., Xiao H. Variability of G1 gene of hantaviruses occurring in the Hubei Province, P.R. China from 1985 to 2000 // Acta Virol. 2005. - V. 49. - P. 51-57.

72. Liang M., Li D., Xiao S.Y., Hang C., Rossi C.A., Schmaljohn C. Antigenic and molecular characterization of hantavirus isolates from China // Virus. Res. 1994.-V. 31.-P. 219-33.

73. Lundkvist A., Bjorsten S., Niklasson B. Immunoglobulin G subclass responses against the structural components of Puumala virus // J. Clin. Microbiol. 1993. -V. 31. -P. 368-372.

74. Luo J., Bergstrom D.E., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 30713078.

75. Mackay I.M. Real-time PCR in microbiology laboratory // Clin. Microbiol. Infect.-2004-V. 10.-P.190-212.

76. Mir M.A., Panganiban A.T. The hantavirus nucleocapsid protein recognizes specific features of the viral RNA panhandle and is altered in conformation upon RNA binding // J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 1824-1835.

77. Morzunov S.P., Rowe J.E., Ksiazek T.G., Peters C.J., St. Jeor S.C., Nichol S.T. Genetic analysis of he diversity and origin of hantaviruses in Peromyscus leucopus mice in North America // J. Virol. 1998. - V. 72. -P. 57-67.

78. Myers T.W., Gelfand D.H. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase // Biochemistry 1991. - V. 30. -P. 7661-7666.

79. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2516-2521.

80. Nazarenko I., Lowe B., Darfler M., Ikonomi P., Schuster D., Rashtchian A. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - e37.

81. Nicacio C., Sallberg M., Hultgren C., Lundkvist A. T-helper and humoral responses to Puumala hantaviruses nucleocapsid protein: identification of T-helper epitopes in a mouse model // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - P. 129138.

82. Nilsson M., Barbany G., Antson D.-O., Gertow K., Landegren U. Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation // Nature Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 791-793.

83. Novotny N., Weissenboeck H., Aberle S., Hinterdorfer F. Hantavirus infection in the domestic cat // J.A.M.A. 1994. - V. 4. - P. 1100-1101.

84. Nordstrom H., Johansson P., Li Q.G., Lundkvist A., Nilsson P., Elgh F. Microarray technology for identification and distinction of hantaviruses // J. Med. Virol. 2004. - V. 72. - P. 646-655.

85. Nuovo G.J., Hohman R.J., Nardone G.A., Nazarenko I.A. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers // J. Histochem. Cytochem. 1999. - V. 47. - P. 273-279.

86. Parrington M.A., Kang C.Y. Nucleotide sequence analysis of the S genome segment of Prospect Hill virus: comparison with the prototype Hantavirus // Virology.- 1990.-V. 175. P. 167-175.

87. Parrington M.A., Lee P.W., Kang C.Y. Molecular characterization of the Prospect Hill virus M RNA segment: a camparison with the M RNA segment of other hantaviruses // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 18451854.

88. Piccirilli J. A., Krauch T., Moroney S.E., Benner S.A. Enzymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet // Nature. 1990. - V. 343. - P. 33-37.

89. Plyusnin A. Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy // Arch. Virol. 2002. - V. 147. - P. 665-782.

90. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motif among the RNA-dependent polymerare encoding elements // EMBO J. 1989. -V. 8.-P. 3867-3879.

91. Puthavathana P., Lee H.W., Kang C.Y. Typing of Hantaviruses from five continents by polymerase chain reaction // Virus Res. -1992. V.26. - P. 114.

92. Ririe K.M., Rasmussen R.P., Wittwer C.T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1997. - V. 245. - P. 154-160.

93. Rizvanov A.A., Khaiboullina S.F., St. Jeor S. Development of reassortant viruses between pathogenic hantavirus strains // Virology. 2004. - V. 327. -P. 225-232.

94. Rowe J.E., St. Jeor S.C., Riolo J., Otteson E.W., Monroe M.C., Henderson W.W., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Nichol S.T. Coexistence of several novel hantaviruses in rodents indigenous to North America // Virology. 1995. -V. 213.-P. 122-130.

95. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. 1989. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Gold Spring Harbor.

96. Schmaljohn A.L., Li D.L., Negley D.L., Bressler D.S., Turell M.J., Korch G.W., Ascher M.S., Schmaljohn C.S. Isolation and initial characterization of a newfound Hantavirus from California // Virology. 1995. - V. 206. - P. 963-972.

97. Schmaljohn C., Hasty S., Harrison S., Dalrymple J. Characterization of Hantaan virions, the prototype virus of HFRS // J. Infect. Dis. 1983. - V. 148.-P. 1005-1012.

98. Schmaljohn C.S., Jennings G.B., Hay J., Dalrymple J.M. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan virus // Virology. 1986. - V. 155. - P. 633-643.

99. Schmaljohn C., Chu Y., Schamaljohn A., Dalrymple J. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virs recombinants // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 3162-3170.

100. Schmaljohn C.S., Schmaliohn A., Dalrymple J.M. Hantaan virus M RNA coding strategy nucleotide sequence and gene order // Virology. 1987. -V. 157.-P. 31-39.

101. Shengqi W., Xiaohong W., Suhong C., Wei G. A new fluorescent quantitative polymerase chain reaction technique // Anal. Biochem. 2002. -V. 309.-P. 206-211.

102. Sherrill C.B., Marshall D.J., Moser M.J., Larsen C.A., Daude-Snow L., Prudent J.R. Nucleic acid analysis using an expanded genetic alphabet to quench fluorescence // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 4550-4556.

103. Sironen T., Vaheri A., Plyusnin A. Molecular evolution of Puumala hantavirus // J. Virol. 2001. -V. 75. - P. 11803-11810.

104. Slonova R.A., Tkachenko E.A., Kushnarev E.L., Dzagurova T.K., Astakhova T.I. Hantavirus isolation from birds // Acta Virol. 1992. - V. 32.-P. 493.

105. Solinas A., Brown L.J., McKeen C., Mellor J.M., Nicol J., Thelwell N., Brown T. Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - e96.

106. Song J.W., Baek L.J., Nagle J.W., Schlitter D., Yanagihara R. Genetic and pathogenetic hantavirus from white-footed mouse (Peromyscus leucopus) latter//Lancet. 1996. V. 344. - P. 1637.

107. Stohwasser R., Raab K., Darai G., Bautz E.K. Primary structure of the large (L) RNA segment of nephropathia epidemica virus strain Hallnas B1 coding for the viral RNA polymerase // Virology. 1991. - V. 183. - P. 386-391.

108. Svanvik N., Stahlberg A., Sehlstedt U., Sjoback R., Kubista M. Detection of PCR products in real time using light-up probes // Anal. Biochem. 2000. -V. 287. - P. 179-182.

109. Switzer C.Y., Moroney S.E., Benner S.A. Enzymatic recognition of the base pair between isocytidine and isoguanosine // Biochemistry. 1993. - V. 32. -P. 10489-10496.

110. Terajima M., Hendershot J.D., Kariwa H., Koster F.T., Hjelle B., Goade D., DeFronzo M.C., Ennis F.A. High levels of viremia in patients with the Hantavirus pulmonary synrome // J. Infect. Dis. 1999. - V. 180. - P. 20302034.

111. Todd A.V., Fuery C.J., Impey H.L., Applegate T.L., Haughton M.A. DzyNA-PCR: use of DNAzymes to detect and quantify nucleic acid sequences in a real-time fluorescent format // Clin. Chem. 2000. - V. 46. -P. 625-630.

112. Tse C., Capeau J. Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids. // Ann. Biol. Clin. 2003. -V. 61. - P. 279-293.

113. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluorescence upon hybridization // Nat. Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 303-308.

114. Tyagi S., Manas S.A., Kramer F.R. Wavelength-shifting molecular beacons //Nat. Biotechnol.-2000.-V. 18.-P. 1191-1196.

115. Vahlenkamp M., Muller T., Tackmann K., Loschner U., Schmitz H., Schreiber M. The muskrat (iOndatra zibethicus) as a new reservoir for puumala-like hantavirus strains in Europe // Virus Res. 1998. - V. 57. - P. 139-150.

116. Vapalahti O. Dis. Genetic and antigenic properties of Puumala and Tula viruses d-r. Helsinki: 1996. 90 P.

117. Vapalahti 0., Lundkvist A., Kallio-Kokko H., Paukku K., Julkunen I., Lankinen H., Vaheri A. Antigenic properties and diagnostic of Puumala virus nucleocapsid protein expressed in insect cells // J. Clin. Microbiol. -1996.-V. 34. -P.l 19-125.

118. Vaughn C.P., Elenitoba-Johnson K.S. Hybridization-induced dequenching of fluorescein-labeled oligonucleotides: a novel strategy for PCR detection and genotyping // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163. - P. 29-35.

119. Vaughn C.P., Elenitoba-Johnson K.S. Intrinsic deoxyguanosine quenching of fluorescein-labeled hybridization probes: a simple method for real-time PCR detection and genotyping // Lab. Invest. 2001. - V.81. - P. 15751577.

120. Verhagen R., Van der Groen G., Ivanov A., Van Rompaey J., Leirs H., Verheyen W. Occurence and distribution of Hantavirus in wild living mammals in Belgium // Acta Virol. 1987. - V. 31. - P. 43-52.

121. Weidmann M., Rudaz V., Nunes M.R., Vasconcelos P.F., Hufert F.T. Rapid detection of human pathogenic orthobunyaviruses // J. Clin. Microbiol. -2003.-V. 41.-P. 3299-3305.

122. Wichmann D., Slenszka W., Alter P., Boehm S., Feldmann H. Hemorrhagic fever with renal syndrome: diagnostic problems with a known disease // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 3414-3416.

123. Whitcombe D., Brownie J., Gillard H.L., McKechne D., Theaker J., Newton C.R., Little S. A homogenous fluorescence assay for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping // Clin. Chem. 1998. - V. 44.-P. 918-923.

124. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // Biotechniques. 1997. -V. 22.-P. 130-131, 134-138.

125. Wittwer C.T., Reed G.H., Gundry C.N., Vandersteen J.G., Pryor R.J. Highresolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen // Clin. Chem. 2003. - V. 49. - P. 853-860.

126. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. - V. 76. - P. 245-254.

127. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR) -amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.

128. Xiao S., Chu Y., Knauert F., Lofts R., Dalrymple J., LeDuc J.W. Comparison of hantavirus isolates using a genus-reactive primer pair polymerase chain reaction. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - P. 567-573.

129. Xiao S.Y., Liang M., Schmaljohn C.S. Molecular and antigenic characterization of HV114, a hantavirus isolated from a patient with renal syndrom in China // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 1675-9.

130. Xiao S.Y., Leduc J.W., Chu Y.K., Schmaljohn C.S. Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae // Virology. -1994.-V. 198.-P. 205-217.

131. Yamasaki K., Weihl C., Roos R. Alternative translation initiation of Theiler's murine encephalomyelitis virus // J. Virol. -1999. V.73. - P. 8519-8526.

132. Yanagihara R., Svedmyr A., Amyx H.L., Lee P., Goldgaber D., Gajdusek D.-C., Gibbs Jr., Nystrom K. Isolation and propagation of nephropathia epidemica virus in bank voles // Scand. J. Infect. Dis. 1984. - V. 16. - P. 225-228.

133. Yashina L.N., Patrushev N.A., Ivanov L.I., Slonova R.A., Mishin V.P., Kompanez G.G., Zdanovskaya N.I., Kuzina I.I., Safronov P.F., Chizhikov

Информация о работе

Романенкова, Майя Леонидовна
кандидата биологических наук
Уфа, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы