Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изотермические и управляемые сменой температур реакции амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изотермические и управляемые сменой температур реакции амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени"

На правах рукописи

ЧЕМЕРИС Дмитрий Алексеевич

ИЗОТЕРМИЧЕСКИЕ И УПРАВЛЯЕМЫЕ СМЕНОЙ ТЕМПЕРАТУР РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ СПЕЦИФИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа -2006

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Ннконоров Юрий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шакирова Фарида Мнннихановна

доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Зашита диссертации состоится «27» декабря 2006 г. в /7 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться а Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан «27» ноября 2006 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н.

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. После своего появления в середине 80-х гг. полимеразкая цепная реакция (ПЦР) [Saiki et al, 1985; 1988] очень быстро стала по существу методом №1 а фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностке. Оставаясь таковым и поныне, она все же заметно изменилась, что в первую очередь связано с переводом этой реакции в режим реального времени, где детекция накопления ампликонов ведется в ходе самого процесса амплификации. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) сильно повлияла па взгляды как исследователей, использующих метод ПЦР для получения новых знаний о функционировании генов и геномов, так и тех, кто занят исключительно ДНК-диагностикой. Если для первых главным среди других задач является возможность количественного определения с помощью ПЦР-РВ числа копий мишени в стартовом материале, то вторые, помимо этого, отдают ей предпочтение еще и ввиду практически полного исключения загрязнения ампликонами рабочих помещений и сведения, таким образом, риска получения ложнопозитивных результатов х абсолютному минимуму, что при массовом характере анализов при использовании обычной ПЦР удается добиться далеко не всегда. Однако, несмотря на большое количество предложенных вариантов детекции ампликонов в ПЦР-РВ [Higuchi et al., 1993; Lee et aL, 1993; Tyagi et aL, 1996; Nazarenko et al., 1997; Whitcombe et aL, 1999; Rasmussen et aL» 2003; Costa et al., 2004; Sherrill et aL, 2004; Monis et al., 2005 и да.], остается возможность разработки новых способов, по некоторым параметрам превосходящих существующие.

Вслед за ПЦР на рубеже 90-х гг. появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК, среди которых можно отметить лнгазную цепную реакцию (ЛЦР) [Вэтапу, 1991], амплификацию смещением цепи [Walker et aL, 1992], ее разновидность в виде амплификации катящимся кольцом [Lizardi et aL, 1998], технологию цнклирующей пробы [Duck et aL, 1990], самоподдерживающуюся репликацию [Guatelli et al., 1990; Compton, 1991], Qp-репликазную амплификацию [Lomeli et al., 1989], разветвленную гибридизационную пробу [Нош, Urdea, 1989]. К настоящему времени большинство из них переведены в передовой и наиболее удобный для ди-

агностики режим реального времени, однако в ряде случаев такой перевод оказался не очень эффективным и не лишенным серьезных недостатков.

Особый интерес эти реакции вызывают еще и тем, что все они (за исключением ЛЦР и стандартной ПЦР) протекают в изотермических условиях, благодаря чему нет потерь времени на смену температур и за счет этого не происходит искусственного сдерживания работы ферментов, что в раде случаев более технологично. Ими и заЛачи исследования. Цели исследования заключались в разработке новых вариантов управляемых сменой температур или протекающих изотермически в режиме реального времени реакций амплификации и высокочувствительной детекция нуклеиновых кислот и демонстрации их применения на практике.

В задачи исследования входило:

1) разработать основанный на флуоресцентном резонансном переносе энергии (ПШТ-эффекге) способ детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) и показать возможность его применения для фундаментальных и прикладных исследований;

2) разработать способ детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ, основанный на временном гашении свечения флуорохрома, находящегося с гасителем в одном праймере, и возникновении флуоресценции вследствие расщепления ам-шшкона термостабилыюй рестркшионной эндонуклеазой;

3) разработать основанный на ГККТ-эффекте способ детекции ампликонов в ходе ЛЦР-РВ, обеспечивающий отсутствие нематричного Актирования;

4) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов ДНК путем объединения технологии циклирующей пробы с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием множественных дезокснрибозимов 10-23;

5) разработать новый способ детекции ампликонов на платформе "УФА* в ходе двухпраймерной амплификации катящимся кольцом (рамификации) в реальном времени;

6) преобразовать гибриднзацнонную цепную реакцию нуклеиновых кислот в режим реального времени (ГЦР-РВ);

7) показать применимость разработанных методов амплификации и высокочувствительной детекции на практике.

Научная новизна и практическая значимость. Разработан улучшенный способ детекции накопления амплнконов в ПЦР-РВ на платформе "УФА", по большинству параметров превосходящий аналогичные методы. Показана применимость данного способа ПЦР-РВ для проведения как ДНК-диагностики, так и для фундаментальных исследований, где он может быть использован для определения уровня экспрессии генов, содержащих нитроны, а также безынтронных генов без ДНКазноЙ обработки. Разработан способ детекции амплнконов в ПЦР-РВ, основанный на временном гашении свечения флуорохрома, расположенного с гасителем в пределах одного прайм ера н возникновении флуоресценции вследствие их разобщения в процессе расщепления ампликона термостабильной рестриктазой TruI в ходе самой амплификации. Путем использования FRET-эффекта ЛЦР переведена в режим реального времени и при этом нематричное лнгнрование с помощью LiCi сведено к минимуму. Разработана ГЦР-РВ, основанная в варианте I на временном гашении свечения флуорохрома темповым гасителем, а вариант Ц рассчитан на эффект FRET. Продемонстрирована высокая специфичность данной реакции, позволяющая дискриминировать ииицизторные молекулы с единичными заменами нуклеотидов, что может быть использовано при анализе однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека. Показана возможность использования в ГЦР молекул РНК в качестве инициатора самосборки без их перевода в кДНК. Произведено объединение технологии амплификации ДНК катящимся кольцом с регистрацией этого процесса с помощью циклирующих проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов. Показано, что протекание двухпраймерной рамификации в реальном времени может контролироваться с помощью регистрации FRET-эффекта на платформе "УФА".

Практическая значимость работы заключается в значительном расширении спектра методов амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени специфичных последовательностей ДНК или РНК. Показана возможность их использования как для фундаментальных, так н прикладных целей, в том числе для детекции коронавируса, хантавируса, вируса птичьего гриппа субтипа H5N1, выявления генетически модифицированных ингредиентов (ГМИ) путем обнаружения наиболее часто используемого для создания трансгенных растений промотора 35S.

АтнюГтиия рдбаты. Материалы диссертации были представлены на П1 съезде ВОГиС (Москва, 2004), международном симпозиуме 'Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004), II и III съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005), 2-ой международной конференции "Внотехно-логня-Биомедицина-Окружающая среда" ([Тушино, 2005), 3-ей международной конференции "Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность" (Пущине, 2006), ХШ меяедукародной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), международной школе* конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (Уфа, 2006).

Конкурсная роддержка работы., Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ—НШ-2217.2003.4, НШ-1003.2006.4 и Государственных контрактов ФЦНТП Jfe№02.445.11.7018, 02.445.11.7381.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и нх обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 176 работ. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 53 рисунка и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служила искусственные молекулы ДНК (олиго-нуклеотиды) и РНК (рибоолигонуклеотиды), синтезированные методом фосфора* мидитного синтеза. 75 различных олигонуклеотидов длиной от 12 до 96 звеньев общей протяженностью свыше 2300 звеньев были синтезированы в ИБГ УНЦ РАН, в ЗАО "Синтол" (Москва) и НПО "Литех" (Москва). Часть из них имели различные модификации и несли различные флуорохромы, а также нх гасители, фосфатные и биотиновые группы. В работе также были использованы природные молекулы ДНК и РНК, имеющие вирусное происхождение (вирус птичьего гриппа

субтипа H5N1, хантавирус серотила PUU), бактериальное (ELcoM), растительное (табак) и животное (лосось, курица, человек) происхождение.

ДНК из разных биологических объектов выделяли классическим фенольно-детергентиым методом с перхлоратом натрия. РНК выделяли гуанидин тиоциа-натным методом. Плазм идную ДНК вьеделяли методом щелочного лизиса. Концентрацию РНК или ДНК в образцах определяли по оптической плотности на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio-Rod, США).

ГТЦР "по конечной точке" проводили & ДНК амшшфикаторе Терцик (ДНК-Технология, Россия). Амплификацию н высокочувствительную детекцию в реальном времени проводили в ДНК амплифнкагорах моделей iCycler iQ (Bio-Rad, США) и АНК-32 (ИАП РАН / ЗАО Синтол, Россия). При проведении изотермических реакций регистрация изменений флуоресценции раствора велась через равные промежутки времени, варьирующие в разных экспериментах от 10 до 60 сек.

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР-РВ, ЛЦР-РВ, ГЦР-РВ, а также рамификации проводили в 10 - 12%-ных полиакриламвдных гелях в приборе вертикального типа Minl-PROTEAN 3 (Bio-Rad, США). Анализ более крупных молекул РНК или ДНК, включая плазм иды, проводился в 1%-ном агарозном геле в приборе горизонтального типа Wide МЫ (Bio-Rad, США). По завершению электрофореза гель окрашивали бромвдом этидия и фотографировали в фотодокументационной системе Gel Camera System (UVP, Inc., США).Дпя олигонуклеотидов, несущих различные флуорохромы, а также ампликонов, полученных с их участием, перед окрашиванием сначала регистрировалась их собственная флуоресценция. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров и олигонуклеотидов проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR Inc. (США) и Oligo 4.1 (National Biosciences Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иолимеразная цепная реакция в реальном времени .

Поскольку ПЦР-РВ предназначена для выявления или количественной оценки тех или иных последовательностей ДНК или РНК, то размер целевых продуктов нет смысла делать большим, В разработанном нами варианте ПЦР-РВ раз-

мер ампликонов составляет всего 40 - 50 пн благодаря тому, что праймеры отжигаются встык или почти встык, что зависит от особенностей нуклеотнцных последовательностей а конкретном выбранном месте. Прн подборе праймеров учитывалась возможность включения в них внутренних меток в виде флуорохромов, представляющих или пару донор/акцептор или пару краситель/гаситель. Подход к про* ведению ПЦР-РВ с таким расположением внутренне меченных соответствующими флуорохромами прямого и обратного праймеров (рис.!) был назван "УФА" ("Универсальная Флуоресцентная Амплификация"), поскольку оказалось, что та* кой способ детекции флуоресценции, возникающей благодаря П^ЕТ-эффекту между донорным и акцепторным красителями, может быть использован и для других методов амплификации нуклеиновых кислот.

5"-.....>3'

^ г<........'жТ5'

»'-11^-.................ГГ>э

^.........^.........тг»-

Рис. 1. Схема ПЦР-РВ на платформе "УФА" с РКЕТ-эффектом между донорным (Р - РАМ) и акцепторным (К - КОХ) красителями. Волнистой стрелкой показан перенос энергии. Расходящиеся лучи от красителя-акцептора символизируют свечение

А Б

I:

I

.. 1

1 | /

1 1 > 1

"П 1

1

г *

! 1

1 у

4- 4-

У 1

- н- к -

■ « 4 « « .¡о м г* I* а •> ы'

Цили

Рис. 2. ПЦР-РВ на платформе "УФА". А - кривые роста флуоресценции. Б -электрофоретнческий анализ ампликонов. 1 - праймеры 1 и 2; 2 - праймеры 3 н 2 (положительно-отрицательный контроль); 3 - праймеры I и 2 без матричной ДНК (отрицательный контроль), М - маркерная ДНК

Праймеры на отрицательно-положительный контроль подбирались с таким расчетом, чтобы расстояние между красителем-донором и красителем-акцептором не позволяло бы произойти FRET, но при этом нарабатывался бы соответствующий ПЦР.продукт. На рис. 2А виден рост флуоресценции целевого продукта, ограниченного прайм ерами 1 и 2, и отсутствие аналогичного подъема для пары праймеров 3 и 2. Электрофоретмческнй контроль (рис. 2Б) показал, что основной целевой продукт, регистрируемый в ходе ПЦР-РВ, имеет ожидаемый размер в 42 пи, тогда как отрицательно-положительный контроль не показывал изменения сигнала флуоресценции во время ПЦР-РВ (рис. 2А), но при окрашивании бромистым этидием хорошо заметен.

Ввиду того, что не все ДНК амплификаторы с оптическим модулем рассчитаны на детекцию FRET-эффекта, нами был разработан вариант с гашением.флуоресценции красителя, входящего в состав одного из праймеров, соответствующим гасителем, находящимся в составе другого праймера (рис. 3 и 4).

, Рис. 3. Схема ПЦР-РВ с гашением флуо-' л."I"""" У""»' ресценции красителя универсальным га................... ^ 2 г сителем. Расходящиеся прямые лучи от

красителя-донора символизируют свечение, а волнистые лучи, исходящие от гасителя, обозначают выделение тепловой энергии

r-LLa^....»*

Рис. 4. Кривые изменения флуоресценции в варианте ПЦР-РВ с эффектом гашения. 1 - праймеры 3 и 2 (положительно-отрицательный контроль); 2 и 3 - праймеры 1 и 2 в присутствии ДНК-мишени, отличающейся по количеству на порядок

* Я О M «

tt к 1* 9 я

В расположении меченых флуорохромамн праймеров при отжиге на мишени в такой близости друг от друга при проведении варианта ПЦР-РВ с переносом энергии между ними на платформе "УФА" есть сразу несколько преимуществ.

Во-первых, такое расположение прайм еров обеспечивает возникновение РВЕТ-эффекта, ввиду того, что эффективность переноса обратно пропорциональна расстоянию между красителем-донором и краснтелем-акцеггтором а шестой степени и не может иметь место при расположении праймеров на некотором, и тем более, значительном удалении друг от друга.

Во-вторых, до минимума сокращается время, достаточное для удлинения прайм ера на требуемое количество нуклеотидов, и такой этап, как этап элонгации, становится не нужен, поскольку построение второй цепи ДНК успевает произойти полностью еще на этапе отжига ила в ходе повышения температуры для денатурации ампликонов, что приводит к заметной экономии времени.

В-третьих, из-за того, что целевой продукт имеет небольшой размер, существенно снижается температура денатурации, при которой цепи ампликона должны разойтись н стать новыми матрицами для отжига праймеров. И здесь есть сразу два важных момента. С одной стороны, это экономия времени вообще, так как переходы от одной температуры к другой не мгновении. Другим важным обстоятельством является сокращение времени пребывания ДНК полимеразы при неоптимальных для работы фермента температурах (повышенных) н тем самым продлевается время его жизни, обеспечивая в целом более надежную амплификацию.

В-четвертых, такое расположение праймеров способно обеспечить амплификацию довольпо коротких фрагментов или, точнее, обломков молекул ДНК или РНК, которые с большей вероятностью могут сохраняться в старых или подвергнувшихся сильному разрушительному воздействию образцах.

В-пятых, благодаря расположению праймеров встык (или почти встык), можно считать, что число значимых нуклеотидов, исходя из которых рассчитывается количество возможных комбинаций, увеличивается вдвое, и д тя двух праймеров по 20 звеньев оно становится равным 40, что при возведении четырех азотистых оснований в сороковую степень дает гептилион (1024) комбинаций. Тем самым обеспечивается высокая специфичность данного варианта ПЦР-РВ, поскольку случаи фалын-праймирования, вызванные отжигом па других местах, расположенных вплотную, сразу двух праймеров, "связанных" между собой эффектом переноса энергии, практически невозможны.

Что касается вероятного отжига праймеров самих на себя с образованием ге-теродимеров, между которыми возможен FRET, то это может быть легко обнаружено на стадии плавления образовавшихся ампликонов, где наличие пика с меньшей температурой плавления, чем целевой продукт, будет свидетельствовать об имеющей место неспецифичной ПЦР, однако подобное должно быть полностью исключено еще на этапах подбора праймеров и отработки метода с конкретной их нарой.

Еще один разработанный вариант ПЦР-РВ основан на временном гашении находящегося в составе одного праймера флуоресцентного красителя расположенным поблизости в нем же универсальным гасителем. Как можно видеть из приведенной на рис. 5 краткой схемы этой реакции, свечение красителя гасится универсальным гасителем до тех пор, пока не произойдет их физическое разобщение под действием термостабильной рестрикционной эндонуклеазы, расщепляющей возникающие в ходе ПЦР ее двуцепочечные сайты узнавания, нарушая тем самым целостность праймера, несущего краситель с гасителем. В данном случае расположение праймеров, как и в предыдущем варианте, встык друг к другу имеет под собой, помимо тех же причин в виде желаемого сокращения времени реакции и обеспечения амплификации деградированных фрагментов ДНК и РНК, еще к цель повысить тем самым специфичность реакции.

*----

т

л

„ ff—£—»- —^—. — -:

з —----* С « jî

Рис. б. Кривая роста флуоресценции в варианте ПЦР-РВ с расщеплением ампликонов термостабильной рестрикта-зой ТпЛ. 1 - в присутствии рестриктззы ТЫ I;

2 - в отсутствии рестриктазы ТпЛ.

Рис.5. Сокращенная схема ПЦР-РВ С термостабильной рестрикционной эндо-нуклеазой Тги\ и временным гашением свечения флуоресцентного красителя (Р) универсальным гасителем (О)

а и я h *

Представленная на рис. 6 кривая роста флуоресценции свидетельствует о происходящем расщеплении увеличивающегося числа ампликонов под действием термостабильной рестриктазы TruL Выбор фермента диктовался, в том числе, и узнаваемой им последовательнстью (для Trul - TVTAA), поскольку она не должна быть GC-богатой, чтобы не повлечь за собой заметное повышение температуры денатурации ампликонов.

Лягязиая цепная реакция в режиме реального времени

Для ЛЦР-РВ применяли два варианта детекции ампликонов, один из которых был основан на использовании шггеркалирующего красителя SYBR Green I, а второй - на возникновении FRET-сигнаяа между донориым и акцепторным красителями, входящими в состав соседних олигонуклеотидов, которые в результате ли-гирования становились цельной молекулой (рис.7). В первом случае (с SYBR Creen I) флуоресценция раствора измерялась при температуре, выше той, что достаточна для плавления одиночных дуплексов (неизбежно образующихся в каждом цикле) н ниже температуры плавления двойного дуплекса, составляющего целевой продукт. Плавление получившихся продуктов (рис. 8А) служило дополнительным контролем специфичности реакции, поскольку позволяло дискриминировать пики, принадлежащие одиночным и двойным дуплексам.

-±—г 3 ~ГТ--ГТУ -2.3-

г.

г у

1 1 4 „у Г-1-- * .....Г У " ; ï' i— -3 .

г .. -г S - t

-г у ■ ■ ■■■ >• » ¡

Рис. 7. Краткая схема ЛЦР-РВ с детекцией ампликонов с помощью FRET-сигнала. D • донорный краситель, А - акцепторный краситель. 1/4 и 2/3 - одиночные дуплексы, 1/4+2/3 - двойные дуплексы, представляющие собой целевой продукт

Регистрация роста флуоресценции в варианте с FRET (рис,8Б) велась при температуре, при которой происходила денатурация, в том числе, и двойных дуплексов, что исключало вероятность возникновения сигнала в результате простого

отжига соседних олигоиуклеотидов на мишени, не сопровождающегося .цитированием ввиду неспаривания нуклеотидов в месте образования ника.

А Б

:i»:ti 9:..........................

iliiiiiiii^iisiiii^iiiiiiiiiliiiisäiä

Рис. S. Типичные профили плавления (А) при проведении ЛЦР-РВ, основанной на использовании интеркалирующего красителя SYBR Green I и кривые роста флуоресценции (Б) в ЛЦР-РВ, основанной на FRET-эффекте.

Определенную проблему при проведении ЛЦР представляет собой нематричное лнгирова!ше по тупым концам одиночных дуплексов, которое было сведено к минимуму путем добавления в лигазную смесь хлористого лития.

Амплификация по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным растеплением химерной пробы

Объединение технологий циклирующей пробы и молекулярного сигнального огня, совмещенные с амплификацией по типу катящегося кольца, позволяет успешно детектировать однонуклеотидный полиморфизм, но при этом необходимо участие трех ферментов - ДНК ли газы, обеспечивающей дискриминирующее ли-гирование кольцевой матрицы ("С-пробы") на анализируемом (искомом) фрагменте ДНК; ДНК полпмеразы со смещающей старую цепь ДНК активностью; РНКазы Н, разрушающей молекулярные сигнальные опш, представленные рибобиконамн. Последний фермент может быть заменен дезоксирибозимом, возникающим в ходе смещения цепи ДНК, поскольку сконструированная С-проба содержит в своем составе, помимо участков для отжига искомой последовательности ДНК и участка для отжига удлиняющегося праймера, еще и антисенс-последовательность дезок-сирибозима 10-23. Важным преимуществом замены РНКазы Н дезоксирибозимом является то, что в первом случае количество фермента в холе реакции остается неизменным, и активность его может только падать, тогда как при изотермической

амплификации по типу катящегося кольца с образованием длинной цепи одноце-почечной ДНК на неб через равные промежутки формируются все новые дезокси-рибозимы, служащие одновременно и местами отжига гибрцдизацнонных цикли-рующих проб в виде меченных флуорохромом и соответствующим ему гасителем химерных ДНК/РНК/ДНК-олигонуклеотядов (рис. 9).

"Серова

^^ май ^^

Рис. 9. Краткая схема технологии цнклирующей пробы, совмещенной с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием функциональных дезоксирибозимов 10-23

На рис. 10 представлена кривая роста флуоресценции, возникающей за счет разрушения химерных проб и физического разобщения красителя с гасителем, типичная для всех опробованных температурных и концентрационных условий, поскольку дезоксирибозим способен проявлять свою каталитическую активность в широком диапазоне.

11« I »1* 1}Н 1* МНЙЯНЯ пях ■

од

Рис. 10. Кривая роста флуоресценции в технологии циклирующей пробы, совмещенной с амплификацией катящимся кольцом с образованием функциональных дезоксирибозимов. 1 - лнгированная С-проба; 2 - линейная С-проба

Рамификация в реальном времена

Значительный интерес представляет реакция рамификации, где наличие двух праймеров, обеспечивает экспоненциальное накопление разветвленных продуктов такой реакции. С этой цепью была синтезирована соответствующая С-проба, которая несла участки для отжига искомой последовательности ДНК, участок для отжига первого прайм ера и участок, представляющий собой хопию второго прайм ера, на котором он мог отжигаться только после появления в реакционной смеси смещенной цепи ДНК, комплементарной исходному олигонуклеотиду. Для регистрации амплификации молекул ДНК, оба праймера были помечены флуоресцентными красителями FAM и ROX, составляющими под донор/акцептор и позволяющими давать FRET-сигнал. Причем, для обеспечения переноса энергии расположение праймеров и красителей в них соответствовало принципу "УФА", подтверждая тем самым его универсальность.

Из приведенной на рис. НА краткой схемы процесса рамификации видно, что по мере удлинения новой цепи ДНК образуется все большее число мест для отжига второго праймера, смещающего встречающиеся ему на пути вторичные цепи ДНК с таких же вторых праймеров, отжегшихся ранее, образуя фрагменты первичной С-пробы. В свою очередь, на этих образующихся фрагментах опять возникают множественные места отжига для первых праймеров, которые также удлиняются, смещая отжегшиеся ниже в направлении 5'—»-3'. Таким образом, в процессе рамификации в реакционной смеси постоянно присутствует довольно сложная смесь как одно- и двуцепочечных фрагментов ДНК, так и частично одно-цепочечных, частично двуцепочечных.

Проведенный электрофоретичесхий анализ продуктов реакции рамификации (рис. 11Б) показывает довольно сложную, но ожидаемую картину с наличием характерной "лестницы" полос ДНК. При этом в силу специфики рамификации, непременным условием шторой является смещение цепей ДНК, не все праймеры образуют места, где происходит FRET, что можно видеть из принципиальной схемы этой реакции. Тем не менее, образующихся конечных продуктов вкупе со временно

существующими промежуточными полупродуктами, где также возникает №ЕТ-эффект, вполне достаточно дня регистрации подъема флуоресценции раствора.

А

Б

спэкигмишеми

~гг

отжиг лраЯмра I ДНК пшымервэа

ваежГ

отжиг пршАмвра 2, V [х* 1 1 '

сиеи^ине цепей

ДНК I поряди О,'

ХИКП порядка, Т \ ____

отжиг сперсйноА Ч А— - ~**г

порции праЯнерое

Рис. 11. Рамификация. А - краткая схема рамификации в реальном времени. Б - электрофорез продуктов рамификации. I - линейная С-проба; 2 - олигонук-леотид, имитирующий искомый фрагмент ДНК; 3 - праймер 1 с красителем-донором; 4 - праймер 2 с красителем-акцептором; 5 и б - продукты рамификации, отличающиеся различным количеством олигонуклеотида 2

Гибрнднзяционияя цепная реакция в реальном времени

Движущей силой ГЦ? является временно сокрытая энергия, заключенная в особым образом сконструированных олигонуккеотидных наноструктурах, представляющих собой шпильки с верхушечной петлей, двуцепочечным стержнем и одноцепочечным участком. В обычных условиях данные олигонуклеотидные конструкции стабильны и в отсутствии инициаториой молекулы не вступают в реакцию гибридизации. Однако стоит только появиться молекуле-инициатору в виде искомой последовательности нуклеиновых кислот, как шпильки раскрываются и начинает происходить рост цепей ДНК.

Теоретически потенциал ГЦР для целей ДНК и РНК диагностики весьма велик и мы посчитали возможным усовершенствовать эту реакцию путем перевода ее в режим реального времени (ГЦР-РВ), где детекция роста цепей ДНК может вестись по увеличивающейся флуоресценции соответствующего красителя за счет исчезновения эффекта гашения, что будет иметь место при пошаговом удлинении

целей ДНК и разнесении за счет этого в пространстве пары молекул флуоро-хром/гаситель. С этой целью нами были синтезированы соответствующие модифицированные олигонуклеотиды с парой РАМ/ОаЬсу! (рис. 12), а также различные вариант» нннциаторных молекул, включая более протяженные по длине, что имитировало случайно фрагментированйую ДНК.

Рис. 12. Шпилечные наноструктуры для ме-гттттттттттт-гтттттг^у года ГЦР-РВ. Р - флуоресцентный краситель,

*"** О - универсальный гаситель. Комплементар-

ные друг другу блоки нуклеотидов показаны ут.тттттмттттТтттттт! гт^у комллементирующимисимволами а исядоа

Проведенные эксперименты показали успешное преобразование ГЦР а ГЦР-РВ, Так, на рис. 13А можно видеть характерную кривую, свидетельствующую об увеличении свечения красителя, нарастающего в ходе реакции по мере того как все большее число шпилек оказывается вовлечено в построение цепей ДНК. При этом рост флуоресценции не наблюдался в реакционной смеси, где присутствовали одни шпильки без инициаторной ДНК.

* » «

Рис. 13. ГЦР-РВ с эффектом дегашения флуоресценции. А - кривая роста флуоресценции. 1 - образец; 2 - отрицательный контроль (без инициатора). Б - элек-трофоретический контроль продуктов, образовавшихся в ходе ГЦР-РВ со шпильками, самосборка которых инициируется геном нуклеокапсидного белка хантавнруса. 1. шпилька а; 2. шпилька Ь; 3. шпильки а и Ь; 4. шпильки а и Ь в присутствии одноцепочечной ДНК фрагмента гена нуклеокапсидного белка ха-натвируса; 5. шпильки а и Ь в присутствии чужеродной одноцепочечной ДНК

Электрофоретический анализ (рис. 13Б) подтвердил рост наиоконструкций и отсутствие такового в образцах без инициатора. Присутствие неспецифической ДНК также не запускало процесс самосборки.

Другое свидетельство высокой специфичности ПДР было получено путем опробования различных олигонуклеотидов, отличающихся от полностью комплементарного заменами отдельных оснований или делениями, на предмет их способности служить инициагорной молекулой, но ни один из них в таком качестве себя не проявил (рис. 14).

А Б

АСТСТАСОАТТССССйТСССТТАА ДСТСХАвСЯТТСТСССТСОСТТАЯ СААСТСТАйОАААССССаГОССТТАА

1 2

3

4

5 аи«ЖГГА6СДТТСЯАСеТ066Т1АА

6 адагстлвздхт—<зссгсссттаа

7 СААСТСТАССАТТ-ССССТСССТТАА

Рис. 14. Дискриминирующие способности ГЦР, обеспечивающие детекцию од-нонуклеотидкого полиморфизма. А • кривые флуоресценции. Б • Инициатор-ные олигонуклеотнды. Подчеркивания и дефисы обозначают замены и делеции нуклеотидов

Исходя из описанного выше принципа расположения комплементарных участков были сконструированы наноструктуры с другими нуклеотвдными последовательностями, включая пару КОХЛЗаЬсуЬ В качестве инициаторной молекулы был взят клонированный фрагмент гена нуклеокапсидного белка хантавируса. Еще один комплект таких олигонуклеотидных шпилек, несущих пару краситель/гаситель • Н.60/ВН<31, и инициаторный олигонуклеотид к ним были изготовлены для детекции корокавируса. И те, и другие показали в целом типичное протекание ГЦР-РВ. Также были сконструированы варианты шпилек, отличающиеся местом расположения флуорохромов, что обеспечивало более заметное дегашение флуоресценции в ходе ГЦР-РВ. в продолжение экспериментов на специфичность ГЦР, хотя и уже с Другой целью, была успешно осуществлена мультиплексная

ГЦР-РВ, где велась одновременная детекция увеличения свечения обоих красителей БАМ и КОХ, что свидетельствовало о независимом росте обеих наноструктур.

кул РНК в их ДНК-копию, поскольку нет препятствий к образованию ДНК/РНК-гетеродуплексов. При этом нами в качестве иннциаторной молекулы вместо природной РНК был использован специально химически синтезированный рибооли-гонуклеотид, также обеспечивший самосборку с характерной кривой роста флуоресценции.

Более перспективным является использование ГЦР-РВ, основанной на РКЕТ-эффекте. С этой целью нами были сконструированы и синтезированы новые олигонуклеотндные шпильки, где одна из них в своей последовательности несла краситель-донор, а вторая - краситель-акцептор.

Как можно видеть из схемы ГЦР-РВ с использованием ИШТ-эффекта, приведенной на рис. 15, в процессе самосборки олнгонуклеотидных шпилек донорные и акцепторные красители оказываются друг от друга на достаточно близком расстоянии, обеспечивающем перенос энергии, тогда как отдельные шпильки, не вовлеченные в цепную реакцию, вклада в регистрируемое свечение не вносят.

щДНКнляРНК + _

Рис. 15. Схема ГЦР-РВ с НШТ-эффекгом. О • краситель-донор, А - краситель-

акцептор

В случае проведения ГЦР-РВ, основанной на ПШГ-эффекте, непосредственно в самом ДНК амплифик агоре может быть обеспечен единый для всех образцов старт этой реакции путем нагрева реакционной смеси до температуры, при ко-

Следует отметить, что для запуска ГЦ? нет необходимости переведа ыоле-

торой произойдет полная денатурация успевших собраться цепей ДНК, и исчезнет возникший ПШГ-сигнал. При снижении температуры реакции до оптимальной для самосборки, этот процесс запустится заново сам собой при условии присутствия в образце инициаторных последовательностей (рис. 16).

ч к « я

Рис. 16. Кривые роста флуоресценции в ГЦР-РВ, основанной на ПЮТ-эффекте. 1 и 2 - разные количества инициаторных молекул, отличающиеся на порядок; 3 - то же что и 2, но с добавлением чужеродной денатурированной ДНК; 4,5 и б - с отсутствием инициатора, при этом в 5 образце присутствует чужеродная денатурированная ДНК, а в б - чужеродная РНК

На основе разработанных в рамках данной работы методов амплификации и. высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в режиме реального времени были созданы соответствующие системы праймеров и олигонуклесгщдных конструкций, пригодные для выявления и анализа промоторов, генов, йх транскрипционных продуктов, прочих участков в геномах организмов различной сложности, среди которых РНК-содержащие хантави-рус к коронавирус, агробактерия, трепонема, ГМИ, Д НК человека и др.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны два скоростных и высокочувствительных способа детекции амшшко-нов в пояимеразной цепной реакции в реальном времени, одни из которых основан на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) между донорным и акцепторным красителями, входящими в состав прямого и обратного праймеров, отжигающихся встык; второй способ рассчитан на эффект гашения фпуорохрома соответствующим гасителем, входящих в состав разных праймеров, отжигающихся аналогичным образом.

2. Разработаны варианты лигазной цепной реакции в реальном времени, основанные как на FRET-эффекте, так и на использовании ннтеркалирующего красителя SYBR Green I, в которых нематричное литерование благодаря присутствию LICI сведено к минимуму.

3. Произведено объединение технологии амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с регистрацией этого процесса в реальном времени с помощью цитирующих химерных ДНК/РНК/ДНК-проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибознмов.

4. Предложен способ детекции в реальном времени протекания реакции рамификации (двухпраймерной амплификации катящимся кольцом), основанный на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА".

5. Разработало 2 варианта метода гибрндиэационной цепной реакции в реальном времени (ГЦР-РВ), особенностями которой является то, что она протекает изотермически, без участия ферментов и в ней происходит не амплификация нуклеиновых кислот, а под действием ннидиаторных (искомых) молекул ДНК или РНК имеет место способный дискриминировать в последователыюсти-мишени даже единичные замены нуклеотидов линейный рост олигонуклеотидных наноструктур, собираемых из пары особым образом сконструированных шпилек:

- вариант I ГЦР-РВ основан на детекции увеличивающейся флуоресценции соответствующего красителя за счет исчезновения эффекта гашения, происходящего при пошаговом удлинении цепей ДНК и разнесении за счет этого в пространстве вое большего числа пар молекул флуорохром/гаснтель, оба из которых находятся в одной из самособирающихся олигонуклеотидных шпилек;

- вариант II ГЦР-РВ рассчитан на детекцию роста цепей ДНК по увеличению свечения красителя-акцептора после переноса на него флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора, входящих по отдельности в состав пары подобных олигонуклеотидных шпилек, также подверженных процессу самосборки.

6. Показана принципиальная возможность применения ряда разработанных подходов для высокочувствительной диагностики возбудителей различных инфекций и детекции генетически-моднфицнрованных ингредиентов, а также для анализа активности транскрипции как безынтронных, так и содержащих интроиы генов.

2t

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Чемерис ДА., Гарафутдинов P.P., Малеев Г.В., Алексеев ЯЖ, Вахигов ВА. Лигазная цегтая реакция в режиме реального времени • новая жизнь старой реакции и ее применение для детекции специфических фрагментов ДНК или РНК // Материалы П съезда Общества бнотехнологов России. Москва, 2004. - С. 15-16.

2. Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Гарафутдинов Р.Р., Малеев Г.В., Чемерис ДА., Вахитов ВА. Детекция специфичных фрагментов ДНК в молекулярно-генетических исследованиях н при анализе продуктов на ГМО. Новое в реал-тайм ДНК амплификации Ц Материалы Ш съезда ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития". Москва, 2004. - С. 482.

3. Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Чемерис ДА., Гарафутдинов P.P., Малеев Г.В., Алексеев Я.И., Вахитов В-Л. Лигазная цепная реакция в реальном времени и ее использование для детекции ГМИ // Материалы Международного симпозиума "Трансгенные растения и проблемы бнобеэопасности". Москва, 2004. - С. 112.

4. Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Вахитов В. А, Чемерис ДА, Жукова ИJO., Та-липов Р.Ф., Гарафутдинов P.P., Малеев ГЛ., Магазова РА., Вахитова Ю.В., Ги-малов Ф.Р. Способ амплификации с помощью лигазной цепной реакции специфических фрагментов ДНК или РНК и их детекция в режиме реального времени //Заявка на патент РФ №2003127702 от 15.09.2003 г„ опубликована 10.04.2005.

5. Чемерис АЛ, Никоноров Ю.М., Романенкова МЛ., Чемерис ДА., Гарафутдинов P.P., Малеев Г.В., Алексеев ЯЛ., Вахитов В А. Лигазная цепная реакция в реальном времени как альтернатива ПЦР в ДНК-диагностике. Новая жизнь старой реакции // 2-ая Международная конференция "Биотехиология-Биомедицина-Окружающая среда". Пущино, 2005. - С, 111-113.

6. Чемерис AB., Бикбулатова С.М., Чемерис ДА, Вахитов В А, Новая старая ДНК //Уфа, 2005.143 С.

7. Гарафутдинов P.P., Никоноров Ю.М., Чемерис ДА., Постригань B.I-L, Филатова О.В., Талипов Р.Ф., Чемерис AB., Вахитов В А. Объединение технологий циклической пробы и молекулярного сигнального огня для детекции однонуклеотид-иых замен в режиме реального времени // Материалы III съезда Общества бнотехнологов России. Москва, 2005, - С. 12-13.

8. Никоноров Ю.М., Чемерис ДА., Гарафутдинов PJ*., Романенкова МЛ., Малеев

Г.В., Чемерис A3., Вахитов ВА. Новые методы улучшенной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК в режиме реального времени с помощью ценных реакций нуклеиновых кислот • полимеразной (ПЦР), липовой (ЛЦР) и гибридизационной (ГЦР) // Материалы Ш съезда Общества биотехнологов России. Москва, 2005.-С. 19-20.

9. Чемерис A3., Никонорое Ю.М., Ромаиенкова MJL, Чемерис ДА, Гарафутдинов Р.Р, Магаэова РА., Малеев ГА., Вахитов ВА-, Василов РР. Способ детекции специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Заявка на патент РФ № 2005132940 от 26.1OJ2O05 г.

Ю.Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Чемерис ДА., Гарафутдинов Р.Р., Ромаиенкова МЛ., Матниязов Р.Т., Гималов Ф.Р., Малеев Г.В., Вахитов В А. ПЦР, ЛЦР и ГЦР - цепные реакции нуклеиновых кислот в режиме реального времени Н Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. 2005. - Том 1,№2. - С. 5-14.

11 .Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Чемерис ДА., Ромаиенкова MJI., Матниязов Р.Т., Князев A3., Гималов Ф.Р., Вахитов ВА. Детекция в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью основанных на FRET-эффекте полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций // Третья международная конференция из серии Наука и бизнес Международное сотрудничество в биотехнологии: Ожидания и реальность. Пущине, 2006. С. 77-80.

12.Чемерис ДА„ Ромаиенкова МЛ., Матниязов Р.Т. Использование основанных на эффекте переноса флуоресцентной резонансной энергии полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций для детекции в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК // Международная школа-конференция молодых ученых "Биотехнология будущего" Санкт-Петербург, 2006. С. 97-99.

13,Чемерис ДА. Гибридизацнонная цепная реакция (ГЦР) в реальном времени, основанная на эффекте флуоресцентного резонансного переноса энергии // Сборник тезисов ХШ международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" М., 2006. С. 24-25.

14.Ромаиенкова МЛ., Никоноров Ю.М., Чемерис ДА, Чемерис A3, ТуЙгунов М.М., Вахитов В А Полимер азная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) в диагностике геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом". Уфа, 2006. С.83-88.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт»-», заказ № 92, тираж 100 игг, 450054, пр. Октября, 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чемерис, Дмитрий Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК.

1.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ

1.3. Лигазная цепная реакция - ЛЦР.

1.4. Амплификация смещением цепи - Strand Displacement Amplification (SDA).

1.5. Амплификация по типу катящегося кольца или рамификация

1.6. Технология циклирующей пробы.

1.7. Гибридизационная цепная реакция - ГЦР.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Фосфорилирование олигонуклеотидов.

2.3. Выделение и очистка нуклеиновых кислот.

2.4. Получение кДНК.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

2.7. Лигазная цепная реакция в реальном времени с красителем SYBR Green 1.

2.8. Лигазная цепная реакция, основанная на FRET-эффекте, в режиме реального времени.

2.9. Проведение амплификации по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы в реальном времени.

2.10. Рамификация в реальном времени.

2.11. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени.

2.12. Электрофоретический анализ ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот.

2.13. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.14. Использованные в работе обычные и модифицированные олигонуклеотиды.

2.15. Основные реактивы, использованные в работе.

2.16. Составы использованных стандартных растворов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

3.2. Лигазная цепная реакция в реальном времени.

3.3. Амплификация по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы.

3.4. Рамификация в реальном времени.

3.5. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени.

3.6. Применимость реакций амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени для фундаментальных исследований и диагностических целей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изотермические и управляемые сменой температур реакции амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени"

Актуальность темы. После своего появления в середине 80-х гг. полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Saiki et al., 1985; 1988] очень быстро стала по существу методом №1 в фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике. Оставаясь таковым и поныне, она все же сильно изменилась, что в первую очередь связано с переводом этой реакции в режим реального времени, где детекция накопления ампликонов ведется в ходе самого процесса амплификации. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) во многом изменила взгляды как исследователей, использующих метод ПЦР для получения новых знаний о функционировании генов и геномов, так и тех, кто занят исключительно ДНК-диагностикой. Если для первых главным среди других задач является возможность количественного определения с помощью ПЦР-РВ числа копий той или иной мишени в стартовом материале, то вторые, помимо этого, отдают ей предпочтение еще и ввиду практически полного исключения загрязнения ампликонами рабочих помещений и сведения, таким образом, риска получения ложнопозитивных результатов к абсолютному минимуму, что при массовом характере анализов при использовании обычной ПЦР удается добиться далеко не всегда. Однако, несмотря на большое количество предложенных вариантов детекции ампликонов в ПЦР-РВ [Higuchi et al., 1993; Lee et al., 1993; Livak et al., 1995; Tyagi et al., 1996; 2000; Nazarenko et al., 1997; 2002; Wittwer et al., 1997; 2003; Whitcombe et al., 1999; Todd et al., 2000; Rasmussen et al., 2003; Zhang et al., 2003; Costa et al., 2004; Sherrill et al., 2004; Monis et al., 2005 и др.] остается возможность разработки новых способов, по некоторым параметрам превосходящих существующие.

Вслед за ПЦР на рубеже 90-х гг. появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК, среди которых можно отметить лигазную цепную реакцию (ЛЦР) [Wu, Wallace, 1989; Barany 1991], амплификацию смещением цепи [Walker et al., 1992], ее разновидность в виде амплификации катящимся кольцом [Lizardi et al., 1998; Zhang et al., 1998], технологию циклирующей пробы [Duck et al., 1990], самоподдерживающаюся репликацию [Kwoh et al., 1989; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991], QP-репликазную амплификацию [Lomeli et al., 1989], разветвленную гибридизационную пробу [Urdea, 1987; Horn et al, 1997]. К настоящему времени большинство из них переведены в передовой и наиболее удобный для диагностики режим реального времени, однако в ряде случаев такой перевод оказался не очень эффективным и не лишенным серьезных недостатков.

Особый интерес эти реакции вызывают еще и тем, что все они (за исключением стандартной ПЦР и ЛЦР) протекают в изотермических условиях, благодаря чему нет потерь времени на смену температур и за счет этого не происходит искусственного сдерживания работы ферментов, что в ряде случаев более технологично.

Цели и задачи исследования. Цели исследования заключались в разработке новых вариантов управляемых сменой температур или протекающих изотермически в режиме реального времени реакций амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот и демонстрации их применения на практике.

В задачи исследования входило:

1) разработать основанный на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET-эффекте) способ детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) и показать возможность его применения для фундаментальных и прикладных исследований;

2) разработать способ детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ, основанный на временном гашении свечения флуорохрома, находящегося с гасителем в одном праймере, и возникновении флуоресценции вследствие расщепления ампликона термостабильной рестрикционной эндонуклеазой;

3) разработать основанный на ЕКЕТ-эффекте способ детекции ампликонов в ходе ЛЦР-РВ, обеспечивающий отсутствие нематричного лигирования;

4) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов ДНК путем объединения технологии циклирующей пробы с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием множественных дезоксирибозимов 10-23;

5) разработать новый способ детекции ампликонов на платформе "УФА" в ходе двухпраймерной амплификации катящимся кольцом (рамификации) в реальном времени;

6) преобразовать гибридизационную цепную реакцию нуклеиновых кислот в режим реального времени (ГЦР-РВ);

7) показать применимость разработанных методов амплификации и высокочувствительной детекции на практике.

Научная новизна и практическая значимость. Разработан улучшенный способ детекции накопления ампликонов в ПЦР-РВ на платформе "УФА", по большинству параметров превосходящий аналогичные методы. Показана применимость данного способа ПЦР-РВ для проведения как ДНК-диагностики, так и для фундаментальных исследований, где он может быть использован для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны, а также безынтронных генов без ДНКазной обработки. Разработан способ детекции ампликонов в ПЦР-РВ, основанный на временном гашении свечения флуорохрома, расположенного с гасителем в пределах одного праймера и возникновении флуоресценции вследствие их разобщения в процессе расщепления ампликона термостабильной рестриктазой Тги! в ходе самой амплификации. Путем использования РКЕТ-эффекта ЛЦР переведена в режим реального времени и при этом нематричное лигирование с помощью 1ЛС1 сведено к минимуму. Разработана ГЦР-РВ, основанная в одном варианте на РЯЕТ-эффекте, а во втором - на эффекте временного гашения свечения флуорохрома темновым гасителем. Продемонстрирована высокая специфичность данной реакции, позволяющая дискриминировать инициаторные молекулы с единичными заменами нуклеотидов, что может быть использовано при анализе однонуклеотидного полиморфизма ДНК человека. Показана возможность использования в ГЦР молекул РНК в качестве инициатора самосборки без их перевода в кДНК. Произведено объединение технологии амплификации ДНК катящимся кольцом с регистрацией этого процесса с помощью циклирующих проб, расщепляемых под действием образующих при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов. Показано, что протекание двухпраймерной рамификации в реальном времени может контролироваться с помощью регистрации FRET-эффекта на платформе "УФА".

Практическая значимость работы заключается в значительном расширении спектра методов амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени специфичных последовательностей ДНК или РНК. Показана возможность их использования как для фундаментальных, так и прикладных целей, в том числе для детекции коронавируса, хантавируса, вируса птичьего гриппа субтипа H5N1, выявления генетически модифицированных ингредиентов (ГМИ) путем обнаружения наиболее часто используемого для создания трансгенных растений промотора 35S. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде ВОГиС (Москва, 2004), международном симпозиуме "Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004), II и III съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005), 3-ей международной конференции "Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность" (Пущино, 2006), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (Уфа, 2006).

Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ -НШ-2217.2003.4, НШ-1003.2006.4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№02.445.11.7018,02.445.11.7381.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 176 работ. Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 53 рисунка и 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чемерис, Дмитрий Алексеевич

выводы

1. Разработаны два скоростных и высокочувствительных способа детекции ампликонов в полимеразной цепной реакции в реальном времени, один из которых основан на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) между донорным и акцепторным красителями, входящими в состав прямого и обратного праймеров, отжигающихся встык; второй способ рассчитан на эффект гашения флуорохрома соответствующим гасителем, входящих в состав разных праймеров, отжигающихся аналогичным образом.

2. Разработаны варианты лигазной цепной реакции в реальном времени, основанные как на FRET-эффекте, так и на использовании интеркалирующего красителя SYBR Green I, в которых нематричное лигирование благодаря присутствию LiCl сведено к минимуму.

3. Произведено объединение технологии амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с регистрацией этого процесса в реальном времени с помощью циклирующих химерных ДНК/РНК/ДНК-проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных д езоксирибозимов.

4. Предложен способ детекции в реальном времени протекания реакции ратификации (двухпраймерной амплификации катящимся кольцом), основанный на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА".

5. Разработано 2 варианта метода гибридизационной цепной реакции в реальном времени (ГЦР-РВ), особенностями которой является то, что она протекает изотермически, без участия ферментов и в ней происходит не амплификация нуклеиновых кислот, а под действием инициаторных гj искомых) молекул ДНК или РНК имеет место способный дискриминировать в последовательности-мишени даже единичные замены нуклеотидов линейный рост олигонуклеотидных наноструктур, собираемых из пары особым образом сконструированных шпилек:

- вариант I ГЦР-РВ основан на детекции увеличивающейся флуоресценции соответствующего красителя за счет исчезновения эффекта гашения, происходящего при пошаговом удлинении цепей ДНК и разнесении за счет этого в пространстве все большего числа пар молекул флуорохром/гаситель, оба из которых находятся в одной из самособирающихся олигонуклеотидных шпилек;

- вариант II ГЦР-РВ рассчитан на детекцию роста цепей ДНК по увеличению свечения красителя-акцептора после переноса на него флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора, входящих по отдельности в состав пары подобных олигонуклеотидных шпилек, также подверженных процессу самосборки.

6. Показана принципиальная возможность применения ряда разработанных подходов для высокочувствительной диагностики возбудителей различных инфекций и детекции генетически-модифицированных ингредиентов, а также для анализа активности транскрипции как безынтронных, так и содержащих интроны генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время практически ни одна работа в молекулярной биологии, где объектами исследований являются нуклеиновые кислоты, не обходится без этапа их амплификации или высокочувствительной детекции. Что касается диагностических анализов, то и они сейчас преимущественно рассчитаны на амплификацию, главным образом, с помощью ПЦР специфичных фрагментов ДНК или РНК, которые могут принадлежать организмам всех уровней сложности, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Причины столь широкого применения таких методов заключаются, с одной стороны, в скорости и относительной простоте амплификации фрагментов нуклеиновых кислот, а с другой - в их повышенной чувствительности и специфичности, благодаря чему экспериментаторы в короткие сроки могут получать достоверные результаты. Новый импульс ДНК/РНК амплификации придал перевод ПЦР в режим реального времени, который открыл новые перспективы в фундаментальных исследованиях и предоставил новые возможности для диагностики. При этом вариантов детекции накопления ампликонов в ПЦР в режиме реального времени разработано в мире уже свыше трех десятков, но лишь на основе только шести из них выпускаются коммерческие наборы. Повышенный интерес к амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот и разработке все новых их способов объясняется еще и тем, что это в настоящее время многомиллиардный и быстро растущий бизнес.

В данной работе предложены два скоростных варианта детекции целевых продуктов с помощью ПЦР-РВ на платформе "УФА", особенностью которой является максимально сближенное расположение прямого и обратного праймеров, дающее целый ряд преимуществ. В одном варианте прямой и обратный праймеры содержат в своем составе красители - донор и акцептор, что обеспечивает возникновение между ними Р11ЕТ-сигнала. Во втором варианте прямой и обратный праймеры несут краситель и его гаситель, что ведет к возникновению эффекта гашения при их объединении в едином двуцепочечном ампликоне. Другим преимуществом является то, что благодаря малому размеру ампликонов становится возможна амплификация мелких обломков молекул ДНК или РНК, отсутствует необходимость проведения отдельной стадии элонгации, что приводит к заметному сокращению времени реакции, а снижение температуры денатурации обеспечивает в целом более надежную амплификацию, поскольку уменьшается время пребывания ДНК полимеразы при высоких (не оптимальных) температурах. Весьма важным является то, что ПЦР-РВ на платформе "УФА" представляет собой реакцию с неким самоконтролем специфичности амплификации, поскольку позволяет на стадии плавления идентифицировать образование возможных праймерных гетеродимеров, которые могли бы привести к ложно-позитивным результатам.

Сближенное расположение праймеров было использовано также при разработке варианта детекции накопления ампликонов в ходе ПЦР-РВ, где изначально имеющий место эффект гашения исчезал благодаря физическому разобщению (под действием термостабильной рестриктазы) входящих в состав одного из праймеров красителя и гасителя, между которыми располагался сайт узнавания этого фермента.

Перевод ПЦР в режим реального времени не мог не повлиять на уже существующие и только разрабатываемые реакции амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот. Так, для исследуемых, в том числе, в данной работе однопраймерной и двупраймерной амплификаций катящимся кольцом ранее уже было предложено несколько вариантов детекции результатов в реальном времени. Предлагаемые нами способы детекции принципиально иные. В одном из них рост флуоресцентного сигнала обеспечивается путем образования множественных дезоксирибозимов и разрушения ими химерных ДНК/РНК/ДНК-проб, содержащих краситель с гасителем. В другом - изменение флуоресценции реакционной смеси вызывается переносом флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора на краситель-акцептор, входящих в состав двух праймеров, которые отжигались на "С-пробе" встык согласно разработанному нами принципу "УФА", подтверждая тем самым его действительную универсальность.

ЛЦР преобразована в режим реального времени путем детекции накопления ампликонов в одном варианте с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I при температуре, при которой одиночные дуплексы плавятся, а двойные дуплексы, представляющие собой целевой продукт, сохраняют свою двуспиральность. Другой вариант детекции основан на FRET-эффекте между красителем-донором, которым изначально был помечен один из олигонуклеотидов, и красителем-акцептором, входящим в состав соседнего олигонуклеотида, когда в результате происходящего матричного лигирования под действием термостабильной ДНК лигазы они становились единой молекулой. При этом регистрация флуоресценции велась при температуре денатурации, исключающей вклад отжегшихся, но непролигировавших олигонуклеотидов. Неспецифическое нематричное лигирование было сведено к минимуму добавлением в реакционную смесь хлористого лития.

Для ГЦР нами также предложены два варианта ее протекания в реальном времени. В одном из них ведется регистрации флуоресценции, возникающей вследствие исчезновения эффекта гашения при разнесении в пространстве пары молекул - флуорохром/гаситель, входящих в состав одного из шпилечных олигонуклеотидов. Во втором - за счет FRET-эффекта между донорным и акцепторным красителями, входящими по отдельности в состав пары подобных шпилек, подвергающихся самосборке. Поскольку ГЦР протекает без участия каких-либо ферментов и в ней происходит рост наноструктур, то ее вполне можно считать нанобиотехнологией.

Показано применение разработанных нами методов для детекции в реальном времени возбудителей вирусных и бактериальных инфекций, оценки уровня экспрессии отдельных генов у растительных и животных организмов, а также для анализа однонуклеотидного полиморфизма ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чемерис, Дмитрий Алексеевич, Уфа

1. Белохвостов А.С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1995. - №1, - С.21-26.

2. Гарафутдинов P.P. Новые методы детекции однонуклеотидных замен и общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодирования: Автореф. дисс. канд. биол. наук / P.P. Гарафутдинов; Инст-т биохим. генет. УНЦ РАН Уфа, 2006. - 23 с.

3. Лысов Ю.П., Флорентьев В.Л., Хорлин А.А. и др. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод // ДАН СССР. 1988. - Т.303. - С.1508-1511.

4. Abravaya К., Carrino J. J., Muldoon S. Lee H.H. Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR) // Nucleic Acids Res. 1995. -V. 23.-P. 675-682.

5. Adler M., Schulz S., Fischer R., Niemeyer C.M. Detection of Rotavirus from stool samples using a standardized immuno-PCR ("Imperacer") method with end-point and real-time detection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. -V.333.-P. 1289-1294.

6. Adler M., Wacker R., Niemeyer M. A real-time immuno-PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003.-V. 308.-P. 240-250.

7. Alves A.M., Can* F.J. Dot blot detection of point mutations with adjacently hybridising synthetic oligonucleotide probes // Nucleic Acids Res. 1988. -V.16.-P. 8723.

8. An L., Tang W., Ranalli T.A. et al. Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplification // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 28952-28958.

9. Auer Т., Sninsky J.J., Gelfand D.H. et al. Selective amplification of RNA utilizing the nucleotide analog dITP and Thermus thermophilus DNA polymerase // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 5021-5025.143

10. Backman K. Ligase Chain Reaction: Diagnostic technology for the 1990s and beyond // Clin. Chem. 1992. - V. 38. - P. 457-458.

11. Bains W., Smith G.C. A novel method for nucleic sequence determination // J. Theor. Biol. 1988. - V. 135. - P. 303-307.

12. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. -V. 88. - P. 189-193.

13. Bar any F. The ligase chain reaction in a PCR world // PCR Methods Applic.1991a. V. l.-P. 5-16.

14. Barletta J. Applications of real-time immuno-polymerase chain reaction (rt

15. CR) for the rapid diagnoses of viral antigens and pathologic proteins // Mol.

16. Aspects Med. 2006. - V. 27. - P. 224-253.

17. Bekkaoui F., Poisson I., Crosby W. et al. Cycling probe technology with RNase H attached to an oligonucleotide // Biotechniques. 1996. - V.20. - P. 240-248.

18. Bengtsson M., Karlsson H.J., Westman G. et al. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR // Nucl. Acids Res. 2003. -V. 31. - e45.

19. Bi W., Stambrook P.J. CCR: a rapid and simple approach for mutation detection // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2949-2951.

20. Biesecker L.G., Bailey-Wilson J.E., Ballantyne J. et al. DNA identifications after the 9/11 World Trade Center attack // Science. 2005. - V. 310. - P. 1122-1123.

21. Birkenmeyer L.G., Mushahwar I.K. DNA probe amplification methods // J. Virol. Methods. 1991. -V. 35. - P. 117-126.

22. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - P.1513-1523.

23. Birkenmeyer L., Armstrong A.S. Preliminary evaluation of the ligase chain reaction for specific detection of Neisseria gonorrhoeae // J. Clin. Microbiol. -1992.-V. 30.-P. 3089-3094.

24. Bois J.S., Venkataraman S., Choi H.M. et al. Topological constraints in nucleic acid hybridization kinetics // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. 4090-4095.

25. Bolton E., McCarthy B. A general method for the isolation of RNA complementary to DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1962. - V.48. - P.1390-1397.

26. Britten R.J., Kohne D.E. Repeated sequences in DNA. Hundreds of thousands of copies of DNA sequences have been incorporated into the genomes of higher organisms//Science. 1968.-V. 161.-P. - 529-540.

27. Bronstein I., Voyta J.C., Edwards B. A comparison of chemiluminescent and colorimetric substrates in a hepatitis B virus DNA hybridization assay // Anal. Biochem. 1989. - V. 180. - P. 95-98.

28. Busti E., Bordoni R., Castiglioni B. et al. Bacterial discrimination by means of a universal array approach mediated by LDR (ligase detection reaction) // BMC Microbiol. 2002. - V. 2. - P.27.

29. Cairns M.J., Turner R., Sun L.Q. Homogeneous real-time detection and quantification of nucleic acid amplification using restriction enzyme digestion // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2004. - V. 318. - P. 684-690.

30. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C. et al. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85. - P. 8790-8794.

31. Chen R., Huang W., Lin Z. et al. Development of a novel real-time RT-PCR assay with LUX primer for the detection of swine transmissible gastroenteritis virus // J. Virol. Methods. 2004. - V. 122. - P. 57-61.

32. Chen X., Livak K.J., ICwok P.Y. A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test // Genome Res. 1998. - V. 8. - P. 549-556.

33. Clegg R.M., Murchi A.I.H., Zechel A., Lilley D.M.J. Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 2994-2998.

34. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. -V. 162.-P. 156-159.

35. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification // Nature. 1991. -V.350. - P.91-92.

36. Costa J.M., Ernault P., Olivi M. et al. Chimeric LNA/DNA probes as a detection system for real-time PCR // Clin. Biochem. 2004. - V.37. - P.930-932.

37. Crockett A.O., Wittwer C.T. Fluorescein-labeled oligonucleotides for real-time per: using the inherent quenching of deoxyguanosine nucleotides // Anal. Biochem. 2001. - V. 290. - P. 89-97.

38. Dahl F., Baner J., Gullberg M. et al. Circle-to-circle amplification for precise and sensitive DNA analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P. 4548-4553.

39. Demchinskaya A.V., Shilov I.A., Karyagina A.S., Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. - V. 50. № 1. - P. 79-89.

40. Denhardt D.T. A membrane-filter technique for the detection of complementary DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1966. - V. 23. - P. 641-646.

41. Didenko V.V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications // Biotechniques. 2001. - V. 31 - P. 1106-1111.

42. Dirks R.M., Pierce N.A. Triggered amplification by hybridization chain reaction//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2004. -V. 101. P. 15275-15278.

43. Drmanac R., Labat I., Brukner I. et al. Sequencing of megabase plus DNA by hybridization: theory of the method // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 114-128.

44. Duck P., Alvarado-Urbina G., Burdick B., Collier B. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides // BioTechniques. 1990. - V. 9. - P. 142-148.

45. Efimov V.A., Chakhmakhcheva O.G., Choob M.V., Archdeacon D. Using chimeric DNA/RNA beacons for target-specific signal amplification. XllthV

46. Symposium «Chemistry of Nucleic Acids Components». 2002. Spindleruv Mlyn, Czech Republic. Abstract Book. V.5. - P. 308-311.

47. Eggerding F.A. A one-step coupled amplification and oligonucleotide ligation procedure for multiplex genetic typing // PCR Methods Appl. 1995. - V. 4. -P. 337-345.

48. Fong W.K., Modrusan Z., McNevin J.P. et al. Rapid solid-phase immunoassay for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using cycling probe technology // J. Clin. Microbiol. 2000. - V.38. - P. 2525-2529.

49. Forster T. Energiewanderung und fluoreszenz //Naturwissenschaften. 1946. -V. 6.-P. 166-175. ^ht. no Didenko, 2001).

50. Forster T. Zwischenmoleculare energiewandenderung und fluoreszenz // Ann. Phys. (Leipzig). 1948. - V. 2. - P. 55-75. (ijht. no Didenko, 2001).

51. French D.J., Archard C.L., Brown T., McDowell D.G. HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination // Mol. Cell. Probes. 2001.-V. 15.-P. 363-374.

52. Getz M.J., Altenburg L.C., Saunders G.F. The use of RNA labeled in vitro with iodine-125 in molecular hybridization experiments // Biochim. Biophys. Acta. -1972.-V. 287.-P. 485-494.

53. Gillespie D., Spiegelman S. A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane // J. Mol. Biol. 1965. - V. 12. - P. 829-842.

54. Gingeras T.R., Higuchi R., Kricka L.J. et al. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics // Clin. Chem. 2005. - V.51. - P.661-671.

55. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. - V.85. - P.609-613.

56. Guatelli J.C., Whitfield K.M., Kwoh D.Y. et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V.87. - P.1874-1878.

57. Hall B.D., Spiegelman S. Sequence complementarity of T2-DNA and T2-specific RNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1961. - V. 47. - P. 137-146.

58. Hall J.G., Eis P.S., Law S.M. et al. Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2000.-V. 97.-P. 8272-8277.

59. Harvey J.J., Lee S.P., Chan E.K. et al. Characterization and applications of CataCleave probe in real-time detection assays // Anal. Biochem. 2004. - V. 333.-P. 246-255.

60. Hayashi M.N., Hayashi M., Spiegelman S. Chromatographic separation of annealed and enzymatically synthesized RNA-DNA hybrids // Biophys J. -1965.-V. 5.-P. 231-246.

61. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S. et al. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. 1992. - V. 10. - P.413-417.

62. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G. et al. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. - V. 11.-P.1026-1030.

63. Horii T., Monji A., Uemura K. et al. Rapid detection of fluoroquinolone resistance by isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids from clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae // J. Microbiol. Methods. 2006. V. 65.-P. 557-561.

64. Horn T., Chang C.A., Urdea M.S. Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4842-4849.

65. Horn T., Chang C.A., Urdea M.S. An improved divergent synthesis of comb-type branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) containing multiple secondary sequences // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4835-4841.

66. Housby J.N., Southern E.M. Thermus scotoductus and Rhodothermus marinus DNA ligases have higher ligation efficiencies than thermus thermophilus DNA ligase // Anal. Biochem. 2002. - V. 302. - P. 88-94.

67. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L. et al. Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes // Mol Cell Probes. 2000. - V. 14. - P. 321-328.

68. Jeon H.J., Shin H.J., Choi J.J. et al. Mutational analyses of the thermostable NAD+-dependent DNA ligase from Thermus filiformis // FEMS Microbiol. Lett.-2004.-V. 237.-P. 111-118.

69. Kalin I., Shephard S., Candrian U. Evaluation of the ligase chain reaction (LCR) for the detection of point mutations // Mutat Res. 1992. - V.283. - P. 119-123.

70. Kandimalla E.R., Agrawal S. "Cylicons" as hybridization-based fluorescent primer-probes: Synthesis, properties and application in real-time PCR // Bioorg. Med. Chem. -2000. V. 8.-P. 1911-1916.

71. Koo K., Jaykus L.A. Detection of single nucleotide polymorphisms within the Listeria genus using an 'asymmetric' fluorogenic probe set and fluorescence resonance energy transfer based-PCR // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - V. 35. -P. 513-517.

72. Kutyavin I.V., Afonina I.A., Mills A. et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 655-661.

73. Laing T.D., Mah D.C.W., Poirier R.T. et al. Genomic DNA detection using cycling probe technology and capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence // Mol. Cell. Probes. 2004. - V.18. - P. 341-348.

74. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique // Science. 1988. - V. 241. - P. 1077-1080.

75. Landegren U. Molecular mechanics of nucleic acid sequence amplification // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P. 199-204.

76. Leary J.J., Brigati D.J., Ward D.C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V.80. -P.4045-4049.

77. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes // Nucl. Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 3761-3766.

78. Lee M.A., Siddle A.L., Page R.H. ResonSense®: simple linear fluorescent probes for quantitative homogenous rapid polymerase chain reaction // Anal. Chim. Acta. 2002. V.457. P.61-70.

79. Li J., Chu X,. Liu Y. et al. A colorimetric method for point mutation detection using high-fidelity DNA ligase // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - el68.

80. Liew M., Pryor R., Palais R. et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons // Clin. Chem. 2004.-V.50.-P.1156-1164.

81. Little M.C., Andrews J., Moore R. et al. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BDProbeTecET // Clin. Chem. 1999. - V. 45. - P. 777-784.

82. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J. et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization // PCR Methods Appl. 1995. - V.4. - P.357-362.

83. Lizardi P.M., Huang X., Zhu Z. et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification // Nat. Genet. 1998. -V.19.-P. 225-232.

84. Lomeli H., Tyagi S., Pritchard C.G. et al. Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization probes // Clin. Chem. 1989. - V. 35. - P. 1826-1831.

85. Luo J., Bergstrom D.E., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase //Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 3071-3078.

86. Lyamichev V.I., Kaiser M.W., Lyamicheva N.E. et al. Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction // Biochemistry. -2000.-V. 39.-P. 9523-9532.

87. Marras S.A., Kramer F.R., Tyagi S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes // Nucl. Acids Res. 2002. - V.30. - el22.

88. Marshall R.L., Laffler T.G., Cerney M.B. et al. Detection of HCV RNA by the asymmetric gap ligase chain reaction // PCR Methods Appl. 1994. - V.4. -P.80-84.

89. Mori N., Motegi Y., Shimamura Y. et al. Development of a new method for diagnosis of rubella vims infection by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification // J. Clin. Microbiol. 2006a. - V. 44. - P. 3268-3273.

90. Mori Y., Nagamine K., Tomita N. et al. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 289. - P. 150-154.

91. Mori Y., Kitao M., Tomita N. et al. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA // J. Bioch. Bioph. Meth. 2004. - V.59. - P. 145-157.

92. Mori Y., Hirano T., Notomi T. Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers // BMC Biotechnol. 2006. - V.6. - P.3.

93. Moser M.J., Marshall DJ., Grenier J.K. et al. Exploiting the enzymatic recognition of an unnatural base pair to develop a universal genetic analysis system // Clin. Chem. 2003. - V.49. - P.407-414.

94. Nadeau J.G., Pitner J.B., Linn C.P. et al., Real-time, sequence-specific detection of nucleic acids during strand displacement amplification // Anal. Biochem. 1999. - V. 276. - P. 177-187.

95. Nagamine K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers // Mol. Cell Probes. 2002. - V.16. -P. 223-229.

96. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2516-2521.

97. Nazarenko I., Lowe B., Darfler M. et al. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore // Nucleic Acids Res. -2002.-V. 30. e37.

98. Nelson N.C., Kacian D.L. Chemiluminescent DNA probes: a comparison of the acridinium ester and dioxetane detection systems and their use in clinical diagnostic assays // Clin. Chim. Acta. 1990. - V. 194. - P. 73-90.

99. Nickerson D.A., Kaiser R., Lappin S. et al. Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990.-V. 87.-P. 8923-8927.

100. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification // Trends Biotechnol. 2005. - V.23. -P.208-216.

101. Nilsson M., Malmgren H., Samiotaki M. et al. Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection // Science. 1994. - V. 265. - P. 2085-2088.

102. Nilsson M., Barbany G., Antson D.O. et al. Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation //Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. -P.791-793.

103. Nilsson M., Antson D.O., Barbany G., Landegren U. RNA-templated DNA ligation for transcript analysis // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 578-581.152

104. Nilsson M., Dahl F., Larsson C. et al. Analyzing genes using closing and replicating circles // Trends Biotechnol. 2006. - V. 24. - P. 83-88.

105. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - E63.

106. Nuovo G.J., Hohman R.J., Nardone G.A. et al. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers // J. Histochem. Cytochem. 1999. V.47. P.273-279.

107. Nurmi J., Ylikoski A., Soukka T. et al. A new label technology for the detection of specific polymerase chain reaction products in a closed tube // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - e28.

108. Pham H.M., Nakajima C., Ohashi K. et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus // J. Clin. Microbiol. -2005. -V. 43.-P. 1646-1650.

109. Pickering J., Bamford A., Godbole V. et al. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - e60.

110. Prensky W., Steffensen D.M., Hughes W.L. The use of iodinated RNA for gene localization//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. -V. 70. - P. 1860-1864.

111. Pritchard C.E., Southern E.M., Effects of base mismatches on joining of short oligodeoxynucleotides by DNA ligases // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. -P. 3403-3407.

112. Rasmussen T.B., Uttenthal A., de Strieker K. et al. Development of a novel quantitative real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of all serotypes of foot-and-mouth disease virus // Arch. Virol. 2003. - V. 148. - P. 2005-2021.

113. Renz M., Kurz C. A colorimetric method for DNA hybridization // Nucleic Acids Res. 1984. - V. 12. - P. 3435-3444.153

114. Rizzo J., Gifford L.K., Zhang X. et al. Chimeric RNA-DNA molecular beacon assay for ribonuclease H activity // Mol.&Cell. Probes. 2002. - V. 16. - P. 277-283.

115. Rosler A., Bailey L., Jones S. et al. Rolling circle amplification for scoring single nucleotide polymorphisms // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. -2001.-V. 20.-P. 893-894.

116. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. - V. 94. - P. 4262-4266. 128.Schachter J. DFA, EIA, PCR, LCR and other technologies: what tests should be used for diagnosis of chlamydia infections? // Immunol Invest. - 1997. - V. 26. - P. 157-161.

117. Seeman N.C. DNA engineering and its application to nanotechnology // Trend.

118. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 437-443. 132.Seeman N.C. From genes to machines: DNA nanomechanical devices //

119. Trends Biochem. Sei. 2005. - V. 30. - P. 119-25. 133.Shchepinov M.S., Udalova I.A., Bridgman A.J. et al. Oligonucleotide dendrimers: synthesis and use as polylabelled DNA probes // Nucleic Acids Res. - 1997. - V. 25. - P. 4447-4454.

120. Shengqi W., Xiaohong W., Suhong C. et al. A new fluorescent quantitative polymerase chain reaction technique // Anal. Biochem. 2002. - V.309. - P. 206-211.

121. Sherril C.B., Marshall D.J., Moser M.J. et al. Nucleic acid analysis using an expanded genetic alphabet to quench fluorescence // J. Am. Chem. Soc. 2004. V.126. P.4550-4556.

122. Sismour A.M., Benner S.A. The use of thymidine analogs to improve the replication of an extra DNA base pair: a synthetic biological system // Nucl. Acids Res. 2005. V.33. P.5640-5646.

123. Smolina I.V., Demidov V.V., Cantor C.R. et al. Real-time monitoring of branched rolling-circle DNA amplification with peptide nucleic acid beacon // Anal. Biochem. 2004. - V. 335. - P. 326-329.

124. Solinas A., Brown L.J., McKeen C. et al. Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - E96.

125. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P. 503-517.

126. Southern E.M., Maskos U., Elder J.K. Analyzing and comparing nucleic acid sequences by hybridization to arrays of oligonucleotides: evaluation using experimental models // Genomics. 1992. - V. 13. - P. 1008-1017.

127. Spargo C.A., Fraiser M.S., Van Cleve M. et al. Detection of M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification // Mol. Cell Probes. 1996.-V. 10.-P. 247-256.

128. Stryer L., Haugland R.P. Energy transfer: a spectroscopic rule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. -V. 58.-P. 719-726.

129. Svanvik N., Stahlberg A., Sehlstedt U. et al. Detection of PCR products in real time using light-up probes // Anal. Biochem. 2000. - V. 287. - P. - 179-182.

130. Thomas D.C., Nardone G.A., Randall S.K., Amplification of padlock probes for DNA diagnostics by cascade rolling circle amplification or the polymerase chain reaction // Arch. Pathol. Lab. Med. 1999. - V. 123. - P. 1170-1176.

131. Tian P., Mandrell R. Detection of norovirus capsid proteins in faecal and food samples by a real time immuno-PCR method // J. Appl. Microbiol. 2006. - V. 100.-P. 564-574.

132. Todd A.V., Fuery C.J., Impey H.L. et al DzyNA-PCR: use of DNAzymes to detect and quantify nucleic acid sequences in a real-time fluorescent format // Clin. Chem. 2000. - V. 46. - P. 625-630.

133. Tong J., Cao W., Barany F. Biochemical properties of a high fidelity DNA ligase from Thermus species AK16D // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 788-794.

134. Tong J., Barany F., Cao W. Ligation reaction specificities of an NAD(+)-dependent DNA ligase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 1447-1454.

135. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization//Nat. Biotechnol. 1996. -V. 14. - P. 303-308.

136. Tyagi S., Marras S.A., Kramer F.R. Wavelength-shifting molecular beacons // Nat. Biotechnol.-2000. V. 18.-P. 1191-1196.

137. Van Ness J., Van Ness L.K., Galas D.J. Isothermal reactions for the amplifica-tion of oligonucleotides //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. V. 100. -P.4504-4509.

138. Vaughn C.P., Elenitoba-Johnson K.S. Hybridization-induced dequenching of fluorescein-labeled oligonucleotides: a novel strategy for PCR detection and genotyping // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163. - P. 29-35.

139. Vincent M., Xu Y., Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification // EMBO Reports. 2004. - V.5. - P. 795-800.

140. Walker G.T, Fraiser M.S, Schräm J.L. et al. Strand displacement amplification~an isothermal, in vitro DNA amplification technique // Nucleic Acids Res. 1992. - V. 20. -1691-1696.

141. Walker G.T, Little M.C, Nadeau J.G. et al. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. - V. 89. - P. 392-396.

142. Warmaar S.O., Cohen J A. A quantitative assay for DNA-DNA hybrids using membrane filters // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1966. - Y.24. - P.554-558.

143. Watson E.J, Templeton A, Russell I. et al. The accuracy and efficacy of screening tests for Chlamydia trachomatis: a systematic review // J. Med. Microbiol. 2002. - V. 51. - P. 1021 -1031.

144. Whitcombe D, Brownie J, Gillard H.L. et al. A homogenous fluorescence assaya for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping // Clin. Chem. 1998. V.44,P.918-923.

145. Wiedmann M, Wilson W.J, Czajka J. et al. Ligase chain reaction (LCR) -overview and applications // PCR Methods Applic. 1994. - V. 3. - P. S51-S64.

146. Winn-Deen E.S. Multi-mutation screening using PCR and ligation principles and applications // Trends Biotechnol. - 1996. - V. 14. - P. 112-114.

147. Wittwer C.T, Herrmann M.G, Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // Biotechniques. -1997.-V. 22.-P. 130-131, 134-138.

148. Wittwer C.T, Ririe K.M., Andrew R.Y. et al. The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control // Biotechniques. -1997a.-V. 22.-P. 176-181.

149. Wittwer C, Reed G, Gundry C.N. et al. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen // Clin. Chem. 2003. - V.49. - P.853-860.

150. Wu D.Y, Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)~ amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.157

151. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989a. V.76. - P.245-254.

152. Yamane A. MagiProbe: a novel fluorescence quenching-based oligonucleotide probe carrying a fluorophore and an intercalator // Nucl. Acids Res. 2002. -V.30. - e97.

153. Yang J.Q., Tata P.V., Park-Turkel H.S., Waksal H.W. The application of AmpliProbe in diagnostics // Biotechniques. 1991. - V. 11. - P. 392-397.

154. Zhang D.Y., Zhang W., Li X., Konomi Y. Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification // Gene. 2001. - V.274. P.209-216.

155. Zhang Y., Zhang D., Li W. et al. A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - el23.

156. Zhou L., Myers A.N., Vandersteen J.G. et al. Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye // Clin. Chem. -2004.-V. 50.-P. 1328-1335.