Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гибридизационная цепная реакция и другие способы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в режиме реального времени

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гибридизационная цепная реакция и другие способы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в режиме реального времени"

На правах рукописи

ЧЕМЕРИС Дмитрий Алексеевич

ГИБРИДИЗАЦИОННАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ И ДРУГИЕ СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ И ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ СПЕЦИФИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 б ОНТ2В08

Уфа - 2008

003448789

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Никоноров Юрий Михайлович

доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна

кандидат биологических наук Самигуллин Тагир Халафович

Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится октября 2008 г в « т» часов

на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002 133 01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу 450054, Уфа, проспект Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан сентября 2008 г

Ученый секретарь Объединенного п

диссертационного совета, к б н --Ж^ /у Бикбулатова С М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы После своего появления в середине 80-х гг полимеразная цеппая реакция (ПЦР) [Saïki et al, 1985, 1988] очень быстро стала по существу методом №1 в фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике Оставаясь таковым и поныне, она все же заметно изменилась, что в первую очередь связано с переводом этой реакции в режим реального времени, где детекция накопления ампликонов ведется в ходе самого процесса амплификации ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) сильно повлияла на взгляды как исследователей, испотьзующих метод ПЦР для получеши новых знаний о функционировании генов и геномов, так и тех, кто занят исключительно ДНК-диагностикой Если для первых главным среди других задач является возможность количествешюго определения с помощью ПЦР-РВ числа копий мишени в стартовом материале, то вторые, помимо этого, отдают ей предпочтение еще и ввиду практически полного исключения загрязнения ампликонами рабочих помещений, и сведения таким образом, риска получения ложнопозитивных результатов к абсолютному минимуму, что при массовом характере анализов при использовании обычной ПЦР удается добиться далеко не всегда Однако несмотря на большое количество предложенных вариантов детекции ампликонов в ПЦР-РВ [Higuchi et al, 1993, Lee et al, 1993, Tyagi et al, 1996, Nazarenko et al, 1997, Whitcombe et al, 1999, Rasmussen et al, 2003, Costa et al, 2004, Shernll et al, 2004, Moms et al, 2005, Li et al, 2006, Ahmad, Ghasemi, 2007, Liu, Hong, 2007, Luk et al, 2007 и др ], остается возможность разработки новых способов, по некоторым параметрам превосходящих существующие

Вслед за ПЦР на рубеже 90-х гг появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК, среди которых можно отметить лигазную цепную реакцию [Вагапу, 1991 ], амплификацию смещением цепи [Walker et al, 1992], ее разновидность в виде амплификации катящимся кольцом [Lizardi et al, 1998], технологию цитирующей пробы [Duck et al, 1990], самоподдерживающуюся репликацию [Guatelli et al, 1990, Compton, 1991], QP-репликазную амплификацию [Lomeli et al, 1989], разветвленную габридизационную пробу [Horn, Urdea, 1989] К настоящему времени большинство из них переведены в передовой и наиболее удобный для диагностики ре-

жим реального времени, однако в ряде случаев такой перевод оказался не очень эффективным и не лишенным серьезных недостатков

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов изотермических и управляемых сменой температур реакций амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот в режиме реального времени и демонстрации возможности их применения на практике В задачи исследования входило

1) преобразовать гибридизационную цепную реакцию нуклеиновых кислот в режим реального времени (ГЦР-РВ) и исследовать ее особенности,

2) разработать способы детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), основанные на флуоресцентном резонансном переносе энергии (ЖЕТ-эффекте) и эффекте гашения,

3) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов РНК с помощью транскрипционной цепной реакции (самоподдерживающейся репликации) на платформе "УФА" в реальном времени (ТЦР-РВ),

4) разработать новый способ детекции ампликонов на платформе "УФА" в ходе двухпраймерной амплификации катящимся кольцом (рамификации) в реальном времени,

5) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов ДНК путем объединения технологии циклирующей пробы с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием множественных дезоксирибозимов 10-23,

6) показать возможность использования разработанных методов амплификации и высокочувствительной детекции для фундаментальных и прикладных исследований

Научная новизна и практическая значимость. Разработаны варианты ГЦР-РВ, основанные на временном гашении свечения флуорохрома темновым гасителем и использовании НЯЕТ-эффскта Продемонстрирована высокая специфичность данной реакции, позволяющая дискриминировать инициаторные молекулы с единичными заменами нуклеотидов, что может быть использовано при анализе однонук-леотидного полиморфизма ДНК высших организмов Показана возможность использования в ГЦР молекул РНК в качестве инициатора самосборки без их перево-

да в кДНК Разработаны улучшенные способы детекции накопления ампликонов в ИТ TP-PR на платформе "УФА", по большинству параметров превосходящие анало-гачные методы Разработан вариант проведения ТЦР-РВ, основанный на FRET-эффекте на платформе "УФА" Показано, что протекание двухпраймерной рамификации в реальном времени может контролироваться с помощью регистрации FRET-эффекта на платформе "УФА" Произведено объединение технологии амплификации ДНК катящимся кольцом с регистрацией этого процесса с помощью цикли-рующих проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов

Практическая значимость работы заключается в расширении спектра методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей ДНК или РНК в реальном времени Показана возможность их использования как для фундаментальных, гак и прикладных целей, в том числе для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны, а также безьнпронных генов без ДНКазной обработки, для детекции коронавируса, хантавируса, вируса птичьего гриппа субтипа H5N1, бледной трепонемы, хламидий, а также для выявления генетически модифицированных растений

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005), 3-ей международной конференции "Международное сотрудничество в биотехнологии ожидания и реальность" (Пущино, 2006), Х1П международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), международной шко-ле-конферетдаи молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург,

2006), всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с точечным синдромом" (Уфа, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва,

2007), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007) Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ-НШ-2217 2003 4,

HUI-1003 2006 4, НШ-649 2008 4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№02 445 11 7018, 02 445 11 7381, 02 512 11 2051, 02 512 11 2107, 02 512 12 0002, Фонда СР МФП НТС № 5490р/7971

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 207 работ Диссертация изложена на 160 страницах, содержит 46 рисунков и 3 таблицы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили искусственные молекулы ДНК (олигонук-леотиды) и РНК (рибоолигонуклеотиды), синтезированные методом фосфорамидит-ного синтеза Более 70 различных олигонуклеотидов длиной от 12 до 96 звеньев общей протяженностью около 2300 звеньев были синтезированы в ИБГ УНЦ РАН, в ЗАО "Сингол" (Москва) и НПО "Литех" (Москва) Часть из них имели модификации и несли различные флуорохромы, а также их гасители, биотиновые группы В работе также были использованы природные молекулы нуклеиновых кислот, имеющие вирусное происхождение (вирус птичьего гриппа субтипа H5N1, хантавирус серотипа PUU), бактериальное (Е coli, Chlamydia trachomatis), растительное (табак) и животное (лосось, курица, человек) происхождение ДНК из разных биологических объектов выделяли классическим фенольно-детергентным методом с перхлоратом натрия РНК выделяли гуанидинтиоцианатным методом Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса Концентрацию РНК или ДНК в образцах определяли по оптической плотности на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio-Rad, США)

ПЦР "по конечной точке" проводили в ДНК амплификаторе Терцик (ДНК-Технология, Россия) Амплификацию и высокочувствительную детекцию в реальном времени проводили в ДНК амплификаторах моделей lCycler iQ (Bio-Rad, США) и АНК-32 (ИАП РАН / ЗАО Синтол, Россия) При проведении изотермических реакций регистрацию изменений флуоресценции раствора проводили через равные промежутки времени, варьирующие в разных экспериментах от 10 до 60 сек Элек-

трофоретический анализ продуктов ГЦР-РВ, ПЦР-РВ, а также рамификации проводили в 10 - 12%-ных полиакриламидных гелях в приборе вертикального типа Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad, США) Анализ более крупных молекул нуклеиновых кислот, включая плазмиды, проводили в 1%-ном агарозном геле в приборе горизонтального типа Wide Mim (Bio-Rad, США) По завершению электрофореза гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали в фотодокуменгационной системе Gel Camera System (UVP, Inc, США) Для олигонуклеотидов, несущих различные флуорохро-мы, а также ампликонов, полученных с их участием, перед окрашиванием сначала регистрировали их собственную флуоресценцию Компьютерный анализ нуклео-•щдных последовательностей, подбор праймеров и олигонуклеотидов проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR Inc (США) и Oligo 4 1 (National Biosciences Inc , США)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гпбридшационна» цепная реакция в реальном времени

Движущей силой ГЦР является временно сокрытая энергия, заключенная в особым образом сконструированных олигонуклеогидных наноструктурах, представляющих собой шпильки с верхушечной петлей, двуцепочечным стержнем и одноцепочечным участком В обычных условиях данные олигонуклеотидные конструкции стабильны и в отсутствии инициаторной молекулы не вступают в реакцию гибридизации Однако стоит только появиться молекуле-инициатору в виде искомой последовательности нуклеиновых кислот, как шпильки раскрываются и начинает происходить рост цепей ДНК

Теоретически потенциал ГЦР для целей ДНК и РНК диагностики весьма велик и мы посчитали возможным усовершенствовать эту реакцию путем перевода ее в режим реального времени (ГЦР-РВ), где детекция роста цепей ДНК может вестись по увеличивающейся флуоресценции соответствующего красителя за счет исчезновения эффекта гашения, что будет иметь место при пошаговом удлинении цепей ДНК и разнесении за счет этого в пространстве все большего числа пар молекул флуорохром/гаситель С этой целью тми были синтезированы соответствующие модифицированные олигонуклеотиды с парой FAM/Dabcyl (рис 1), а

также различные варианты инициаторных молекул, включая более протяженные по длине, что имитировало случайно фрагментированную ДНК.

5А 4 4 А а а - -111111 1111111 Рис. 1. Шпилечные наноструктуры для мето-3' ' 1 1 да ГЦР-РВ. Р - флуоресцентный краситель, <3

- универсальный гаситель. Комплементарные

'1ххххххххх„ххххх&Ь ДРУГ блокинуклеотидов показаны 3.111 ттт т т т-т1тттттт|тгт т^^у комплементирующими символами

О НСЯ-В-РГО

Рис. 2. ГЦР-РВ с эффектом дегашения флуоресценции.

А - кривая роста флуоресценции. 1 - образец; 2 - отрицательный контроль (без инициатора). Б - электрофоретический контроль продуктов, образовавшихся в ходе ГЦР-РВ со шпильками, самосборка которых инициируется геном нуклео-капсидного белка хантавируса. 1 - шпилька а; 2 - шпилька Ь; 3 - шпильки а и Ь; 4 - шпильки а и Ь в присутствии одноцепочечной ДНК фрагмента гена нуклео-капсидного белка ханатвируса; 5 - шпильки а и Ь в присутствии негомологичной одноцепочечной ДНК

Проведенные эксперименты показали успешное преобразование ГЦР в ГЦР-РВ. Так, на рис. 2А можно видеть характерную кривую, свидетельствующую об увеличении свечения красителя, нарастающего в ходе реакции по мере того как все большее число шпилек оказывается вовлечено в построение цепей ДНК. При этом рост флуоресценции не наблюдался в реакционной смеси, где присутствовали одни шпильки без инициаторной ДНК. Электрофоретический анализ (рис. 2Б) подтвердил рост наноконструкций и отсутствие такового в образцах без инициатора. Присутствие неспецифической ДНК также не запускало процесс самосборки.

Другое свидетельство высокой специфичности ГЦР было получено путем опробования различных олигонуклеотидов, отличающихся от полностью комплементарного заменами отдельных оснований или делециями, на предмет их спо-

собности служить инициаторной молекулой, но при этом ни один из них в таком качестве себя не проявил (рис. 3).

А Б

1 АОТСТАСКЗАТТССХЗСОТОСЗОТТАА

2 АОТСТАООАТТСТОСОТОСЭвТТАА

3 СААаТСТАООАААСОасаТОООТТАА

4 СААСТСТАООАТТСОаСаТОаОСТАА

5 СААЭТСТАСЮАТТСААСОТСККЗТТАА

6 СААаТСТАСХЗАТТ--вСОТСЗСКЗТТАА

7 СААЭТСТА«ЗАТТ-<ЗвСОТО«ЗТТАА

Ьвт^т- 1

/ 1

2® Ш , (

и го .! л :

Рис. 3. Дискриминирующие способности ГЦР, обеспечивающие детекцию од-попуклеотидного полиморфизма. А - кривые флуоресценции. Б - Инициатор-ные олигонуклеотиды. Подчеркивания и дефисы обозначают замены и делеции нуклеотидов

Исходя из описанного выше принципа расположения комплементарных участков, были сконструированы наноструктуры с другими нуклеотидными последовательностями, включая пару краситель/гаситель - 1ЮХ/Г)аЬсу1. В качестве инициаторной молекулы была взята денатурированная ДНК клонированного фрагмента гена нуклеокапсидного белка хантавируса. Еще один комплект таких олиго-нуклеотидных шпилек, несущих пару краситель/гаситель - 1160/ВНС>1, и инициа-торный олигонуклеотид к ним быш! изготовлены для детекции коронавируса. И те, и другие показали в целом типичное протекание ГЦР-РВ. Также были сконструированы варианты шпилек, отличающиеся местом расположения флуорохро-мов, что обеспечивало более заметное дегашение флуоресценции в ходе ГЦР-РВ. В продолжение экспериментов на специфичность ГЦР (хотя уже и с другой целью) была успешно осуществлена мультиплексная ГЦР-РВ, где велась одновременная детекция увеличения свечения обоих красителей БАМ и 1ЮХ, что свидетельствовало о независимом росте обеих наноструктур.

Следует отметить, что для запуска ГЦР нет необходимости перевода молекул РНК в их ДНК-копию, поскольку нет препятствий к образованию ДНК/РНК-гетеродуплексов. При этом нами в качестве инициаторной молекулы вместо природной РНК был использован специально химически синтезированный рибоолигонукле-отид, также обеспечивший самосборку с характерной кривой роста флуоресценции.

Более перспективным является использование ГЦР-РВ, основанной на Б'ЯЕТ-эффекте. С этой целью были сконструированы и синтезированы другие олигонуклео-тидные шпильки, где одна из них в своей последовательности несла краситель-донор, а вторая - краситель-акцептор. Как можно видеть из схемы ГЦР-РВ с использованием ЕЯЕТ-эффекта, приведенной на рис. 4, в процессе самосборки олигонуклеотидных шпилек донорные и акцепторные красители оказываются друг от друга на достаточно близком расстоянии, обеспечивающем перенос энергии, тогда как отдельные шпильки, не вовлеченные в цепную реакцию, вклада в регистрируемое свечение не вносят.

оиДНК шш РНК ПХХХХХРХОТХСХСШХССШГП

i4W^fWtfWfoWffl'WTÎ?YYYYYYYYYYYYYYYYYY

îttîtïi ; - м i.. -. - -il.!'. 7

YfYYÏYYYYYVYVVYYYV^J L

tmtrn itttttttttttttt

"MfYt ?tf YYtYVYYrrrrVYYrrrr

--A--

Рис. 4. Схема ГЦР-РВ с FRET-эффектом. D - краситель-донор, А - краситель-акцептор

50 55 60 65

Рис. 5. Кривые роста флуоресценции в ГТЦ'-РВ, основанной на FRET-эффекте. 1 и 2 - разные количества инициаторных молекул, отличающиеся на порядок; 3 - то же что и 2, но с добавлением негомологичной денатурированной ДНК; 4, 5 и 6 - с отсутствием инициатора, при этом в 5-м образце присутствует негомологичная денатурированная ДНК., а в 6-м - негомологичная РНК

В случае проведения ГЦР-РВ, основанной на РКЕТ-эффекте, непосредственно в самом ДНК амплификаторе может быть обеспечен единый для всех образцов старт этой реакции путем нагрева реакционной смеси до температуры при которой произойдет полная денатурация успевших собраться цепей ДНК, и исчезнет возникший РШЗТ-сигнал. При снижении температуры реакции до оптимальной для самосборки, этот процесс запустится заново сам собой при условии присутствия в образце инициаторных последовательностей (рис. 5).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени на платформе «УФА»

Поскольку ГПЦР-РВ предназначена для выявления или количественной оценки тех или иных последовательностей ДНК или РНК, то размер целевых продуктов нет смысла делать большим. В разработанном варианте ПЦР-РВ на платформе «УФА» (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) размер амплико-нов составляет всего 33 - 50 пн благодаря тому, что праймеры отжигаются встык или с перекрытием в 1 нуклеотид, что зависит от особенностей нуклеотидных последовательностей в конкретном выбранном месте (рис.6). При подборе прайме-ров учитывалась возможность включения в них внутренних меток в виде флуоро-хромов, представляющих или пару донор/акцептор, или пару краситель/гаситель.

Рис. б. Схема ПЦР-РВ на платформе "УФА" с РКЕТ-эффекгом между до норным (Т - РАМ) и акцепторным (Я - ЯОХ) красителями. Волнистой стрелкой показан перенос энергии. Расходящиеся лучи от красителя-акцептора символизируют свечение

Праймеры на так называемый положительно-отрицательный контроль подбирались с таким расчетом, чтобы увеличенное расстояние между красителем-донором и красителем-акцептором не приводило бы к РКЕТ-эффекту, но при этом нарабатывался бы соответствующий ПЦР-продукт. На рис. 7А виден рост флуоресценции целевого продукта, ограниченного праймерами 1 и 2, и отсутствие аналогичного подъема

для пары праймеров 3 и 2. Электрофоретический контроль показал, что основной целевой продукт, регистрируемый в ходе ПЦР-РВ, имеет ожидаемый размер в 42 пи, тогда как наработка ампликона размером 160 пн в отрицательно-положительном контроле не приводила к изменению сигнала флуоресценции во время ПЦР-РВ (рис. 7А), но при окрашивании бромистым этидием он хорошо заметен (рис. 7Б).

А

Б

10 12 14 16 Циклы

20 22 24 26

Рис. 7. ПЦР-РВ на платформе "УФА". А - кривые роста флуоресценции. Б - электрофоретический анализ ампликонов. 1 - праймеры 1 и 2; 2 - прай-меры 3 и 2 (положительно-отрицательный контроль); 3 - праймеры 1 и 2 без матричной ДНК (отрицательный контроль), М - маркерная ДНК

Ввиду того, что не все ДНК амплификаторы с оптическим модулем рассчитаны на детекцию РИЗТ-эффекта, нами был разработан вариант с гашением флуоресценции красителя, входящего в состав одного из праймеров, соответствующим гасителем, находящимся в составе другого праймера (рис. 8 и 9).

Рис. 8. Схема ПЦР-РВ с гашением флуоресценции красителя Р' универсальным гасителем (2. Расходящиеся прямые лучи от красителя-донора символизируют свечение, а волнистые лучи, исходящие от гасителя, обозначают выделение тепловой энергии

37?^

1 V-^

<.......

» 2

Рис. 9. Кривые изменения флуоресценции в варианте ПЦР-РВ с эффектом гашения. 1 - праймеры 3 и 2 (положительно-отрицательный контроль); 2 и 3 - праймеры 1 и 2 в присутствии ДНК-мишени, отличающейся по количеству на порядок

__1 l-J.-J.l- - М | | 4,

£ \ V ■ —. М - — I

V &

гр -1 Т^ -4-4-- —|~г~,

! 1 ч Х- -Н-- 1 44-1

ш -Н— ч -Ч; - 1 2 3

В расположении меченых флуорохромами праймсров, при отжиге на мишени в такой близости друг от друга при яроведешш варианта ПЦР-РВ с переносом энергии между ними на платформе "УФА" есть сразу несколько преимуществ

Во-первых, такое расположите праймеров обеспечивает возникновение ПШТ-эффекга ввиду того, что эффективность переноса обратно пропорциональна расстоянию между красителем-донором и красителем-акцептором в шестой степени и не может иметь место при расположении праймеров на удалении друг от друга Во-вторых, до минимума сокращается время, достаточное для удлинения прай-мера на требуемое количество нуклеотидов, и такой этап, как этап элонгации становится не нужен, поскольку построение второй цепи ДНК успевает произойти полностью еще на этапе отжига или в ходе повышения температуры для денатурации амплшсонов, что приводит к заметной экономии времени В-третьих, из-за того, что целевой продукт имеет небольшой размер, существенно снижается температура денатурации, при которой цепи ампликона должны разойтись и стать новыми матрицами для отжига праймеров И здесь два важных момента С одной стороны, это экономия времени вообще, так как переходы от одной температуры к другой не мгновенны С другой - сокращение времени пребывания ДНК полиме-разы при неоптимальных для работы фермента температурах (повышенных) продлевает время его жизни, обеспечивая в целом более надежную амплификацию В-чегвертых, такое расположение праймеров способно обеспечить амплификацию довольно коротких фрагментов (обломков) молекул ДНК или РНК, которые с большей вероятностью могут сохраняться в старых или подвергнувшихся сильному разрушительному воздействию образцах В-пятых, благодаря расположению праймеров встык (или почти встык), число значимых нуклеотидов исходя из которых рассчитывается количество возможных комбинаций, увеличивается вдвое, и, например, для двух праймеров по 20 звеньев оно становится равным 40, что при возведении четырех азотистых оснований в сороковую степень дает септиллион (1024) комбинаций Тем самым обеспечивается высокая специфичность данного варианта ПЦР-РВ, поскольку случаи фалып-праймирования, вызванные отжигом на других местах, расположенных вплотную, сразу двух праймеров, "связанных"

между собой эффектами переноса энергии или гашением флуоресценции, практически невозможны

Что касается вероятного отжига праймеров самих на себя с образованием ге-теродимеров, между которыми возможен FRET, то это может быть легко обнаружено на стадии плавления образовавшихся ампликонов, где наличие пика с меньшей температурой плавления чем целевой продукт, будет свидетельствовать об имеющей место неспецифичной ПНР, однако подобное должно быть полностью исключено еще на этапах подбора праймеров и отработки метода с конкретной их парой

Подход к проведению ПЦР-РВ с максимально сближенным расположением внутренне меченных соответствующими флуорохромами прямого и обратного праймеров был назван нами "УФА", поскольку оказалось что такой способ детекции изменения флуоресценции реакциошюй смеси действительно универсален и может быть использован для других методов амплификации нуклеиновых кислот

Транскрипционная цепная реакция в режиме реального времени

Транскрипционная цепная реакция характеризуется накоплением двух типов ампликонов - временных РНК-ампликонов и постоянных ДНК-ампликонов Благодаря использованию двух праймеров, обеспечивающих FRET-эффект на платформе «УФА», оказалось возможным количественно регистрировать протекание экспоненциальной амплификации РНК путем детекции постоянных ДНК-ампликонов, тогда как предложенные другими авторами варианты этой реакции регистрировали появление временных РНК-ампликонов, подвергающихся запрограммированному разрушению Из краткой схемы протекания реакции, представленной на рис 10, видно, что на первом этапе происходит отжиг одного из праймеров, несущего последовательность промотора фага Т7 В результате ряда последовательных ферментативных действий образуется двуцепочечный промотор фага Т7, и Т7 РНК полимераза обеспечивает появление множественных РНК-ампликонов, которые становятся временными РНК-матрицами для образования новых ДНК-ампликонов, за счет чего реакция приобретает цепной характер, и при регистрации ее протекания в реальном времени формируется характерная кривая, показанная на рис 11

к \ праймер

обратной трап скриптам ~Г7 ч.

ДНК-ампл иконы

-РНК-ампликоны

отжиг второго прайнера обратная 'рансхриптала

Рис. 10. Краткая схема протекания 'ГЦР в реальном времени

Рис. 11. Регистрация изменения флуоресценции красителя-акцептора после переноса на него флуоресцентной резонансной энергии возбужденного красителя-донора в ходе ТЦР-РВ. 1 - образец, содержащий мишень "РНК"; 2 - отрицательный контроль

Разработанный вариант детекции на платформе "УФА" образующихся в ходе транскрипционной цепной реакции постоянных ДНК-ампликонов подтверждает универсальность применения максимально сближенного расположения праймеров.

Рамификация в реальном времени

Значительный интерес представляет реакция рамификации, где наличие двух праймеров обеспечивает экспоненциальное накопление разветвленных продуктов такой реакции. С этой целью была синтезирована соответствующая С-проба, которая несла участки для отжига искомой последовательности ДНК,

участок для отжига первого праймера и участок, представляющий собой копию второго праймера, на котором он мог отжигаться только после появления в реакционной смеси смещенной цепи ДНК, комплементарной исходному олигонуклео-тиду. Для регистрации амплификации молекул ДНК, оба праймера были помечены флуоресцентными красителями РАМ и ЯОХ, составляющими пару до-нор/акцентор и позволяющими давать РШЗТ-сигнал. Причем, для обеспечения переноса энергии расположение праймеров и красителей в них соответствовало принципу "УФА", подтверждая его универсальность.

Рис. 12. Рамификация. А - краткая схема рамификации в реальном времени. Б - электрофорез продуктов рамификации. 1 - линейная С-проба; 2 - олигонук-леотид, имитирующий искомый фрагмент ДНК; 3 - праймер 1 с красителем-донором; 4 - праймер 2 с красителем-акцептором; 5 - продукты рамификации

Из приведенной на рис. 12А краткой схемы процесса рамификации видно, что по мере удлинения новой цепи ДНК образуется все большее число мест для отжига второго праймера, смещающего встречающиеся ему на пути вторичные цепи ДНК с таких же вторых праймеров, отжегшихся ранее, образуя копии первичной С-пробы. В свою очередь, на этих образующихся копиях опять возникают множественные места отжига для первых праймеров, которые также удлиняются, смещая отжегшиеся ниже в направлении 5'—>У. Таким образом, в процессе рамификации в реакционной смеси постоянно присутствует смесь как одно- и двуцепо-

А

Б

чечных фрагментов ДНК, так и частично одноцепочечных, частично двуцепочеч-ных

Проведенный электрофоретическии анализ продуктов реакции рамификации (рис 12Б) показывает довольно сложную, но ожидаемую картину с наличием характерной "лестницы" полос ДНК При этом в силу специфики рамификации, непременным условием которой является смещение цепей ДНК, не все праймеры образуют места, где происходит FRET, что можно видеть из принципиальной схемы этой реакции Тем не менее, образующихся конечных продуктов вкупе со временно существующими промежуточными полупродуктами, где также возникает FRET-эффект, вполне достаточно для регистрации подъема флуоресценции раствора

Амплификация по типу катящегося кольца с дезоксирпбозимным расщеплением химерной пробы

Объединение технологий циклирующей пробы и молекулярного сигнального огня, совмещенные с амплификацией по типу катящегося кольца, позволяет успешно детектировать однонуклеотидный полиморфизм, но при этом необходимо участие трех ферментов - ДНК лигазы, обеспечивающей дискриминирующее ли-гирование кольцевой матрицы (С-пробы) на анализируемом (искомом) фрагменте ДНК, ДНК полимеразы со смещающей старую цепь ДНК активностью, РНКазы Н, разрушающей молекулярные сигнальные огни, представленные рибобиконами Последний фермент может быть заменен дезоксирибозимом, возникающим в ходе смещения цепи ДНК, поскольку сконструированная С-проба содержит в своем составе, помимо участков для отжига искомой последовательности ДНК и участка для отжига удлиняющегося праймера, еще и антисенс-последовательность дезок-сирибозима 10-23

Важным преимуществом замены РНКазы H дезоксирибозимом является то что в первом случае количество фермента в ходе реакции остается неизменным, и активность его может только падать, тогда как при изотермической амплификации по типу катящегося кольца с образованием длинной цепи одноцепочечной ДНК на ней через равные промежутки формируются все новые дезоксирибозимы, служащие одновременно и местами отжига гибридизационных циклирующих проб

в виде меченных флуорохромом и соответствующим ему гасителем химерных ДНК/РНК/ДНК-олигонуклеотидов (рис. 13).

Рис. 13. Краткая схема технологии циклирующей пробы, совмещенной с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием функциональных дезоксирибозимов 10-23

О 2 4 6 0 10 12 14 16 10 20 22 24 26 20 30 32 34 06 00 40 42 44 46 40 50 52

Рис. 14. Кривая роста флуоресценции в технологии циклирующей пробы, совмещенной с амплификацией катящимся кольцом с образованием функциональных дезоксирибозимов. 1 - литерованная С-проба; 2 - линейная С-проба

На рис. 14 представлена кривая роста флуоресценции, возникающей за счег разрушения химерных проб и физического разобщения красителя с гасителем, типичная для всех опробованных температурных и концентрационных условий, поскольку дезоксирибозим способен проявлять свою каталитическую активность в широком диапазоне.

На основе разработанных в рамках данной работы методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых

кислот в режиме реального времени были созданы соответствующие системы праимеров и олигонуклеотидных конструкций, пригодные для выявления и анализа промоторов, генов, их транскрипционных продуктов, прочих участков в геномах организмов различной сложности, среди которых РНК-содержащие хантавирус и коронавирус, агробактерия, трепонема, трансгенные растения, ДНК человека и др

ВЫВОДЫ

1 Показано, что в гибридизационной цепной реакции, переведенной тми в режим реального времени (ГЦР-РВ), под действием инициаторных молекул происходит линеиный рост наноструктур го особым образом сконструированных двух типов олигонуклеотидных шпилек, способный дискриминировать единичные замены нуклеотидов в последовательности-мишени

2 Предложены два варианта ГЦР-РВ

- вариант 1 основан на детекции увеличивающейся флуоресценции красителя за счет исчезновения эффекта гашения, происходящего при поэтапном удлинении цепей ДНК и разнесении в пространстве пар молекул флуорохром/гасигель, которые находятся в самособирающихся олигонуклеотидных шпильках одного типа,

- вариант 2 рассчитан на детекцию роста цепей ДНК по увеличению свечения красителя-акцептора после переноса на него флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора, входящих по отдельности в составы аналогичных олигонуклеотидных шпилек разных типов

3 Разработаны два скоростных и высокочувствительных способа детекции амплико-нов в полимеразной цепной реакции в реальном времени на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), один из которых основан на переносе флуоресцентной резонансной энергии между донорным и акцепторным красителями входящими в составы прямого и обратного праймеров, отжигающихся в непосредственной близости друг от друга (встык или с условным перекрытием в один нуклео-тид), второй способ рассчитан на эффект гашения флуорохрома соответствующим гасителем, входящих в составы праймеров, отжигающихся аналогичным образом

4 Предложен способ обнаружения специфичных фрагментов РНК путем детекции в реальном времени появления постоянных ДНК-ампликонов в процессе протека-

ния транскрипционной цепной реакции, основанный на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА" между донорным и акцепторным красителями, входящими в составы первого и второго праймеров

5 Предложен способ детекции в реальном времени протекания реакции рамификации (двухпраймерной амплификации катящимся кольцом), основанный на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА" между донорным и акцепторным красителями, входящими в составы первого и второго праймеров

6 Произведено объединение технологии амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с регистрацией этого процесса в реальном времени с помощью цикли-рующих химерных ДНК/РПК/ДНК-проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов

7 Показана принципиальная возможность применения разработанных подходов амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот для диагностики возбудителей различных инфекций и обнаружения генетически-модифицированных растений, а также для анализа активности транскрипции бе-зынгронных и содержащих интроны генов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Чемерис Д А, Нишноров Ю М., Вахигов В А Гибридизационная цепная реакция в режиме реального времени// Доклады Академии наук 2008 Т419 №1 С 123-125

2 Чемерис А В , Бикбулатова С М , Чемерис Д А , Вахитов В А Новая старая ДНК//Уфа, 2005 143 С

3 Чемерис А В , Никоноров Ю М, Чемерис Д А, Гарафутдинов Р Р, Романен-кова М JI, Матниязов Р Т, Гималов Ф Р , Малеев Г В , Вахигов В А ПЦР, ЛЦР и ГЦР - цепные реакции нуклеиновых кислот в режиме реального времени // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии 2005 -Т 1,№2 -С 5-14

4 Chemens А V , Nikonorov Yu М, Romanenkova М L , Chemens D А , Garafut-dinov R R , Magazova R A, Maleev G V , Vakhitov V A, Vasilov R G Novel methods of amplifying DNA or RNA with real-time PCR // Umted States Patent Application Publication No 2007/0117125 Al, May, 24 2007

5 Чемерис А В , Никоноров Ю M, Романенкова М JI, Чемерис Д А , Гарафутдинов Р Р, Магазова Р А , Малеев Г А, Вахигов В А, Василов Р Г Способ де-

20

текции специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Опубликованная заявка на патент РФ № 2005132940 с приоритетом от 01 03 2006 г (Бюлл № 33 от 27 11 2007 г )

6 Матшмзов Р Т , Гималов Ф Р, Чемерис Д А , Никоноров Ю М, Вахитов В А , Чемерис А В , Магданов Э Г , Постригань Б Н, Князев А В Способ детекции в режиме реального времени специфичных фрагментов РНК с помощью полимеразной цепной реакции без применения ДНКазы // Заявка на патент РФ № 2007138956 с приоритетом от 22 октября 2007 г

7 Гарафутдинов Р Р , Никоноров Ю М, Чемерис Д А, Постригань Б Н , Филатова О В , Талипов Р Ф, Чемерис А В , Вахитов В А Объединение технологий циклической пробы и молекулярного сигнального огня для детекции однонуклео-тидных замен в режиме реального времени И Материалы III съезда Общества биотехнологов России Москва, 2005 - С 12-13

8 Никоноров ЮМ., Чемерис ДА, Гарафутдинов РР, Ромапенкова МЛ, Малеев Г В, Чемерис А В, Вахитов В А Новые методы улучшенной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК в режиме реального времени с помощью цепных реакций нуклеиновых кислот - полимеразной (ПЦР), лигазной (ЛЦР) и гибридизационной (ГЦР) // Материалы Ш съезда Общества биотехнологов России Москва, 2005 -С 19-20

9 Чемерис А В , Никоноров Ю М , Чемерис Д А, Романенкова МЛ , Матния-зов Р Т , Князев А В , Гималов Ф Р , Вахитов В А Детекция в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью основанных на РКЕТ-эффекте полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций // Третья международная конференция из серии Наука и бизнес Международное сотрудничество в биотехнологии Ожидания и реальность Пущино, 2006 С 77-80

10 Чемерис Д А, Романенкова М Л, Матниязов Р Т Использование основанных на эффекте переноса флуоресцентной резонансной энергии полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций для детекции в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК // Международная школа-конференция молодых ученых "Биотехнология будущего" Санкт-Петербург, 2006 С 97-99

11 Чемерис Д А Гибридизационная цепная реакция (ГЦР) в реальном времени, основанная на эффекте флуоресцентного резонансного переноса энергии // Сбор-

ник тезисов XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" М, 2006 С 24-25

12 Романенкова М JI, Никоноров Ю М, Чемерис Д А, Чемерис А В , Туйгу нов М М, Вахитов В А Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) в диагностике геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" Уфа, 2006 С 83-88

13 Жукова И Ю , Чемерис Д А , Никоноров Ю М, Мавзютов А Р Новый метод детекции Chlamydia trachomatis в реальном времени с помощью полимеразной цепной реакции посредством амплификации фрагмента гена белка внешней мембраны // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века», г Уфа, 2007 С 48-50

14 Магазова Р А, Чемерис Д А, Никоноров Ю М, Мавзютов А Р Амплификация фрагмента гена ДНК полимеразы Treponema pallidum pallidum с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века», г Уфа, 2007 С 83-84

15 Магазова Р А, Чемерис Д А, Никоноров Ю М, Чемерис А В, Мавзютов Р А Новый метод детекции Treponema pallidum амплификацией фрагмента гена ДНК-полимеразы с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007, Т 3 С 61-62

16 Матниязов Р Т , Князев А В , Чемерис Д А, Постригань Б Н , Чемерис А В Надежное подтверждение произошедшего трансгеноза при получении трансгенных растений с помощью агробактериальной трансформации // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона го физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века», г Уфа, 2007 , С 89-91

17 Чемерис ДА Исследования особенностей протекания гибридизационной цепной реакции // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века», г Уфа, 2007 С 139-140

ЧЕМЕРИС Дмитрий Алексеевич

ГИБРИДИЗАЦИОННАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ И ДРУГИЕ СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ И ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ СПЕЦИФИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 23 09 08 Формат 60 х 84'/16 Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Печать на ризографе Услпечл 1,4 Уч-издл 1,5 Тираж 100 экз Заказ № 108

Издательство «Гилем» АН РБ 450077, г Уфа, ул Кирова, 15 Тел 273-05-93,272-36-82 gilem@anrb ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чемерис, Дмитрий Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК.

1.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ

1.3. Лигазная цепная реакция - ЛЦР.

1.4. Амплификация смещением цепи - Strand Displacement Amplification (SDA).

1.5. Амплификация по типу катящегося кольца или рамификация

1.6. Самоподдерживающая репликация., 5.

1.7. Технология циклирующей пробы.

1.8. Гибридизационная цепная реакция - ГЦР.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Выделение и очистка нуклеиновых кислот.7.

2.3. Получение кДНК.

2.4. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

2.7. Транскрипционная цепная реакция в реальном времени.

2.8. Рамификация в реальном времени.

2.9. Проведение амплификации по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы в реальном времени.

2.10. Электрофоретический анализ ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот.

2.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.12. Использованные в работе обычные и модифицированные олигонуклеотиды.

2.13. Основные реактивы, использованные в работе.

2.14. Составы использованных стандартных растворов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени.

3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

3.3. Транскрипционная цепная реакция в реальном времени.

3.4. Рамификация в реальном времени.

3.5. Амплификация по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы.

3.6. Применимость реакций амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени для фундаментальных исследований и диагностических целей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гибридизационная цепная реакция и другие способы амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в режиме реального времени"

Актуальность темы. После своего появления в середине 80-х гг. полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Saiki et al., 1985; 1988] очень быстро стала по существу методом №1 в фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике. Оставаясь таковым и поныне, она все же сильно изменилась, что в первую очередь связано с переводом этой реакции в режим реального времени, где детекция накопления ампликонов ведется в ходе самого процесса амплификации. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) во многом изменила взгляды как исследователей, использующих метод ПЦР для получения новых знаний о функционировании генов и геномов, так и тех, кто занят исключительно ДНК-диагностикой. Если для первых главным среди других задач является возможность количественного определения с помощью ПЦР-РВ числа копий той или иной мишени в стартовом материале, то вторые, помимо этого, отдают ей предпочтение еще и ввиду практически полного исключения загрязнения ампликонами рабочих помещений, и сведения таким образом, риска получения ложнопозитивных результатов к абсолютному минимуму, что при массовом характере анализов при использовании обычной ПЦР удается добиться далеко не всегда. Однако, несмотря на большое количество предложенных вариантов детекции ампликонов в ПЦР-РВ [Higuchi et al., 1993; Lee et al., 1993; Livak et al., 1995; Tyagi et al., 1996; 2000; Nazarenko et al., 1997; 2002; Wittwer et al., 1997; 2003; Whitcombe et al., 1999; Todd et al., 2000; Rasmussen et al., 2003; Zhang et al., 2003; Costa et al., 2004; Sherrill et al., 2004; Monis et al., 2005; Li et al., 2006; Ahmad, Ghasemi, 2007; Liu, Hong, 2007; Luk et al., 2007 и др.] остается возможность разработки новых способов, по некоторым параметрам превосходящих существующие.

Вслед за ПЦР на рубеже 90-х гг. появился целый ряд других реакций амплификации и способов высокочувствительной детекции специфичных фрагментов ДНК или РНК, среди которых можно отметить лигазную цепную реакцию (ЛЦР) [Wu, Wallace, 1989; Barany 1991], амплификацию смещением цепи [Walker et al., 1992], ее разновидность в виде амплификации катящимся кольцом [Lizardi et al., 1998; Zhang et al., 1998], технологию циклирующей пробы [Duck et al., 1990], самоподцерживающаюся репликацию [Kwoh et al., 1989; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991], Qp-репликазную амплификацию [Lomeli et al., 1989], разветвленную гибридизационную пробу [Urdea, 1987; Horn et al, 1997]. К настоящему времени большинство из них переведены в передовой и наиболее удобный для диагностики режим реального времени, однако в ряде случаев такой перевод оказался не очень эффективным и не лишенным серьезных недостатков.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов изотермических и управляемых сменой температур реакций амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот в режиме реального времени и демонстрации возможности их применения на практике.

В задачи исследования входило:

1) преобразовать гибридизационную цепную реакцию нуклеиновых кислот в режим реального времени (ГЦР-РВ) и исследовать ее особенности;

2) разработать способы детекции ампликонов в ходе ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), основанные на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET-эффекте) и эффекте гашения;

3) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов РНК с помощью транскрипционной цепной реакции (самоподдерживающейся репликации) на платформе "УФА" в реальном времени (ТЦР-РВ);

4) разработать новый способ детекции ампликонов на платформе "УФА" в ходе двухпраймерной амплификации катящимся кольцом (рамификации) в реальном времени;

5) разработать новый способ детекции специфичных фрагментов ДНК путем объединения технологии циклирующей пробы с амплификацией по типу катящегося кольца с образованием множественных дезоксирибозимов 10-23;

6) показать возможность использования разработанных методов амплификации и высокочувствительной детекции для фундаментальных и прикладных исследований. Научная новизна и практическая значимость. Разработаны варианты ГЦР-РВ, основанные на временном гашении свечения флуорохрома темновым гасителем и использовании РЫЕТ-эффекта. Продемонстрирована высокая специфичность данной реакции, позволяющая дискриминировать инициаторные молекулы с единичными заменами нуклеотидов, что может быть использовано при анализе однонуклеотидного полиморфизма ДНК высших организмов. Показана возможность использования в ГЦР молекул РНК в качестве инициатора самосборки без их перевода в к ДНК. Разработаны улучшенные способы детекции накопления ампликонов в ПЦР-РВ на платформе "УФА", по большинству параметров превосходящие аналогичные методы. Разработан вариант проведения ТЦР-РВ, основанный на РКЕТ-эффекте на платформе "УФА". Показано, что протекание двухпраймерной рамификации в реальном времени может контролироваться с помощью регистрации РКЕТ-эффекта на платформе "УФА". Произведено объединение технологии амплификации ДНК катящимся кольцом с регистрацией этого процесса с помощью циклирующих проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов.

Практическая значимость работы заключается в расширении спектра методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей ДНК или РНК в реальном времени. Показана возможность их использования как для фундаментальных, так и прикладных целей, в том числе для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны, а также безынтронных генов без ДНКазной обработки, для детекции коронавируса, хантавируса, вируса птичьего гриппа субтипа Н5Ы1, бледной трепонемы, хламидий, а также для выявления генетически модифицированных растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Ш съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Путцино, 2005), 3-ей международной конференции "Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность" (Пущино, 2006), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), всероссийской научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (Уфа, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007). Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ -НШ-2217.2003.4, НШ-1003.2006.4, НШ-649.2008.4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№02.445.11.7018, 02.445.11.7381, 02.512.11.2051, 02.512.11.2107, 02.512.12.0002; Фонда СР МФП НТС № 5490р/7971. Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 207 работ. Диссертация изложена на 160 страницах, содержит 46 рисунков и 3 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чемерис, Дмитрий Алексеевич

выводы

1. Показано, что в гибридизационной цепной реакции, переведенной нами в режим реального времени (ГЦР-РВ), под действием инициаторных молекул происходит линейный рост наноструктур из особым образом сконструированных двух типов олигонуклеотидных шпилек, способный дискриминировать единичные замены нуклеотидов в последовательности-мишени.

2. Предложены два варианта ГЦР-РВ:

- вариант 1 основан на детекции увеличивающейся флуоресценции красителя за счет исчезновения эффекта гашения, происходящего при поэтапном удлинении цепей ДНК и разнесении в пространстве пар молекул флуорохром/гаситель, которые находятся в самособирающихся олигонуклеотидных шпильках одного типа;

- вариант 2 рассчитан на детекцию роста цепей ДНК по увеличению свечения красителя-акцептора после переноса на него флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора, входящих по отдельности в составы аналогичных олигонуклеотидных шпилек разных типов.

3. Разработаны два скоростных и высокочувствительных способа детекции ампликонов в полимеразной цепной реакции в реальном времени на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация), один из которых основан на переносе флуоресцентной резонансной энергии между донорным и акцепторным красителями, входящими в составы прямого и обратного праймеров, отжигающихся в непосредственной близости друг от друга (встык или с условным перекрытием в один нуклеотид); второй способ рассчитан на эффект гашения флуорохрома соответствующим гасителем, входящих в составы праймеров, отжигающихся аналогичным образом.

4. Предложен способ обнаружения специфичных фрагментов РНК путем детекции в реальном времени появления постоянных ДНК-ампликонов в процессе протекания транскрипционной цепной реакции, основанный на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА" между донорным и акцепторным красителями, входящими в составы первого и второго праймеров.

5. Предложен способ детекции в реальном времени протекания реакции рамификации (двухпраймерной амплификации катящимся кольцом), основанный на переносе флуоресцентной резонансной энергии на платформе "УФА" между донорным и акцепторным красителями, входящими в составы первого и второго праймеров.

6. Произведено объединение технологии амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с регистрацией этого процесса в реальном времени с помощью циклирующих химерных ДНК/РНК/ДНК-проб, расщепляемых под действием образующихся при смещении цепи ДНК множественных дезоксирибозимов.

7. Показана принципиальная возможность применения разработанных подходов амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот для диагностики возбудителей различных инфекций и обнаружения генетически-модифицированных растений, а также для анализа активности транскрипции безынтронных и содержащих интроны генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время практически ни одна работа в молекулярной биологии, где объектами исследований являются нуклеиновые кислоты, не обходится без этапа их амплификации или высокочувствительной детекции. Что касается диагностических анализов, то и они сейчас преимущественно рассчитаны на амплификацию, главным образом, с помощью ПЦР специфичных фрагментов ДНК или РНК, которые могут принадлежать организмам всех уровней сложности, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Причины столь широкого применения таких методов заключаются, с одной стороны, в скорости и относительной простоте амплификации фрагментов нуклеиновых кислот, а с другой - в их повышенной чувствительности и специфичности, благодаря чему экспериментаторы в короткие сроки могут получать достоверные результаты. Новый импульс ДНК/РНК амплификации придал перевод ПЦР в режим реального времени, который открыл новые перспективы в фундаментальных исследованиях и предоставил новые возможности для диагностики. При этом вариантов детекции накопления ампликонов в ПЦР в режиме реального времени разработано в мире уже свыше трех десятков, но лишь на основе только шести из них выпускаются коммерческие наборы. Повышенный интерес к амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот и разработке все новых их способов объясняется еще и тем, что это в настоящее время многомиллиардный и быстро растущий бизнес.

В данной работе для ГЦР нами предложены два варианта ее протекания в реальном времени. В одном из них ведется регистрации флуоресценции, возникающей вследствие исчезновения эффекта гашения при разнесении в пространстве пары молекул - флуорохром/гаситель, входящих в состав одного из шпилечных олигонуклеотидов. Во втором - за счет БИЕТ-эффекта между донорным и акцепторным красителями, входящими по отдельности в состав пары подобных шпилек, подвергающихся самосборке. Важным моментом является высокая специфичность этой реакции, способная дискриминировать в исследуемых образцах однонуклеотидные замены. Поскольку ГЦР протекает без участия каких-либо ферментов и в ней происходит рост наноструктур, то ее вполне можно считать нанобиотехнологией.

Предложены два скоростных варианта детекции целевых продуктов с помощью ПЦР-РВ на платформе "УФА", особенностью которой является максимально сближенное расположение прямого и обратного праймеров, дающее целый ряд преимуществ. В одном варианте прямой и обратный праймеры содержат в своем составе красители - донор и акцептор, что обеспечивает возникновение между ними БКЕТ-сигнала. Во втором варианте прямой и обратный праймеры несут краситель и его гаситель, что ведет к возникновению эффекта гашения при их объединении в едином двуцепочечном ампликоне. Другим преимуществом является то, что благодаря малому размеру ампликонов становится возможна амплификация мелких обломков молекул ДНК или РНК, отсутствует необходимость проведения отдельной стадии элонгации, что приводит к заметному сокращению времени реакции, а снижение температуры денатурации обеспечивает в целом более надежную амплификацию, поскольку уменьшается время пребывания ДНК полимеразы при высоких (не оптимальных) температурах. Весьма важным является то, что ПЦР-РВ на платформе "УФА" представляет собой реакцию с неким самоконтролем специфичности амплификации, поскольку позволяет на стадии плавления идентифицировать образование возможных праймерных гетеродимеров, которые могли бы привести к ложно-позитивным результатам.

Перевод ПЦР в режим реального времени не мог не повлиять на уже существующие и только разрабатываемые реакции амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот. Так, для исследуемых, в том числе, в данной работе однопраймерной и двупраймерной амплификаций катящимся кольцом ранее уже было предложено несколько вариантов детекции результатов в реальном времени. Предлагаемые нами способы детекции принципиально иные. В одном из них рост флуоресцентного сигнала обеспечивается путем образования множественных дезоксирибозимов и разрушения ими химерных ДНК/РНК/ДНК-проб, содержащих краситель с гасителем. В другом - изменение флуоресценции реакционной смеси вызывается переносом флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора на краситель-акцептор, входящих в состав двух праймеров, которые отжигались на "С-пробе" встык согласно разработанному нами принципу "УФА", подтверждая тем самым его действительную универсальность. Еще одно подтверждение универсальности принципа «УФА» исходит из осуществленного перевода ТЦР в режим реального времени, где сближенное расположение праймеров также обеспечивает РКЕТ-эффект.

Показано применение разработанных нами методов для детекции в реальном времени возбудителей вирусных и бактериальных инфекций, оценки уровня экспрессии отдельных генов у растительных и животных организмов, а также для анализа однонуклеотидного полиморфизма ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чемерис, Дмитрий Алексеевич, Уфа

1. Белохвостов А.С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1995. -№1, - С.21-26.

2. Гарафутдинов P.P. Новые методы детекции однонуклеотидных замен и общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодирования: Автореф. дисс. канд. биол. наук / P.P. Гарафутдинов; Инст-т биохим. генет. УНЦ РАН Уфа, 2006. - 23 с.

3. Лысов Ю.П., Флорентьев В.Л., Хорлин А.А. и др. Определение нуклеотидной последовательности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами. Новый метод // ДАН СССР. 1988. - Т.ЗОЗ. - С.1508-1511.

4. Abravaya К., Carrino J.J., Muldoon S. Lee H.H. Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR) // Nucleic Acids Res. 1995. -V. 23.-P. 675-682.

5. Adler M., Schulz S., Fischer R., Niemeyer C.M. Detection of Rotavirus from stool samples using a standardized immuno-PCR ("Imperacer") method with end-point and real-time detection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. -V. 333.-P. 1289-1294.

6. Adler M., Wacker R., Niemeyer M. A real-time immuno-PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003. V. 308. - P. 240-250.

7. Ahmad A.I., Ghasemi J.B. New unsymmetrical cyanine dyes for real-time thermal cycling // Anal.Bioanal.Chem. 2007. -V.389. - P. 983-988.

8. Alves A.M., Carr F.J. Dot blot detection of point mutations with adjacently hybridising synthetic oligonucleotide probes // Nucleic Acids Res. 1988. -V.16.-P. 8723.

9. Amicarelli G., Shehi E., Makrigiorgos G.M., Adlerstein D. FLAG assay as a novel method for real-time signal generation during PCR: application to detection and genotyping of KRAS codon 12 mutations // Nucleic Acids Res. -2007. — V. 35. -el31.

10. An L., Tang W., Ranalli T.A., Kim H.J., Wytiaz J., Kong H. Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplification // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 28952-28958.

11. Auer T., Sninsky J.J., Gelfand D.H., Myers T.W. Selective amplification of RNA utilizing the nucleotide analog dITP and Thermus thermophilus DNA polymerase // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 5021-5025.

12. Backman K. Ligase Chain Reaction: Diagnostic technology for the 1990s and beyond // Clin. Chem. 1992. - V. 38. - P. 457-458.

13. Bains W., Smith G.C. A novel method for nucleic sequence determination // J. Theor. Biol. 1988. -V. 135. - P. 303-307.

14. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 189-193.

15. Barany F. The ligase chain reaction in a PCR world // PCR Methods Applic.1991a.-V. l.-P. 5-16.

16. Barletta J. Applications of real-time immuno-polymerase chain reaction (rt

17. CR) for the rapid diagnoses of viral antigens and pathologic proteins // Mol.

18. Aspects Med. 2006. - V. 27. - P. 224-253.

19. Barletta J.M., Edelman D.C., Highsmith W.E., Constantine N.T. Detection of ultra-low levels of pathologic prion protein in scrapie infected hamster brain140homogenates using real-time immuno-PCR // J. Virol. Methods. 2005. - V. 127.-P. 154-164.

20. Barringer K.J., Orgel L., Wahl G., Gingeras T.R. Blunt-end and single-strand ligations by Escherichia coli ligase: influence on an in vitro amplification scheme//Gene.-1990.-V. 89.-P. 117-122.

21. Bekkaoui F., Poisson I., Crosby W., Cloney L., Duck P. Cycling probe technology with RNase H attached to an oligonucleotide // Biotechniques. -1996. -V.20.- P. 240-248.

22. Birkenmeyer L.G., Mushahwar I.K. DNA probe amplification methods // J. Virol. Methods. 1991. -V. 35. - P. 117-126.

23. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - P. 1513-1523.

24. Birkenmeyer L., Armstrong A.S. Preliminary evaluation of the ligase chain reaction for specific detection of Neisseria gonorrhoeae // J. Clin. Microbiol. -1992. V. 30. - P. 3089-3094.

25. Bois J.S., Venkataraman S., Choi H.M., Spakowitz A.J., Wang Z.G., Pierce N.A. Topological constraints in nucleic acid hybridization kinetics // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. 4090-4095.

26. Bolton E., McCarthy B. A general method for the isolation of RNA complementary to DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1962. - V.48. -P.1390-1397.

27. Britten R.J., Kohne D.E. Repeated sequences in DNA. Hundreds of thousands of copies of DNA sequences have been incorporated into the genomes of higher organisms // Science. 1968. - V. 161. - P. - 529-540.

28. Bronstein I., Voyta J.C., Edwards B. A comparison of chemiluminescent and colorimetric substrates in a hepatitis B virus DNA hybridization assay // Anal. Biochem. 1989. -V. 180. - P. 95-98.

29. Cairns M.J., Turner R., Sun L.Q. Homogeneous real-time detection and quantification of nucleic acid amplification using restriction enzyme digestion // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2004. - V. 318. - P. 684-690.

30. Cardullo R.A, Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8790-8794.

31. Chen R., Huang W., Lin Z., Zhou Z., Yu H., Zhu D. Development of a novel real-time RT-PCR assay with LUX primer for the detection of swine transmissible gastroenteritis virus // J. Virol. Methods. 2004. - V. 122. - P. 5761.

32. Chen X., Livak K.J., Kwok P.Y. A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test // Genome Res. 1998. - V. 8. - P. 549-556.

33. Clegg R.M., Murchi A.I.H., Zechel A., Lilley D.M.J. Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 2994-2998.

34. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. -V. 162.-P. 156-159.

35. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification // Nature. 1991. -V.350. - P.91-92.

36. Costa J.M., Ernault P., Olivi M., Gaillon T., Arar K. Chimeric LNA/DNA probes as a detection system for real-time PCR // Clin. Biochem. 2004. - V.37. - P.930-932.

37. Costa A.M., Lamb D., Garland S.M., Tabrizi S.N. Evaluation of LightCycler as a platform for nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) in real-time detection of enteroviruses // Curr.Microbiol. 2008. - V. 56. - P. 80-83.

38. Crockett A.O., Wittwer C.T. Fluorescein-labeled oligonucleotides for real-time per: using the inherent quenching of deoxyguanosine nucleotides // Anal. Biochem. 2001. - V. 290. - P. 89-97.

39. Dahl F., Baner J., Gullberg M., Mendel-Hartvig M., Landegren U., Nilsson M. Circle-to-circle amplification for precise and sensitive DNA analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -V. 101. -P. 4548-4553.

40. Demchinskaya A.V., Shilov I.A., Karyagina A.S., Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction // J. Biochem. Biophys. Methods. -2001. -V. 50. №1.-P. 79-89.

41. Denhardt D.T. A membrane-filter technique for the detection of complementary DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1966. - V. 23. - P. 641-646.

42. Dickinson Laing T., Mah D.C., Poirier R.T., Bekkaoui F., Lee W.E., Bader D.E. Genomic DNA detection using cycling probe technology and capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence // Mol. Cell. Probes. 2004. -V.18. - P. 341-348.

43. Didenko V.V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications // Biotechniques. 2001. - V. 31 - P. 11061111.

44. Dirks R.M., Pierce N.A. Triggered amplification by hybridization chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P. 15275-15278.

45. Drmanac R., Labat I., Brukner I., Crkvenjakov R. Sequencing of megabase plus DNA by hybridization: theory of the method // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 114-128.

46. Duck P., Alvarado-Urbina G., Burdick B., Collier B. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides // BioTechniques. 1990. - V. 9. - P. 142-148.

47. Eggerding F.A. A one-step coupled amplification and oligonucleotide ligation procedure for multiplex genetic typing // PCR Methods Appl. 1995. - V. 4. -P. 337-345.

48. Fong W.K., Modrusan Z., McNevin J.P., Marostenmaki J., Zin B., Bekkaoui F. Rapid solid-phase immunoassay for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using cycling probe technology // J. Clin. Microbiol.2000. V.38. - P. 2525-2529.

49. Forster T. Energiewanderung und fluoreszenz // Naturwissenschaften. 1946. -V. 33.-P. 166-175.

50. Forster T. Zwischenmoleculare energiewandenderung und fluoreszenz // Ann. Phys. (Leipzig). 1948. - V. 2. - P. 55-75. (ijht. no Didenko, 2001).

51. French D.J., Archard C.L., Brown T., McDowell D.G. HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination // Mol. Cell. Probes.2001.-V. 15.-P. 363-374.

52. Gbaj A., Walsh L., Rogert M.C., Sardarian A., Bichenkova E.V., Etchells L.L., Whitcombe D., Douglas K.T. Target-assembled exciplexes based on Scorpion oligonucleotides // Biosci.Rep. 2008. - V. 28. - P. 1-5.

53. Getz M.J., Altenburg L.C., Saunders G.F. The use of RNA labeled in vitro with iodine-125 in molecular hybridization experiments // Biochim. Biophys. Acta. -1972.-V. 287.-P. 485-494.

54. Gillespie D., Spiegelman S. A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane // J. Mol. Biol. 1965. - V. 12. - P. 829-842.

55. Gingeras T.R., Higuchi R., Kricka L.J., Lo Y.M., Wittwer C.T. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics // Clin. Chem. 2005. - V.51. - P.661-671.144

56. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. - V.85. - P.609-613.

57. Hagiwara M., Sasaki H., Matsuo K., Honda M., Kawase M., Nakagawa H. Loop-mediated isothermal amplification method for detection of human papillomavirus type 6, 11, 16, and 18 // J.Med.Virol. 2007. - V.79. - P.605-615.

58. Hall B.D., Spiegelman S. Sequence complementarity of T2-DNA and T2-specific RNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1961. - V. 47. - P. 137-146.

59. Harvey J.J., Lee S.P., Chan E.K., Kim J.H., Hwang E.S., Cha C.Y., Knutson J.R., Han M.K. Characterization and applications of CataCleave probe in realtime detection assays // Anal. Biochem. 2004. - V. 333. - P. 246-255.

60. Hayashi M.N., Hayashi M., Spiegelman S. Chromatographic separation of annealed and enzymatically synthesized RNA-DNA hybrids // Biophys J. -1965.-V. 5.-P. 231-246.

61. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. 1992. - V. 10. -P.413-417.

62. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: realtime monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. — V. 11. — P.1026-1030.

63. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—»31 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88.-P. 7276-7280.

64. Horn T., Chang C.A., Urdea M.S. Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4842-4849.

65. Horn T., Chang C.A., Urdea M.S. An improved divergent synthesis of comb-type branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) containing multiple secondary sequences // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4835-4841.

66. Housby J.N., Southern E.M. Thermus scotoductus and Rhodothermus marinus DNA ligases have higher ligation efficiencies than thermus thermophilus DNA ligase // Anal. Biochem. 2002. - V. 302. - P. 88-94.

67. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L., Nordgren S., Svanvik N., Westman G., Kubista M., Sjoback R., Sehlstedt U. Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes // Mol Cell Probes. 2000. - V. 14. - P. 321-328.

68. Johnson S.C., Sherrill C.B., Marshall D.J., Moser M.J., Prudent J.R. A third base pair for the polymerase chain reaction: inserting isoC and isoG // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 1937-1941.

69. Jurinke C., van den B.D., Jacob A., Tang K., Worl R., Koster H. Analysis of ligase chain reaction products via matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-mass spectrometry // Anal. Biochem. 1996. - V. 237. - P. 174181.

70. Kalin I., Shephard S., Candrian U. Evaluation of the ligase chain reaction (LCR) for the detection of point mutations // Mutat Res. 1992. - V.283. -P.l 19-123.

71. Kandimalla E.R., Agrawal S. "Cylicons" as hybridization-based fluorescent primer-probes: Synthesis, properties and application in real-time PCR // Bioorg. Med. Chem. 2000. - V. 8. - P. 1911-1916.

72. Keightley M.C., Sillekens P., Schippers W., Rinaldo C., George K.S. Real-time NASBA detection of SARS-associated coronavirus and comparison with realtime reverse transcription-PCR // J.Med.Virol. 2005. - V. 77. - P. 602-608.

73. Kohler O., Jarikote D.V., Seitz O. Forced intercalation probes (FIT Probes): thiazole orange as a fluorescent base in peptide nucleic acids for homogeneous single-nucleotide-polymorphism detection // Chembiochem. 2005. — V. 6. - P. 69-77.

74. K00 K., Jaykus L.A. Detection of single nucleotide polymorphisms within the Listeria genus using an 'asymmetric' fluorogenic probe set and fluorescence resonance energy transfer based-PCR // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - V. 35. -P. 513-517.

75. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique // Science. 1988. -V. 241. - P. 1077-1080.

76. Landegren U. Molecular mechanics of nucleic acid sequence amplification // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P. 199-204.

77. Leary J J., Brigati D.J., Ward D.C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V.80. -P.4045-4049.

78. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes // Nucl. Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 37613766.

79. Lee M.A., Siddle A.L., Page R.H. ResonSense®: simple linear fluorescent probes for quantitative homogenous rapid polymerase chain reaction // Anal. Chim. Acta. 2002. V.457. P.61-70.

80. Li J., Chu X,. Liu Y., Jiang J.H., He Z., Zhang Z., Shen G., Yu R.Q. A colorimetric method for point mutation detection using high-fidelity DNA ligase // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - el68.

81. Li J., Wang F., Mamon H., Kulke M.H., Harris L., Maher E., Wang L., Makrigiorgos G.M. Antiprimer quenching-based real-time PCR and its application to the analysis of clinical cancer samples // Clin.Chem. 2006. - V. 52. - P. 624-633.

82. Li J., Makrigiorgos G.M. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping // Nat.Protoc. 2007. - V. 2. - P. 50-58.

83. Li J J., Chu Y., Lee B.Y., Xie X.S. Enzymatic signal amplification of molecular beacons for sensitive DNA detection // Nucleic Acids Res. 2008. - V.36. -e36.

84. Liew M., Pryor R., Palais R., Meadows C., Erali M., Lyon E., Wittwer C. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons // Clin. Chem. 2004. V.50. - P. 1156-1164.

85. Luk, K. C.; Devare, S. G.; Hackett, J. R., Jr. Partially double-stranded linear DNA probes: novel design for sensitive detection of genetically polymorphic targets // J.Virol.Methods 2007. - V. 144. - P. 1-11.

86. Lizardi P.M., Huang X., Zhu Z., Bray-Ward P., Thomas D.C., Ward D.C. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification //Nat. Genet. 1998. - V.19. - P. 225-232.

87. Lomeli H., Tyagi S., Pritchard C.G., Lizardi P.M., Kramer F.R. Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization probes // Clin., Chem. — 1989.-V. 35.-P. 1826-1831.

88. Luo J., Bergstrom D.E., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 3071-3078.

89. Lyamichev V.I., Kaiser M.W., Lyamicheva N.E., Vologodskii A.V., Hall J.G., Ma W.P., Allawi H.T., Neri B.P. Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction // Biochemistry. 2000. — V. 39. — P. 9523-9532.

90. Marras S.A., Kramer F.R., Tyagi S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes // Nucl. Acids Res. 2002. - V.30. - el22.

91. Mori Y., Nagamine K., Tomita N., Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 289. -P. 150-154.

92. Mori Y., Kitao M., Tomita N., Notomi T. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA // J. Bioch. Bioph. Meth. 2004. - V.59. -P.145-157.

93. Mori Y., Hirano T., Notomi T. Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers // BMC Biotechnol. 2006. - V.6. -P.3.

94. Nadeau J.G., Pitner J.B., Linn C.P., Schram J.L., Dean C.H., Nycz C.M. Realtime, sequence-specific detection of nucleic acids during strand displacement amplification // Anal. Biochem. 1999. - V. 276. - P. 177-187.

95. Nagamine K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers // Mol. Cell Probes. — 2002. V.16. -P. 223-229.

96. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. -V. 25. - P. 2516-2521.

97. Nazarenko I., Lowe B., Darfler M., Ikonomi P., Schuster D., Rashtchian A. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - e37.

98. Nelson N.C., Kacian D.L. Chemiluminescent DNA probes: a comparison of the acridinium ester and dioxetane detection systems and their use in clinical diagnostic assays // Clin. Chim. Acta. 1990. - V. 194. - P. 73-90.

99. Nickerson D.A., Kaiser R., Lappin S., Stewart J., Hood L., Landegren U. Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 8923-8927.

100. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification // Trends Biotechnol. 2005. - V.23. -P.208-216.

101. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Detecting antigens by quantitative immuno-PCR // Nat.Protoc. 2007. - V. 2. - P. 1918-1930.

102. Nilsson M., Malmgren H., Samiotaki M., Kwiatkowski M., Chowdhary B.P., Landegren U. Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection // Science. 1994. - V. 265. - P. 2085-2088.

103. Nilsson M., Barbany G., Antson D.O., Gertow K., Landegren U. Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation // Nat. Biotechnol. 2000. - V.18. - P.791-793.

104. Nilsson M., Antson D.O., Barbany G., Landegren U. RNA-templated DNA ligation for transcript analysis // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 578581.

105. Nilsson M.} Dahl F., Larsson C., Gullberg M., Stenberg J. Analyzing genes using closing and replicating circles // Trends Biotechnol. — 2006. — V.24. — P.83-88.

106. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic Acids Res.-2000.-V. 28.-E63.

107. Nuovo G.J., Hohman RJ., Nardone G.A., Nazarenko I.A. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers // J. Histochem. Cytochem. 1999. V.47. P.273-279.

108. Nurmi J., Ylikoski A., Soukka T., Karp M., Lovgren T. A new label technology for the detection of specific polymerase chain reaction products in a closed tube // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - e28.

109. Patterson S.S., Smith M.W., Casper E.T., Huffinan D., Stark L., Fries D., Paul J.H. A nucleic acid sequence-based amplification assay for real-time detection of norovirus genogroup II // J.Appl.Microbiol. 2006. V. 101. - P. 956-963.

110. Pham H.M., Nakajima C., Ohashi K.} Onuma M. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus // J. Clin. Microbiol. 2005. - V. 43. - P. 1646-1650.

111. Prensky W., Steffensen D.M., Hughes W.L. The use of iodinated RNA for gene localization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - V. 70. - P. 18601864.

112. Pritchard C.E., Southern E.M., Effects of base mismatches on joining of short oligodeoxynucleotides by DNA ligases // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. -P. 3403-3407.

113. Renz M., Kurz C. A colorimetric method for DNA hybridization // Nucleic Acids Res. 1984. -V. 12. - P. 3435-3444.

114. Reynisson E., Josefsen M.H., Krause M., Hoorfar J. Evaluation of probe chemistries and platforms to improve the detection limit of real-time PCR // J.Microbiol.Methods 2006. V. 66. - P. 206-216.

115. Rizzo J., Gifford L.K., Zhang X., Gewirtz A.M., Lu P. Chimeric RNA-DNA molecular beacon assay for ribonuclease H activity // Mol. Cell. Probes. 2002. -V. 16.-P. 277-283.

116. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - V. 239. - P. 487-491.

117. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of side cell anemia // Science. — 1985. — V. 230.-P. 1350-1354.

118. Sano T.} Smith C.} Cantor C.R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates // Science. 1992. V.258. -P.120-122.

119. Santoro S.W., Joyce G.F., A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme //

120. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 4262-4266. 150.Schachter J. DFA, EIA, PCR, LCR and other technologies: what tests should be used for diagnosis of chlamydia infections? // Immunol Invest. - 1997. - V. 26.-P. 157-161.

121. Seeman N.C. DNA engineering and its application to nanotechnology // Trend.

122. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 437-443. 154.Seeman N.C. From genes to machines: DNA nanomechanical devices //

123. Sherrill C.B., Marshall D.J., Moser M.J., Larsen C.A., Daude-Snow L., Jurczyk S., Shapiro G., Prudent J.R. Nucleic acid analysis using an expanded genetic alphabet to quench fluorescence // J. Am. Chem. Soc. 2004. V.126. P.4550-4556.

124. Sismour A.M., Benner S.A. The use of thymidine analogs to improve the replication of an extra DNA base pair: a synthetic biological system // Nucl. Acids Res. 2005. V.33. P.5640-5646.

125. Smolina I.V., Demidov V.V., Cantor C.R., Broude N.E. Real-time monitoring of branched rolling-circle DNA amplification with peptide nucleic acid beacon // Anal. Biochem. 2004. - V. 335. - P. 326-329.

126. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P. 503-517.

127. Southern E.M., Maskos U., Elder J.K. Analyzing and comparing nucleic acid sequences by hybridization to arrays of oligonucleotides: evaluation using experimental models // Genomics. 1992. - V. 13. - P. 1008-1017.

128. Spargo C.A., Fraiser M.S., Van Cleve M., Wright D.J., Nycz C.M., Spears P.A., Walker G.T. Detection of M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification // Mol. Cell Probes. 1996. - V. 10. - P. 247-256.

129. Stryer L., Haugland R.P. Energy transfer: a spectroscopic rule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. - V. 58. - P. 719-726.

130. Svanvik N., Stahlberg A., Sehlstedt U., Sjoback R., Kubista M. Detection of PCR products in real time using light-up probes // Anal. Biochem. 2000. - V. 287.-P.- 179-182.

131. Thomas D.C., Nardone G.A., Randall S.K., Amplification of padlock probes for DNA diagnostics by cascade rolling circle amplification or the polymerase chain reaction // Arch. Pathol. Lab. Med. 1999. - V. 123. - P. 1170-1176.156

132. Tian P., Mandrell R. Detection of norovirus capsid proteins in faecal and food samples by a real time immuno-PCR method // J. Appl. Microbiol. 2006. - V. 100.-P. 564-574.

133. Todd A.V., Fuery C.J., Impey H.L., Applegate T.L., Haughton M.A. DzyNA-PCR: use of DNAzymes to detect and quantify nucleic acid sequences in a realtime fluorescent format // Clin. Chem. 2000. - V. 46. - P. 625-630.

134. Tong J., Cao W., Barany F. Biochemical properties of a high fidelity DNA ligase from Thermus species AK16D // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. — P. 788-794.

135. Tong J., Barany F., Cao W. Ligation reaction specificities of an NAD(+)-dependent DNA ligase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 1447-1454.

136. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization // Nat. Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 303-308.

137. Tyagi S., Marras S.A., Kramer F.R. Wavelength-shifting molecular beacons // Nat. Biotechnol.-2000.-V. 18.-P. 1191-1196.

138. Uemori T., Mukai H., Takeda O., Moriyama M., Sato Y., Hokazono S., Takatsu N., Asada K., Kato I. Investigation of the molecular mechanism of ICAN, a novel gene amplification method // J.Biochem. 2007. — V.142. -P.283-292.

139. Van Ness J., Van Ness L.K., Galas D.J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V.100. -P.4504-4509.

140. Vaughn C.P., Elenitoba-Johnson K.S. Hybridization-induced dequenching of fluorescein-labeled oligonucleotides: a novel strategy for PCR detection and genotyping // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163. - P. 29-35.

141. Venkatesan N., Seo Y.J., Kim B.H. Quencher-free molecular beacons: a new strategy in fluorescence based nucleic acid analysis // Chem.Soc.Rev. 2008. -V.37.-P. 648-663.

142. Vincent M., Xu Y., Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification // EMBO Reports. 2004. - V.5. - P. 795-800.

143. Walker G.T., Fraiser M.S., Schram J.L., Little M.C., Nadeau J.G., Malinowski D.P. Strand displacement amplification—an isothermal, in vitro DNA amplification technique // Nucleic Acids Res. 1992. - V. 20. -1691-1696.

144. Walker G.T., Little M.C., Nadeau J.G., Shank D.D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 392-396.

145. Warmaar S.O., Cohen J.A. A quantitative assay for DNA-DNA hybrids using membrane filters // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1966. - V.24. - P.554-558.

146. Watson E.J., Templeton A., Russell I., Paavonen J., Mardh P.A., Stary A., Pederson B.S. The accuracy and efficacy of screening tests for Chlamydia trachomatis: a systematic review // J. Med. Microbiol. 2002. — V. 51. - P. 1021-1031.

147. Whitcombe D., Brownie J., Gillard H.L., McKechnie D., Theaker J., Newton C.R., Little S. A homogenous fluorescence assaya for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping // Clin. Chem. 1998. V.44, P.918-923.

148. Wiedmann M., Wilson W.J., Czajka J., Luo J., Barany F., Batt C.A. Ligase chain reaction (LCR) overview and applications // PCR Methods Applic. -1994.-V. 3.-P. S51-S64.

149. Winn-Deen E.S. Multi-mutation screening using PCR and ligation principles and applications // Trends Biotechnol. - 1996. - V. 14. - P. 112-114.

150. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // Biotechniques. -1997.-V. 22.-P. 130-131, 134-138.

151. Wittwer C.T., Ririe K.M., Andrew R.V., David D.A., Gundry R.A., Balis UJ. The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control // Biotechniques. 1997a. - V. 22. - P. 176-181.

152. Wittwer C., Reed G., Gundry C.N., Vandersteen J.G., Pryor R.J. Highresolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen // Clin. Chem. 2003. - V.49. - P.853-860.

153. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)-amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.

154. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989a. V.76. - P.245-254.

155. Yamane A. MagiProbe: a novel fluorescence quenching-based oligonucleotide probe carrying a fluorophore and an intercalator // Nucl. Acids Res. 2002. -V.30. - e97.

156. Yang J.Q., Tata P.V., Park-Turkel H.S., Waksal H.W. The application of AmpliProbe in diagnostics // Biotechniques. 1991. - V. 11. - P. 392-397.

157. Yang L., Fung C.W., Cho E.J., Ellington A.D. Real-time rolling circle amplification for protein detection // Anal.Chem. 2007. - V.79 - P.3320-3329.

158. Yang L., Liang W., Jiang L., Li W., Cao W., Wilson Z.A., Zhang D. A novel universal real-time PCR system using the attached universal duplex probes for quantitative analysis of nucleic acids // BMC.Mol.Biol. 2008. - V. 9. - P. 54.

159. Yi J., Zhang W., Zhang D.Y. Molecular Zipper: a fluorescent probe for realtime isothermal DNA amplification // Nucleic Acids Res. 2006. - V.34. - e81.

160. Zhang D., Wu J., Ye F., Feng T., Lee I., Yin B. Amplification of circularizable probes for the detection of target nucleic acids and proteins // Clin. Chim. Acta. — 2006. V.363. - P.61-70.

161. Zhang D.Y., Brandwein M., Hsuih T.C., Li H. Amplification of target-specific, ligation-dependent circular probe // Gene. 1998. - V.211. - P.277-285.

162. Zhang D.Y., Zhang W., Li X., Konomi Y. Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification // Gene. 2001. - V.274. P.209-216.

163. Zhang Y., Zhang D., Li W., Chen J., Peng Y., Cao W. A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - el23.

164. Zhou L., Myers A.N., Vandersteen J.G., Wang L., Wittwer C.T. Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye // Clin. Chem. 2004. - V. 50. - P. 1328-1335.