Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование нового метода ПЦР-фингерпринтинга для дифференциации микроорганизмов на низших таксономических уровнях
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Использование нового метода ПЦР-фингерпринтинга для дифференциации микроорганизмов на низших таксономических уровнях"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ЦЕНТР«БИОИНЖЕНЕРИЯ»
На правах рукописи УДК 574.3+479.852.11.(088+0471
Цыганкова Светлана Валерьевна
Использование нового метода ПЦР-фингерпринтинга для дифференциации микроорганизмов на низших таксономических уровнях
Специальность 03.00.07.-микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2004
Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН
Нучные руководители академик РАСХН профессор
К.Г. Скрябин (ОЗ.ОО.ОЗ-молекулярная биология) кандидат биологических наук Е.С. Булыгина (03.00.07-микробиологня)
Официальные оппоненты доктор биологических наук профессор
Ф.С.-У. Джалилов кандидат биологичесюх наук И.К. Кравченко
Ведущая организация Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Зашита диссертации состоится 7 октября 2004 гола в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 053 05 66 МГУ по адресу 119899. Москва. Ленинские горы, д 1. МГУ. корп 12. Биологический факультет, аудитория М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ Автореферат разослан.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Разработка методов идентификации микроорганизмов на низших таксономических уровнях имеет исключительное значение для решения как фундаментальных научных проблем, так и прикладных задач В современной микробиологии при идентификации микроорганизмов и изучении их филогенетических отношений широко используются различные молекулярно-биологические методы Одним из общепринятых подходов является анализ сходства первичной структуры нуклеотндных последовательностей ^ pPНK Данный метод позволяет с высокой степенью достоверности определять филогенетическое положение прокариот на родовом и выше уровнях Однако консервативность нуклеотидной последовательности ^ рРНК ограничивает применение этого метода для диагностики близкородственных микроорганизмов Для более точной идентификации бактерий часто используют анализ нуклеотидных последовательностей межгенной области ^ - 23S рРНК. Но и этот метод не всегда дает надежные результаты, особенно при анализе близких видов и штаммов Кроме того, указанные методы являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими Такого же рода анализ, помимо гена ^ рРНК и межгенной области 16S - 23S рРНК. проводится и для других генов прокариот Но применяемая методология обладает теми же недостатками, что были отмечены выше
В настоящее время активное развитие получила группа методов геномного фингерпринтинга. основанная на интегральных способах сравнения геномов изучаемых организмов Данные методы не требуют знания полной молекулярной организации генома и значительно дешевле, чем методы сравнения нуклеотидных последовательностей отдельных генов
Эффективность методов геномного фингерпринтинга в большой степени зависит от выбора систем олигонуклеотых пранмеров К настоящему времени существует достаточно большое разнообразие методик, базирующихся на праймерных системах, специфичных для той или иной области генома бактерий Обычно, с помощью методов, основанных на применении ГЩР. изучают полиморфизм определенной, сравнительно небольшой части генома, что ограничивает разрешающую способность методики, не позволяя разделять близкие виды и штаммы При клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях, в сельском хозяйстве при определения этиологии возбудителей, а также при патентовании промышленных штаммов и создании молекулярных паспортов необходимо четко различать и идентифицировать близкие штаммы Поэтому большой интерес представляет разработка методов, позволяющих
1 | РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ ]
i библиотека i
выявлять такие различия и поиск новых пранмерных систем, обеспечивающих более высокую разрешающую способность метода
Цель и задачи исследования. Целью данной работы была проверка применимости нового метола ПЦР-фингерпринтинга DIR-ПЦР (diverged inverted repeats) для дифференциации микроорганизмов на самых низших таксономических уровнях видовом и штаммовом Конкретные задачи исследования состояли в следующем
1. Проверка предложенных праймерных систем на ДНК бактерий различных таксономических групп с целью выявления систем, пригодных для получения наиболее информативных спектров DIR-ПЦР
2. Оптимизация условий проведения реакции для получения специфичных и воспроизводимых ПЦР-спектров бактерий разных таксономических групп
3. Исследование возможности применения предлагаемого метода DIR-ПЦР для изучения филогенетических взаимоотношений внутри двух близкородственных групп бактерий географических толятов патовара Xanthomonas campestris и подвидов энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis-
4. Применение метода DIR-ПЦР для выявления геномных различий внутри двух групп диссоциантов штаммов Bacillus cereus и Bacillus subtilis-
5. Сравнение степени надежности и разрешающей способности метода DIR-ПЦР с другими методами ПЦР-фингерпрннтинга
Научная новизна работы. Показано, что созданный в Центре "Бионнженерия" РАН новый метод геномного фингерпринтинга с использованием праймеров на основе днвергированных инвертированных повторов (DER) обладает высокой разрешающей способностью на видовом, ггодвидовом и штаммовом уровнях
Применение данного метода для изучения штаммов из разл|гчных географических популяций Х campestris pv. campestris позволило выделить филогенетические группы, коррелирующие с их географическим происхождением
Впервые проведен всесторонний анализ бактерий вида В. thuringiensis с одновременным изучением как отдельных генов (16S рРНК. 23S рРНК и межгенная область 16S - 23S рРНК). так и с использованием методов геномного фингерпринтинга (ВОХ-ПЦР. ERIC-ПЦР. (GTG)-UP. (О-ПЦР. М1Т2-ПЦР. tRNA-ПЦР и DIR-ПЦР) и показано, что метод DIR-ПЦР обладает большей чувствительностью при дифференциации близких штаммов На примере лабораторных диссоииантов В. cereus и В. s-ubtrlis показано, что разработанный метод позволяет выявлять геномные различия на самом низшем таксономическом уровне
Практическая значимость работы. Предложенный метод может использоваться для дифференциации широкого ряда штаммов-продуцентов перспективных для промышленных целен, биотехнологии и генной инженерии, а также патогенных микроорганизмов, представляющих интерес для медицины и сельского хозяйства, которые другими методами не разделяются
Разработанный SCAR-маркер для бактерий вида A campestris дает возможность проводить диагностику зараженности семян сельскохозяйственных культур этим патогеном
Разработанный SCAR-маркер для подвидов энтомопатогенных бацилл В. thuringiensis. продуцирующих токсины против насекомых отряда Lepidoptera {cry токсины) дает возможность проводить быстрый скрининг природных популяций и вновь выделяемых штаммов данного ннсектопатогена для выявления штаммов-продуцентов токсинов типа cry]. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино. 2000). семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов Биотехнология-2001 (Пушино. 200П. Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках» (Санкт-Петербург. 2001), П-ом Московском Международном конгрессе "Биотехнология состояние и перспективы развития" (Москва. 2003). 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions (Санкт-Петербург. 2003). APS Annual Meeting (Charlott. NC. USA. 2003). Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы и 6 тезисов в сборниках работ российских и зарубежных конференций
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают рисунков. 18 таблиц и 4 приложений Диссертация состоит из разделов "Введение"". "Обзор литературы". "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования"" и "Результаты и обсуждение"). "Выводы"" и '"Список литературы", который содержит 18 отечественных и 176 иностранных наименований
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были 46 штаммов A campestris и 5 штаммов других видов Xanthomonas из коллекции к с н. в и с АН Игнатова, лаборатория генома растений Центра "Биоинженерия" РАН. 19 штаммов бацилл вида В. thuringiensis из коллекции Центра "Биоинженерня" РАН. а также 5 диссоцнантов штамма В. ceretis ВКМ 504 и 3 диссошшнта
штамма В subti/i BKM 720 из коллекции л б н. профессора Г' И Эль-Регистан. лаборатория классификации и хранения уникальных микроорганизмов ИНМИ им С Н Виноградскош РА.Н Выделение ДНК. Для выделения ДНК применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли (Bimboim & Doly. 1979") и Wizard-технологии фирмы Promega (США)
ПНР со специфическими праймерами к crvl. crv и crv генам. Для получения ПЦР-фрагментов cry генов были использованы описанные ранее праймеры и протоколы проведения 1ТЦР (Carozzi et.al.. 1991: Juarez -Perez et.al.. 1997).
ТИП с праймерами к различным повторяющимся элементам, проводили с применением разработанных ранее праймерных систем и протоколов постановки реакции (Louws et.al.. 1999: George et.al.. 1997: Epplen et.al.. 1991).
DIR-ПЦР. Амплификацию геномной ДНК проводили с использованием следующих праймеров KRP2 5-CAGGAAGAAG-3: KRP8 5'-GAAGTTCAGG-3: KRP10 5-CTTCAAGGTT-3: KRPN2 5-CGCCIGGIGGAT-3: KRPN1 5-TCIIAAGCTTCA-3: KRPN10 5-CAICICCGCCGC-3' на приборе Cetus. 480 (Perkin Elmers. Швеция) ДНК бактерий фуппы cereus амшшфнцировали при следующих условиях объем амплификационнои смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав 1х буфер полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)SO4. 6 мМ трис-НС1. рН 8 8. 6 мМ MgCb). 5 нМ dTP. 50 нг ДНК-матрицы. 12 5 пкМ праймера и 1 25 ед BioTaq DNA Polymerase ("Дпалат ЛТД". Россия) Температурно-временной профиль первый цикл -94°С х 3 мин. следующие 35 циклов - 94°С х 30 сек. 37°С х 40 сек. и 72°С х 1 мин. окончательная элонгация - 7 мин при 72°С При амплификации ДНК бактерий рода Xanthomonas концентрация MgClj составляла 2 5 мМ. dNTP - 75 aVt. праймеров - 10 пкМ Температурно-временной профиль реакции первый цикл - 94°С х 30 сек . 30°С х 30 сек . 72°С х 1 мин 30 сек. следующие 43 цикла 94°С х 5 сек. 30°С х 30 сек и 72°С х 1 мин 30 сек. окончательная элонгация - 7 мин при 72°С Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. при напряженности поля 6 Всм Для документации результатов лектрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали систему гель-документации BioDocII (Biometra. Германия)
Филогенетический анализ. Генетические расстояния (D) при построении фенограмм по данным ПЦР-фннгерпринтов рассчитывали по формуле Нея-Ли (Nei & 1л. 1979) Генетические расстояния (D) при построении филогенетических деревьев по данным нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и межгенной области 16S-23S рРНК рассчитывали по формуле Таджима-Нея (Tadjima & Nei. 1984).
Очистка фрагментов ПНР в агарозе. Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей при помощи электрофореза в 0 8% легкоплавкой агарозе с применением набора PCR-Preps (Promega. США)
Клонирование ГГНР-Фпагментов. Выделенные ПЦР-фрагменты клонировали в векторерОБ.М-Т (Promega. США") Продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки Eschenchia coli штамм DH5a Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили при помощи набора Wizard MiniPrep (Promega. США), согласно рекомендациям производителя Секвенирование ПНР-Фрагментов. Секвенированне проводили по методу Сенгера (Sanger et.al. 1977) Плазмиды со вставкой секвенировали с универсальных плазмидных праймеров SP6 и Т7 Секвешфование 5'концевой области гена 16S рРНК и 16S-23S рРНК межгенной области проводили с использованием универсальных праймеров (Lane. 1991) Для секвенирования гена 16S рРНК использовали праймеры 11-27F - 5-GTTTGATCMTGGCTCAG-3 (прямой); 530R -5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3 (обратный), для межгенной области 16S-23S рРНК. 1406F- 5-TGYACACACCTCCCGT-3 (прямой). 242R - 5-KTTCGCTCGCCRCTAC-3 (обратный) Секвенирование cry]-. сгуЗ- и cr-специфичных ПЦР-фрагментов проводили с использованием соответствующих амплифицирующих праймеров
Для постановки реакции секвенирования использовали набор "Silver Sequecing (производство Promega. США) и протокол фирмы-производителя с незначительными модификациями Электрофорез проводили на приборе SQ3 Sequencer. Hoefer (США) в 7%-ном полиакриламилном геле толщиной 0.1 мм в денатурирующих условиях (в присутствии 7М мочевины) Последовательность нуклеотидов в ДНК считывали непосредственно с радиоавтографов гелей (Чемернс и др. 1999)
SCAR-ПНР. Амплификацию cryl-специфичного региона проводили на ДНК знтомопатогенных штаммов В thuringiensis со следующими SCAR праймерамн F2 - 5-CAOGCAGTTATCAGTGAAATC-3: F3 - 5-AAAGTAACTCCAGGACAGCC-3 - 5-CTGTTCCACATAAATCTCATC-3. Амплификацию осуществляли в реакционной смеси объемом 25 мкл следующего состава 1х буфер полимеразы BioTaq с (~NH4)SO4 ("Fermentas". Литва). 1 мМ MgCl2. 7.5 нМ dNTP. 50 нг ДНК-матрицы. 12 5 пкМ каждого праймера и 1 25 ед BioTaq DNA Polymerase ("Диалат ЛТД, Россия) Температурно-временной профиль ПЦР первичная денатурация - 94°С х 3 мин; последующие 27 циклов - 94°С х 30 сек.. 56°С х 30 сек и 72°С х 1 мин Амплификацию специфичного для A campestris pv. campestris ПЦР-фрагмента проводили с использованием SCAR-праймеров следующего состава 804F - 5-GGCCGGGGTAATGGACAAGC-3: 1443R - 5-GCAGTAAGGTGCAGGGCAATTACG-3
Амплификацию осуществляли в реакционной смеси объемом 25 мкл следующего состава 1х буфер полимераш BioTaq с (NH4)S04 ("Fermentas". Литва). 1.5 мМ MgCb. 7.5 нМ dNTP. 50 нг ДНК-матрнцы. 10 пкМ каждого праймера и 1.25 ел BioTaq DNA Polymerase ("Диалат ЛТД". Россия) Температурно-временной профиль ГГЦР первичная денатурация - 94°С х 3 мин. последующие 26 циклов - 94°С х 30 сек. 68°С х 30 сек и 72°С х 1 мин
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
L Подбор поаймеров Из 100 первоначально предложенных последовательностей праймеров были отобраны 12. не содержащих ярко выраженных мотивов, с ПД-составом приблизительно 50% Эти праймеры был» проверены на ДНК бактерий из разных таксономических групп включая архей для выявления праймерных систем, дающих наиболее информативные спектры полос Праймеры. выбранные для работы, указаны в разделе «Объекты и методы исследования».
По методу Таглчн (Taguchi & Wu. 1980) для бактерий группы В. cereus и вида А campestris была проведена оптимизация условий ГП1Р с целью подбора параметров реакции, при которых получаются высокоспецнфичные ДНК-спектры
2. Изучение генетических взаимоотношений между изолятами Xanthomonas campestris ру._
campestris. Первой группой бактерий, на которой проверяли метод DIR-ПЦР. стали бактерии вида A campestris. являющиеся фитопатогенамп большинства важнейших сельскохозяйственных культур (Leyns etal. 1984V Эти бактерии вызывают такие распространенные заболевания растений, как сосудистый бактериоз, листовая пятнистость и ожог листьев Высокая фенотипическая однородность видов Xanthomonas вызывает большие сложности при дифференциации этих бактерий Штаммы, выделенные из разных культур, относили к различным патовариантам A, campestris на основании анализа их спектра вирулентности и симптомов, вызываемых на поражаемых растениях, но не на основании физнолого-биохимическнх особенностей, по которым они практически не различимы (Dye & Lettiot. 1968) В 19л5 году была предложена рекласспфпкшщярола Xanthomonas. основанная на гомологии ДНК. в результате которой 140 описанных на тот момент патоваров A", campestris были разделены на 20 отдельных геномовидов (Vauterin et.al. 1995) Однако взаимоотношения различных патоварнантов внутри вновь образованных филогенетических групп изучены слабо, а взаимоотношения между географическими изолятами отдельных патоваров практически не исследованы Между тем генетическая характеристика этих изолятов важна для выявления источника заболеваний и изучения распространения бактерий данного вида
Нами были исследованы 46 штаммов А, campesths ру. campesttis. выделенных из локальных популяции патогена из нескольких районов России, а также из Японии. Великобритании. США. Германии. Канады и Венгрии (табл 1) Для сравнения были также использованы коллекционные штаммы других видов ксантомонад.
Таблица I. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas использованные в работе
Примечание - Группы ДНК-ДНК гомологии поданным Vauterin (Vauterin et.al.. 1995): NCPPB National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (Великобритания). PHW - частная коллекция Paull Williams (университет Висконсина. США). HRI - Horticulture Research Intemational-Wellesboume (Великобритания)
2.1. Анализ нуклеотилных последовательностей 168 рРНК и межгенной области 168 - 238 рРНК. Для первичной оценки степени полиморфизма между изолятами А", сатрея^ ру.
силных последовательностей 16S рРНК и межгенной области 16S - 23S рРНК. Для первичной оценки степени полиморфизма между изолятами A", campestris pv. Проведенный анализ показал ПОЛНУЮ идентичность нуклеотилных последовательностей 16S рРНК v изучаемых штаммов и типового ш гамма Л" campestris pv. campestris 568T Кроме того, было обнаружено практически полное совпадение этих последовательностей с нуклеотидными последовательностями 16S рРНК большинства других видов ксантомонад Как видно из приведенного филогенетического дерева по данным анализа 16S рРНК. изучаемые штаммы образуют компактный кластер с дрлтимн видами рода Xanthomonas но внутри этого кластера не разделяются (рис 1а)
В межгенной области также наблюдалось полное сходство нуклеотндныч последовательностей анализируемых июлятов с последовательностью типового штамма и достаточно высокое сходство с последовательностями штаммов других видов Филогенетическое дерево по данным анализа межгенной области 16S-23S рРНК отражает более высокий полиморфизм этого региона по сравнению с 16S рРНК Анализ последовательностей показал, что большинство представителей других геномовидов возможно разделить этим методом, но в случае изолятов A* campestris pv. campestris этот метод не работает (рис 1Ь) 2.2. Анализ полиморфизма июлятов A', campestris методами ПЦР-фингерпринтинга с использованием ранее описанных праймеров. ПЦР-фннгерпринты близкородственных видов ксанюмонад и штаммов патовара А сатречтч pv. campestris были получены с использованием праймеров. гомологичных BOX элементу и терминаторной последовательности (GC)4 (рис 2) Как видно из приведенных паттернов, ряд штаммов и даже видов ксантомонад на основе этих результатов не отличаются друг от друга Примером могут служить патовары A' orvzae pv. orvzae NCPPB3OO21 и Al orvzae pv. onzicola NCPPB15851. которые имеют практически идентичные картины по ВОХ-ПЦР. а по фингерпрннтам (GCU-nilP от этих патоваров не отличим штамм A' axonopodis p\ phaseoh var {ичсат HRI924a. Аналогичная картина наблюдается и в случае других патоваров A campestris (pv. raphani NCPPB19461 и р\ campettns RU2) и японских нзолятов A' campestris pv. campestris Л5Ь и J41 а Различия межд\ ПЦР-фингерпринтами этих пар штаммов сводились к минорным ПТIP-фрагментам малой интенсивности
Таким образом. ПЦР-фингерпрнты. получаемые на основе указанных методов, показывают низкую специфичность на видовом и штаммовом уровнях
ч
X пгкаоНа I ЧС <ШГП 101611 - Л. рориИ 1Л1С *'4'т (\9«9?2|
Хс р),{, РЧШ17
V е р» с Ш 2
А. е. в^. с. 1*К1
г 566' (\9-9171 • V <А»1гоЬ ЬМС 8684* 107611 V с Р1 с НШ 1279
X г рт с 1
V г р* с Р1
V г с Н1|
V <■. ру л 1-К1
рнц117
Л.^. р< . с. Л1.
нкиэтч
А. £. р» с ЛТСС 33911 (^С (Ф3902)
Иг руг Р1
А ТСС 13911IV: 0030021 X сисигЬнае 1_ЧС 690Т (Л 10760) _ V /гацаИаг ЬМ<". 708* (Х9®920| , V коплгым [Д1С 73'т 010759) ' ягЬопсЫв ЬМС 747т ( *|07<7) • А. ел ЬМС *047т (\9*921)
V Ьгчт!(.Чв 947* О 107641
V сюгюы 1Л1С. 671' а 10762)
V ри1 ЬМС 847' П 107*8) X шхк (.МО 716' О 107*4)
1— А. етЬаг! 1_МС 86781 (Л 1076*1 - V вхопороЛа ЬМв 5МТ <*95919| А. жскЫ ЦИО 4711ГЧ10766)
-'-А «»ЛшМ ШС'»1 ОЮТЧ)
»1-Л. *нкт1 ЬМС 8670* Г> 107*6) -£ таЪорЬШе 9*8Т"(\9*921)
1С« р> с ЬМС*68,(АР2097*5)
V егугл* ръ «пгм ВД319 (ЛВ0262РТ) X *тсл*пв XV1111 <АГ12308Я>
I- X м*а>6г 1.МС 73611 ЛР209Т65)
— X мН>пгк*!а 1СМР351 (лК20*Г<21
X Ьтогит ЬМС 733* |ЛГ2097Ч> I— X р!Л 1ЛЮ «47' |ЛГ2097«1>
V етемгЫии 1М(. 6901 (ЛГ2097«7) X Ьпми Шв 9471 (АР209754) X /г»«**« 1АК. 708* (АР260972)
X 1СМР 31*1 (ЛРЮ976А
X шту^в 1.МС $38 (АГ209Т53) [г-X г р*р/шмоВ20 (Л1?>9434) «М- X с. рт Ятиа ШС 918 (ЛР«372071 X тгЬпа ЬМС 8$Т0Г <АР2ОТ60) X [ЛР2609"1>
X нам ЬМС «71Т(АР209762| X вЫт—м 1СМР196 (ЛР2097Ч) У ямАорШЬ* АТСС 13637 (АМ591*8) X АдеЬ 1ЛМ; 8684г (АР209"63) X кутОмЫ 1 Мв 739' (АР209ТЧ9) X 0»т|ммп> 1МС8761 (де209764>
а) Ь)
РИСУНОК 1 (а, Ь) Филогенетические деревья отражающие степень родства бактерий вода А сашре4(]И4 с другими видами рода Хапякотопая Дерево (а) построено на основе сравнения последовательностей гена 16S рРНК метоаом Ш Дерево (Ь) построено на основе сравнения последовательностей межгенной области 16S-23S рРНК методом UPGMA Подчеркиванием отмечены штаммы А сатречГпч pv сатреПШ выбранные для анализа Значения бутстрепа рассчитаны для 500 повторностей и даны в процентах от исходного значения В скобках указаны номера микроорганизмов, взятых из GenBank Шкала отражает генетические расстояния по Нею-Ли CNei &. Lt 1979)
1 2 14 <6 7 8 9 tO 11 12 11 14 И 16 17 18 19 2« 21 22 21 24 2« 26 27 28 29 10 Ч 12« 14 И 16
а)
Ь)
Рисунок 2 Электрофоретнческин анализ ПНР-продуктов. полученных на препаратах ДНК Rahloma solanacearum R11 и разных видов Xanthomonas с использованием праймеров BOX (а) и (СС)4 (Ъ)
Номера дорожек 1,19 - маркер молекулярной массы ДНК 1 kb (Fermentas) 2.20 - Rahtnma solanaceamm Rll 3,21 -A axonopodis p\ malvaceaivm NCPPB633T 4 .22 - A orvzae p\ nrvzae NCPPB3002T. 5,23 - A orvzae pv orvzicoh NCPPB15R51 6.24 - A lecicatona p> vecicatona NCPPB422T, 7,25 - A axonopodis (сатречГпч) pv phaceoh var fustán* 924a 8,26 - A сатреч/ris p\ laphan: NCPPB19461 9.27 -A campean* pv í-атреч/пч NCPPB5281 10,28-А сатречтч p\ tampestn* PHW231 11.29 A сатречтч p\ сатреч/ич NCPPB1711 12 30 -A campeMn t pv campeitns 8417 13Л - A campeshis pv сатреч/пч HRI 1279a 14-52 - A сатречтч pv tampeiliis RU2.15.33 - A campeihis pv armotaaae ХаЭ 16.34-A сатречтч pv campesina J41a 17.35 - А сатреч/пч pv сатречтч Л 5b 1836 - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы
2 3 Изучение изалятов X. campestns методом DIR-ПЦР. В результате проведения DIR-ПЦР для всех из\ ченных штаммов А сатречтч были полнены высокоспецифичные спектры которые различаются числом и размерами ПЦР-фрагмьнтов (рис 3) При этом ПЦР-фингерпрннты разных геночовндов ксантомонад существенно отличаются друг от друга Из приведенного рисунка видно что патовары р\ orvzae pv arvícola и pi phaseoh var /ичсапч имеют специфичные фннгерпринты в противоположность BOX и (GCVj ПЦР-фингерпринтам (рис 3)
Таким образом в отличие от других методов предлагаемый метод DIR-ПЦР показывает более высокую разрешающую способность как на уровне разных видов так и внутри одного вида
Ш
1 2 .115 6? 8 9 10 II 1113 14 1« 16 17 18 19 2« 21 22 23 24 252« 27 28 29 30 31
о-^-v--^
я) Ь)
Рисунок 3. DIR-ПЦР фингерпринты. полученные на ДНК различных видов Xanthomonas » типовых штаммов A', campestris pv. campestris с применением праймеров KRP2-KRP8 (а) и
KRPN2 (Ь).
Номера дорожек: 1,15.23,31 - маркер молекулярной массы ДНК 1 kb (Fermentas): 2.16 - Ewinia Stewart: 3.17 - A', axonopodis px. mahacearum NCPPB633T: 4,18 - A', oryzae pv. oryzae NCPPB3OO2T: 5,19 - A', oryzae px. oryzicola NCPPB1585T: 6,20 - A', vesicatoria pv. vesicatoria NCPPB422T; 7,21 - A', axonopodis (campestris) px. phaseoli var. fuscans 924a: 8,22 - A', campestris px. raphani NCPPBI946T: 9.24 - A', campestris px. armoraciae NCPPB3471: 10,25 - A", campestris px. armoraciae Xa5; 11.26,27 - X. campestris pv. campestris NCPPB5281: 12,28 - A', campestris pv. campestris PHW117: 13,29 - A', campestris px. campestris HRI1279a; 30 - A', campestris pv. campestris HRI 1279b: 14 - контрольная ПНР в отсутствие ДНК-матрицы
2.4. Фенетический анализ геномных фингерпринтов. полученных метолом DIR-ПЦР. По
результатам DIR-ПЦР было определено около 60 полиморфных маркеров для всех проанализированных штаммов Для количественной оценки степени полиморфизма штаммов А'. campestris полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных состояний, в которой наличие или отсутствие в ПЦР-фингерпрннтах одинакового по размеру ампликона рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно На основе этой матрицы методом близжайшего связывания (NJ) была построена дендрограмма, отражающая степень различия/сходства исследуемых штаммов Из приведенной дендрограммы видно, что изученные штаммы распадаются на 4 отдельных кластера (рис. 4V Первый и второй кластеры образуют штаммы A*, campestris pv. campestris из разных географических ареалов Англии, России. Германии. Венгрии. США и Канады Сюда же попадает часть штаммов японского происхождения (J66. J45a. J20a. J41a\ которые были выделены из зараженных растений.
выращенных m импортированных в Японию семян Большинство изолятов первого кластера относились к 1 серотигту и 1 гаплотипу поданным Alvarez (Alvarez et.al.. 1994). "
Третий кластер образовали японские изоляты Л5Ь. Л 5а. Л9Ь. Л 9а, которые представляют локальную местную популяцию, в противоположность штаммам, вошедшим в первый (J20a. J45a. J66) и во второй кластеры (J41 а).
Четвертый кластер составили типовые штаммы других патоваров A* campestris: X. campestris pv raphani NCPPB 1946T. X campestris pv. armoraciae NCPPB 347T и Ха5 и японский нзолят A" campestris pv campestris Л 8а Эти патовары близки по биохимическим, морфологическим, иммунологическим и генетическим признакам (Vauterin et al.. 1995: Alvarez et al 1994. Игнатов п др 1998). поэтому присутствие шолята A', campestris pv campestris в данном кластере вполне объяснимо
В отдельную группу попали типовые штаммы других видов Xanthomonas: X. axonopodis pv malvaceamm NCPPB6331. A', axonopodis (campestris) pv. phaseoli var. fuscans IIRI924a. A". oryzae pv. oryzae NCPPB3OO2 T. A' o/yzae pv. oryzicola NCPPB 15551. X. vesicatoria pv vesicatoria NCPPB4221".
Распределение большинства исследованных штаммов A, campestris pv. campestris no кластерам согласуется с разделением этих штаммов на серотипы. идентифицированные по антигенным свойствам экзополисахарилов (Alvarez et.al. 1994. Игнатов и др.. 1998) и гаплотипы, определенные ранее RFLP анализом (Alvarez et.al.. 1994) Причем, если на филогенетических деревья, построенных по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и межгенной области 16S-23S рРНК, все семь проанализированных штаммов из разных географических мест (PHW117. HRI1279b. Dl. RU1. RU2. J4la. UK1) располагались в одном кластере и были неотделимы друг от друга, то дендрограмма по данным DIR-фннгерпринтинга показала, что все эти штаммы относятся к разным кластерам (PHW117. Dl. UK1 -первый кластер. 1ПШ279Ь. RU1. RU2. J41a - Brq-юй кластер") и являются генетически разнородными
Таким образом, анализ штаммов A, campestris показал, что предлагаемый метод DIR-ПЦР обладает большей разрешающей способностью по сравнению с анализом нуклеотидных последовательностей локусов рибосомного оперона и другими методами ГЩР-фннгерпринтинга. и может быть в дальнейшем использован в эпидемиолопгческих исследованиях для выявления этиологии возбудителя
Рисунок 4 Денлрограмма генетических отношений между штаммами Xanthnmonas построенная МТ-методом на основе суммарных данных ЭШ-фингерпринтинга Дендрограмма сконструирована по 60 полиморфным ЛОКУСЭМ Шкала отражает генетические расстояния по Нею-Ля (Ке1 & Ы 1979) Указаны значения бутстрепа > 50% I II III IV - выявляемые кластеры Подчеркиванием отмечены штаммы не отличающиеся по данным анализа нуклеотидных последовательностей 168 рРНК и межгенной области 168-238 рРНК
2.5. Разработка и проверка SCAR-праймеров для Xanthomonas campestris. В результате анализа ПЦР-фингерпринтов. полученных с применением одного из предлагаемых праймеров (KRPN2) практически у всех протестированных штаммов A. campestris был обнаружен специфический ПЦР-фрагмент размером около 600 п н. который отсутствовал в фингерпринтах других видов Xanthomonas (рнс. 2У Этот фрагмент был секвеннрован. и на основе его нуклеотилной последовательности была предложена схема проведения SCAR-ПИР (sequence characterized amplified region) для высокоспеинфичного выявления обнаруженного маркера На рисунке 5 представлены результаты проверки разработанных SCAR-праПмеров на специфичность, из которого следует, что в результате SCAR-ПЦР фрагмент размером 639 п.н выявлялся только на ДНК штаммов A*, campestris- Таким образом, с помощью предлагаемого нами метода можно осуществлять быстрый поиск молекулярных маркеров, специфичных для определенной группы бактерий, в данном случае для вида A", campestris. что может быть использовано для проверки семян сельскохозяйственных растений при проведении санитарного контроля
Рисунок 5. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов. полученных с применением SCAR праймеров на ДНК различных фитопатогенных бактерий (а) и изолятов A, campestris pv. campestris (Ь).
Номера дорожек: 1,16 - - маркер молекулярной массы ДНК I kb (Fermentas): 2 - A", campestib pv. campestris NCPPB528T: 3 - A', campestris pv. campestris HRI 1279a: 4 - X. axonopodis pv. mahaceamm NCPPB6331: 5 - A*, oryzae pv. oryzae NCPPB3OO2T: 6 - A', vesicatoria pv. vesicatoria NCPPB422T; 7 - A', axonopodis pv. phaseoli var. fuscans HRI924a: 8 - Erwinia stewari HRI5231: 9 -Erwinia carotovora ER1; 10 - Ralstonia solanacearum Rl 1: 11 - Pseudomonas cichori PCH7; 12 - Pi. syringae pv. syringae PS32; 13 - Pantoea aghmerance РАЗ: 14 - Ps. syringae pv. maculicola PS132: 17 - X. campestris pv. campestris HI 1: 18 - D16: 19 - D2: 20 - RU1: 21 - RU2: 22 - RU3: 23 - RU4: 24 - J45a: 25 - J15a: 26 - J19b: 27 - J66: 28 - J41a: 15.29 - контрольная ПЦР в отсутствии ДНК-матрицы.
3. Изучение внутривидового - разнообразия энтомопатогенных бактерий вила Bacillus thurinsienm. Повышенный интерес к бактериям вила В thunngiensis связан с тем. что эти микроорганизмы продуцируют целый спектр кристаллических белков-биоинсектипидов против многих насекомых-вредителей По фенотипическим и генотипическнм признакам подвиды знтомопатогенных башшл неразличимы Единственное их отличие - это тип продуцируемого токсина
Для работы была использована коллекция чнтомопатогенных бацилл, продуцирующих различные типы токсинов (таб 2)
Таблица 2. Штаммы Bacillus thurihgiensis использованные в работе
Исследуемые микроорганизмы Типы cry генов Насекомые-мишени
ß thuringiensis sbsp. thuringiensis TO 1001 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
В. thuringiensis sbsp. toumanofjfi B6021 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
! B. thuringiensis sbsp. berliner 1715 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
! B. thuringiensis sbsp. solio B6026 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
i В. thuringiensis sbsp. cameroun B6775 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
B. thuringiensis sbsp. gallería CB01 'T4 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
I В thuringiensis sbsp. dendrnlimus T04A001 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
B. thuringiensis sbsp. cohneri B6068 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
' B. thuringiensis sbsp. birstaki B6066 crvl Lepidoptera (чешуекрылые)
' B. thuringiensis sbsp. ostriniae CB05 cryl Lepidoptera / Díptera (чешуекрылые: двукрылые)
; B. thuringiensis sbsp. morrisoni B6069 cry2 Lepidoptera ¡ Díptera (чешуекрылые.' двукрылые)
! В thuringiensis sbsp. tenebrinnis B5081 crv3 Coleóptera (жестокрылые)
' B. thuringiensis sbsp. israelensis B6064 cir4 Díptera (двукрылые)
3.1. Сиквенсный анализ 5'-кониевых областей 168 и 238 рРНК и спейсерной области 168 -238 рРНК. Первоначально для изучения филогенетических отношений между подвидами В thuringiensis были определены нуклеотндные последовательности гнпервариабельнон области 5'-конца 168 рРНК (360 пн) и межгенноП области 168-238 с прилегающим к нему 5"-репюном 238 рРНК (длиной около 350 п н.) (рис 6) Из данного рисунка видно, что все проанализированные штаммы разделились на 3 группы, внутри которых последовательности были практически идентичны Нуклеотидные последовательности генов 168 и 238 рРНК у штаммов первой группы были идентичны последовательности типового штамма В thuringiensis МСТМВ 9134х Вторая группа включала штаммы, в последовательностях которых обнаружились замены трех нуклеотидов в области 168 рРНК гена и двух нуклеотндов в области 238 рРНК. характерные для последовательностей В. anlhracis и типового штамма В. cereus МОМВ 9373Т.
Третья группа представлена штаммами нуклсотидные последовательности которых были похожи с последовательностями В апШаа* и В сегеич МС1МБ 9373Т по 168 рРНК а по 238 рРНК - с В Шыпп&ешй МС1МБ 9134х В межгенной области 168-238 рРНК междл изучаемыми подвидами бацилл не было выявлено существенных различий Немногочисленные н\клеотидные замены обнаруженные в последовательностях генов 168 и 238 рРНК недостаточны для выявления различии межд\ отдельными подвидами
Рисунок 6 Сравнение вариабельных л частков иуклеотилных последовательностей штаммов В 1Ьипк51еп%ч
5'-фрагмента reHaI6SpPHK
antl* >ссегп€
carIMCTC1114 J «т111СТИЗЛГЗ!4Г Chut S32 В t thur В t tou» В t fcert P t aotto
B.-t vC^a^jr
В С gal В t dpndr e t coim Б t Icurst В t ostr В t racjri & £. Left R-t-OSr
U) m
nr oi <i Hi
<i <j>
a> ot м
CI ~T*AGAGt"T7GCTC'',TATrAAGTTA (73 TATGAAG7TA
(731 TTAAGAGCTTCCTCTTATIJI'LGTTA
prp ттаАСАсегозпетгалсдазтта
(73 > TT<»40ASCI1i0fTCTCATai.«iITA
i>3> эт®ккястгеехс1СА*вА*в,т
(7>> T^JftiSiJGCT'PqCrciPCAAG^ftGTtA C731 ГГОАСА'ЭТТОС'КГРСАЖ'ЙАеТИ! im TTe«GftaCT7GCTCTCA*GAAQ3TA
xm хт®<»осстеотсг«»*дА»ОТ1»
(73» TTAAGAGCTTGCTCTTATTAArTTA
71) TTAAGAGCTrrCCTCTT^TfAAGTTA
(731 ГГЛА^СГТТССТСТТДКЗААГ'ТЛ
(73) TTXAGAGCTTGCTCTTATGAAC^TA
(73) TTiAGAGCTTCCTCmTATC.AAGTTi
mt ТТ*АбА<ЗСЗТОСТС!?ТАТ<ЗАА£УГТА
(73> TIASeA0eiTSCTCITAISJ»ePJA
t ni та*ляАбЕ1тсстет;рАлнмЕт
5'-фрагмента гена 23S рРНК
ant( S^ter I. SI rCT*WT'"lX}\A't,ArAT*T3GTA»TrAA J-
carSAT25621 '151 CCTAC TGAA^ACVTAOrsTATOGAAG*
ceT"lNCTHB<>773T '151 i С ГГ.' IV* T M. ЛТЛГ!. ХЛ 'X.Z"ЛAG.'-
LhuriNCT'MtH* (151 СТТА T^TGAATACATAGGGTAiTGAAGA
ОшЯКХИВЙг«» "TlSt> OTTA«CrejU(TA£3lTAfiG<irWGGAAG»
в t ihur (ii (istl ссидсстедАГАСМАаастАтаоАгь»
В t eoum fit mil CCTtACCTei««C»TA«aGTAIGHAAtH
В t Ы,т1 (1J (151) ССТТКХТейЛТЖСАТаяаСТАТССААСА
В t sofcfco Hi (15-IJ CCTTA3CCTGARTACA.TAGGGTATGGAAfa
B.t.ewec CU (15ii СЯ5?В1СР1Х»КГАСАТаоа01АТа<5Ь&Л
Etai (1 (i5P CCTTATCTGAATACATAGCyiTAAJGAAI^
E t dendr (1 (151 OCTTATt TGAATACATA jG"TA*jGAA№
В t colir (1 (151 < CTTAT-TGAATACATAGGGTAIUMAA J
В С kuret (1 (1511 CCT1ATCTCAATACA РАСПИТAK3GAAHA
В t ostr (2) (1511 CLTTATCTGAATACATAGGGTAASGAA№
В t 'nyzf T (2-1 (1511 CCTTKCTCAiTJtaSrACbGT'iSCTAG»
P i tan (31 (151) CCW>CCT«AA*APATSCOe-fAT<KtAAW li«J (.стемст^^АсатАйеыгдтеыик»
anth #Sterne - Bacillus anthract* str Steme GenBank entrv- Х5Л0Л9 cer#NCIMB9373T - Bacillus сегеич NCIMB 9373 (T) GenBank entr> X5>060 X94448 cer#ATCC25621 - Bacillus ceteui \TCC 2^621 GenBank entryAF267907 cer#NCTC11143 - Bacillus ceteiis Mr NCTC 11143 GenBank entrv X55O63 thu#NCIMB9134T - Baciihis thunngtenn* NCIMB 9134 (T) GenBank entn- X"5062 X89895 thu#NCTC4042 - Bacillus thunngiensis NCTC 4042 GenBank emr\ AF2679O4 thu# S32 - Baalim thunngiensit S32 GenBank entn AB116122
3 2 Применение ранее описанных методов ГЩР-фингерпринтинга для дифференциации энтомопатогенных бактерий вида В thunhgiensis Дальнейшую дифференциацию эотомопатогенных бактерий проводили методами геномного фингерпринтинга с использованием описанных ранее праймеров (ОТО) (праймер гомологичный терминаторным последовательностям) MIT2 (праймер гомологичный консервативным фланкирующим последовательностям мобильных генетических элементов) и праймерная система ЕШС1Я-ЬЯ1С2 (праймеры гомолошчные энтеробактфиальным межгенным повторам) В данном случае наблюдается слабая вариабельность спектров среди близких подвидов (рис 7) По (ОТО)<-
фингерпринтам подвиды berliner и Cameroun, а также colmen и kurstaki практически не различаются аналогичная картина набчюлаетхя и по остальным фингерпринтам По характера фингерпринтов поллченных на праГшере (GTG)< аналпзнрлемые штаммы разбиваются на три rpvnnbi соответствующие филогенетическим грчппам выделяемым по резутьтатам анализа 16S/23S рРНК Причем 1 и 2 группы это штаммы несущие гены crvl а 3 группа - что штаммы несущие гены сп2 сл? и crv4 Две из тре\ rpvnn достоверно выделялись по фингерпринтам ERIC праймеров однако по спектрам MIT2 праймера >же никакие группы обозначить нельзя Таким образом в данном сл\чае можно говорить о разнице ПЦР-фингерпринтов межд\ группами но вн\три групп не все подвиды удается различить
s
«i?»
1 2 3 4 < i ' 8 9 »0 ii 12 ij 14 i* 16 г 18 19 20 21 22 2 » 24 2? 26 г 28 » jo <1 12 v *4ш63'383941> 41 42 41 44 4< ___> ^_„__-'s__
a)
b)
1 v—
C)
Рисунок 7 Электрофоретическни анализ ПЦР-продуктов пол\ченных на препаратах ДНК энтомопатогенных бактерий В thwtngienus с использованием праймеров (GTG) (a) MIT2 (с) и пары ERIC IR FRIC2 (b)
Номера дорожек 1,16.31 маркер молекулярной массы ДНК 1 kb (Fermentas) 2,17,32 - В thunngiensis <bsp ihwingiensn T01001 3.18.11 - В thunngiensi* bsp imimanoß B6021 4,19,34-ß thvnngienm sbsp berlina 1715 5.20,3- В thvrmgwnus sbsp wtto B6026 6.21.36 - В thunngtensii sbbp carnet oun B6773 7.22,37 - В thiinngiensn sbsp gallería CBOl T4 8,23.38 - В Ihwmgtenm dendtoUnw, Т04 ¡4.001 9.24.39 - В thuimgienw sbsp colmen B6068 10.25.40-ß thurmgtenw sbsp kurMakt B6066 11.26.41-ß thunngiensif <Ъър oclrimae СВОЗ 12,27.42 В thunngiensis sbsp momsom B6069 13.28,43 - В thw-mgwnsis sbsp tenehют* B5081 14,29.44 В thunngienvit sbsp ivaelemtt B6064 15.30.45 - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы Цифры и фигурные скобки обозначают группы на которые разбиваются исследуемые штаммы по ДНК-спектрам
3 3 Изучение штаммов энтомопатогенньга бацилл В thurmgienns методом DÏR-ИЦР. В
результате проведенного анализа было показано что каждый из 13 изучаемых штаммов имеет достаточно уникальный набор ПЦР-фрагментов позволяющий рашичатъ эти штаммы межд\ собой (рис 8) Подвиды berliner и Cameroun, а также colmen и kurstaki которые на основании
предыдущих фмнгерпринтов не рагаичались в данном случае отличаются по нескольким ПЦР-фрагментам В отличие от исполыовавшихся ранее методов DIR-ГЩР позволяет четко идентифицировать интересующие группы вне зависимости от используемого пранмера
РИСУНОК 8 Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов. полученных на препаратах ДНК бактерии В thurmgienvs t использованием пар праймеров KRP2-KRP10 (а) и KRPN2-KRPN10 (Ъ)
Номера дорожек 1,16 маркер молекулярной массы ДНК 1 kb (Fermentas) 2.17 - В thunngiemis sbsp thunngien<iis T01001 3,18 - В thunngiemis sbsp tcnimanoffi B6021 4.19 В thunngiemis sbbp bethnei 1715 5,20 - В Ihurtngiensis sbsp totto В6026 6.21 - В Ihvringiensis sbsp cameroun B6775 1J.I-B thunngiensis sbbp gallena СВ0ГТ4 8.23 В thuiingientiK sbsp dendrohmus Т04Л001 9J4 - В thunngiensis sbsp colmen B6068 10.25 - В thuringiemis sbsp hirttah B6066 11,26 -B thuiingienvs sbsp nttnmae CB05 12,27-5 thunngiensis sbsp monisoni B6069 13.28 - £ thurmgienvs sbsp tenebnonis B5O81 14,29 Z? thutmgienus sbsp tsiaehmi* B6064 15,30 - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы
Цифры и фигурные скобки обозначают группы на которые разбиваются исследуемые штаммы по ПЦР-фингерпринтам
3 4 Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов энтомопагогенных бактерий вида В
thunngiensis Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов пол\ченных как методом DIR-ТТЦР так и другими методами ПЦР-фингерпринтинга. выявил их высокую степень корреляции что подтверждается приведенными фенограммами по данным каждого из анализов (рис 9) Состав и расположение основных кластеров и в том и в другом случае был практически одинаковым Первый кластер образовали штаммы бацилл несущие гены crvl которые по результатам геномного фннгерпрннтннга принадлежали 1 группе а по результатам анализа 16S рРНК и 23 S рРНК имели последовательности, типичные для В thunngienw Второй кластер составили
также штаммы несущие гены en 1 по результатам ППР-фингерпринтннга принадлежавшие второй группе а по 16S н 23S рРНК имеющие послеловательности типа В се>еич и В anthtacis Третий кластер образуют три штамма обпадающие генами сп2 en ? п о\4 * которых по 16S рРНК были последовательности типа В cerettv и В anlhraas а по 23S рРНК - типа В fhunngienin Следует отметить, что если первая фенограмма (рис построена по результатам только DIR ПНР то вторая (рис 9Ь) - по суммарным данным разных типов праймеров описанных в литературе ERIC1R-ERIC2 BOX REP2-I - RFPIR I MIT2 GTG и праймер к tRN" \ Использование какой либо одной из перечисленных систем праймеров не позволяет достоверно выявлять различия междл штаммами т к число информативных (\никапьных) полос дифференцирующих близкие штаммы для большинства известных методов невелико что демонстрируют приведенные фингерпринты (рис 7)
3 5 Разработка и проверка SC"VR-маркеров для выявления В thuringiensts. патогенных в отношении насекомых отрада Lepidoptera При анализе ДНК-фингерпринтов полученных методом DIR-ПЦР было выявлено несколько ГЩР-фрагментов. специфичных как для вида В thimngtentiK в целом, так и для подвидов продуцирующих токсины патогенные в отношении насекомых отряда чешуекрылые (гены cnl) Один из таких фрагментов размером 820 п н (рис 10) был использован для разработки молекулярных маркеров специфичных для штаммов с cnl генами На рисунке 10 представлены результаты проверки разработанных SC\R-npafiMepoB Амплификация с предложенными парами праймеров (F2 R3 и F3- R3) л всех штаммов В thurm°ten*i4 вырабатывающих токсины cnl выявила специфические ПЦР фрагменты размером 705 пни 57° пн соответственно (рис 10) V др\гнх видов баципл (В сени* В tuhtiht В hchemformi\ и В т\ сок/es) а также штаммов В thurmgienm принадлежащих к другим en-группам такая полоса не обнаружена
Таким образом это еще раз подтверждает возможность использования метода DIR-ПЦР для быстрого поиска молекулярных маркеров Кроме того разработанные SCAR-маркеры позволяют проводить быстрый скрининг природных популяций с целью выявления штаммов носителей cr\ I генов
PHCVHOK 9 Дендрограчмы отражающие генетические отношения междл подвидами Bacillus thurmgiensa построенные методом N1 по ре-я лътатам DIR ПЦР (а) и др\гим методам геномного фингерпринтинга (Ь \ Шкпа отражает генетические расстояния по Нею-Пи fNei & LL 1979) На дендрограммач \ казаны значения б\тстрепа > > I 2 * - выявляемые кластеры
Выявление специфичного фрагмента DIR-ПЦР
Поверка ра>работанных bCUl-маркеров
FZTR3 праймеры
RS-RJnpiumepbi
579 пл. ~
JfffW
70S пм?
1 > Í « Í » I « НИ И IMHMH М1«мл Е >< и* writ»»)! }t »MX»)*»^ M4I Л О U
сгу!
I 2 | 4 « * • » » II Ш< 14 1«
Рисунок 10 Разработка и проверка ^С АЯ маркеров для бактерий вида Васг/Нь (Ьигтретк несл ши\ гены сп 1 Номера дорожек
1 - маркер Moiein лярной массы ДНК ! kb (Fermentas)
2 - В thw tngiensis sbsp thurmgiensis TOI 001
4 - В tfoit m gi ens is sbsp unmanojfî B6021
4-5 thurmgiensis sbsp berime/ 17H
* - В thunngiensis sbsp sotto B6026
6-5 thurmgiensis sbsp galleríaCBOlT4
7 В thurmgiensts «bsp dendtolmus T04A001
8 - В thunngiensis «bsp Cameroun B6"'75
9 В thwmgiensis sbsp colmen B6068
10-5 tfrunngiensis sbsp kurstah В6066
Il В thunngiensis sbsp morrisom В6069 12-5 thunngiensis sbsp osrrmiae CBD5 П В thunngiensis «bsp tenebrionis B^ORl
И- контрольная ПЦР в ототствие ДНК-матрииы Стрелка обозначает ПЦР фрагмент специфичный для штаммов с генччн сп }
1 22 23 44 - маркер мелеет лярной массы ЛНК 1 Ib
(Fermentas i
2 24-5 thutmgiertsis sbsp thurmgiensts TOI 001
3 2^-5 thii> ingiensts sbsp toumanoffi В6021
4 26-5 thw tngienm sbsp berlina i 7 И
5 27- 5 thurmgiensts sbsp gallería CB01 T4 6.28-5 thunngiensis sbsp sotto В6026
7 29-5 thurmgiensts sbsp dendrolavus Т04А001
8 - 5 thurmgtensts sbsp Cameroun 136775
9 4 - 5 thunngiensis sbsp colmen В 6068 J0f 32 - Л thurmgiensis «sbsp kurstab B6066
11, Я 4 - В thunngiensis sbsp morraom B6069
12, 44 - В thurmgiensts sbsp osrrmiae CB05 14, 46 - 5 thurmgiensts sbsp tstoelensts В6064
I&38-5 cereus В 16 17,39- 5 thunngiensis 4Q281 18.40 - 5 thunngiensis sbsp gallería В-6% 19 41 В mvcotdes АТС С 10206 20 42-5 hchemformis 21 4^ - контрольная ПЦР в отс\ тствие ДНК матрицы
4. Выявление геномных различий лиссоииантов штаммов Bacillus cereus и Bacillus subtilis. Поскольку процесс фенотипической изменчивости лежит в основе таких процессов и явлений, как изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и персистенция патогенных и условно-патогенных бактерий, результативность симбиозов и замешение продуктивных вариантов промышленных штаммов, то идентификация и характеристика на молекулярном уровне бактериальных культур, способных к диссоциации, является весьма актуальной
Согласно современным представлениям процесс популяцнонной вариабельности бактерий обусловлен перестройками генетического материала клетки, например, вттригеномной рекомбинацией (Прозоров. 200П Однако, работ, в которых были показаны генетические различия между ревертируемыми днссоциантами крайне мало (Birch et.aL 1991). Между тем выявление и изучение геномных различий таких диссоциантов необходимо для контроля стабильности популяции продуктивных вариантов
Нами были изучены 5 диссоцнантов штамма В cereus и 3 днссоцианта штамма В. subtilis-которые продуцируют целый ряд протегапгпгческих ферментов и используются в создании препаратов для утилизации бытовых отходов Все варианты различались между собой по колониально-морфологическим признакам (таб 3) и степени протеолитической активности Для выявления генетических разлгчий между ними был использован метод DIR-ГЩР
Таблица 3. Колониально-морфологические признаки диссоциантов В. subtilis и В. cereus.
! Тип колоний Характеристика колоний
В. subtilis
R Шероховатые колонии с ровными краями
М Слизистые колонии амебовидной формы
S Гладкие блестящие слегка вытчелые полл прозрачные колонии Размер колоний значительно меньше, чем \ дрггих лиссоииантов
В. cereus
Доминантный Круглые матовые желтоватые колонии с плоской приподнятой поверхностью и пастообразной консистенцией
Мвконлный Серовато-белые матовые колонии с пастообразной консистенцией и структурой напоминающей корень дерева
Прозрачный Круглые неокрашенные колонии с неровными краями и тестообразной консистенцией
Прозрачно-мнкоилный Неокрашенные колонии с тестообразной консистенцией и структурой, напоминающей корень дерева
Белый Кр> глые блестящие колонии с ровными краями с интенсивной белой окраской и слизистой консистенцией
Полученные ПЦР фингерпринты -ггпх лиисоциантов представленные на рисунке 11 показывают что практически все спектры исследуемых диссоциантов отличаются межд% собой по числл и размерам ПЦР-фрагментов бочьшинства диссоииантов В wbtilis изменения сводятся к исчезновению одною-дв\х ПЦР-фрагментов при сохранении обшей картины фингерпрннта Для 4 из 5 днссоциантов В сееич наблюдалась похожая картина однако ПЦР-фингерпрннты полученные для диссоиианта белого типа существенно отличались от спектров четырех остальных вариантов Как видно из рисунка в ПЦР фингерпринте бепого диссоцианта количество полос общих с другими диссоииантами. невелико и в основном преобладают полосы характерные только для тгого диссоцнанта
РИСУНОК 11 Результаты электрофоретического анализа предметов ПЦР на препаратах ДНК диссоциантов В cetent и В svbtilis с применением праймеров KRPN1 (а) и KRPN2 (Ь) Номера лорожек. 1,11 - маркер молекулярной массы ДНК 1 kb (Fermentas) 2,12 - В сегеич штамм 504 доминантный тип 3.13 - В ceretis штамм 504 микоидный тип 4,14 - В сегеич штамм 504 прозрачный тип 5,15 В ceieus штамм 504 прозрачно-микоиднын тип 6,16 - В сегеи* штамм 504 белый тип 7,17-5 vubtihs штамм 720 R-тип 8.18 - В wbtihs штамм 720 М тип 9,19 - В wbfihs штамм 720 S тип 10.20 - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы Стрелками отмечены ПЦР-фрагменты специфичные для диссоцнанта В cereus штамм 504 прозрачного типа
Среди всех изученных диссоциантов В cereus наибольшей протеолитнческой активностью обладал прозрачный вариант Изучение ПЦР-спектров этого диссоцнанта также выявило его отличия от других вариантов в его фингерпринтах присутствуют специфичные ПЦР-фрагменты (на рисунке 11 они обозначены стрелками), которые отсутствуют у других вариантов В cereus-
Таким образом, метод DIR-ГТЦР позволяет дифференцировать популяционные дисеоцнанты бактерий штаммов В cereus штамм 504 и В subtihs штамм 720. различающиеся устойчивыми фенотнпическими признаками
Существенное отличие ГЩР-фингерпринтов белого диесоцианта от фингерпринтов других днссоииантов В cereus возможно объясняется тем. что при его образовании произошло встраивание в геном или. наоборот, вырезание одной или нескольких мегаплазмид. являющихся характерными для геномов В cereus и В. thvringiensis
ВЫВОДЫ:
1. Предлагаемый новый метод геномного фннгерпринтинга позволяет выявлять различия между подвидами, патоварами и штаммами различных микроорганизмов
a) был выявлен высокий полиморфизм штаммов в популяции A, campestnsf- campestris. не обнаруживаемый другими молекулярно-биологическнми подходами.
b) метод DIR-ГЩР выявил обособленные группы среди подвидов В- thunngiensis. коррелирующие с фактом наличия определенных типов генов с/т.
2. Показано, что DIR-ПЦР может быть применен для поиска молекулярных маркеров, сцепленных с заданным признаком
а) разработан SCAR-маркер для бактерий вида A campeslris. которые можно применять для диагностики зараженности семян растений эти патогеном.
разработан специфичный SCAR-маркер для подвидов В- thunngiensis. продуцирующих сгу/-токснны против насекомых отряда Lepidoptera.
3. Метод DIR-ПЦР показал более высокую разрешающую способность по сравнению с описанными ранее методами анализом нуклеотндных последовательностей рибосомных генов и методами геномного фингерпрннтинга, но при этом результаты DIR-ПЦР не противоречат данным, получаемым этими методами
4. Разрешающая способность предлагаемого метода позволяет выявлять геномные различия у диссопиантов одного штамма
Список работ по материалам диссертации:
1. Цыганкова СВ. Булыгина ЕС. Кузнецов ББ. Хабибулин СС. Дорошенко ЕВ. Короткое ЕВ. Эль-Регистан Г.И Получение внутрипопуляционных днссоциантов некоторых башшл и применение метода DIR-ГЩР для их идентификации / Микробиология 2004 Т 73 № 3 С 398-405.
2. Tsygankova S. V.. Ignatov A. N.. Boulygina E. S.. Kuznetsov В. В.. Korotkov E. V. Genetic relationships among strains of Xanthomonas campestns pv campestris revealed by novel rep-PCR primers '' Furopian Journal of Plant Pathology. 2004. In press.
3. Цыганкова СВ. Кузнецов ББ. Булыгина ЕС. Коротков ЕВ. Чален МБ 2001 Разработка метода идентификации прокариот на основе DAF-ПЦР и его применение к анализу генетических различий близкородственных бактерий / Горизонты физико-химической биологии Школа-конференция Тезисы стендовых сообщений Пущине Россия Т 1 С. 213
4. Цыганкова С.В . Кузнецов Б Б . Булыгпна Е С . Коротков Е В Сравнение современных молекулярно-биологических методов для идентификации близкородственных микроорганизмов / Семинар-презентация инновационных научно-технических проектов Бнотехнология-2001. Тезисы стендовых сообщений Пущина Россия 2001 С. 185.
5. Цыганкова С В , Игнатов АН. Булыгина ЕС. Кузнецов Б Б, Коротков Е В Применение метода DIR-ПЦР для изучения генетического полиморфизма фитопатогенных бактерий Xanihomonas campestru; I Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в X1X-XXI веках» Тезисы стендовых сообщений Санкт-Петербург. Россия 2001 С 79.
6. Цыганкова С В . Хабнбулин С С. Лойко Н Г.. Дорошенко Е В . Булыгина Е С. Кузнецов
Б Б.. Коротков Е В.. Воейкова ТА . Эль-Регистан Г И Регуляция фенотипическон диссоциации бактерий / И-ой Московский международный Конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития" Тезисы стендовых сообщений Москва. Россия 2003 С. 16
7. Ignatov A.. Tsygankova S.. Matveeva E.. Boulygina Г.. Kuznetsov В.. & N.W. Schaad. TonB cluster in Xanihomonas campestns (XC) and Ralstonia solanacearum (RS) is associated with host specificity / 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions St.-Peterburg. Russia. (Abstracts). 2003. P. 139.
8. Ignatov A.N.. Matveeva E.V. Tsygankova S.V.. Polytiko V.A.. Schaad N.W. DNA polymorphism of Xanthomonas iranshicens in Russian Federation revealed by PCR markers and 16s-23s ITSR sequence/' Phytopathology. 2003. V.93. P. 38-39.
Подписано в печать 06.08 2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 116 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102
^15666
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цыганкова, Светлана Валерьевна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ГЛАВА 1. Методы идентификации микроорганизмов.
1.1. Идентификация микроорганизмов, основанная на фенотипических методах.
1.2. Идентификация микроорганизмов, основанная на генотипических методах.
1.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК.
1.2.2. ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация.
1.2.3. Секвенирование белков и нуклеиновых кислот.
1.2.4. Использование ДНК-зондов для обнаружения бактерий и изучения состава микробных популяций.
1.2.5. Краткая характеристика бактериального генома.
1.2.6. Использование ПЦР со специфичными праймерами для обнаружения и идентификации бактерий.
1.2.7. ДНК-фингерпринтинг.
ГЛАВА 2. Характеристика отдельных групп бактерий.
2.1 Фитопатогенные бактерии родаXanthomonas.
2.1.2. Генетические взаимоотношения внутри вида X. campestris.4L
2.2. Бактерии группы Bacillus cereus.
2.2.1. Энтомопатогенные бактерии вида Bacillus thuringiensis.
2.2.2. Методы идентификации и классификации бактерий вида Bacillus thuringiensis.
2.2.3. Методы, используемые для идентификации cry генов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования.
3.1. Объекты исследования.
3.2. Выделение препаратов ДНК из биомассы.
3.3. ПЦР со специфическими праймерами к cryl, сгуЗ и сгу4 генам.
3.4. ПЦР с KRP и KRPN праймерами.
3.5. ПЦР с использованием праймеров к различным повторяющимся элементам.
3.6. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе.
3.7. Филогенетический анализ.
3.8. Клонирование ПЦР-фрагментов.
3.8.1. Приготовление компетентных клеток.
3.8.2. Лигирование.
3.8.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК.
3.8.4. Выделение плазмидной ДНК.
3.8.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК.
3.9. Секвенирование плазмид со вставкой.
3.9.1. Мечение праймеров.
3.9.2. Постановка реакции секвенирования.
3.10. SCAR-ПЦР анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 4. Подбор олигонуклеотидных праймеров для проведения DIR-ПЦР.
ГЛАВА 5. Оптимизация условий проведения DIR-ПЦР.
5.1. Оптимизация условий DIR-ПЦР для бактерий родов Xanthomonas и Bacillus.
ГЛАВА 6. Изучение генетических взаимоотношений между изолятами Xanthomonas campestris pv. campestris.
6.1. Сиквенсный анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и межгенной области 16S - 23 S рРНК.
6.2. Получение видо- и штаммо-специфичных фингерпринтов на ДНК Xanthomonas, выделенных в различных географических ареалах.
6.3. Фенетический анализ полученных геномных фингерпринтов.
6.4. Сравнение эффективности DIR-ПЦР и гер-ПЦР при изучении генетического полиморфизма штаммов Xanthomonas.
6.5. Разработка и тестирование SCAR праймеров для Xanthomonas campestris.
ГЛАВА 7. Изучение внутривидового разнообразия энтомопатогенных бактерий вида
Bacillus thuringiensis.
7.1 ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных к cryl, cry 3 и cry 4 генам.
7.2. Секвенирование и рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов, соответствующих cry генам.
7.3. Сиквенсный анализ 5'-концевых областей 16S и 23S рРНК и межгенной области 16S - 23S рРНК.
7.4. Изучение энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis методом DIR-ПЦР.
7.5. ПЦР-анализ энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis с применением праймерных систем к мобильным элементам, межгенным повторам и к терминаторным последовательностям.
7.6. Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов энтомопатогенных бактерий вида В. thuringiensis.
7.7. Разработка и тестирование SCAR праймеров для В. thuringiensis, патогенных в отношении насекомых отряда Lepidoptera.
ГЛАВА 8. Выявление геномных различий диссоциантов штаммов Bacillus cereus и
Bacillus subtilis.
8.1. Проверка видовой чистоты диссоциантов В. cereus.
8.1.1. Сиквенсный анализ 5'-вариабельной области гена 16S рРНК.
8.1.2. Проверка диссоциантов В. cereus на наличие cry генов.
8.2. ПЦР-анализ диссоциантов В. cereus с использованием праймеров к мобильным элементам.
8.3. Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов диссоциантов
В. cereus и В. subtilis.
ГЛАВА 9. Анализ таксономической надежности и разрешающей способности DIR-ПЦР в сравнении с другими методами ДНК-фингерпринтинга на примере видов Bacillus thuringiensis и Xanthomonas campestris.
9.1. Анализ штаммов рода Xanthomonas.
9.2. Анализ штаммов вида Bacillus thuringiensis.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование нового метода ПЦР-фингерпринтинга для дифференциации микроорганизмов на низших таксономических уровнях"
В настоящее время для описания и идентификации прокариотических организмов применяется совокупность фенотипических, генотипических и филогенетических подходов. К фенотипическим традиционно относят признаки отдельных бактерий, определяемые с помощью физических и биохимических методов (спектр общих белков, состав жирных кислот, антигенные характеристики и т.д.). Генотипические признаки в узком смысле сводятся к изо-ферментным паттернам, последовательностям ДНК определенных генов и сайт-специфичным ПЦР-фрагментам. В широком смысле к ним относятся также и ДНК-фингерпринты.
Успехи, достигнутые в последние годы в определении новых видов и идентификации штаммов микроорганизмов, связаны, прежде всего, с развитием молекулярно-биологических методов. Секвенирование нуклеиновых кислот и белков, а также методы геномного фингер-принтинга дают возможность сравнивать не только гены или их отдельные участки, но и полные геномы бактерий. Данные методы широко используются для идентификации различных прокариот и обнаружения их в образцах окружающей среды.
Однако при всем многообразии современных молекулярных методов остаются проблемы, которые до сих пор еще не решены. Например, большое значение имеет идентификация штаммов близкородственных бактерий в клинической диагностике, особенно в тех случаях, когда необходимо определить этиологию возбудителя, либо идентифицировать конкретные штаммы патогенов, отчего может зависеть характер дальнейшего лечения. Аналогичные проблемы возникают в промышленности, когда требуется установить штамм-продуцент, либо при его патентовании. Использование таких методов, как картирование генома, анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК или межгенной области 16S-23S рРНК, как правило, не дает положительных результатов в подобных исследованиях. Поэтому существует необходимость разработки новых методов идентификации близкородственных прокариот.
Применяемые методы ПЦР-диагностики (специфичный ПЦР) основаны на подробном изучении молекулярной структуры отдельных генов, что требует больших финансовых и временных затрат. Разработка методов генотипирования, которые основаны на интегральных способах характеристики генома и не требуют полного знания его молекулярной организации (сиквенса), позволит успешно решить данную проблему в более короткие сроки и с большей эффективностью.
Предлагаемый метод DIR-ПЦР, относящийся к группе методов генотипирования (ДНК-дактилоскопии), может использоваться как для изучения микроэволюции бактерий, так и для быстрой разработки систем праймеров, позволяющих проводить диагностику бактерий в разных таксономических подразделениях.
Более высокая, по сравнению с другими методами генотипического анализа, специфичность DIR-ПЦР, позволяет оценить степень родства микроорганизмов даже на низших (вплоть до пггаммового) таксономических уровнях, что весьма существенно для изучения видообразования и других проблем микроэволюции. Кроме того, по мере наполнения банка данных геномных фингерпринтов на базе DIR-ПЦР станет возможной более быстрая идентификация микроорганизмов, чем при частичном секвенировании 16S рРНК, к тому же стоимость такого анализа будет существенно дешевле.
Целью данной работы была проверка применимости нового метода ПЦР-фингерпринтинга DIR-ПЦР (diverged inverted repeats) для дифференциации микроорганизмов на самых низших таксономических уровнях: видовом и пггаммовом. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
1. Проверка предложенных праймерных систем на ДНК бактерий различных таксономических групп с целью выявления систем, пригодных для получения наиболее информативных спектров DIR-ПЦР.
2. Оптимизация условий проведения реакции для получения специфичных и воспроизводимых ПЦР-спектров бактерий разных таксономических групп.
3. Исследование возможности применения предлагаемого метода DIR-ПЦР для изучения филогенетических взаимоотношений внутри групп близких штаммов патовара Xanthomonas campestris и энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis.
4. Применение метода DIR-ПЦР для выявления геномных различий диссоциантов штаммов Bacillus cereus и Bacillus subtilis.
5. Сравнение степени надежности и разрешающей способности метода DIR-ПЦР с другими методами ПЦР-фингерпринтинга.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛАВА 1. Методы идентификации микроорганизмов.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Цыганкова, Светлана Валерьевна
ВЫВОДЫ:
1. Предлагаемый новый метод геномного фингерпринтинга позволяет выявлять различия между подвидами, патоварами и штаммами различных микроорганизмов: a) был выявлен высокий полиморфизм штаммов в популяции X. campestris pv. campestris, не обнаруживаемый другими молекулярно-биологическими подходами; b) метод DIR-ПЦР выявил обособленные группы среди подвидов В. thuringiensis, коррелирующие с фактом наличия определенных типов генов cry.
2. Показано, что DIR-ПЦР может быть применен для поиска молекулярных маркеров, сцепленных с заданным признаком: a) разработан SCAR-маркер для бактерий вида X. campestris, которые можно применять для диагностики зараженности семян растений эти патогеном; b) разработан специфичный SCAR-маркер для подвидов В. thuringiensis, продуцирующих cryl-токсины против насекомых отряда Lepidoptera.
3. Метод DIR-ПЦР показал более высокую разрешающую способность по сравнению с описанными ранее методами: анализом нуклеотидных последовательностей рибосомных генов и методами геномного фингерпринтинга, но при этом результаты DIR-ПЦР не противоречат данным, получаемым этими методами.
4. Разрешающая способность предлагаемого метода позволяет выявлять геномные различия у диссоциантов одного штамма.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цыганкова, Светлана Валерьевна, Москва
1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования // М.: Медицина. 1982. С. 126-162.
2. Булыгина Е.С. Систематика Грамотрицательных метилотрофных бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 5S рибосомных РНК // Кандидатская дисс. 1991.
3. Гальченко В.Ф., Абрамочкина Ф.Н., Безрукова JI.B., Соколова Е.Н., Иванов М.В. Видовой состав аэробной метанотрофной микрофлоры черного моря // Микробиология. 1988. Т. 57. С. 305-310.
4. Головлев E.JI Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. Т. 59. №2. С. 149-155.
5. Головлев E.JI. О старых проблемах новой систематики бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. №2. С. 281-286.
6. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus // Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 811-819.
7. Дубинина И.Г., Щербо С.Н., Макаров В.Б. Метод полимеразной цепной реакции в лабораторной практике // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. № 7. С. 4-6.
8. Игнатов А.Н., Кугинуки Я., Хида К. Возбудитель бактериозов капустных Xanthomonas campestris. О создании устойчивых к ксантомонадам растений семейства Brassiceae II Сельскохозяйственная биология. 2002. Т. 5. С. 75-84.
9. Игнатов А.Н., Поляков K.JL, Самохвалов А.Н. Количественный анализ серологических признаков Xanthomonas campestris И Сельскохозяйственная биология. 1998. №1. С. 106-115.
10. Милько Е.С. Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации // М.: Изд-во МГУ. 1991. С. 143.
11. Прозоров А А Рекомбинантные перестройки генома бактерий и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С. 581-594.
12. Турова Т.П. Филогения прокариот на основании анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей // Успехи микробиологии. 1983. Т. 18. С. 92-112.
13. Турова Т.П. Использование гибридизационного анализа нуклеиновых кислот для идентификации бактерий//Успехи микробиологии. 1992. Т. 25. С. 185-211.
14. Цыганкова С.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Хабибулин С.С., Дорошенко Е.В., Эль-Регистан Г.И. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации // Микробиология. 2004. Т. 73. № 3. С. 398-405.
15. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК / Под ред. В.А. Вахитова. М.: Наука. 1999. С. 199-204.
16. Шлегель Г. Общая микробиология / Под ред. Е.Н. Кондратьевой. М.: Мир. 1987.
17. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z.f Miller W. and Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.
18. Alvarez A.M., Benedict A.A., Mizumoto C.Y., Hunter J.E., Gabriel D.W. Serological, pathological and genetic diversity among strains of Xanthomonas campestris infecting crucifers // Phytopathology. 1994. V. 84. P. 1449-1357.
19. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-169.
20. Aroson A.I., Beckman W., Dunn P. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens // Microbiol. Rev. 1986. V. 50. P. 1-24.
21. Ash C., Farrow A.E., Dorsch M., Stackebrandt E., Collins M. Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16s rRNA//Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 343-346.
22. Ash C., Farrow J.A.E., Wallbanks S., Collins M.D. Phylogenetic heterogenety of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small-subunits-ribosomal RNA sequences // Lett. Appl. Microbiol. 1991. V. 13. P. 202-206.
23. Barry Т., Colleran G., Glennon M., Dunican L.K., Gannon F. The 16S/23S ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria//PCR methods Appl. 1991. V. 5. P. 51-56.
24. Benson D.R., Xanna D. Frankia diversity in an alder stands as estimated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis of whole-cell proteins // Can. J. Bot. 1983. V. 61. P. 2919-2923.
25. Bergey's. Manual of determinative bacteriology // Eds.: Holt J.G. et al., Williams and Wilkins, Baltimore. 1984.
26. Birch A., Hausler A., Ruttener C., Hutter R. Chromosomal deletions and Rearrangement in Streptomyces glaucescens И J. Bacteriol. 1991. P. 3531-3538.
27. Birnboim H.C., Doly J. A raoid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids. Res. 1979. V. 7. P. 1513-1523.
28. Bradbury J.F. Xanthomonas Dawson 1939 // In Bergeys manual of systematic bacteriology. Eds.: N.R. Krig and J.G. Holt, Williams and Wilkins Co., Baltimore. 1984. V. 1. P. 199-210.
29. Bravo A. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis б-endotoxin family proteins and their functional domains // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 2793-2801.
30. Bravo A., Jansens S., Peferoen M. Immunocytochemical localization of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins in intoxicated insects // J. Invertebr. Pathol. 1992. V. 60. P. 237-246.
31. Brousseau R., Saint-Onge A., Prefontaine G., Masson L., Cabana J. Arbitrary primer polymerase chain reaction, a powerful method to identity Bacillus thuringiensis serovars and strains //Appl. Envir. Microbiol. 1993. V. 59. P. 114-119.
32. Buss H.J., Denner E.B.W., Lubitz W. Classification and identification Bacteria: current approacher to an old problem. Overview of the methods used in bacterial systematics // J. Biotecnology. 1996. V. 47 P. 3-38.
33. Caetano-Anolles G., Bassam B.G., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Bio/Texnology 1991. V. 9. P. 553-557.
34. Carozzi N.B., Kramer V.C., Warm G.W., Evola S., Kozill M. Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles // Appl. Envir. Microbiol. 1991. V. 57. P. 3057-3061.
35. Ceron J., Covarrubias L., Quintero R., Ortiz A., Ortiz M., Aranda E., Lina L., Bravo A. PCR analysis of the Cryl insecticidal crystal family genes from Bacillus thuringiensis II Appl. Envir. Microbiol. 1994. V. 60. P. 353-356.
36. Ceron J., Ortiz A., Quintero R., Guereca L., Bravo A. Specific PCR primers directed to identify Ciyl and Crylll genes within a Bacillus thuringiensis strain collection // Appl. Envir. Microbiol. 1995. V. 61. P. 3826-3831.
37. Chaley M.B., Korotkov E.V., Skryabin K.G. The method revealing latent periodicity of the nucleotide sequences modified for a case of small samples // DNA Res. 1999. V. 6. P.153-163.
38. Charteris W. Taguchi systems of experimental design and data analysis A quality engineering technology for the food industry // J. Soc. Dairy. Technol. 1992. V. 45. P. 33-49.
39. Collins M.D., Jones D. Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implications // Microbiol. Rev. 1981. V. 45. P.316-354.
40. Coloe P.G., Slattery J.F., Cavanaugh P., Vaughan J. The cellular fatty acid composition of Campylobacter species isolated from cases of enteritis in man and animals // J. Hyg. 1986. V. 96. P. 225-229.
41. Conzalez J.M., Brown Jr. B.J., Carlton B.C. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for 5-endotoxin among strains of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus И Proc. Natl. Acad. USA. 1982. V. 79. P. 6951-6955.
42. Devereux R., Kane M.D., Winfrey J., Stahl D.A. Genus- and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulfate-reducing bacteria // System. Appl. Microbiol. 1992. V. 15. P.601-609.
43. Dubiley S., Kirillov E., Mirzabekov A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 19.
44. Dye D.W. and Lelliott R.A. Genus II. Xanthomonas И In: Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed. Eds.: R.E. Bushanan and N.E. Gibbons, Williams and Wilkins, Baltimore. 1974. P. 243-249.
45. Edmilson R., Goncalves E.R., Rosato Y.B. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer sequences // IJSEM. 2002. V. 52. P. 355-361.
46. Eisenach K.D., Sifford M.D., Cave M.D., Bates J.H., Crawford J.T. Detection of
47. Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction // Am. Rev. Respir. Dis. 1991. V.144. P. 1160-1163.
48. Farrelly V., Rainey F.A., Stackrbrandt E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of baterial spacies // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P.2798-2801.
49. Feitelson J.S. The Bacillus thuringiensis family tree // In: Advanced engineered pesticides. Ed.: L. Kim, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. 1993. P. 63-72.
50. Fleming J., Sanserverino J., Sayler G.S. Quantitative relationship between naphthalene catabolic frequency and exspression in predicting PAN degradation in soils at town gas manufacturing sites // Environ. Sci. Technol. 1993. V. 27. P. 1068-1074.
51. Flor H. Current status of the gene-for-gene concept // Annu. Rev. Phytopathol. 1971. V. 9. P. 275-296.
52. Frachon E., Hamon S., Nicolas L., de Baijac H. Cellular fatty acid analysis as a potential tool for predicting mosquitocidal activity of Bacillus sphaericus strains // Appl. Envir. Microbiol. 1991. V. 57. P. 3394-3398.
53. George M.L.C., Bustamam M., Cruz W.T., Leach J.E., Nelson R.J. Movement of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in southeast Asia detected using PCR-based DNA fingerprinting // Phytopathology. 1997. V.87. P. 302-309.
54. Gibson J.R., Slater E., Xery J., Tompkins D.S., Owen R.J. Use of an amplified-fragment length polymorphism technique to fingerprint and differentiate isolates of Helicobacter pylori II J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. P. 2580-2585.
55. Gonzalez R. and Hanna B.A. Evaluation of Gen-Probe DNA hybridization systems for the identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-intracellulare // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1987. V.8. P. 69-77.
56. Gurtler V., Mayall B.C. Genetic transfer and genome evolution in MRSA // Microbiology. 2001. V. 147. P. 3195-3197.
57. Gurtler V., Wilson V.A., Mayall B.C. Classification of medically important Clostridia using restiction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rRNA // J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2673-2679.
58. Guschin D.Y., Mobarry В., Prudnikov D., Stahl D.A., Ritmann B.E. and Mirzabekov A.D. Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental stadies in microbiology//Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 65. P. 2397-2402.
59. Hammens W.P., Vogel R.F. The genus Lactobacillus. II In: The genera of lactic acid bacteria. The lactic acid bacteria. Eds.: B.J.B. Wood and W.H. Holzapfel, Blackie Academie and Professional, Glasgow, Scotland. 1995. V. 2. P. 19-54.
60. Hauben L., Vauterin L., Swings J., Moore E.R.S. Comparison of 16S ribosomal DNA sequences of all Xanthomonas species // Int. J. Syst. Bacteriology. 1997. V. 47. P. 328-335.
61. Heimpel A.M., Angus T.A. The taxonomy of insect pathogens related to Bacillus cereus Frankland and Frankland // Canadian J. Microbiol. 1958. V. 4 P. 531-541.
62. Herdman M. J., Waterbury J.B. Deoxyribonucleic acid base composition of Cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. V. 111. P.63-85.
63. Hofte H., Whiteley H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensi // Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P.242-255.
64. Honeycutt R., Sobral B.W., McClelland M. Polymerase chain reaction (PCR) detection and quantification using a short PCR product and a synthetic internal positive control // Anal. Biochem. 1997. V. 248. P.303-306.
65. Honeycutt R.J., Sobral B.W., McClelland M. tRNA intergenic spacers reveal polymorphisms diagnostic for Xanthomonas albilineans // Microbiology. 1995. V. 141. P. 3229-3239.
66. Hulton C.S.J., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escerichia coli, Salmonella typhimurium, and other enterobacteria I I Mol. Microbiol. 1991. V. 5. P. 825-834.
67. Hung C.H., Yang C.F., Yang C.Y., Tseng Y.H. Involvement of tonB-exbBDlD2 operon in infection of Xanthomonas campestris phage phi L7 I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 21. P. 878-884.
68. Ignatov A.N., Kuginuki Y., Hida K. Pathotypes of Xanthomonas campestris pv. campestris in Japan // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 1999. V. 34. P. 177-181.
69. Ishiwata S. On a find of severe flacherie (sotto disease) // Dainihon Sanshi Kaiho. 1901. V. 114. P. 1-5.
70. Jaccard P. Novelles recgerches sur la distribution florale // Bull. Soc. Vaud. Sci. Nat. 1908. V. 44. P. 223-270.
71. Jang P., Vauterin L., Vancanneyt M., Swings J., Kersters K. Application of fatty acid methyl easters for the taxonomic analysis of the genus Xanthomonas И Syst. Appl. Microbiol. 1993. V. 16. P. 47-71.
72. Jassen P., Maquelin K., Coopman R., Tjerberg I., Bonvet P., Kerstens K., Dijkshoorn L. Discrimination of Acinetobacter genomic species by AFLP fingerprinting // Int. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 1179-1187.
73. Jensen M.A., Webster J.A., Straus N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 945-952.
74. Johnson E.A. Bacillus cereus food poisoning // In: Food science and technology: a series of monographs. Foodborn diseases. Ed.: D.O. Diver, Academic press, Troy, MO, USA. 1990. P. 127136.
75. Joung K.-B., Cote J.-C. A phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis serovars by RFLP-based rybotyping // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91. P. 279-289.
76. Joung K.-B., Cote J.-C. Phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis serovars based on 16S rRNA gene restriction fragment length polymorphisms // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 90. P. 115122.
77. Juarez-Perez V.M., Ferrandis M.D., Frutos K. PCR-based approach for detection of novel Bacillus thuringiensis cry genes //Appl. Envir. Microbiol. 1997. V. 63. P. 2997-3002.
78. Kaltenboeck В., Kousoulas K.G., Storz J. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 487-502.
79. Kamoun S., Kadmar H.V., Tola E., Kado C.I. Incompatible interaction between crucifers and Xanthomonas campestris involves a vasicular hypersensitive response: role of the hrpX locus // Molecular plant-microbe interactions. 1992. V.5. P. 22-33.
80. Kendall M.G. Rank Correlation Methods, 3nd ed. // Charles Griffin, London. 1970.
81. Kim H-S. Comparative study of the frequency, flagellar serotype, crystal shape, toxicity, and cry gene contents of Bacillus thuringiensis from three environments // Curr. Microbiol. 2000. V. 41. P. 250-256.
82. Kim J., Nietfeld J., Benson A.K. Octamer-based genome scanning distinguishes a unique subpopulation of E. coli 0157:H7 strains in cattle // PNAS. 1999. V. 96. P. 13288-13293.
83. Knowles B.H. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal 5-endotoxins // Adv. Insect. Physiol. 1994.V. 24. P.275-308.
84. Kostman J.R., Edlind T.D., LiPuma J.J., Stull T.L. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia determined by polymerase chain reaction ribotyping // J. Clin. Microbiol. 1992. V. 30. P. 2084-2087.
85. Kronstad J.W., Whiteley H.R. Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes // Gene. 1986. V. 43. P. 29-40.
86. Kryweinczyk J. Antigenic composition of delta-endotoxin as an aid in identification of Bacillus thuringiensis varieties // Technical report IP-X-12. Canadian Forestry Service, Ottawa, Ontario, Canada. 1977.
87. Kuo W.S., Chak K.F. Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorfism of the PCR-amplified DNA // Appl. Envir. Microbiol. 1996. V. 62. P. 1369-1377.
88. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing // In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial systematics. Eds.: E. Stackebrandt and M. Goodfellow, John Wiley and Sons, Chichester. 1991.
89. Lawrence D., Heltefuss S., Seifer H.S.H. DifFeretiation of Bacillus anthracis from Bacillus cereus by gas chromatographic whole-cell fatty acid analysis // J. Clin. Microbiol. 1991. V. 29. P. 1508-1512.
90. Lawrence J.G., Ochman H., Hartl D.L. Molecular and evolutionary relationships among enteric bacteria//J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 1911-1921.
91. Lecadet M.-M., Frachon E., Cosmao Dumanior V. et.al. Updating the H-antigen classification of Bacillus thuringiensis II J. Appl. Microbiol. 1999. V. 86. P. 660-672.
92. Less M.A., Newnan D.M.and Garland S.M. Comparison of a DNA probe assay with culture for the detection of Chlamydia thrachomatis // J. Med. Microbiol. 1991. V. 35. P. 159-161.
93. Leyns F., De Cleene M., Swings J.-G., De Ley J. The host range of the Xanthomonas II Bot. Rev. 1984. V. 50. P. 308-356.
94. Liang Y., Patel S.S., Dean D.H. Irreversible binding kinetics of Bacillus thuringiensis Cry IA 5-endotoxins to gypsy moth brush border membanes vesicles is directly correlated to toxicity // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 24719-24724.
95. Liesack W., Weyland H., Stackrbrandt E. Potential risk of gene amplifycation by PCR as determined by 16S rDNA analysis of a mixed-culture of strict barophilic bacteria // Microb. Ecol. 1991. V. 21. P. 191-198.
96. Link W., Dixens C., Singh M., Schwall M., Melchinger A.E. Genetic diversity in European and Mediterranean faba bean germ plasm revealed by RAPD markers // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 90. P. 27-32.
97. Louws F.G., Rademaker J.L.W., de Bruijn F.G. The three Ds of PCR-based genomic analysis of phytobacteria: diversity, detection and disease diagnosis // Ann. Rev. Phytopathol. 1999. V. 37. P. 81-125.
98. Mahillon J., Chandler M. Insertion sequences // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 725-774.
99. Mantel N. The detection of disease clustering and a generalized regression approach // Cancer Res. 1967. V. 27. P. 209-220.
100. Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M., Schleifer K.-H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and solutions // System. Appl. Microbiol. 1992. V. 14. P. 593-600.
101. Marchesi J.R., Sato Т., Weightman A.J., Martin T.A., Fry J.C., Hiom S.J., Wade W.G. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA//Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 795-799.
102. Matheson V.G., Munakata-Marr J., Hopkins G.D., McCarty P.L., Tiedje J.M., Forney L.J. A novel means to develop strain-specific DNA probes for detecting bacteria in the environment // Apll. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 2863-2869.
103. Mayer L.W. Use of plasmid profiles in epidemiologic surveillance of diseases outbreaks and in tracing the transmission of antibiotic resistance // Clin. Microbiol. Rev. 1988. V. 1. P. 228-243.
104. Mazurek G.H., Reddy V., Marston B.J., Haas W.H., Crawford J.T. DNA fingerprinting by infrequent-restriction-site amplification // J. Clin. Microbiol. 1996. V. 34, P. 2386-2390.
105. Milch H. Advance in bacterial typing methods // Acta. Microbiol. Immunol. Hung. 1998. V. 45. P. 401-408.
106. Mobarry B.K., Wagner M., Urbain V., Rittmann B.E., Stahl D.A. Phylogenetic probes for analyzing abundance and spatial organization of nitrifying bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P.2156-2162.
107. Murray B.E., Singh K.V., Heath J.D., Sharma B.R., Weinstock G.M. Comparison of genomic DNAs of different enterococcus isolates using restriction endonucleases with infrequent recognition sites //J. Clinic. Microbiol. 1990. V.28. P. 2059-2063.
108. Myers L.E., Silva S.V.P.S., Procuniar J.D., Little P.B. Genomic fingerprinting of Haemophilus somnus isolates using a random amplified polymorphic DNA assay // J. Clin. Microbiol. 1993. V. 31. P. 512-517.
109. Nachtigall M. Characterization of Xanthomonas campestris pv. campestris isolates by immunological and molecular biological methods // In: Federal Centre for Breeding Research on Cultivated plants. Annual Report. 1998.
110. Nastasi A., Mammina C., Villafrate M.R. rDNA fingerprinting as tool in epidemiological analysis of Salmonella typhi infections // Epidemiol. Infect. 1991. V. 107. P. 565-576.
111. Nei M., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979. V. 76. P. 5269-5273.
112. Ohba M., Aizawa K. Frequency of cry ' spore forming Bacillus cereus possessing flagellar antigens of Bacillus thuringiensis // J. of Basic Microbiol. 1986. V. 26 P. 185-188.
113. Olsen J.E., Aabo S., Hill W., Notermans S., Wernars K., Granum P.E., Popovic Т., Rasmussen H.N., Olsvik O. Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens // Int. J. Food Microbiol. 1995. V. 28. P. 1-78.
114. Pace N.R., Stahl D.A., Lane D.J. and Olsen G.J. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences // In: Advances in microbial ecology. Ed.: K.C. Marshall, Plenun press, New York, N.Y. 1986, P. 1-55.
115. Paul J. H., Cesaares L., Thurmond J. Amplification of the rbcL gene from dissolved and particulate DNA from aquatic environments // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 19631966.
116. Pearson K. On the coefficient of racial likeness // Biometrika. 1962. V. 18. P. 105-117.
117. Peinado M.A., Malkhosyan S., Velazquez A., Perucho M. Isolation and characterization of allelic losses and gains in colorectal tumors by arbitrarily primed polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10065-10069.
118. Pichard S.L., Campbell L., Paul J. H. Diversity of the ribulose bisphosphate carboxylase/Oxygenase form 1 gene (rbcL) in natural phytoplankton communities // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3600-3606.
119. Poh C.L., Yeo C.C., Tay L. Genome fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis and ribotyping to differentiate Pseudomonas aeruginosa serotype 011 strains // Eur. J. Clinic. Microbiol. Infect. Dis. 1992. V. 11. P. 817-822.
120. Poulsen L.K., Ballard G., Stahl D.A. Use of rRNK fluorescence in situ hybridization for measuring the activity of single cells in young and established biofilms // Appl. Microbiol. 1993. V. 59. P.1354-1360.
121. Reysenbach A-L., Giver L.J., Wickham G.S., Pace N.R. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction//Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 3417-3418.
122. Rossier O., Van de Ackerveken G., Bonas U. HrpB2 and HrpF from Xanthomonas are type Ш-secreted proteins and essential for pathogenicity and recognition by the host plant // Mol. Microbiol. 2000. V. 38. P. 828-838.
123. Salzberg S.L., Salzberg A.J., Kerlavage A.R., Tomb J.F. Skewed oligomers and origins of replication // Gene. 1998. V. 217. P. 57-67.
124. Sambrook J., Fritsch E.F., Manniatis. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. / Ed.: C. Nolan, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.
125. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 84. P. 5463-5467.
126. Sayada C., Denamur E., Orfila J., Catalan F., Elion J. Rapid genotyping of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein by the polymerase chain reaction // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 83, P. 73-78.
127. Shaad N.W., Vidaver A.K., Lacy G.H., Rudolph K., Jones J.B. Evaluation of proposed amended names of several Pseudomonads and Xanthomonads and recommendations // Phytopathology. 2000. V. 90. P. 208-213.
128. Schleifer K.H., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications // Bacteriol. Rev. 1972. V. 36. P. 407-477.
129. Schlichting С., Branger С., Fournier J.-M. Typing of Staphylococcus aureus by pulsed-field gel electrophoresis, zymotyping, capsular typing and phage typing: resolution of clonal relationships //J. Clinic. Microbiol. 1993. V. 31. P. 227-232.
130. Smith R.A., Couche G.A. The phylloplane as a soyrse of Bacillus thuringiensis variants // Appl. Envir. Microbiol. 1991. V. 57. P. 311-315.
131. Stern M.J., Ames G.F.L., Smith N.H., Robinson E.C., Higgins C.F. Repetative extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome // Cell. 1984. V. 37. P. 10151026.
132. Taguchi G., Wu Y. Introduction to off-line quality control // Japan Quality Control * Organisation. Nagoya, Japan. 1980.
133. Tajima F., Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences // Mol. Biol. EvoL 1984. V. 1. P. 269-285.
134. Tram C., Simonet M., Nicolas M.-H., Offredo C., Grimont F., Lefevre M., Ageron E., Debure A., Grimont P.A.D. Molecular typing of nosocomial isolates of Legionella pneumophila serogroup 3 //J. Clinic. Microbiol. 1990. V. 28. P. 242-245.
135. Tsang A.Y., Denner J.C., Brennen P.J., McClatchey J.K. Clinical and epidemiological importance of typing Mycobacterium avium complex isolates // J. Clinic. Microbiol. 1992. V. 30. P. 479-484.
136. Turnbull P.C.B., Huston R.A., Ward M.J., Jones M.N., Quinn C.P., Finnie N.J., Duggleby C.J., Kramer J.M., Melling J. Bacillus anthracis but not always anthrax // J. Appl. Bacteriol. 1992. V. 72. P. 21-28.
137. Ueda Т., Suga Y, Yashiro N., Matsuguchi T. Remarkable N2-fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of niffl gene sequences // J. Bacterid. 1995. V. 177. P. 1414-1417.
138. Van de Peer, Y., De Wachter R. TRECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows Environment Comput // Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.
139. Vauterin L., Hoste В., Kersters K., Swings J. Rectification of Xanthomonas II Int. J. Syst. Bacteriology. 1995. V. 45. P. 472-489.
140. Vauterin L., Swings J., Kersters K. Grouping of Xanthomonas campestris pathovars by SDS-PAGE of proteins//J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 1677-1687.
141. Versalotic J., Koeuth Т., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 68236831.
142. Vines A., Reeves M.W., Hunter S., Swaminathan B. Restriction fragment length polymorphism in four virulence-associated genes of Listeria monocytogenes II Res. Microbiol.1992. V. 143. P. 281-294.
143. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee Т., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Muiper M., Zabeau M. AFLP: a new concept for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1995. V. 21. P. 4407-4414.
144. Ward D.M., Bateson M.M., Weller R. and Ruff-Roberts A.L. Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature // In: Advances in microbial ecology. Ed.: K.C. Marshall, Plenun press, New York, N.Y. 1992. P.219-286.
145. Way J.S., Josephson K.L., Pillai S.D., Abbaszadegan M., Gebra C.P., Pepper I.L. Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction // Appl. Environ. Mocrobiol.1993. V. 59. P. 1473-1479.
146. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 7213-7218.
147. Wiedmann M., Barany F., Batt C.A. Detection of Listeria monocytogenes with a nonisotopic polymerase chain reaction-coupled ligase chain reaction assay // Appl. Environ. Mocrobiol. 1993. V. 59. P. 2743-2745.
148. Williams J.G-K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.
149. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. V. 51. P. 221 -271.
150. Yakubu D.E., Abadi F.J., Pennington Т.Н. Molecular typing methods for Neisseria meningitides H J. Med. Microbiol. 1999. V. 48. P. 1055-1064.
151. Yang P., De Vos P., Kersters K., Swings J. Polyamine patterns as chemotaxonomic markers for the genus Xanthomonas // Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. V. 43. P. 709-714.
152. Zahner V., Momen H., Salles C.A., Rablnovitch I. A comparative study of enzyme variation in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis И J. Appl. Bacteriol. 1989. V. 67. P. 275-282.
153. Zehr J.P., Mellon M., Braun S., Litaker W., Steppe Т., Paerl H.W. Diversity of heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 2527-2532.
154. Zeigler D.R. Gene sequences useful for predicting relatedness of whole genomes in bacteria // USEM. 2003. V. 53. P. 1893-1900.
-
Цыганкова, Светлана Валерьевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.07
- Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба
- Биоразнообразие бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas и создание молекулярной системы их идентификации и диагностики
- Внутривидовое разнообразие колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ
- Генетическая гетерогенность популяций кур, определяемая ДНК-фингерпринтингом и RAPD-анализом
- Полиморфные ДНК-маркеры в исследовании генетического разнообразия лососевых рыб
