Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфные ДНК-маркеры в исследовании генетического разнообразия лососевых рыб

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфные ДНК-маркеры в исследовании генетического разнообразия лососевых рыб"

На правах рукописи

СЕКСТЕ ЭДГАР АРТУРОВИЧ

ПОЛИМОРФНЫЕ ДНК - МАРКЕРЫ В ИССЛЕДОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

Специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.П. ТЕРЛ1ЕЦКИЙ

(ГНУ ВНИИГРЖ)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б.П. ЗАВЕРТЯЕВ

(ГНУ ВНИИГРЖ)

доктор биологических наук И.Н. АНИСИМОВА

(ГНУ ВНИИР РАСХН)

Ведущее учреждение:

ФГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела МСХ РФ

Защита диссертации состоится «——» -2008 г. в ^

часов на заседании диссертационного совета Д 006.012.01 по защите докторских диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ГНУ ВНИИГРЖ) Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 196601, Санкт-Петербург- Пушкин, Московское шоссе, 55-а. Факс: (812>465-99-89. E-mail: spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ Автореферат разослан «¿А ¿2/t/T? О,i 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Акгуальносп. темы. Поддержание оптимального уровня генетического разнообразия является одной из важнейших задач, требующих немедленного решения, поскольку снижение генетической гетерогенности приводит к ухудшению многих качественных показателей рыбы и ставит под угрозу существование генофондных популяций лосося и пород радужной форели В тоже время увеличение генетического разнообразия приводит к утрате уникальных свойств и признаков, характерных для пород и популяций лососевых рыб.

В настоящее время с внедрением в практику молекулярно-генетических методов исследования, таких как ДНК-фингерпринтинг, таксонопринт, БАРЮ-анализ, появилась возможность проводить генетический контроль над уровнем генетического разнообразия в генофондных популяциях, подбирать оптимальную структуру и размер популяций, осуществлять подбор пар производителей для получения эффекта гетерозиса, подбирать пары для повышения выживаемости личинок и мальков лососевых рыб, а также осуществлять молекулярно-генетической оценку эффективности проводимой селекции, уточнять историю выведения пород и популяций лососевых рыб.

Представленная работа является частью научных исследований, проводимых лабораторией молекулярной цитогенетшш ГНУ ВНИИ генетики и разведения с -х. животных в соответствии с научной программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации, выполненной по договору с РАСХН: 06.01 01 «Установить генетическую гетерогенность популяций сельскохозяйственных животных и разработать комплексную систему оценки наследственных качеств племенных животных на основе использования генетических маркеров|и ДНК- технологий» (номер гос. регистрации 15070.7822000013.06.8.001.1)

1.2. Цель и задачи исследований. Основной целью работы является оценка генетического разнообразия пород и популяций лососевых рыб с помощью полиморфных ДНК-маркеров

В конкретные задачи работы входило.

определить перспективы применения метода ЛАРО-РСЯ для выявления различий между видами и породами лососевых рыб,

провести подбор праймеров, способных выявлять повторяющиеся последовательности ДНК у лососевых рыб,

обнаружить маркерные фрагменты ДНК у отдельных пород и популяций лосося, используя молекулярный зонд (ООАТ)4

провести сравнительную оценку генетических параметров, полученных с помощью 2-х методов. КАРБ-РСК-анализа и ДНК-фингерпринтинга

1.3. Научная новизна работы. Впервые показан высокий уровень сходства между популяциями онежского и балтийского лососей (В8=0,92 по праймеру ОРР-17) Выявлены максимальные различия между популяциями каспийского и балтийского лососей (В8=0,69 по праймеру ОРР-17) Обнаружены маркерные фрагменты, характерные для каспийского лосося

Наблюдается достаточно высокий уровень сходства между породой радужной форели росталь и популяцией стальноголового лосося

Показана высокая отрицательная корреляция между коэффициентом сходства и скоростью роста годовиков, а также между коэффициентом сходства и сохранностью мальков при гетерогенном подборе в парах стальноголового лосося

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость состоит в разработке молекулярно-

генетических подходов для выявления особенностей породообразовательных процессов у лососевых рыб.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности использования 11АРВ-РСК. анализа для обнаружения маркерных

последовательностей ДНК у генофондных популяций лосося и пород радужной форели

Использованные методы позволяют с большой эффективностью подбирать пары стальноголового лосося для дальнейшего получения товарной рыбы

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на аспирантских сессиях, отчетах лаборатории молекулярной цитогенетики и в материалах межрегиональной научной конференции аспирантов и студентов СПбГАУ, посвященной 100-летию университета Отдельные положения работы представлены в материалах международной научной конференции ГНУ ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», Санкт-Петербург, 26-28 июня 2007 и в журнале «Доклады РАСХН».

1.6. Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

1.7. Объем и сгруюура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений производству и списка использованной литературы Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц и 13 рисунков Список литературы включает 175 наименований, в том числе 112 на английском языке

1.8. Основные положения, выносимые на защипу:

наличие маркерных последовательностей, характерных для отдельных популяций рыб, выявляемых с помощью RAPD-PCR-анализа и ДНК-фингерпринтинга

использование зонда (GGAT)4 для типирования популяций

лосося,

сравнительная оценка основных генетических параметров, полученных методом RAPD-PCR и ДНК-фингерпринтингом

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИ генетики и разведения с.-х животных Объектом исследования были образцы ДНК. Геномную ДНК выделяли из крови рыб семейства лососевых: онежского, балтийского, каспийского и стальноголового лосося (род Salmo) и у некоторых пород радужной форели: росталь, рофор, форель дональдсона, камлоопс и адлерская янтарная (род Oncorhynchus) (от 8 до 10 голов). Выделяли ДНК по стандартной методике (Т. Маниатис, 1984)

Для определения популяционно-генетических параметров в генофондных популяциях лосося и в породах радужной форели использовали два метода исследования - полимеразную цепную реакцию со случайными праймерами (RAPD-PCR-анализ) и ДНК- фингерпринтинг

RAPD-PCR-анализ проводили с использованием 10 олигонуклеотидных праймеров ОРР-12 (TJHatanaka et al, 2003), OPA-16 (P В Mather, 2001), UBC-744 (T Jug et al., 2004), UBC-575 (T Jug et al, 2004), UBC-509 (T Jug et al, 2004), UBC-508 (T Jug et al, 2004), OPC-03 (X. Zhang et al, 1995), OPC-05(X. Zhang et al, 1995), OPC-12 (X Zhang et al., 1995), OPP-17( D Sharma et al., 2001).

Для ДНК-фингерпринтинга использовали олигонуклеотидный зонд (GGAT)4 меченый дезоксигенином по усовершенствованной нами методике (VP Terletski, 2003)

Изображения анализировали с помощью программ компьютерной графики и Iplab™ и RFLPscan™, а также программы Gelstats™, которая позволяет рассчитать популяционно-генетические параметры по методикам разработчиков

Анализ внутрипопуляционной генетической вариабельности проводили на основании расчетов средней гетерозиготности (Stephens J С et al, 1992)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ полиморфизма ДНК лососевых рыб рода Salmo с помощью RAPD-PCR -анализа

В предварительных экспериментах было протестировано 10 десятичленных олигонуклеотидных праймера, из которых отобрано только два ОРР-17 и ОРС-ОЗ, дающие наиболее информативные картины распределения полос (фрагментов ДНК) Исследованные популяции отличались по частотам встречаемости полос (табл 1).

Так, например, фрагменты №2 (950 пн.), 6 (300 пн), 11 (670 пн) обнаружены у всех изученных каспийских лососей и полностью отсутствуют в RAPD-cnerapax онежского и балтийского лососей Фрагменты №3 (850 п.н.), №5 (320), и №14 (360 п.н), встречаются только у балтийского и онежского лососей.

Наиболее близкими оказались группы онежского и балтийского лососей (BS=0,93 по праймеру ОРР-17, BS=0,81 по праймеру ОРС-ОЗ и BS=0,87 по суммарной матрице) Такое генетическое сходство можно объяснить географической близостью ареалов распространения указанных групп лосося. К тому же наши результаты подтверждают данные морфологии и кариотипа лосося, в результате которых популяции онежского и балтийского лосося были отнесены к 2-м подвидам благородного лосося. Максимальные различия были получены между популяциями каспийского и балтийского лосося (BS=0,69 по праймеру ОРР-17, В8=0,75 по праймеру ОРС-ОЗ, BS=0,72 по суммарной матрице) Каспийский лосось подвергся большей дивергенции вследствие географической изоляции этого вида лосося и отсутствием обмена генетическим материалом на протяжении многих поколений

Таблица 1. Частота встречаемости некоторых фрагментов ДНК на

КАРП- спектрах лососевых рыб

Праймер Номер Размер Частота встречаемости фрагментов

фрагмента фрагмента онежский каспийский балтийский

(ПН) лосось лосось лосось

1 1030 0,89 0,00 1,00

2 950 0,00 1,00 0,00

3 850 1,00 0,00 1,00

ОРР-17 4 800 0,89 0,50 1,00

5 320 1,00 0,00 1,00

6 300 0,00 1,00 0,00

7 250 0,89 0,50 0,89

8 2100 1,00 0,75 0,00

9 2000 0,00 1,00 0,89

10 840 1,00 0,00 0,56

ОРС-ОЗ И 670 0,00 1,00 0,00

12 420 1,00 1,00 0,22

13 380 1,00 1,00 0,33

14 360 1,00 0,00 1,00

Результаты расчетов генетического сходства и генетического расстояния между различными группами рыб, полученные с использованием двух праймеров ОРР-17 и ОРС-ОЗ представлены в таблице 2.

Таблица 2. Коэффициенты генетического сходства (ВБ) и генетические расстояния (О) между популяциями онежского, балтийского и каспийского

лосося по данным {{АРО-анализа

Праймер В 8 внутри групп В 8 между группами генетическое расстояние по Lynch (D)

I II III I-II I - III II-III Г - III II - III

ОРР-17 0,91 0,93 0,94 0,70 0,93 0,69 0,22 0,00 0,24

ОРС-ОЗ 1,00 0,96 0,88 0,81 0,81 0,75 0,17 0,13 0,18

По двум праймер 0,96 0,95 0,91 0,76 0,87 0,72 0,20 0,06 0,21

I — онежский лосось, II — каспийский лосось, III - балтийский лосось

D— генетическое расстояние по Lynch (1991)

Низкие значения генетического расстояния отмечены между онежским и балтийским лососем (D=0,00 по праймеру ОРР-17, D=0,13 по праймеру ОРС-ОЗ и D-0,06 по суммарной матрице)

Генетическое разнообразие определяли по критерию средней гетерозиготности. Наибольшее генетическое разнообразие наблюдается у балтийского лосося (Н1=0,11), а наименьшее у каспийского лосося (Н1=0,06) по суммарной матрице

3.2. Анализ гетерогенности лососевых рыб рода Salmo с помощью ДНК-фши ерпринтинга

На картине фингерпринтинга ДНК балтийского, онежского и каспийского лососей имеются полосы, встречающиеся у всех изучаемых видов с частотой 1,00 (фрагменты 53, 67 и 70) Есть также фрагменты, характерные для отдельных популяций

Таблица 3. Коэффициенты генетического сходства (BS) и генетические расстояния (D) между популяциями онежского, балтийского и

каспийского лосося по данным ДНК-фингерпринтинга

Кол-во

Популяция п полос на BS внутри BS между D

дорожку Х±ш ir групп группами

балтийский 10 33,2±1,57 9,23x10"* 0,57

лосось 0,53 0,07

онежский лосось 9 33,3±1,11 1,63х10"7 0,63

балтийский 10 33,2±1,57 9,23x10"9 0,57

лосось 7,04х10"и 0,43 0,13

каспийский 10 39,2± 1,97 0,55

лосось

онежский лосось 9 33,3±1,12 1,63x10"' 0,63

7,04x10"11 0,44 0,15

каспийский 10 39,2±1,97 0,55

лосось

Р — вероятность встречаемости двух особей с идентичными

фрагментами ДНК; п - число особей

Например, фрагмент 42 является мономорфным для каспийского лосося и редко встречается у балтийского и онежского лососей А фрагмент 122 является мономорфным для онежского лосося и редко встречается у балтийского и каспийского лососей

Коэффициенты сходства между балтийским и онежским лососем значительно выше, чем между каспийским и обоими этими видами (табл 3) Соответственно, значения генетического расстояния между каспийским и другими двумя популяциями были существенно выше

Расчет генетического разнообразия внутри популяций проводился по критерию средней гетерозиготности (Stephens J С etal, 1992) Самый высокий уровень гетерозиготности отмечен в популяции каспийского лосося (Н=0,62) Самый низкий уровень генетического разнообразия выявлен в популяции онежского лосося (Н-0,40) Это объясняется малочисленностью популяции Кроме того, онежский лосось является представителем озерной экофауны, что практически исключает обмен генетичес,кой информацией и ведет к снижению генетического разнообразия этого ценного вида рыб Для более точной оценки требуется проведение мониторинга природной популяции этого вида

В ходе исследования выяснилось, что каспийский лосось по изучаемым минисателлитным маркерам, значительно отличаются от всех изучаемых видов лосося Балтийский и онежский лосось в процессе эволюции генетически дивергировали незначительно, поскольку относятся к одному виду. Полученные данные могут быть использованы для контроля генетического разнообразия в генофондных популяциях лососевых рыб

3.3. Анализ генетического разнообразия пород радужной форели с помощью КАРО-РСК-аналтоа

Был проведен ЛАРО-анализ 2-х пород радужной форели (росталь и рофор) и популяции стальноголового лосося, с целью оценки генетического разнообразия этих популяций Были отобраны 6 праймеров, дающие наиболее полиморфную картину распределения полос

Породы радужной форели отличались по частотам встречаемости полос на КАРБ-спектрах (табл 4)

Таблица 4. Частота встречаемости некоторых фрагментов ДНК на

ЯАРВ-спектрах пород радужной форели и стальноголового лосося

Праймер Размер Частота встречаемости фрагментов

фрагмента (пн) росталь стальноголовый лосось рофор

770 0,56 0,75 0,44

430 0,33 0,25 0,67

ОРР-17 350 0,78 0,50 0,22

300 0,56 0,63 0,67

1600 0,00 0,25 0,33

1200 0,67 0,88 0,67

ОРС-12 500 0,44 1,00 0,56

480 0,44 0,38 0,78

2500 1,00 1,00 0,56

900 0,89 1,00 0,56

ОРС-05 890 1,00 0,88 1,00

600 1,00 0,63 0,78

880 0,67 0,50 0,13

ОРС-ОЗ 750 0,89 0,88 0,63

600 0,78 0,88 1,00

1300 0,78 1,00 0,67

UBC-744 500 0,67 0,63 1,00

1050 1,00 0,88 1,00

UBC-508 1000 1,00 0,63 1,00

720 0,67 0,50 1,00

Разница в частотах незначительна, но все же позволяет судить о степени полиморфизма в определенной популяции Так с помощью праймера

ОРС-12 выявлен фрагмент ДНК размером 500 п.н, встречающийся у всех особей стальноголового лосося и значительно реже у пород росталь и рофор Праймер ОРС-05 выявил фрагмент длиной 600 п н , который был обнаружен у всех особей форелей росталь и рофор Праймер ЦВС-508 обнаружил фрагмент длиной 1000 пн. у всех форелей рофор и росталь и встречающийся с меньшей частотой у стальноголового лосося

Наиболее однородной группой оказалась порода росталь (В8=0,99 по праймеру ОРС-05 и В8=0,92 по суммарной матрице), а наиболее гетерогенной - стальноголовый лосось (В8=0,79 по праймеру ЦВС-508 и 0,91 по суммарной матрице) (табл 5) Стальноголовый лосось - проходная рыба, характеризующийся множеством фенотипически различающихся форм, приспособленных к самым различным ареалам, что естественно отражается на генофонде популяций, как следствие высокий уровень генетического разнообразия.

Таблица 5. Коэффициенты генетического сходства (ВБ) и генетические расстоянии (1>) между породами радужной форели росталь и рофор и популяцией стальноголового лосося по данным КАРО-анализа

Праймер ВБ внутри групп В Б между группами О (генетическое расстояние)

I II Ш Ы1 ЫП II -III 1-Н 1-Ш II - III

ОРР-17 0,80 0,84 0,84 0,83 0,81 0,84 0,00 0,01 0,00

ОРС-12 0,94 0,96 0,92 0,94 0,93 0,93 0,01 0,00 0,01

ОРС-05 0,99 0,95 0,90 0,96 0,93 0,91 0,01 0,02 0,02

ОРС-ОЗ 0,92 0,92 0,94 0,93 0,91 0,93 0,00 0,02 0,01

ЦВС-744 0,93 0,96 0,96 0,95 0,94 0,94 0,00 0,00 0,01

ЦВС-508 0,92 0,79 0,90 0,86 0,90 0,84 0,00 0,01 0,01

По суммарн матрице 0,92 0,91 0,91 0,91 0,91 0,90 0,00 0,01 0,01

I - росталь , II - стальноголовый лосось(Ропша) ; III - рофор

Порода росталь в свою очередь создавалась на основе стальноголового лосося, с применением близкородственных скрещиваний, что повлекло за собой снижение генетического разнообразия

Наиболее близкими среди пород являются особи пород росталь и стальноголового лосося (В8=0,96 по праймеру ОРС-05, по праймеру ЦВС-744- 0,95 и по суммарной матрице - 0,91)

Максимальные различия были получены между особями стальноголового лосося и форели рофор (В8=0,84 по праймеру ОРР-17 и 0,90 по суммарной матрице).

Относительно низкие значения генетического расстояния отмечены между породой росталь и стальноголовым лососем (табл 5) Поскольку генофонд породы росталь представлен значительной долей генов стальноголового лосося

3.4. Генетическая изменчивость радужной форели, определяемая методом ДНК-фингерпринтинга Для сравнения изучаемых пород форели, был проведен анализ частоты встречаемости полос. К отличительным особенностям породы росталь следует считать отсутствие полос 3, 6, 27, присутствие у всех особей полосы 44 У стальноголового лосося при отсутствии полосы 27, присутствуют полосы 3 и 6 Порода рофор имеет все три полосы 3, 6 и 27, при отсутствии полосы 109. Частота встречаемости полос у каждой породы рыб позволяет идентифицировать исследуемые популяции

Коэффициенты сходства находятся в пределах, характерных и для других видов животных Наиболее низкие коэффициенты сходства у стальноголового лосося и породы рофор свидетельствуют о высокой гетерогенности популяций, по сравнению с породой росталь (табл. 6) Коэффициенты сходства между породами достаточно высокие Это говорит о генетической близости изучаемых популяций рыб Об этом свидетельствуют и данные о генетических расстояниях.

Таблица 6. Коэффициенты генетического сходства (Вв) и генетические расстояния (О) менаду породами радужной форели росгаль и рофор и популяцией стальноголового лосося цо данным ДНК-фингерпрншинга

Порода п Среднее число полос на дорожке Р ВБ внутри групп В8 между группами Б

росталь 10 34,2±3,12 5,4x10-' 0,66

стальноголо- 1,4x10"10 0,51 0,06

вый лосось 10 30,0±4,02 0,47

росталь 10 34,2±3,12 5,4x10-'" 0,66 0,50 0,09

рофор 10 31 ¿±4,05 7,8хЮ'10 0,51

стальноголо- 10 30,0±4,02 1,4x10-'" 0,47

вый лосось 7,8x10-'° 0,45 0,05

рофор 10 31,2±4,05 0,51

Генетическая дивергенция небольшая между всеми группами Наиболее высокий показатель генетического расстояния между породами росталь и рофор.

3.5. Молекулярно-генетический анализ пар-производителей стальноголового лосося с помощью ДНК - фингерпринтинга

Ставилась задача установления связи между генетическим сходством (В Б) производителей по ДНК-фингерпринту и производственными показателями потомков этих пар. Коэффициент сходства между подобранными парами составлял 0,48±0,026 при минимуме 0,27 (гетерогенный подбор) и максимуме 0,66 (близкий гомогенному подбору) Интересно, что зависимость сохранности мальков от ВБ была обратной (0,46), а навеска рыбы при последующем выращивании характеризовалась положительным коэффициентом корреляции (0,42) Выявлено, что на такие показатели как сохранность шфы, сохранность личинок, скорость роста в первые четыре месяца и др. оказывают большее влияние другие факторы, а не гомогенность или гетерогенность подбора В результате оценки роста и развития молоди за 7 месяцев, селекционерами было отобрано потомство

пары №6 и пары №9 Коэффициент сходства (В8) между производителями в этих парах составлял 0,51 и 0,38 соответственно Семья №9 имеет низкий коэффициент сходства, а семья №6 коэффициент сходства несколько выше среднего по всем изучаемым парам

Проведенная оценка изменчивости потомков семьи 9 и семьи 6 показала, что Вй внутри семей высокий (0,78 и 0,76), а между семьями низкий (0,57±0,005). Гетерозиготность семьи 6 оказалась практически такой же, как и у семьи 9, несмотря на то, что подбор производителей у семьи 9 был гетерогенным.

3.6. ДНК-фннгерпртггинг популяций радужной форели Адлерского рыбного хозяйства

На данном этапе исследования нами изучались методом ДНК -фингерпринтинга породы форели янтарная (трех разновидностей окраски дикой, паломино и альбино), форели породы камлоопс и дональдсона

Сравнивая изучаемые породы форели нами, во-первых, был проведен анализ частоты встречаемости полос Были обнаружены полосы, частота встречаемости которых в одной породе значительно отличалась от частоты встречаемости в другой

Таблица 7. Коэффициенты генетического сходства (ВБ) и генетические расстояния (О) в трех группах форели (янтарная дикой окраски, паломино, альбино) по данным ДНК - фингерпринтинга

Сравниваемые Полос на

группы форели п дорожку Р ВБ внутри ВБ между В

Х±т групп групами

янтарная дикой 9 28,2±2,4 9,6х 10"" 0,41

окраски 2,7x10"11 0,37 0,02

паломино 9 24,3±3,1 0,37

янтарная дикой 9 28,2±2,4 9,6x10"12 0,41

окраски 0,36 0,05

альбино 7 18,6±3,7 5,2x10"8 0,41

паломино 9 24,3±3,1 2,7x10"" 0,37

0,38 0,01

альбино 7 18,б±3,7 5,2x10"8 0,41

Была обнаружена маркерная полоса, характеризующая популяцию у форели породы дональдсона Имелись полосы с высокой частотой встречаемости в одной популяции и с низкой - в другой Есть также множество редко встречающихся полос, что обуславливает полиморфизм ДНК и дает возможность оценивать гетерозиготность популяции

При исследовании пород форели была поставлена задача изучения их генетического разнообразия Во-первых, анализировались фингерпринты по коэффициенту сходства (ВЭ)

Таблица 8. Коэффициенты генетического сходства (ВБ) и генетические расстояния (О) в трех группах форели (камлоопс, дональдсона и янтарной дикой окраски) по данным ДНК - фингерпринпшга

Сравниваемые п Полос на Р В8 внутри ВБ Б

группы форели дорожку Х±ш групп между групами

камлоопс 9 28,6±2,4 9,6x10'" 0,50

2,7х10"п 0,44 0,06

форель 10 25,1±2,0 0,50

дональдсона

камлоопс 9 28,6±2,4 9,6x10'" 0,50 0,43 0,04

янтарная дикой 10 26,4±1,9 5,2x10"8 0,44

окраски

форель 10 25,1*2,0 2,7x10'" 0,50

дональдсона янтарная дикой 10 26,4±1,9 5,2x10"8 0,44 0,43 0,04

окраски

Сравнение всех изучаемых пород форели показало наибольшее

отличие камлоопс и дональдсона Коэффициент сходства внутри пород форели дональдсона и форели камлоопс был выше, чем у янтарной дикой окраски (табл. 8) Средняя гетерозиготность была выше у янтарной дикой окраски и янтарной паломино. Низкий уровень гетерозиготности отмечен в породах форели камлоопс, дональдсона и янтарная альбино Возможно, это обусловлено жестким отбором и высокой степенью инбридинга.

17

ВЫВОДЫ

1 Проведенный анализ RAPD-спектров выявил маркерные фрагменты размером 950 п н., 670 пни 300 п н, специфичные для каспийского лосося.

2 Методом ДНК-фингерпринтинга показана значительная разница в частотах встречаемости ряда фрагментов ДНК между онежским, балтийским и каспийским лососем

3 В результате RAPD-анализа наблюдается высокое генетическое сходство между популяциями онежского и балтийского лосося (BS=0,93 по праймеру ОРР-17), а так же - между породой росталь и сталъноголовым лососем (BS=0,96 по праймеру ОРС-05, по праймеру UBC-744- 0,95 и по суммарной матрице - 0,91)

4. По данным RAPD-анализа, максимальные различия были получены между популяциями каспийского и балтийского лосося (BS=0,69 по праймеру ОРР-17).

5 Самый высокий уровень гетерозиготности отмечен в популяции каспийского лосося (Н=0,62) Самый низкий уровень генетического разнообразия выявлен в популяции онежского лосося (Н=0,40) при использовании ДНК-фингерпринтинга

6 В ходе RAPD- анализа выяснилось, что популяции янтарной форели Адлерского рыбного хозяйства по основным генетическим параметрам слабо различаются, что вероятно связано с жестким отбором в этих популяциях

7 В результате анализа пар производителей стальноголового лосося выявлена отрицательная корреляция между сохранностью их мальков и коэффициентом сходства (BS) при гетерогенном подборе

8 ДНК-фингерпринтинг, в целом, подтверждает основные выводы, полученные с использованием RAPD-анализа

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Данные по полиморфным ДНК-маркерам рекомендуется использовать при разведении пород радужной форели и в программах по сохранению генофондных популяций онежского, балтийского и каспийского лосося,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сексте Э.А. Молекулярно-генетический анализ гетерогенности пород радужной форели / Э.А. Сексте, Н.В. Дементьева, В.П Терлецкий и др. //Доклады РАСХН.-2008.-№1.-С 43-46

2. Сексте Э.А. Применение ПЦР-анализа со случайными праймерами для тттрования популяций рыб семейства лососевых / Э.А Сексте, О.В. Митрофанова, НВ Дементьева, В.П Терлецкий, АФ Яковлев // Материалы конференции, посвященной 100-летию научной селекции в России. - М.- 2003 - С. 190

3. Мшрофанова О.В. Полиморфизм ДНК лососевых рыб, определяемый НАРБ-РСК анализом / О.В. Митрофанова, Э А Сексте, Н В Дементьева, В.П Терлецкий, А.Ф Яковлев // Материалы Межрегиональной научной конференции аспирантов и студентов зооинженерного факультета, посвященной 100-летию университета. -Санкт-Петербург-Пушкин, 2004, - С 64-69

4 Митрофанова О В. Использование случайных праймеров для типирования популяций лососевых рыб / О В. Митрофанова, Э.А. Сексте, Н.В. Дементьева, В П. Терлецкий, А.Ф Яковлев // Генетика, селекция и племенное дело в аквакультуре России - М.. ФГНУ «Росинформагротех». - 2005.- С. 182-184

5. Яковлев А.Ф. Использование полиморфизма ДНК и генов в селекции сельскохозяйственных животных / А Ф. Яковлев, В.П. Терлецкий, В.И Тыщенко, Н.В Дементьева, О.В Митрофанова, Э.А. Сексте

//Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве». -Санкт-Петербург,- 2007,- С. 18-23

6. Терлецкий В.П. Молекулярно-генетическая оценка гетерозиготности в популяциях животных. / В.П. Терлецкий, Н.В. Дементьева, В.И. Тьиценко, О.В. Митрофанова, Э.А. Сексте и др. // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», Санкт-Петербург, 2007,- С. 273-277

7. Дементьева Н.В. Молекулярно-генетический анализ при подборе пар стальноголового лосося. / Н.В. Дементьева, В.И. Тыщенко, В.П. Терлецкий, Э.А. Сексте и др. // Материалы международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», Санкт-Петербург, 2007.- С. 413-416

ФН

Подписано в печать 17.03.2008 г. Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Объём 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № / С С

Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сексте, Эдгар Артурович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности в структуре ДНК животных.

1.2. Полиморфизм повторяющихся последовательностей днк.ю

1.3. Методические особенности RAPD-PCR-анализа.

1.4. Использование полиморфных ДНК-маркеров для изучения популяций различных видов рыб.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Выделение ДНК.

2.3. Расщепление ДНК рестриктазами.

2.4. Электрофорез фрагментов ДНК.

2.5. Перенос ДНК с агарозного геля на фильтр.

2.6. Прегибридизация и гибридизация ДНК.

2.7. Детекция дезоксигенина на фильтрах.

2.8. Полимеразная цепная реакция со случайными праймерами (RAPD-PCR- анализ).

2.9. Обработка результатов исследования.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Анализ полиморфизма ДНК лососевых рыб рода Salmo с помощью RAPD-PCR- анализа.

3.2. Анализ гетерогенности лососевых рыб рода Salmo с помощью ДНК-фингерпринтинга.

3.3. Анализ генетического разнообразия пород радужной форели с помощью RAPD-PCR-анализа.

3.4. Генетическая изменчивость радужной форели, определяемая методом ДНК-фингерпринтинга.

3.5. Молекуля'рно-генетический анализ пар - производителей стальноголового лосося с помощью ДНК - фингерпринтинга.

3.6. ПЦР-типирование популяций радужной форели Адлерского рыбного хозяйства.

3.7. ДНК-фингерпринтинг популяций радужной форели Адлерского рыбного хозяйства.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.,.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфные ДНК-маркеры в исследовании генетического разнообразия лососевых рыб"

Актуальность темы. Поддержание оптимального уровня генетического разнообразия является одной из важнейших задач, требующих немедленного решения, поскольку снижение генетической гетерогенности приводит к ухудшению многих качественных показателей рыбы и ставит под угрозу существование генофондных популяций лосося и пород радужной форели. В

I » тоже время увеличение генетического разнообразия приводит к утрате уникальных свойств и признаков, характерных для пород и популяций лососевых рыб.

В настоящее время с внедрением в практику молекулярно-генетических методов исследования, таких как ДНК-фингерпринтинг, таксонопринт, RAPD-анализ, появилась возможность проводить генетический контроль над уровнем генетического разнообразия в генофондных популяциях, подбирать оптимальную структуру и размер популяций, осуществлять подбор пар производителей для получения эффекта гетерозиса, подбирать пары- для повышения выживаемости личинок и мальков лососевых рыб, а также осуществлять молекулярно-генетической оценку эффективности проводимой селекции, уточнять историю выведения пород и популяций лососевых рыб.

Представленная работа является частью научных исследований, проводимых лабораторией молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИ генетики и разведения с.-х. животных в соответствии с научной программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации, выполненной по договору с РАСХН: 06.01.01. «Установить генетическую гетерогенность популяций сельскохозяйственных животных и разработать комплексную систему оценки наследственных качеств племенных животных на основе использования генетических маркёров и ДНК- технологий» (номер гос. регистрации 15070.7822000013.06.8.001.1).

Цель и задачи исследований. Основной целью работы является оценка генетического разнообразия пород и популяций лососевых рыб с помощью полиморфных ДНК-маркеров.

В конкретные задачи работы входило: определить перспективы применения метода RAPD-PCR для выявления различий между видами и породами лососевых рыб; провести подбор праймеров, способных выявлять повторяющиеся последовательности ДНК у лососевых рыб; обнаружить маркерные, фрагменты ДНК у отдельных пород и популяций лосося, используя молекулярный зонд (GGAT)4 провести сравнительную? оценку генетических параметров, полученных с помощью 2-х методов: RAPD-PCR-анализа и ДНК-фингерпринтинга.

Научная новизна работы. Впервые показан высокий уровень, сходства между популяциями онежского и балтийского лососей (BS=0,92 по праймеру ОРР-17). Выявлены максимальные различия между популяциями каспийского и балтийского лососей (BS=0,69 по; праймеру ОРР-17). Обнаружены маркерные фрагменты, характерные для каспийского лосося; "

Наблюдается достаточно высокий уровень сходства между породой радужной форели росталь и популяцией стальноголового лосося:

Показана высокая: отрицательная корреляция между коэффициентом: сходства и скоростью ростатодовиков; а также между коэффициентом сходства и сохранностью мальков при гетерогенном подборе в парах стальноголового лосося.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость состоит в разработке молекулярно-генетических подходов для выявления особенностей породообразовательных процессов у лососевых рыб.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности использования RAPD-PCR анализа для обнаружения маркерных последовательностей ДНК у генофондных популяций лосося и пород радужной форели.

Использованные методы позволяют с большой эффективностью подбирать пары стальноголового лосося для дальнейшего получения товарной рыбы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на аспирантских сессиях, отчетах лаборатории молекулярной цитогенетики и в материалах межрегиональной научной конференции аспирантов и студентов СПбГАУ, посвященной 100-летию университета. Отдельные положения работы представлены в материалах международной научной конференции ГНУ ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», Санкт-Петербург, 26-28 июня 2007 и в журнале «Доклады РАСХН».

Основные положения, выносимые на защиту: наличие маркерных последовательностей, характерных для отдельных популяций рыб, выявляемых с помощью RAPD-PCR-анализа и ДНК-фингерпринтинга использование зонда (GGAT)4 для типирования популяций лосося;

- сравнительная оценка основных генетических параметров, полученных методом RAPD-PCRh ДНК-фингерпринти и гом.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Сексте, Эдгар Артурович

выводы

1. Проведенный анализ RAPD-спектров выявил маркерные фрагменты размером 950 п.н., 670 п.н. и 300 п.н., специфичные для каспийского лосося.

2. Методом ДНК-фингерпринтинга показана значительная разница в частотах встречаемости ряда фрагментов ДНК между онежским, балтийским и каспийским лососем.

3. В результате RAPD-анализа наблюдается высокое генетическое сходство между популяциями онежского и балтийского лосося (BS=0,93 по праймеру ОРР-17), а так же - между породой росталь и стальноголовым лососем (BS=0,96.по праймеру ОРС-05, по праймеру UBC-744- 0,95 и по суммарной матрице - 0,91).

4. По данным RAPD-анализа, максимальные различия были получены между популяциями каспийского и балтийского лосося (BS=0,69 по праймеру ОРР-17). , ,

5. Самый высокий уровень гетерозиготности отмечен в популяции каспийского лосося (Н=0,62). Самый низкий уровень генетического разнообразия выявлен в популяции онежского лосося (Н=0,40) при использовании ДНК-фингерпринтинга.

6. В ходе RAPD- анализа выяснилось, что популяции янтарной форели Адлерского рыбного хозяйства по основным генетическим параметрам слабо различаются, что вероятно связано с жестким отбором в этих популяциях.

7. В результате анализа пар производителей стальноголового лосося выявлена отрицательная корреляция между сохранностью их мальков и коэффициентом сходства (BS) при гетерогенном подборе.

8. ДНК-фингерпринтинг, в целом, подтверждает основные выводы, полученные с использованием RAPD-анализа.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Данные по полиморфным ДНК-маркерам рекомендуется использовать при разведении пород радужной форели и в программах по сохранению генофондных популяций онежского, балтийского и каспийского лосося.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сексте, Эдгар Артурович, Санкт-Петербург

1. Адаричев В.А., Корохов Н.П., Остапчук Я.В., Дымшиц Г.М., Маркель А.Л. Характеристика линий крыс с нормотензивным и гипертензивным статусом методом геномного фингерпринтинга // Генетика.-1996.-Т.32.-С.1669-1672

2. Алтухов, Ю.П., Сальменкова, Е.А., Омельченко, В.Т. Популяционная генетика лососевых рыб./ Ю.П.Алтухов; Е.А. Сальменкова, В.Т.Омельченко М.: Наука, 1997г.

3. Балдеску Н.Г., Гинскэ и др. Первичное исследование вещественныхiдоказательств и оценка их пригодности для биологической идентификационной экспертизы методом геномной "дактилоскопии" // Суд. мед. эксп.-1990.-Т.4-С.12 ^

4. Банникова, А.А., Матвеев, В.А., Крамеров, Д.А. Опыт использования интер-8ГЫЕ-ПЦР в изучении филогенеза млекопитающих. / А.А.Банникова, В.А.Матвеев, Д.А.Крамеров //Генетика. М.: Наука,-2002.-№6-Т.38.-С.853. .864.

5. Барышева Е.В., Просняк М.И., Власов М.С. и др. Использование ДНК фага М13 для анализа межиндивидуального полиморфизма ДНК человека на примере изучения популяции г. Краснодара // Генетика.-1989.-Т.25.-С.2079-2081

6. Блисковский В.В. Тандемные повторы ДНК в геноме позвоночных: структура, возможные механизмы образования и эволюции // Мол. биол.-1992.-Т.26.-С.965-982

7. Булат, С.А., Мироненко, Н.В. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами. / С.А.Булат, Н.В.Мироненко //Генетика. М.: Наука,-1996.-Т.32.-С.165.183.

8. Ю.Владыченская Н.С., Мирошниченко Г.П. Развитие представлений о чередовании полинуклеотидных последовательностей в геномах эукариотов//Успехи современной биологии.-1983.-Т.96.-С.196-210

9. Генетика, селекция и племенное дело в аквакультуре России.- М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005.- 428с.

10. Гинатулин А.А. Структура, организация и ' эволюция генома позвоночных.-М.:Наука, 1984.-294 с.

11. Глазко В.И., Дунин И:М., Глазко Г.В., Калашникова JI.A. Введение в ДНК-технологии.- М: ФГНУ Росинформагротех, 2001.-436с.

12. Глазко,В .И., Зеленая, Л.Б. Дифференциация домашней лошади и лошади Пржевальского по различным последовательностям ДНК. / В.И. Глазко, Л.Б.Зеленая //Генетика. -М:: Наука,-1998.-Ж7.- Т.34.-С.996.999.

13. Глик, В., Пастернак, Дж. Молекулярная биотехнология: Принципы и применение./ В.Глик, Дж Пастернак М.: Мир, 2002 г.

14. Демидова И.А., Сурин B.JL, Менделеева Л.П., ' Савченко В.Г. Амплификация гипервариабельных участков генома для установления типа гемопоэза у больных гемобластозами после аллогенной трансплантации костного мозга // Генетика.-1997.-Т.ЗЗ.-С.546-549

15. Деренко, М.В., Малярчук, Б.А. Однопраймерный вариант ПЦР-амплификации участков главной некодирующей области митохондриальной ДНК человека. / М.В.Деренко, Б.А.Малярчук // Генетика. М.: Наука-1994.-№ 11.- Т.ЗО.-С.1535. 1537.

16. Долматова, И.Ю., Саитбаталов, Т.Ф., Гареев, Ф.Т. RAPD анализ генетического полиморфизма уток. Межпородные различия. / И.Ю.Долматова, Т.Ф. Саитбаталов, Ф.Т.Гареев // Генетика. - М.: Наука,-2000.-№5,- Т.36.-С.682. .687.

17. Дорофеева, Е.А. Систематика и история расселения европейских лососей рода Salmo./ Е.А.Дорофеева // Вопросы ихтиологии. М.: Наука,-1998.-№4.- Т.38.-С.437.447.

18. Иванов П.Л. Молекулярно-генетическая- индивидуализация человека // авт.док.дисс.-М.-1995.-57 с.

19. Иванов П.Л., Вербовая Л.В., Гуртовая С.В. Применение геномной "дактилоскопии" для диагностики монозиготности близнецов // Суд. мед. эксп.-1991.-Т.1-С.32-33

20. Иванов П.Л., Гуртовая С.В., Вербовая Л.В. и др. Геномная "дактилоскопия" в экспертизе спорного отцовства и определении биологического родства//Суд. мед. эксп.-1990>Т.2.-С.36-38

21. Иванов П.Л., Гуртовая С.В., Плаксин В.О. и др. Геномная "дактилоскопия" с использованием в качестве зонда бактериофага М13 (экспертиза вещественных доказательств и идентификация личности) // Суд. мед. эксп.-1989.-Т.4.-С.39-42

22. Игнатов,- А.Н., Кугуники, Я., Супрунова, Т.П. и др. RAPD-маркеры, сцепленные с локусом устойчивости к расе 4 возбудителя сосудистогобактериоза у Brassika rapa L. / А.Н.Игнатов // Генетика.-2000.-Т.36.f . \1. С.357.360.

23. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в работе' с генетическими ресурсами растений. / А.В.Конарев // С.-х. биология М., - 1998. - Т.5.-С.3.24.

24. Кривенко А.А., Филипенко M.JL, Адаричев 1В.А. и др. Анализ косегрегации полиморфных ДНК-маркеров с величиной артериального давления у крыс гипертензивной линии НИСАГ // Генетика.-1999.-Т.З5.-С. 164-169

25. Куликова, И.В., Челомина, Г.Н., Журавлёв, Ю.Н. RAPD-PCR анализ генетического разнообразия маньчжурского фазана. / И.В. Куликова, Г.Н. Челомина, Ю.Н.Журавлёв // Генетика. М.: Наука,-2002.-№6.-Т.38.-С.836.841.

26. Ларкин, Д.М., Кузнецов, С.Б., Астахова, Н.В., Жданова, Н.С. Использование ПЦР маркеров для картирования хромосомы 12 свиньи. / Д.М.Ларкин с соавт. // Генетика. М.: Наука,-2001.-№3.- Т.37.-С.358.364.

27. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование":' М :Мир, 1984. 480 с.

28. Медников, Б.М., Шубина, Е.А., Мельникова, М.Н., Саввантова, К.А. Проблема родового статуса тихоокеанских лососей и форелей (геносистематический анализ). / Б.М.Медников с соавт. // Вопросы ихтиологии. М.: Наука,-1999.-№1.- Т.39.-С.14.21.

29. Рыбчин, В1Н. Основы генетической инженерии. / В.Н.Рыбчин // СПб, из-во СПбГТУ, 1999 г. 522 с.

30. Рысков А.П., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И. и др. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп:использование в. качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13 // Генетика.-1988а.-Т.24.-С.227-23 8

31. Рысков А.П., Токарская О.Н., Вербовая Л.В. Геномная "дактилоскопия" микроорганизмов: использование в качестве гибридизационного зонда ДНК фага Ml3 // Генетика;-19886.-Т.24.-С. 1310-1313

32. Рябинина, Н.Л., Гречко, В.В., Даревский, И.С. Полиморфизм ДНК популяций ящериц семейства Lacertidae, определяемый методом RAPD / Н.Л.Рябинина, В.В.Гречко, И.С.Даревский // Генетика.-1998.-Т.34.-С. 1661. 1667.

33. Сайки, Р., Тилинстен, У., Эрлих, Г. Анализ генома. / Р.Сайки, У.Гилинстен, Г. М.Эрлих //Мир,-1990.-248с.

34. Семенова, С.К., Илларионова, Н.А., Васильев, В.А. и др., Филенко, А.Л., Васильев, В.А. и др. Использование полиморфных маркеров ДНК для дифференциации пород кур различного происхождения. / С.К.Семенова с соавт. // Генетика.-1996.- №6. Т.32.-С.795.803.

35. Семенова, С.К., Романова, Е.А., Бенедиктов; Рысков, А.П. Анализ генетической изменчивости печеночного сосальщика Fasciola hapatica с помощью ПЦР со случайными праймерами. / С.К.Семенова // Генетика.-1995.- №2. С.273.275.

36. Сидоренко, А.П., Березовская, О.П., Созинов, А.А. Оценка генетического полиморфизма в популяции колорадского жука по RAPD-маркерам. / А.П.Сидоренко, О.П.Березовская, А.А. Созинов // Генетика.-2000.-Т.36.-С.651. .656.

37. Симоненко В.Н. Микросателлитные последовательности (TG)n-rana генома крупного рогатого скота: Автореф. дисс.канд. биол. наук.-Боровск, 2001.-26с.

38. Спиридонова, JI.H., Челомина, Г.Н., Крюков, А.П. Генетическое разнообразие черной и болыпеюповой ворон по данным RAPD-PCR анализа. / Л.Н.Спиридонова, Г.Н.Челомина, А.П.Крюков // Генетика.-2003.- №6.- Т.39.-С.1516.1526.

39. Терлецкий В.П. Молекулярно-генетические методы анализа» генетической изменчивости в популяциях животных // Международный Аграрный Журнал.- 1998.-Т.4.-С.38-40

40. Токарская О.Н., Зуев.А.В., Сорокин Ф.Г. и др. Геномная дактилоскопия журавлей: новый подход для генотипирования видов // Генетика.-1990.-Т.26.-С.599-606 },

41. Уфыркина О.В., Васильев В.А., Крюков А.П., Рысков А.П. Геномная дактилоскопия ворон: изучение генетической структуры популяций гибридной зоны // Генетика.-1995.-Т.7.-С.883-888

42. Челомина- Г.Н., Павленко М.В., Картавцева И.В., Боескоров Г.Г., Ляпунова Е.А., Воронцов Н.Н. Генетическая дифференциация* лесных мышей Кавказа: сравнение изозимной, хромосомной и молекулярной дивергенции // Генетика.-1998.-Т.34.-С.213-225

43. Шагинян, И.А., Гинцбург, A.JI. ПЦР генетическое типирование патогенных микроорганизмов. / И.А.Шагинян, А.Л.Гинцбург // Генетика.-1995.- №5.- Т.31.-С.600-610.

44. АН S., Mailer C.R., Epplen J.T. DNA fingerprinting by oligonucleotide probes specific for simple repeats // Human Genetics.-1986.-V.74.-P. 239243

45. Araneda, C.M., Neira, R., Iturra, P. Identification of DNA polymorphic markers associated to muscle coloration in COHO SALMON (Oncorhynchuskisatch) / Araneda, C.M. et al. // Plant., Animal & Microbe Genomes. i

46. Cnference Aquaculture. 2002.

47. Avvedimento V.E. Sequence organization of porcine DNA // Nucl.Acids Res.-1976.- V.3.-P.2491-2505

48. Bagley, M.J., Anderson, S.L., May, B. Choice of methodology for assessing genetic impacts of environmental stressors: polymorphism and reproducibility of RAPD and AFLP fingerprints. / M.J.Bagley et al. // Ecotoxicology. 2002.-vol.10. №4 - p.239-244.

49. Bardakci, F., Skibinski, D.O. Application of the RAPD technique in tilapia fish: species' and subspecies identification. / F.Bardakci, ■D.O.Skibinski // Heredity, 1994. .- vol.73. №2 - p. 117-123.

50. Becerril, C., Acevedo, H., Ferrero, M., Sanz, F., Castano, A. DNA fingerprint comparison of rainbow trout and RTG-2 cell line using random amplified polymorphic DNA. / G.Becerril et al. // Ecotoxicology. 2001.- vol.10. №2 -p.115-124.

51. Bell G;, Selby M., Rutter J. The highly polymorphic region near the human insulin is composed of simple tandemly repeating sequences //Nature.-1982.-V.295.-P.31-35

52. Bernardi G. The human genome: organization and evolutionary history // Annu.Rev.Genetics.-1995 .-V.29.-P.445-476

53. Bernardi G., Olofsson В., Filipski J., Zerial M., Salinas J. The mosaic'-'genome of warm-blooded vertebrates // Science.-1985.-V.228.-P.953-958

54. Bettink S., Wullich В., Christmann A., Zwergel Т., Zang K.D., Unteregger G. Genetic heterogeneity of prostatic carcinoma-derived cell lines as emphasized by DNA fingerprinting // Electrophoresis.-1992.-V. 13.-P. 644-646

55. Bielawski, J.P., Pumo, P.E. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analisis of Atlantic Coast striped bass. / J.P. Bielawski, P.E.Pumo // Heredity, 1997.- vol.78. №1 -p.32-40.

56. Blackburn E.H. Telomerases // Annu.Rev.Biochem.-1992.-V.61.-P.l 13-129

57. Blanchelot A. Genetic relatedness in honeybees as established by DNA fingerprinting//J. of Heredity.-1991.-V.82.-P.391-396

58. Borowsky, R.L., Vidthayanon, С. Nucleotide diversity in population of balitorid-cave fishes from Thailand. / R.L.Borowsky et al. // Mol.Ecol;, 2001.-vol. 10. № 12 - p.2799-2805.

59. Borowsky, R.L., Wilkens, H. Mapping a cave fish genome: polygenic systems and regressive evolution./ R.L.Borowsky et al. // Heredity, 2002,-vol.93. № 1 - p. 19-21.

60. Breen M., Downs P. et al. Intrageneric amplification of horse microsatellite markers with emphasis on the Przewalski's horse (E. Przewalskii) Anim. Genet.-1994:-V.25 .-P:401-405

61. Britten R:J. and Kohne DIE. Repeated sequences in DNA //. Science.-1968.-V. 161.-P.529-540 '

62. Caetano-Anolles, G., Bassam, B.J:, Gresshoff,. P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers./ G.Gaetano-. Anolles et al. // Bio Technology.-1991.-V.9.-P.553-557.

63. Gallejas, 0., Ochandb;; M;Di Phylogenetic . relabionhips among VSpanish? Barbus species (Pisces, Gypriniodae) shown by RAPD markers / C.Callejas et al. // Heredity, -2002.- vol.89. №1• - p.36-43.

64. Carlson, J.E., Tulsieram, L.K., Glaubitz, J.C. et al. Segregation of random amplified DNA markers in F1 progeny of conifers./ J.E.Carlson et al. // Theor. Appl. Genetics.-1991 .-V.83 .-P. 194-200.

65. Chong, E.K., Tan;S:G. et al. Idetification and characterization of Malaysian river catfish, Mystus nemurus (C&V): RAPD and AFLP analysis. / L.K.Chong et al. II Biochem. Genet- 2000; - V.38- №3, 4.-P.63-76.

66. Cohen J.E. DNA fingerprinting for forensic identification: potential effects on data integration of subpopulation heterogeneity and band number variability // Am. J. Human Genet.-1990.-V.46.-P.358-368

67. Davidson E.H. and Britten R.J. Organization, transcription and regulation in animal genome // Quart.Rev.Biol.-1973.-V.48.-P.565-61390; Davidson E.H. Comparative aspects of DNA organization in Metazoa // Chromosoma.-1975 .-V.51 .-P.253-259

68. Dinesh, K.R., Lim, T.M., Chua, K.L. et al. RAPD analisis: an efficient method of DNA fingeфrinting in fishes./ K.R.Dinesh et al.// J.Zoology. —1993. vol. 10. - №5 - p.849-854.

69. Ellegren H., Chowdhary В., Johansson M. et al. A primary linkage map of the porcine genome reveals a low rate of genetic recombination // Genetics.1994.-V.137.-P. 1089

70. Epplen C., Epplen J.T. Expression of (cac)n/(gtg)n simple repetitive sequences, in: mRNA of human lymphocytes // Hum.Genetics:-1994;-V.93.-,1. P.35-41

71. Ezzel G. Panel of DNA flngeфrints in court cases // Science News.-1992.-V.141.-P.261

72. Fobes, S., Knudsen, K., Allendorf, F. Genetic variation in DNA COHO SALMON from1 the lower Columbia: river. / S.Fobes et al. // Benneville Power Administration; 1993;- p; 1-29: •

73. Foo, C.L., Dinesh, K.R. et al. Inheritance of RAPD markers in the guppy fish: Poecilia reticulata. / G.L. Foo et al:.// Zoolog.Sci. 1995. - vol.12. - №5 -p.535-541.98;Galan G.A. Evolution» of the repetitive and non-repetitive DNA // In:

74. Gilbert D.A., Lehman N., O'Brien S.J., Wayne R.K. Genetic fingerprinting reflects population differentiation in the California Channel Island fox // Nature.-1990a.-V.344.-P.764-767

75. Gilbert D.A., Parker C., Pusey A.E., Stephens J.C., O'Brien S.J. Analytical DNA fingerprinting in lions: parentage, genetic diversity, and kinship // J. Hered.-1991.-V.82.-P.378-386

76. Grimaldi M.C. and Crouau-Roy B. Microsatellite allelic homoplasy due to variable flanking sequences // J. Mol. Evol.-1997.-V.44.-P.336-340

77. Grobet L., Charlier C., Hancet R. DNA fingerprints and leukochimerism in bovine dizygotic twins // Ann. Med. Vet.-1991.-V.135.-P.353-359 ;

78. Grobet L., Charlier C., Schwers A., Hancet R. Detection of freemartinism by means of DNA fingerprints and a bovine Y-specific probe // Ann. Med. Vet.— 1992.-V.136.-P.41-49

79. Hatanaka, Т., Galetti, P.M. RAPD markers indicate the occurrence of structured populations in a migratory freshwater, fish species./ T.Hat'anaka et al. // Genet.Mol.biol. -2003. vol.26. - №l.p.l4

80. Healy P.J., Dennis J.A., Nickols P.J., Reichmann K.G. Hemeropoetic chimerism: a complication in heterozygote detection tests for inherited defects in cattle //Anim. Genet.-1994.-V.25.-P.l-6,

81. Hedenskog M., Sjogren M., Cederberg H., Rannug U. Induction of germline-length mutations at the minisatellitesPC-l1 and PC-2 in male mice exposed to polychlorinated biphenyls and diesel exhaust emissions // Environ. Mol. Mutagen.-1997.-V.30.-P.254-259

82. Hohenhorst J., Strazinger C. Use of microsatellites for parentage control in pigs // Anim. Genet.-1994.-V.25.-P.25

83. Holland C.A. Sequence complexity of nuclear and messenger RNA in Hela cells // J.Mol.Biol.-1980.-V.138.-P.755-778

84. Inoue M. et al. Isolation of polymorphic microsatellite loci from Japanese black cattle and their application to individual identification // Anim. Genet.-1994.-V.25.-P: 144

85. Iturra P., Lam N, Vergara N., Medrano J.E Characterization of sex chromosomes in rainbow trout and coho salmon using fluorescence in sity hybridization (FISH)// Genetica -2001 .vol.11 l.-p.l25-131.

86. Jeffreys A.J., Bois P., Buard J., Collick A., Dubrova Y. et al. Spontaneous and5 induced minisatellite instability // Electrophoresis.-1997.-V.18.-P.1501-1511

87. Jeffreys A.J., Royle N.J., Wilson V., Wong Z. Spontaneous mutation-rates to new length alleles at random-repetitive hypervariable loci in human* DNA // Nature.-1988.-V.332.-P.278-281s

88. Jeffreys A.J., Wilson* V., Kelly R. Mouse DNA fingerprints analysis of chromosome localization and germ-line stability of hypervariable loci in recombinant inbred strains // Nucl.Acid Res.-1987.-V.15.-P.2823-2836

89. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable minisatellite region in human DNA // Nature.-1985a.-V.314.-P.67-73

90. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific "fingerprints" of human DNA // Nature.-1985b.-V.316.-P.76-78

91. Jin L., Chakraborty R. Estimation of genetic distance and coefficient of gene diversity from single-probe multilocus DNA fingerprinting data // Mol. Biol. Evol.-1994.-V. 11 .-P. 120-127

92. Johnson, S.L., Midson, C.N., Ballinger, E.W. et al. Identification of RAPD primers that reveal extensive polymorphisms between laboratory strains of zebrafish. / S.L.Johnson et al. // Genomics. 1994.-V.19.- №5. - P.152-156.

93. Joshi A.R., Sinha S., Dil-Afroz, Sulaiman I.M., Banerji A.K., Hasnain S.E. Alterations in brain tumor DNA detected by a fingerprinting probe // Indian J. Biochem. Biophys.-1996.-V.33.-P.455-457

94. Jug Т., Dove., J. Pohar and A.Snoj RAPD analysis as a tool for discriminating marble trout from hybrids(marble trout x brown trout) in the zones of hybridization //Animal Breeding and Genetics .2004.-vol. 121 .-№ 3-p.156-162

95. Kashi Y.,,Lipkin E., Darvasi A., Nave A., Gruenbaum Y., Beckmann J. S., Soller M. Parentage identification in the bovine using DNA fingerprints // Dairy Sci.-1990.-V.73.-P.3306-3311

96. Kashi Y., Nave A., Gruenbaum Y., Soller M., Beckmann J.S. A minisatellite from bovine which produces highly polymorphic DNA fingerprinting patterns in mammals and chickens // Anim. Genet.-1992.-V.23 .-P.570 ij

97. Kovacs, В., Egedi, S., Bartfai, R., Orban, L. Male-specific DNA markers from African catfish (Clarias garie pinus). / B.Kovacs et al. //. Genetica. — 2000.-V.110.-№3. P.267-276.

98. Lynch M. Analysis of population genetic structure by DNA fingerprinting // In: "DNA fingerprinting: approaches and applications".-Basel,11 1991.-Birkhauser Verlag.-P. 113-126

99. Manning J.E. Interspersion-of repetitive and non-repetitive DNA sequences in the Drosophila melenogaster genome'// Cell.-1975.-V.4.-P. 141-155

100. Mather, P.B. Overview offish genetics, research at Queensland university of technology. / P.B.Mather // Aquaculture ICLARM Conf. Proc. 04. 2001. -p.133-139.

101. Matsumura Y., Tarin D. DNA fingerprinting survey of various human tumors and their metastases // Cancer Res.-1992.-V.52.-P:2174-2179

102. Mathur P.K., Ponsuksili S., Groen A.F., Horst P. Estimation of genetic variability within and between populations using DNA fingerprints // Proceedings 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.-Guelph.-1994.-P.528-531

103. McGowan, С. And Davidson, W.S. The RAPD technique fails to detect a male-specific genetic marker in Atlantic salmon. / C.McGowan, W.S. Davidson//J. Fish biology.- 1998. V.53.-№5. - P.1134-1136.

104. Meyer E. Microsatellite polymorphisms reveal phylogenetic relationships in primates // J.Mol.Evol.-1995.-V.41 .-P. 10-14

105. Mohideen, M.A., Moore, J.L., Cheng, K.C., Centromere-linked microsatellite markers for linkage groups 3, 4, 6, 7, 13 and 20 zebrafish (Danio rerio). / M.A.Mohideen et al. // Genomics. 2000.-V.67.- №1. -P. 102-106.

106. Moran C. Microsatellite repeats in pig (Sus domestica) and chicken (Gallus domesticus) // J.of Heredity.-1993.-V.84.-P.274-280

107. Moyzis R.K. An alternative view of mammalian DNA sequence organization. 1. Repetitive sequence interspersion in Syrian hamster <DNA: a model system // J.Mol.Biol.-1981 .-V. 153 .-P.841 -870

108. Naish, K.A., Warren, M. et al. Multilocus DNA fingerprinting and RAPD reveal similar genetic relationships petween strains of Oreochromis niloticus (Piscesi Cichlidae) / K.A.Naish et al. // Mol.Ecol., 1995.- vol.4. №2 - p.271-274.

109. Nakamura Y., Leppert M., O'Connel P. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science.-1987.-V.135.-P.1616-1622

110. Nakamura K., Ozaki A., Akutsu Т., Iwai K., Sakamoto Т., Yoshizaki G., Okamoto N. Genetic mapping of the dominant albino locus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Mol Genet Genomics.- 2001.- V.265.- №1.- P.687-693

111. Novikov L.V., Kalinovsky V.P., I-Ienson K.P. Method of DNA fingerprinting for determination of structural peculiarities of human genomic DNA// In: Biotechnology.-St.-Petersburg, 1994.-P.83-84

112. Numberg P., Marczinek К., Thiel G., hampe J. Parallel genome analysis by one- and two-dimentional DNA fingerprinting in human gliomas // Electrophoresis.-1995 .-V. 16.-P. 1715-1725

113. Ohtsuka, M., Makino, S. Et al. Construction of a linkage map of the medaka (Oryzias latipes) and mapping of the Da mutant locus defective in dorsoventral patterming. / M.Ohtsuka et al.-// Genome Res. 1999.- vol.9; -№1 - p. 1277-1287.

114. Okada N., Hamada M., Ogiwara I., Ohshima K. SINEs and1; LINHs share common 3' sequences: a review//Gene.- 1997.-V.205.-P.229-243

115. Parkin Di The use of genetic fingerprinting in the study of animal population // J. Zoology.-1989.-V.217.-P.351-353

116. Rogstad, S.H., Pelican S. GELSTATS: a computer program for population genetics analysis using VNTR multilocus probe data // BioTechniques.-1996.-V.-21.-P. 1128-1131

117. Schneider-Stock R., Gunther Т., Roessner A., Epplen J.T. Somatic DNA alterations in breast carcinomas, of different lymph-node status by DNA fingerprint analeses // Cancer Genet. Cytogenet.-1998.-V. 103.-P. 149-154

118. Schwai'ger P.M., Gomolka M., Geldermann H., Zischler H., Buitcamp Ji, Epplen JIT., Ammer PI. Oligonucleotide fingerprinting to individualize ungulates //Apph Theor. Electrophor.-1992.-V.2.-P.193-200

119. Sertadaki A. and Lindsay S; CAC the neglected repeat // BioEssays.-1996.-V.18.-P.237-242

120. Sharma D., AppaRao K.B.C., Singh R.V. and Totey S.M. Genetic diversity among chicken breeds estimated through randomly amplified polymorphic

121. DNA./ D.Sharma et al.//Animal Biotechnology.-2001.-vol.l2.-№ 2. p.lll-120

122. Shriver M.D. Origins and evolution of VNTR loci: the apolipoprotein B3' VNTR// Ph.D Thesis.-1993.-University of Texas.-Houston

123. Singer M.F. SINEs and LINEs: highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes // Cell.-1982.-V.28.-P.433-434

124. Smiht G.R. and Stearley R.F. The classification and scientific names of rainbow and cutthroad trout // Fisheries.-1989.-V.14.-P.4-10.

125. Streit, В., Stadler, Т., Schwenk, K. Et al. Natural hybridization in freshwater animals Ecological implications and molecular approaches. / B.Streit et al. // Natur wissenschaften; 1994. V.81.- №2. -P.65-73.

126. Sultmann, H., Mayer, W.E. et al. Phylogenetic analysis of cichlid fishes using nuclear DNA markers. / H. Sultmann et al. // Mol.Biol.Evol. 1995. -V.12.- №6. -P. 1033-1047.

127. Supowit S.C. and Rosen J.M. Gene* expression in normal and neoplastic mammary tissue // Biochemistry.-1980.-V. 19.-3452-3460

128. Tegelstrom H. and von Essen L. DNA fingerprinting of captive breeding pairs of lesser white-fronted geese (Anser erythropus) with unknown pedigrees //Biochem. Genet.-1996.-V.34.-P.287-296

129. Terletski V.P., Tycshenko V.U., Dementieva N.V., Belash D.E., Terentieva E.G., Golod V.M. Molecular genetic analisis of population parameters inselected breeds of Salmon // Vortragstagungder DGfZ/undder GfT am 17/18, September 2003 in Gottingen, D 25.

130. Thomsen P.D. and Miller J.R. Pig genome analysis: differential distribution of SINE and LINE sequences is less pronounced than in the human and mouse genomes // Mamm.genome.-1996.-V.7.-P.42-46

131. Trommelen G.J.M., Den Daas J., Vijg J., Vitterlinden A. DNA profiling of cattle using micro-and minisatellite core probes // Animal Genetics.-1993 a.-V.23.-P.23 5-241

132. Vergara N., Iturra P. and Aguirre R. Multilocus DNA-fingerprinting using oligonucleotide probes (GATA)4 and (GGAT)4 in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). /Genetics &Molecular Biology.- 1998-V.21.- №2.-P.45- 48

133. Viard F., Franck P., Dubois M.P., Estoup A., Jarne P. Variation of microsatellite size homoplasy across electrromorphs, loci, and populations in three invertebrate species //'J.Mol.Evol:-1998.-V.47.-P.42-51 •

134. Welsh J. and McCleland G.M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl. Acids Res.-1990.-V.18.-P.7213-7218

135. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S:V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acid Res.-1990.-V.18.-P.6531-6535

136. Wong A.K., Yee H:A., van de Sande J.H., Rattner J.B. Distribution of CT-rich tracts is conserved in vertebrate chromosomes // Chromosoma.-1990.-V.99.- P.344-351

137. Wyman A. and White J. Hypervariable regions in the genomes contain tandem repeats of short DNA sequences // Proc.Nat.Acad.Sci.USA.-1980.-V.77.-P.6754.

138. Ye X., Zhu J., Velleman S.G., Bacon W.L., Nestor K.E. Measurement of genetic variation within and between Japanese quail lines using DNA fingerprinting // Poult. Sci.-1998b.-V.77.-P.1755-1758

139. Ye X., Zhu J., Velleman S.G., Nestor K.E. Genetic diversity of commercial turkey primary breeding lines as estimated by DNA fingerprinting // Poult. Sci.-1998a.-V.77.-P.802-807

140. Yoon, J.M., Kim, G.W. Randomly amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction analisis of two different populations of cultured Korean catfish silurus asotus./ J.M.Yoon, G.W.Kim // J. Bioscience. 2001. V.26.- №6. -P.641-647.

141. Zhang X., McDaniel G.R. and Giambrone J.J. Random amplified polymorphic DNA comparison among broiler lines selected for incidence of tibial dyschondroplasia./ X.Zhang et aI.//Poultry science.-1995.-vol.74.-p.1253-1258.

142. Zhu J., Nestor K.E., Moritsu Y. Relationship between band sharing levels of DNA fingerprints and inbreeding coefficients and estimation, of true inbreeding in turkey lines // Poult. Sci.-1996.-V.75.-P.25-28