Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная эволюция лососевых рыб

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная эволюция лососевых рыб"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ МОРЯ

На правах рукописи

Ошейник Алла Геннадьевна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

03.00.10 - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

У

Владивосток 1995

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН, г.Владивосток.

Научный руководитель :

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М.К.Глубоковский

доктор биологических наук В.В.Суханов

кандидат биологических наук А.Ю.Семенченко

Ведущая организация : Институт общей генетики

имени Н.И.Вавилова. г.МоскЕа

Защита диссертации состоится '¿¿Г''ЗЛ&О^Л 1995г. в "/О" часов на заседании специализированного совета Д 003.66.01 при Институте биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, г.Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМ ДВО РАН (Владивосток, ул. Пальчевского, 17).

Автореферат разослан "2 /" О.

1934г.

Ученый секретарь - —

Специализированного совета " Л.Л.Вудникова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Построение естественной системы, отражающей филогенетическое родство организмов является важнейшей задачей биологии, в частности ихтиологии.

Вопросы эволюции лососевых рыб являются предметом интенсивного изучения в течение нескольких десятилетий. Родственные связи таксонов в сем. Salmonidae, время их появления, темпы и направления эволюции до сих пор во многом остаются дискуссионными. Современные представления о таксономическом статусе видов и родов в семействе и уровнях их филогенетической близости основаны прежде всего на данных морфологии и кариологии.' В последние годы для анализа родственных взаимоотношений между видами стали' широко применять генетико-биохимические и молекулярно-биологические подходы. которые могут прояснить ряд спорных вопросов филогении и систематики лососевых рыб.

Для получения количественных оценок генетической дивергенции в сем. Salmonidae представляется интересным одновременно использовать два метода - электрофоретическое разделение белков и рест-риктазный анализ митохондриальной ДНК (мтДНК). Первый традиционно применяется в биохимической систематике, хотя и имеет ограниченные возможности (Richardson et al., 1986; Nei, 1987). Ясно, что вся информация, заключенная в геноме, может быть получена лишь путем непосредственного анализа и сравнения генетического матери-аза, т.е. ДНК. Но прямое секвенирование куклеотидных последовательностей по-прежнему остается трудоемкой процедурой. Креме того, поскольку различные участки генома эволюционируют с разными скоростями, полученные результаты во многом ' зависят от выбора праймера. Однако существует и более простой путь'- рестркктазнкй анализ митохондриальной ДНК. Так как мтДНК наследуется преимущественно по материнской линии и эволюционирует со скоростью в 4-10 раз превышающей скорость эволюции уникальных последовательностей ядерного генома, эти деэ метода дают независимую информацию. С точки зрения систематики, такой' комплексный подход интересен тем, что позволяет сравнивать виды непосредственно по достаточно большому числу гомологичных генов.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы является изучение молекулярной эволюции и филогении лососевых рыб по данным сравнительного исследования митохондриальной ДНК и белков,

кодируемых ядерной ДНК. Исходя из этой цели, были сформулированы следующие задачи.

- Получить количественные оценки дивергенции ядерного и митохонд-риального геномов в сем. 5а1штс1ае.

- Определить последовательность возникновения видов лососевых рыб.

- Сравнить темпы и направления эволюции ядерных и митохондриадь-ных генов у разных таксонов лососей.

- Уточнить родственные отношения видов тихоокеанских лососей и форелей.

- Оценить устойчивость полученной классификации в зависимости от изменений количества к качества дифференцирующих признаков, круга объектов сравнения, методов анализа.

Научная новизна.

- Впервые на единой методической основе проведено сравнительное изучение митохондриального и ядерного геномов для группы еидов, представляющих четыре рода сем. За1топ1с1ае.

- В результате исследования получены оценки степени генетической дивергенции, основанные на различных по качеству признаках.

- Разработаны наиболее вероятные эволюционные гипотезы для мито-хондриадьного и ядерного геномов лососевых рыб.

- Впервые на основе количественных методов фенетического и кла-дисткого анализов изучено влияние начальных условий описания таксонов (количества и качества признаков), а также числа объектов классификации на результаты филогенетических реконструкций.

•- Впервые на основе молекулярно-генетических данных подтверждается самостоятельный родовой статус тихоокеанских форелей.

Практическая ценность рабсил.'. После введения государствами двухсотмильной экономической зоны лососи являются национальным достоянием той страны, где происходит их воспроизводство. В связи с этш важное значение приобретает не просто изучение морфологической и генетической изменчивости в рамках отдельного вида, но и понимание эволюционной истории лососевых рыб. Общество и государство должны иметь представление не только о том, чем они владеют сейчас, но и каким путем сформировались природные ресурсы.

Проведенное исследование указывает на перспективность комплексного изучения мигохондриального и ядерного геномов для решения сложных проблем систематики и таксономии лососевых рыб.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлялись на III Всесоюзном совещании по лососевидным рыбам (Тольятти, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), V Всесоюзном совещании "Систематика, биология и биотехника разведения лососевых рыб" (Москва, 1994), Международной конференции "Bridges of science betmeen North America and Russian Far East" (Владивосток, 1994), а также докладывались на годичных конференциях ИЕМ ДЕО РАН (1987, 1992, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура работ. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы. Материал изложен на 318 страницах машинописного текста, включает в себя 12 таблиц и 73 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 469 источников, в том числе 310 работ на иностранном языке.

Глава 1. НЕКОТОРЫЕ ПРОБЛЕМЫ СИСТЕМАТИКИ И ФИЛОГЕНИИ СЕМ. SALMONIDAE

В главе на основе литературных данных обсуждаются проблема определения наиболее архаичного таксона, стоящего у основания филогенетического дерева семейства Salmonidae (Salmoniformes, 3al-mcnoidei, Salmonoidae), a также различные езгляды исследователей на взаимоотношения родов Oncorhynchus и Parasalmo, которые в более широком смысле охватывают как родственные связи -тихоокеанских и атлантических еидов форелей, так и филогенетические отношения тихоокеанских лососей.

Глава Z. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В основу работы положен .материал по лососевым рыбам, собранный в течение 1989-1992 гг. в реках Белая и Мануй (о.Сахалин), Камчатка (п-ов Камчатка), Киевка, Литовка (Приморский край), а также полученные в Ташкентском форелевом хозяйстве. Исследованы следующие виды: кета Oncorhynchus keta (Walbaum), горбуша O.gor-buscha (Walbaum), с-има O.masou (Brevoort), нерка O.nerka (Walbäum), кижуч O.kisutch (Walbaum), чавыча 0.tschawytscha (Walbaum), микижа Parasalmo mykiss (Walbaum), радужная форель P.gmrdneri, мальма Salvelinus malma (Walbaum), белый голец S.albus (Glubo-kovsky), кунджа S.leucomaenis (Pallas), сахалинский таймень Para-hucho perryi (Brevoort).

Казхдый иг IS наученных еидое описан по двум комплексам признаков: аллели, характеризующие ядерный геном, и фрагменты мтДНК, характеризующие митохондриальный геном. Экспериментальная часть работы выполнена совместно с Н.Е.Поляковой. В главе дано описание использованных методов злектрофоретического разделения белков и рестриктазного анализа мтДНК. Статистическая обработка полученных результатов включала фенетический анализ генетического сходства методами невзвешэняой парно-групповой средней связи (Sneath, So-kal, 1973), вагнеровских дистанций CFarris, 1972), Фитча-Марголи-ша (Fith, Margoliash, 1967) и методом главных компонент (Lebart et al.. 1984)., а также кладисткий анатаа признаков для выявления последовательности дивергенции видов методом максимальной экономии (Hendy, Решу, 1S8S) и методом бутстреп-анализа (Felsenstein, 1985).

Расчеты были проведены на компьютере IBM PC/AT с использованием пакетов статистических программ PHYLIF, версия 3.3 (Felsenstein, 1990), BI03YS (Swofford , Selander, 1981), NTSYS (Rohlf , 1990), REAP (McElroy et al., 1391).

Глава 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИВЕРГЕНЦИЯ И ФИЛОГЕНИЯ ЛОСОСЕЙ СЕМ. SALMONIDAE ПО БЕЛКОВЫМ МАРКЕРАМ ГЕНОВ

Представители лососевых рыб сем. Salmonidae уже давно и интенсивно исследуются биохимическими методами (Tsuyuki, Roberts., 1966; Utter et al., 1973; Numachi, 1984;0синов, 1991, и др.). Однако, сопоставляя равные, немногочисленные биохимические признаки, систематики предлагают различные филогенетические гипотезы. Во многом ограниченность выводов о родственных отношениях лососей связана также с отсутствием исследований, в которых на единой методической основе изучались бы гомологичные гены у представителей разных таксонов лососевых рыб. Кроме того, в большинстве работ, использующих электрофорез белков при изучении вопросов эволюции лососей, к сожалению, не проводилась количественная оценка генетического сходства видов. Таким образом, в настоящее время назрела необходимость увеличить выборки таксономических признаков без введения каких-либо искусственных критериев (например, "функциональной значимости") для сравнения большего числа таксонов.

3.2 Оценка степени внутри- и межвидовой генетической изменчивости. В работе представлены данные по генетической изменчивости 19 ферментных систем, кодируемых 40 аллозимными локусами у 12

1. 20 . 1, 00 О. 80 О. 60 . О, 40 0.20 . о. оо

.0. tefa

.0. corbuscha

с;

.0. nsrka .0. kisutch

.0. tschaoytsctia .0. masou

L

.Р. тук t ss

r£

,P. gairdncri P. pcrryt .5. malma

_S. albus .5. leucooacnis

Рис. i. Фенограмма 12 видов лососевых рыб (UPGMA). По оси стандартные генетические дистанции. Использовано 40 локусов.

видев лососевых рыб сем. Saltnonidae (средние значения гетерози-готности, среднее число аллелей б лакусе, доля полиморфных локу-сов). Генетические дистанции (Nei, 1972; Rogers, 1972) , полученные на основании исследования внутри- и межвидовой изменчивости, приведены в табл.1. При фенетическом анализе аплозимннх данных (рис.1) очевидна тесная связь родов Oncorhyncnus и Parasalmo (Dn-0,739). Максимально удалены от тихоокеанских лососей гольцы рода Salvelinus (Dn=l,153) и дальневосточные таймени рода Parahucho (Dn= 1,198), которые на фекограммах образуют общий кластер. Так как уровень генетической дивергенции между Parahucho и Salvelinus (Dn--0,912) выше соответствующего уровня между Oncorhynchus и Parasalmo, .тихоокеанские лососи и форели объединяются друг с другом раньше, чем Parahucho присоединяется к группе гольцов. Однако, согласно оценкам усредненных генетических дистанций, Parahucho блихе к Parasalmo, чем к Salvelinus.

Фенетический анализ генетического сходства тихоокеанских лососей'(рис. 1) позволяет сделать следующие еыводы: 1) наследованные виды разделяются на три группы (сима, кижуч-чавыча, нерка-горбуша - кета); 2) кижуч с чавычей .оказываются более сходны между собой, чем нерка, горбуша и кета ; 3) сима объединяется с тихоокеанскими форелями и, таким образом, генетически оказывается более близкой к роду Parasalmo.

Матрица генетических дистанций между видами лососевых рыб сем. Salmonidae*

Таблица 1

Вид

3

3

•10

11

12

Т. O.keta

2. O.gorbuscha

3. O.nerka

4. O.masou

5. O.kisutch

6. 0. tschawytscha

7. P.perryi

8. P.mykiss

9. P.gairdneri

10. S.malma

11. S.albus

12. S.leucomaenis

0,349 07557 0,355 0,456 0,414 0,711 0,570 Ж564 0,638 0,642 0,663

0,408 (0,112) 0,796 (0,168) 0,414 (0,112) 0,587 (0,141) 0,512 (0,127) 1,232 (0,245) 0,836 (0,176) 0,815 (0,172) 0,996 (0,202) 1,007 (0,202) 1,069 (0,214)

0,553 0,252 0,461 0,473 0,790 0,594

0,807 (0,178) 0,281 (0,091) 0,604 (0,145) 0,634 (0)152) 1,597 (0,331) 0,899 (0,195) 0,920 (0,197) 1,486 (0,307) 1,502 (0,305) 1,384 (0,285)

0,524 0,516 0,491 0,626 0,393

0,727 (0,162) 0,711 (0,161) 0,660 (0,151) 0,975 (0,205) 0,486 (0,124) 0,496 (0,125) 1,263 (0,260) 1,265 (0,260) 1,334 (0,271)

0,419 0,309 0,680 0,566

0,526 (0;i30)

0,478' (0,122)

1.135 (0,234)

0,830 (0,181)

0,841 (0,184)

1,121 (0,2331

1.136 (0,234)

1,208 (0.249)

0,089 0,642 0,484

0,076 (0;045) 1,026 (0,215) 0,662 (0,154) 0,661 (0,154) 1,035 (0,212) 1,051 (0,214) 1,202 (0,241)

0,615 0,511

0,953 (0,201) 0,715 (0,160) 0,719 (0,161) 1,101 (0,225) 1,114 (0,225) 1,271 (0,254)

0,880 (0,187) 0,877 (0.187) 0,846 (0,187) 0,846 (0,187) 1,044 (0,219)

0,588

0,003 (0,002) 0,946 (0,199) 0,940 (0,198) 1,002 (0,208)

0,603 0,401 0,571 0,489 0,517 0,589 0,021

0,928 (0,196 0,924 (0,196) 0,992 (0,205)

0,771 0,775 0,748

0,715 0,714 0,736

0,673 0,679 0,701

0,647 0,654 0,700

0,668 0,674 0,721

0,571 0,570 0,648

0,614 0,610 0,635

0,607 0,606 0,634

- 0,013 0,132 0,127

0,001 (0,0006) 0,131 0,124 (0,059)(0,056)

* - низке диагонали - генетические дистанции по Нею (Nei дистанций ( Mueller, Avala, 1982 )•, выше диагонали (Rogers, 1972)

cd

1972), стандартные ошибки генетических - генетические дистанции по Роджерсу

- г-

Сопоставление результатов фонетического анализа методами UPGMA, вагнеровских дистанций, Фитча-Марголиша и методом главных компонент свидетельствует, что объединение Salvelinus и Parahucho на фенограммах в обащй кластер не отражает действительное генетическое сходство видов, а является следствием ограниченности методов кластер-анализа. Три вида, которые исследованы в роде Salvelinus представляют единую тихоокеанскую филетическую группу (Глу-боковский, 1990). Сравнительно небольшой размах генетических дистанций медду видами внутри рода подтверждает, что группа достаточно однородна и включает генетически близкие виды. Уровень дивергенции шести видов тихоокеанских лососей, установленный по 40 аллозимнкм локусам, порядок фенетических связей и их отношения с группой Parasalmo достаточно устойчиво повторяются, независимо от методов анализа.

С эволюционных позиций фенетическое сходство зависит от двух факторов: времени с момента дивергенции видов и темпов их последующей эволюции. Как известно, при реконструкции филогенетических отношений только кладисткий подход позволяет методологически корректно установить отношения предок-потомок и тем самым определить направление эволюционных изменений и порядок событий, связанных с генетической дивергенцией.

3.3. Родственные связи лососей сем. Salmonidae. Результаты кладисткого анализа 72 филогенетически информативных признаков, описывающих гомологичные гены ядерной ДНК у 12 видов лососей представлены на рис.2. Полученная методом бугстреп-анализа кла-дограмма дает возможность выдвинуть следующую гипотезу эволюции видов (рис. 2,а). Первый этап дивергенции общего предка лососевых связан с отделением дальневосточного тайменя P.perryi, который таким образом выступает в качестве сестринского таксона по отношению ко всем остальным исследованным видам. В дальнейшем эволюция лососей шла двумя независимыми стволами, один из которых -филум гольцов, другой - общий филум тихоокеанских лососей и форелей. В последнем, согласно кладисткому бутстреп-анализу, сима образует монофилетическую группу с Parasalmo, кижуч с чавычей, кэта является сестринским таксоном по отношению к кластеру нерка-горбуша. Однако статистические характеристики устойчивости точек ветвления подтзердцавт указанный состав не у всех монофилетичес-ких групп. Что касается эволюционных событий в гольцоеой ветви, а также отделения Parahucho и общего предка Salvelinus, то статис-

Рис. 2. Кладограммы 12 еидое лососевых рыб по комплексу 72 филогенетически информативных признаков.

тический уровень устойчивости этих точек ветвления очень высокий. Не вызывает сомнений монофилетическое происхождение групп видов ОасогЬупсЬиз и Рагаза1то. В то же время низкие показатели устойчивости практически для всех точек дивергенции тихоокеанских лососей (кроме монофилетической группы кижуч - чавыча) рассчитанные бутстреп-анализом, свидетельствуют о том, что количество филогенетически информативных признаков недостаточно для определения последовательности дивергенции видов рода ОпсогпупсЬиз. В результате методом максимальной экономии для этого набора признаков получено две статистически равновероятных кладограммы , одна из которых повторяет топологии кладограммы, построенной методом бутстреп- анализа (рис.2,а), а другая отличается интерпретацией отношений в филуме, объединяющем тихоокеанских лососей и форелей (рис.2,б). Согласно второй кладограмме после отделения ветви Ра-газа1шо, все тихоокеанские лососи, включая симу, какое-то время эволюционировали вместе.

Учитывая, что существенная обособленность родов ОпсогИупсИиз

и Parasalmo отмечалась многими исследователями (Hikita, 1962; Vladykov, 1962) был проведен кладисткий анализ видов этих двух родов. Показано, что тихоокеанские лососи имеют достаточное количество производных признаков, которые появились у общего предка рода уже после дивергенции Parasalmo. Сима образует монофилети-ческую группу с другими видами рода Qncorhynchus на 100% уровне устойчивости. Таким образом, сближение симы и тихоокеанских форелей и, соответственно, обособленное положение симы в роде Qncorhynchus, обусловлено большим числом общих предковых признаков, сохраненных без изменения в процессе эволюции. Поэтому нельзя согласиться с мнением тех авторов (Utter et al., 1973), которые считают, что сила должна быть таксономически включена в род Para-salmo. Полученные результаты кроме того указывают на неправомерность как объединения в одну филогенетическую группу симы, кижуча и чавычи (Hikita, 1962; Simón, 1963; Коровина, Коновалов, 1972; Гориков и др., 1979), так и - разделения кижуча и чавычи (Омель-ченко и др., 1971; Царев и др., 1984; Шубина, 1985). Последние два вида по нашим данным являются мояофилетической группой, т.е. произошли от общего предка.

Глава 4. ФИЛОГЕНИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 1Ю ДАННЫМ РЕСТРИКТАЗН0Г0 АНАЛИЗА КМТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК S настоящее время в молекулярно-биологических эволюционных исследованиях наиболее широко используется митохондриальный геном. Получены оценки уровня дивергенции некоторых видов лососевых рыб на основе рестриктазного анализа и секвенирования коротких последовательностей мгДНК. В ряде работ авторы ограничились фене-тическим анализом (Thomas et al., 1986; Гинатулина и др., 1988; Grewe et al., 1990; Qohara, 1991; Shedlock et al., 1991), в других - предпринята попытка оценить последовательность дивергенции таксонов методами кладизма (Berg, Ferris, 1984; Gyllensten, Wilson, 1987; McVeigh, Davidson, 1991; Shedlock et al., 1992; Шедь-ко, Гинатулина, 1993). Для получения более обоснованных выводов об эволюции видев в семействе Salrnonidae представляется важным увеличить количество признаков, используемых в анализе, исследовав не гены, кодирующие ферменты, а любую другую часть генома. С нашей точки зрения, митохондриальная ДНК представляет уникальную возможность сравнить эволюционно разные участки генома, и установить насколько эволюции генов отражает эволюцию видов.

4.2 Рестриктазный анализ митохондриалыюго генома лососевых рыб. Размер митохондриального генома лососевых составил 16800+800 пар нуклеотидов. Полученные оценки вполне удовлетворительные и совпадают с ранее опубликованными данными. В табл.2 приведены попарные оценки уровня дивергенции нуклеотидных последовательностей у 11 видов лососевых рыб (Nei, Li, 1979; Nei, 1987). В общей сложности изучено 276 фрагментов мтДНК, в среднем для каждого вида 49-50 фрагментов, охватывающих 304 пар нуклеотидов, что составляет около 2%. от митохондриального генома.

Степень дивергенции видов внутри родов лососевых колеблется от 0 - 5,17+1,07%, среди гольцов рода Salvelinus до 2,05+0,71% -8,54+ 1,141 среди тихоокеанских лососей рода Oncorhynchus. Можно

0; 15_0.10_О. ОБ_а 00 Il0z(2)

_О. eorbuscha

~_О. легка

___О. keta

-O.masou

_O.kisitch

_О. tschanytscha

___P. my kiss

S.walma

__Is. albus

_S. leucoBiaenls

____________________________ P. perry i

a

_0. gorbuscha

"I_0. nerka

_0. keta

___0. nasou

___0. kisutcf)

_0. tsd&rytscha

- -P.myklss

_P. perry i

S. malrna [_S. albus

g _S. leucomaenis

Рис. 3. Фенограммы 11 видов лососевых рыб (UPGMA). По оси оценки дивергенции для а) общих, б) редких гаплотипов мтДНК.

Таблица 2

Оценки нуклеотидных различий мт ДНК 11 видов лососевых рыб ( в % )

Вид 1 2 3, 4 5 6 7 О 9 10 11

1. 0. £0гЬивсЬа 3,27 3,22 5,67 6,38 8,64 9,36 9,30 11,85 11,85 10,40

(0,80) (0,82) (0,98) (1,02) (1,14) (1,20) (1,20) (1,33) (1,33) (1,27)

2. 0. ке1а 2,55 3,49 7,78 7,89 8,29 10,21 8,40 9,95 9,95 9,38

(0,76) (0,87) (1,13) (1,13) (1,15) (1,27) (1,19) (1,29) (1,29) (1,25)

3. 0. пегка 2,05 2,77 5,14 3,71 5,20 8,46 7,39 10,89 10,89 10,96

(0,71) (0,82) (1,01) (0,89) (1,01) (1,24) (1,19) (1,39) (1,39) (1,38)

4. 0. тазои 5,99 7,92 5,14 4,29 6,19 7,85 10,01 9,81 9,81 11,38

(1,03) (1,17) (1,01) (0,91) (1,05) (1,1?) (1.28) (1,30) (1,30) (1,36)

5. 0. к1зиЬсЬ 5,73 6,36 3,88 3,78 3,08 8,99 6,66 9,95 9,95 10,01

(1,01) (1,07) (0,91) (0,88) (0,80) (1,22) (1,10) (1,29) (1,29) (1,29)

6. 0. 1зсЬа1ку1зс11а 7,48 7,11 5,20 5,56 2,33 11,65 6,99 10,59 9,88 9,31

(1Д1) (1,12) (1,01) (1,01) (0,73) (1,35) (1,12) (1,32) (1,29) (1,26)

7. Р. реггу1 16,13 14,12 12,62 11.10 14,42 12,09 9,74 13,00 13,00 11,10

(1,55) (1.52) (1;49) (1,38) (1,50) (1,41) (1,30) (1,46) (1Д6) (1,38)

8. Р. ту^ББ 9,63 8,14 7,46 •10,08 5,95 5,95 9,32 . 10,17 10,17 11,94

(1,24) (1,20) (1.18) (1,28) (1,05) (1,05) (1,32) (1,35) (1,35) (1,42)

9. 3. та1та 11,45 9,53 10,02 9,74 10,52 12,23 12,39 10,17 0,25 5,17

(1,36) (1,31) (1,35) (1,30) (1,33) (1,40) (1,50) (1,35) (0,30) (1,07)

10 . 3. а1ЬиБ 11,45 9,53 10,02 9,74 10,52 Л О ЪО 1 , 12,39 10,17 0,00 5,17

(1,36) (1,31) (1,35) (1,30) (1,33) (1,40) (1,50) (1.35) (0,00) (1,07)

11 . 3. 1еисотаегиз 10,08 8,46 •10,96 12,30 10,65 11,45 10,59 12,01 4,78 4,78

(1,28) (1,24) (1,33) (1,40) (1,32) (1,36) (1,40) (1,41) (1,04) (1,04)

-а -- ниже диагонали расположены оценки нуклеотидных различий (Ке1,Ы, 1979; Ме1, 1987; уравнение 5.55) и их стандартные ошибки ШрЬо11, 1977; уравнение 7), рассчитанные для общих ( часто встречающихся ) гашютипов мтДНК; выше диагонали расположены оценки нуклеотидных различий , 1л, 1979; Ме1, 1967) и стандартные ошибки (ирИоН, 1977), рассчитанные для редких гашютипов мтДИК

оценить и различия на уровне родов: наиболее близко связаны тихоокеанские лососи и тихоокеанские форели (8,12+1Д7%); наибольшая дивергенция наблюдается между родами Oncorhynchus и Parahucho (9,42+1,31% - 13,08+1,24%), а также Oncorhynchus и Salvelinus (12,50+ 1,00%).

На рис.3 представлены две фенограммы, построенные по методу UPGMA (в диссертации анализируются два комплекса признаков, описывающих общие и редкие гаплотипы мтДНК), которые топологически отличается только положением ветвей Parahucho - Salvelinus. Так как дивергенция между этими родами намного превышает 5%. мы рассматриваем обе фенограммы как равновероятные в отношении положения ветвей Parahucho и Salvelinus.

Независимо от набора признаков отсутствуют принципиальные изменения как в группировке близких родов (Oncorhynchus - Para-salmo) , так и в последовательности присоединения Еетвей внутри кластеров, объединяющих еиды одного рода. Из феногра.1м следует, что тихоокеанские лососи разделяются на две группы еидов: 1) сима - кижуч - чавыча и 2) нерка - горбуша - кета. Взаимная близость видов е этих группах различна. В первом кластере сима занимает обособленное положение по отношению к кижучу и чавыче. Вторая группа более компактная, и объективная оценка фенетической обособленности нерки, горбуши и кеты, если принять во внимание стандартные ошибки дистанций, затруднена.

4.3 Родственные связи лососей сем. Salmónidas. Для определения последовательности возникновения видов был проведен кладист-кий анализ признаков, характеризующих мигохондриальный геном лососей. В качестве внешней группы рассматривали P.perryi. В зависимости от набора признаков были получены филогенетические схемы, которые отличаются как расположением ветвей внутри филумов, так и устойчивостью самих ветвей. Показано, что при некоторых сочетаниях дифференцирующее признаков, тихоокеанские форели могут попадать в один кластер вместе с кюкучем и чавычей, в то время как сима занимает обособленное положение. Уменьшение количества признаков, как и исключение ряда таксонов из анализа также приводит к увеличению сходства видов тихоокеанских лососей и форелей. Подобная филогенетическая схема была получена американскими и канадскими исследователями (Berg, Ferris, 1984; Thomas et al, 1986; Thomas, Beckenbaoh, 1389; Grewe et al., 1990; McVeigh, Davidson, 199i). Расширение состава используемых для анатаза признаков и

0. keta

P.gairdnert

S. leucooaenis

S. malna

S. albus

P. pcrryi

P. ntykiss

0. ncrka

O.masou

0. kisutch

0. gorbuscha

O. tscheorytscha

Рис. 4. Кладограммы 12 видов лососевых рыб по комплексу 118 филогенетически информативных признаков.

применение метода максимальной экономии надежно определяют последовательность дивергенции : в начале от общего предка отделился предок Parasalmo, в то время как виды рода Oncorhynchus, включая симу, еще какое-то время эволюционировали вместе.

Анализ кладограчм свидетельствует, что только полный набор изученных признаков позволяет надежно оценить филогенетические взаимоотношения видов тихоокеанских лососей и связи высших таксонов лососевых рыб. Основываясь на результатах бутстреп-анализа (рис.4,а) и анализа методом максимальной экономии (рис.4,а,б) комплекса из 118 филогенетически информативных признаков, предложена следующая кладисгкая гипотеза. После отделения P.perryi от общего предка , остальные таксоны какое-то время эволюционировали общим стволом, который далее разделился на две ветви: филум гольцов и филум тихоокеанских лососей и форелей. Однако для следующего цикла дивергенции (Oncorhynchus - Parasalmo) статистический доверительный уровень равен всего 76%. Таким образом, положение на кладограмме Parasalmo требует дальнейшего уточнения. Общий предок рода Oncorhynchus таете разделился на два филуыа. На следующем этапе дивергенции от одного из них отделилась сима, затем

кижуч и чавыча. Второй фшг/м, вероятно, дал начато сразу трем ветвям, но дивергенция предков кеты, горбуши и нерки была более продолжительной, чем в первой группе. Ив предложенных в последнее время филогенетических схем наиболее близким к данным представлениям являются эволюционные гипотезы Глубоковского (Глубоковский, Глубоковская, 1981; Глубоковский, 1990), Романова (1683), Смита и Стерли БЬеаг1еу, 1989), с учетом того, что положение симы

на нашей кладограмме не достаточно устойчивое и, возможно, потребует дальнейшего уточнения.

Тем не менее рестриктазный анализ мтДНК убедительно свидетельствует. о том, что сима принадлежит к роду ОпсогЬупсЬиз. Несколько большее фенетическое сходство скмы и Рага5а1шо по признакам. 'характеризующим -ядерный геном, может быть связано с тем, что сима как вид сформировалась в нат-ивном ареале рода (Меауе, 1958) и поэтому сохранила многие предковые черты, которые свойственны также и тихоокеанским форелям. Учитывая, что полученные нами результаты отражают эволюцию митохондркального генома лососей, можно предположить, что обнаруженные различия филогенетических схем обусловлены более высокой скоростью эволюции мтДНК.

• Результаты кладисткого анализа гольцов рода Еа1уе1шиз-свидетельствуют о монофилетическом происхождении кунджи, мальмы и белого гольца, родственные связи между которыми очень устойчивые и не меняются в зависимости от набора используемых признаков и методов анализа. Полученные результаты подтверждают, что кунджа сформировалась на более ранних этапах дивергенции гольцов (Викто-ровский, 1978; РЬуШрз еЬ а!., 1989; Глубоковский, 1990).

В заключение отметим, что проведенный фенетический анализ сходства ыитохондриальных геномов лососей позволяет выделить четыре группы таксонов: ОпсогЬупсЬиз, Рагаза1шо, За1уеИпиз, Рага-ЬисЬо. Так как с позиций кладизма ранг таксона определяется последовательностью ветвления на кладограмме, мы моясем рассматривать эти группы в равном ранге. Таксономическое положение Рагаза1ню, по нашему мнению, не может быть определено только на основе изучения митохондриального генома, который, как известно, наследуется по материнской линии. Необходимо совместное исследование мито-хондриальных и ядерных генов для повышения надежности выводов о путях эволюции лососевых рыб.

Глава 5. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НАЧАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ОПИСАНИЯ ТАКСОНОВ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОНСТРУКЦИЙ

В филогенетических исследованиях, восстанавливающих эволюцию таксонов на основе сравнительных данных, начальные условия описания во многом определяют надежность эволюционных гипотез. К начальным условиям относятся как параметры описания признаков (количество, качество или специфика, кодировка, взвешивание, полярность и т.д.) , так и параметры описания контекста классификации (внешняя группа, набор операционных таксономических единиц и т.д.). При выполнении этой части исследования были поставлены следующие задачи. Во-первых, на количественной основе показать принципиальную возможность анализа влияния начальных условий описания. Во-вторых, оценить уровень и характер влияния некоторых параметров, входящих в эти условия: количества и качества дифференцирующих признаков, способов кодирования признаков, влияния внешней группы и набора таксонов, которые считаются единой эволюционирующей структурой.

Общая схема анализа, при котором каждый исходный набор признаков рассматривался отдельно, состояла в следующем.

1. Для изучения влияние количества использованных признаков на устойчивость классификации для каждой меры генетического расстояния было рассчитано по 9 матриц путем использования сначала 10, затем 20 и 30 аллозимных локусов.

2. Использовали две системы кодирования аллозимных данных.

3. Для анализа влияния контекста в качестве независимых переменных рассматривались: а) внешняя группа (Parahucho, Salvelinus, в некоторых вариантах Parasalmo); б) число таксонов. При этом из полного набора объектов сравнения исключались как отдельные виды, так и группы видов.

4. Для каждой матрицы данных эволюционное дерево было реконструировано с помощью фенетических методов, и показана последовательность дивергенции таксонов при фиксированном состоянии параметров признаков и варьировании внешних групп. В диссертации приводятся все варианты дендрограмм, которые иллюстрируются 61 рисунком.

Сделан вывод, что из рассмотренных параметров наибольшее значение имеет репрезентативность используемого комплекса молеку-лярно-генетических маркеров в отношении структуры геномов сравниваемых видов. Результаты настоящего исследования показали высокую степень соответствия между дендрограммами, построенными для мито-

хондриалькых и ядерных генов. Обсуждаемые фенограммы (рис.1,а, 3,а,б) топологически отличаются присоединением ветвей О.тазои и Р.реггу!. Если для тайменя, учитывая уровень дивергенции и указанные в диссертации статистические ограничения, все положения оказываются равновероятными, то сходство симы с кижучем и чавычей в одном случае (мтДНК) или с РагазаХшо (ядерная ДНК) в другом, определяется особенностями эволюции митохондриальных и ядерных генов. Это можно рассматривать как экспериментальное свидетельство того, что ни один из комплексов признаков не является репрезентативным в отношении всего генома и в полной мере не отражает структуру взаимоотношений объектов классификации. Очевидно, что влияние качественного состава признаков связано с общим уровнем разнообразия и, следовательно, опосредовано - с количеством использованных признаков.

Учитывая, что митохондриальный геном наследуется независимо от ядерного, а также то, что явление гетероплазмии не было обнаружено в исследованных образцах мтДНК, все признаки были объединены в одном филогенетическом анализе. Три кладограммы, построен-

Рис. 5. Кладограмма 12 видов лососевых рыб по комплексу 190 филогенетически информативных признаков.

ные для данного комплекса из 190 филогенетически информативных признаков имеют одну топологию (рис. 5), которая, с нашей точки зрения, отражает не только эволюцию генов, но и последовательность дивергенции исследованных видов лососей. Первый этап дивергенции предполагает отделение ветви Parahucho perryi, который ближе других таксонов связан с основанием филограчмы и, следовательно, с общим предком. Остальные таксоны, по-видимому, относительно непродолжительное время эволюционировали общим филумом, который дивергировал на гольцовую ветвь и Еетвь общего предка Oncorhynchus- Parasalmo. В филуме тихоокеанских лососей от общего предка рода первой дивергировала сима, затем ветвь, которая в последствии разделилась на предков современных кижуча и чавычи. На последнем этапе филогенеза сформировались нерка, горбуша и кета.

Проверка устойчивости топологий фенограмм и кладисткий анализ убедительно показали, что P.perryi и гольцы рода Salvelinus не являются монофилетической группой, а представляют разные филе-тические ветви в эволюции семейства. Таким образом, высказанное ранее предположение о близости родов Salvelinus и Hucho (для некоторых схем, включая Parahucho в качестве подвода), вероятно, не отражает филогенетические отношения данных родов (Чэрнавин, 1923; Behnke, 1968; Викторовский, 1978; Kendal, Behnke, 1984; Stearley, Smith, 1993). Гораздо более обоснованным является отнесение гольцов Salvelinus и сахатинского тайменя Parahucho к различным над-родовым таксонам (Holcik, 1982; Глубоковсккй, 1983, 1990; Дорофеева, 1989).

Предпринятая попытка количественной оценки влияния начачьных условий описания таксонов на филогенетические реконструкции свидетельствует о том, что принципиальный источник дискутируемой сейчас проблемы взаимоотношений Oncorhynchus и Parasalmo - это адекватность описания. Чем полнее будет отражено разнообразие реальных взаимосвязей видов и описаны сами виды в структуре признаков, которые выделил исследователь, тем более обоснованными и определенными будут результаты классификации.

Глава 6. НАПРАВЛЕНИЕ И ТЕМПЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭВОЛЮЦИИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

Опираясь на результаты проведенного филогенетического анализа лососевых рыб, полученные данные по генетической дивергенции

их таксонов и допуская, что молекулярные изменения происходят достаточно равномерно, чтобы служить эволюционными часами, в зтой главе рассчитано абсолютное Бремя дивергенции для изученных видов.

Показано, что могут наблюдаться значительные колебания от таксона к таксону темпов молекулярной эволюции, которые можно обнаружить только сравнивая оценки дивергенции для митохондриальных и ядерных генов. При анализе степени дивергенции O.masou и Para-salmo оказалось, что скорость эволюции мтДНК симы была очень высокой. Вместе с тем, ядерный геном данного вида эволюционировал достаточно медленно. Для остальных пяти видов тихоокеанских лососей такого расхождения в темпах эволюции митохондриальной и ядерной ДНК не отмечено.

Примером быстро эволюционирующей группы являются также тихоокеанские гольцы. Скорость эволюции рода Salvelinus представляется исключительно высокой и касается всех уровней биологической организации (Глубоковский, 1977; ВиктсроЕский, 1978). В основе этого, видимо, лежит высокая скорость нуклеотидных замещений как ядерных, так и митохондриальных генов.

Известно, что эволюционные процессы по разному влияют на ми-тохондриальный и ядерный геномы. Ранее был сделан вывод, что уровень разнообразия мтДНК может быть не связан со степенью морфологических различий или уровнем изменчивости ядерной ДНК (Wilson et al., 1974; Gyllensten, Wilson, 1987). Как следует из результатов нашего исследования, темпы.эволюции (скорости нуклеотидных замен) митохондриальных и ядерных генов могут отличаться и весьма значительно, но общее направление молекулярной и морфологической эволюции лососей совпадает. Оценки абсолютного Бремени дивергенции таксонов, рассчитанные для двух независимо наследующихся частей генома лососевых, находятся приблизительно в одном диапазоне значений и совпадают с эволюционными гипотезами, разработанными систематиками (Neave, 1958; Глубоковский, 1990). Это свидетельствует о том, что филогенетические реконструкции, основанные на изучении молекулярных признаков, отражают не только эволюцию генов, но и эволюцию видов в целом.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Фенетический анализ генетического сходства 12 видов лососевых рыб позволяет выделить четыре группы генетически близких видов: Oncorhynchus, Parasalmo, Parahucho, Salvelinus. Максимальный уровень генетической дивергенции выявлен между родами Oncorhynchus и Parahucho, Oncorhynchus и Salvelinus. Наибольшее сходство по мо-лекулярно-генетическим маркерам обнаружено между тихоокеанскими лососями и тихоокеанскими форелями.

2. На основании изучения молекулярно-генетических маркеров, характеризующих эволюцию митохондриальных и ядерных генов, предложена схема филогенетических отношений шести видов лососей рода Oncorhynchus. В начате от общего предка отделилась сима, затем филум предка кижуча и чавычи, которые эволюционировали одним стволом до следующего цикла дивергенции. Второй филум, вероятно, дал начало сразу трем ветвям - кете, горбуше и нерке, но совместная дивергенция предка этих видов была более продолжительной.

3. Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что сима O.masou принадлежит к роду Oncorhynchus. Таксономическое положение симы в системе родов Oncorhynchus и Parasalmo может быть понято лишь при совместном исследовании митохондриатьных и ядерных генов. Сравнительный анализ фенетического сходства симы и тихоокеанских форелей, основанный на генетических признаках разного качества отражает неравномерность темпов эволюции митохондриаль-ного и ядерного геномов лососевых рыб.

4. Молекулярно-генетические исследования не дают оснований для пересмотра таксономического положения рода Parasalmo и объединения тихоокеанских форелей с- тихоокеанскими лососями в рамках одного рода. Фенетическое сходство Parasalmo и группы архаичных видов Oncorhynchus обусловлено как начальными условиями описания (количеством и качеством дифференцирующих признаков), так и составом сравниваемых таксонов. Репрезентативный набор признаков в отношении всего генома и применение методов кладисткого анализа надежно определяют последовательность дивергенции: в начале от общего предка отделился предок Parasalmo, в то время как виды рода Oncorhynchus какое-то время эволюционировали вместе.

5. Показана возможность существенного влияния начальных условий описания таксонов на филогенетические реконструкции. Из рассмотренных параметров наибольшее значение имеет состав и количество используемого набора признаков и его репрезентативность структуре геномов сравниваемых _ видов. Показано, что количество признаков оказывает наибольшее, а кодирование признаков -наименьшее влияние на устойчивость классификации в случае использования признаков одного качества. Влияние на устойчивость классификации качественного состава используемых признаков или специфики конкретного анализируемого гена связано с общим уровнем разнообразия взаимоотношений между таксонами и, следовательно, опосредовано, с количеством использованных признаков.

6. Изучение зависимости устойчивости классификации от выбора внешней группы показало, что ее варьирование мало влияет на генетическое сходство таксонов, но весьма заметно на результаты филогенетических реконструкций последовательности возникновения таксонов. Из Есех возможных вариантов о точки зрения теории кладизма лучшей внешней группой, маркирующей основание дендрограмм, является дальневосточный таймень P.perryi. Таким образом, род Рага-huc'no дивергироват от общего предка лососевых ранее, чем роды Oncorhynchus, Parasalrro, Salvelinus.

7. Для более полного понимания эволюции лососевых рыб необходимо исследовать с позиций молекулярной биологии представителей всех родов семейства. Наибольшее влияние на структуру родственных связей в пределах исследованной группы оказывают таксоны, сохранившие в процессе эволюции общие предковые признаки: Parasalmo, Ра-rahucho и примитивные виды рода Oncorhynchus (сима, кижуч).

8. Генетические данные можно использовать в качестве молекулярных часов в пределах той степени точности, с которой возможно определить время дивергенции геномов лососевых рыб. Предки современных родов Salvelinus, Parahucho, Parasalmo, Oncorhynchus появились не позднее олигоцена (возможно, на границе эоцена и олигоцена). Следующий этап дивергенции, связанный с образованием еидов лососей, относится к плиоцену-плейстоцену. Показано, что темпы дивергенции митохондриальных и ядерных генов могут отличаться даже у близких видов, однако общее направление молекулярной эволюции таксонов по ядерным и мктохондриальным генам совпадает.

- 23 -

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. Полякова Н.Е., Олейник А.Г. Филогения тихоокеанских лососей.

Рестриктазкый анализ митохондриальной ДНК // Современное состояние исследований лососевидных рыб. Тольятти: МЭВЕ АН СССР, 1988. С. 254.

2. Полякова Н.Е., Олейник А,Г. Изоферменты эстеразы D у симы Оп-

ccrhynchus masou // Генетика. 1988. Т.24. N 6. С. 1130-1131.

3. Полякова Н.Е., Олейник А.Г. Дивергенция митохондриальной ДНК и

биохимическая систематика лососевых рыб подсемейства Salmo-ninae // Молекулярные механизмы генетических процессов. М., 1990. С. 9?.

4. Полякова Н.Е., Олейник А.Г.Митохондриальная ДНК лососевых рыб:

межвидовая изменчивость // Цитология, биохимия и физиология морских организмов. Владивосток: ЮМ ДВО АН СССР, 1990. С. 129-134.

5. Олейник А.Г., Полякова Н.Е. Анализ межвидовой генетической

дифференциации у некоторых видов сем. Salrconidae //ДЕЛ. ВИНИТИ. 1992. 16.04.92. N 1317-1392. 42 С.

6. Олейник А.Г., Полякова Н.Е. Генетическая дифференциация и фи-

логения лососевых рыб сем. Salmónidas // Генетика. 1992. Т. 28. N 9. С. 141-149.

7. Олейник А.Г. Количественный анализ влияния начальных условий

описания таксонов на результаты филогенетических реконструкций в сем. Salmonidae // Систематика, биология и биотехника разведения лососевых рыб. Санкт-Петербург: ГосНИОРХ, 1994. С. 144-146.

8. Qleynik A.G. Molecular systematics of fish of the family Sal-

monidae // Bridges of sciences between North America and Russian Far East. Vladivostok: Dalnauka, 1994. P. 129.

9. Олейник А.Г., Полякова Н.Е. Рестриктазкый анализ митохондри-

ального генома лососевых рыб сем. Salmonidae // Генетика. 1994. Т. 30. N 9. С. 1202-1214. 10.Олейник А.Г. Филогения лососевых рыб сем. Salmonidae по данным рестриктазкого анализа митохондриальной ДНК // Генетика. 1994. Т. 30. (в печати)