Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение микросателлитной изменчивости лососевых рыб

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение микросателлитной изменчивости лососевых рыб"

005059889 На правах рукописи

Шайхаев Евгений Гаджирамазанович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 МАЙ 2013

Москва, 2013

005059889

Работа выполнена в лаборатории генетических проблем идентификации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Животовский Лев Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Сулимова Галина Ефимовна

Заведующий лабораторией сравнительной генетики животных Института общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

доктор биологических наук

Холодова Марина Владимировна

Руководитель кабинета методов молекулярной диагностики Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцева РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря имени A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток.

Защита состоится « 6 » июня 2013 г. в 15:00 час. на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: Москва, 119991, ГСП-1, ул. Губкина, д 3. Тел.: 499 13562-13,499 135-14-31. aspirantura@vigg.ru . Факс: 499 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «J3» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

(О

Синелыцикова Татьяна Аркадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Лососевые рыбы являются ценнейшим водным биоресурсом российского Дальнего Востока. Их природные популяции широко распространены в бассейне Тихого океана и имеют разные по протяженности нерестовые ареалы на азиатском и северо-американском континентах.

Последние два десятилетия наиболее популярными маркерами для популяционно-генетических исследований лососевых рыб являются микросателлиты - последовательности, состоящие из большого количества коротких повторов и отличающиеся высоким уровнем аллельного полиморфизма (Goldstein and Schlótterer 1999; Животовский, 2006; Bhargava, Fuentes, 2009).

Микросателлиты могут амплифицироваться не только у тех видов, у которых они были идентифицированы, но и у других филогенетически близких видов (Ellegren, 2004). Важно подчеркнуть возможность амплификации у разных видов с использованием одной и той же пары праймеров - т.н. перекрестная амплификация (трансферабельность). Хотя возможность перекрестной амплификации снижается с увеличением эволюционной дистанции между видами, тем не менее, при ее успешности можно получить универсальные праймеры сразу для нескольких видов. Такие универсальные праймеры могут быть полезными для решение некоторых прикладных задач.

Микросателлиты, вне зависимости от вида, могут сохранять свои свойства высоко-полиморфных генетических маркеров. В связи с этим, универсальные праймеры позволяют расширить уже известный набор локусов, избавив исследователя от сложных и продолжительных по времени работ по обнаружению и разработке новых локусов для популяционно-генетических исследований и индивидуальной идентификации. В свою очередь, полиморфизм одних и тех же локусов в зависимости от вида может отличаться — вплоть до того, что локус, проявляющий высокий уровень полиморфизма у одного вида, может быть мономорфным у другого, даже филогенетически близкого вида (Morin et al., 1998; Ellegren et al., 1995). Обнаруженные между видами различия в полиморфизме, а также интервалах размеров аллелей, могут использоваться для целей внутривидовой идентификации и выявления межвидовых гибридов (Routtu et al., 2003; Vanhaecke et al., 2012).

В связи с тем, что промысел и воспроизводство ценных видов лососевых рыб постоянно увеличивается, разработки генетических маркеров для их идентификации на видовом и внутривидовом уровнях становятся особенно актуальными.

Микросателлитная изменчивость на межвидовом уровне характеризуется не только различиями в количестве повторов, но также и изменениями структуры повторов и фланкирующих регионов. Лососевые рыбы представляют большой

интерес для филогенетических исследований. Несмотря на большое количество данных, полученных с помощью анализа различных признаков, как морфологических так и молекулярных, некоторые вопросы, касающиеся филогении лососевых рыб, остаются до конца не выясненными (Crespi, Тео, 2002; Crete-Lafreniere et al., 2012). С помощью универсальных праймеров, уже посредством секвенирования аллелей микросателлитных локусов, можно изучить их структуру у разных видов. Данные о структуре микросателлитов могут использоваться для филогенетических исследований, направленных на реконструкцию эволюционного процесса и установления родственных связей меэвду таксонами (Zhao Jun Shao, Rivals et al., 2011; Martin et al., 2001).

Кроме того, сравнительное изучение структуры микросателлитов может внести вклад в понимание сложных мутационных процессов, происходящих в них в ходе эволюции (Taylor et al., 1999; Angers et al., 1997). Цель работы

Целью данной работы является изучение изменчивости микросателлитных локусов у разных видов рыб семейства Salmonidae и применение полученных данных для эволюционных исследований, а также решения прикладных задач идентификации.

Задачи исследования

1. Разработать праймеры для перекрестной амплификации микросателлитов у разных видов лососевых рыб российского Дальнего Востока.

2. Провести фрагментный анализ выбранных нами локусов у исследуемых видов и оценить их полиморфизм.

3. Выявить локусы наиболее подходящие для внутри- и межвидовой идентификации лососевых рыб и проверить их на конкретных примерах.

4. Секвенировать аллели микросателлитных локусов и выявить филогенетические отношения исследуемых видов лососевых рыб по данным маркерам.

5. Определить характер эволюционных изменений в микросателлитных локусах: точковых замен, микросателлитных мутаций, протяженных делеций/инсерций.

Научная новизная работы

Автором впервые разработаны универсальные праймеры, с помощью которых удалось добиться стабильной и качественной амплификации восьми микросателлитных локусов у десяти видов лососевых рыб. Фрагментный анализ разработанных микросателлитов показал заметные различия в уровне полиморфизма и интервалах размеров аллелей между разными видами лососевых рыб.

Впервые продемонстрирована возможность применения данных локусов для решения задач внутри- и межвидовой идентификации, а также идентификации гибридных особей лососевых рыб.

Впервые определены нуклеотидные последовательности восьми микросателлитных локусов, как фланкирующих регионов, так и повторяющихся

последовательностей у десяти видов лососевых рыб. Выявлены заметные различия в структуре микросателлитных локусов, накопившиеся в ходе эволюции лососевых рыб. Впервые проведенный филогенетический анализ данных последовательностей показал монофилию рода Oncorhynchus по отношению к родам Salvelinus, Salmo и Parahucho.

Практическая значимость

В последнее время, в связи с ростом воспроизводства, вылова и увеличения продукции лососевых рыб, возникают и будут усиливаться запросы по идентификации биологических образцов. Разработанные нами маркеры оказались полезными для этих целей. На конкретных примерах продемонстрирована возможность применения микросателлитных локусов для внутри- и межвидовой идентификации, а также идентификации гибридов лососевых рыб. Также, ввиду повышенного интереса к изучению популяций лососевых рыб, разработанные микросателлиты оказались востребованы для популяционно-генетических исследований.

Апробация результатов

Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Воспроизводство естественных популяций ценных видов рыб» (Санкт-Петербург, 2010), на международной конференции «Проблемы популяционной и общей генетики, посвященной памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю. П. Алтухова» (Москва, 14-16 ноября 2011), на международной молодежной конференции «Популяционная генетика: Современное состояние и перспективы», посвященной памятной дате - 75-летию со дня рождения Ю.П. Алтухова» (Москва, 17-18 ноября 2011).

Декларация личного участия автора

Автор участвовал в экспедиции по сбору большей части биологического материала данной работы на полуострове Камчатка в 2008 году. Автор самостоятельно проводил выделение ДНК из всех собранных биологических образцов. Автором были разработаны шесть пар праймеров и оптимизированы условия амплификации восьми исследуемых микросателлитных локусов у десяти видов рыб семейства Salmonidae. Автором самостоятельно был проведен фрагментный анализ всех микросателлитных локусов у всех исследуемых видов лососевых рыб, а также пробоподготовка ПЦР-продуктов (аллелей) для секвенирования.

Статистическая обработка результатов в программе GDA была проведена совместно с М. В. Шитовой. Автор самостоятельно проводил редактирование, выравнивание и филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей в программах SeqMan, Editseq, Megalign и Mega 5. По результатам данной работы написано 4 статьи, которые приняты в печать и опубликованы в журналах ВАК.

Структура и объем диссертации

Работа, изложенная на 154 страницах (включая 2 приложения на 22 страницах), состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждение», заключения, выводов, списка сокращений, списка цитированной литературы (включающего 229 источника) и приложений. Работа содержит 23 рисунка и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал. Материалом для данной работы послужили выборки разных видов лососевых рыб, собранные в нескольких регионах российского Дальнего Востока. В исследование были вовлечены семь видов представителей рода Oncorhynchus (кета, горбуша, нерка, кижуч, чавыча, сима, микижа), а также представители других родов лососевых рыб, в частности, рода Salvelinus - белый голец и кунджа, и рода Parahucho - сахалинский таймень (табл. 2.1.).

Помимо популяционных сборов, в работе использован материал по восьми гибридам кеты и горбуши, собранный на забойке Курильского рыбоводного завода (р. Курилка, о. Итуруп) проф. Л.А. Животовским и главным рыбоводом Курильского ЛРЗ В.П. Погодиным 15-22 октября 2011г. Также использовали материал по спектру питания косаток: чешуя и кусочки кожи — собранные с поверхности воды дериваты рыб после удачной охоты косаток сотрудниками кафедры зоологии позвоночных Биолого-почвенного факультета СПбГУ летом 2012 г. в южной части Авачинского залива (Камчатка). Материал был передан нам Татьяной Ивкович для определения видового спектра питания, с разрешением использовать в нашей работе.

В базе данных Whole-Genome-Shotgun contigs при помощи NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlni.nih. govA были обнаружены последовательности микросателлитных локусов OtsG68, OkilO, ОпеЮЗ, 0пе109, Ssal97, ОттЮ37, 0mml050, ОкеЗ у атлантического лосося - семги Salmo salar.

Таблица 2.1. Характеристика исследованных выборок лососевых рыб

Вид Места сбора биологических проб Дата сбора(число.месяц.год) Количество рыб Сборщик проб

Кета Oncorhynchus keta Река Камчатка (п-ов Камчатка) 10.08.2008 44 Е.Г. Шайхаев

Нерка 0. nerka ... 10-13.08.2008 48 ...

Чавыча 0. tshawytscha ... 10-13.08.2008 48 ...

Микижа 0. mykiss ... 10-16.08.2008 48 ...

Белый голец Salvelinus albus ... 25-30.08.2008 44 ...

Кунджа S. leucomaenis ... 10-13.08.2008 44 ...

Кижуч О. kisutch ... 10.08.2008 42 ...

Сахалинский таймень Parahucho pertyi Река Даги (о. Сахалин) 21.10.2009 22 A.A. Юрченко Л.А. Животовский

Сима О. masou Река Знаменка (о. Сахалин) 19.10.2008 44 Л.А. Животовский

Горбуша О. gorbuscha Река Курилка (о. Итуруп) 27.07.2007 44 Л.К. Фёдорова

- Все сборы проб осуществляли в ходе плановых экспедиционных работ лаборатории (рук. Л.А. Животовский).

- Сборы на р. Камчатка проводили совместно с зав. биостанцией «Радуга» ИБМДВО РАН М.Ю. Ковалевым.

- Сборы на р. Даги проводили совместно с экспедицией от AHO «Сахалинская лососевая инициатива» (зав. С.Ю. Диденко) под руководством А.Ю. Семенченко иД.Л. Диденко. Брали прижизненные пробы (кусочек плавника) с

последующим выпуском рыб в водоем.

Анализ ДНК. Выделение ДНК проводили из соединительной ткани плавника рыбы, при помощи набора «Diatom DNA prep 200», ООО «Лаборатория Изоген», согласно прилагаемой инструкции.

В базе данных NCBI nucleotide (http://www.ncbi.nlm.rtih.gov/nuccore/) изначально было выбрано 14 микросателлитных локусов, обнаруженных у разных видов лососевых рыб: OtsG68 (Williamson et al., 2002), OtsG85 (Williamson et al., 2002), 0tsl02 (Nelson, Beachem, 1998), Ots 211 (Nelson, Beachem, 1998), ОпеЮЗ (Olsen et al., 2000), 0nel09 (Olsen et al., 2000), ОММЮ37 (Rexroad III et al., 2002), OMM1050 (Rexroad III et al., 2002), OMM1121 (Rexroad III et al., 2002), OMM1070 (Rexroad III et al., 2002) , OkilO (Smith et al., 1998), Oki2 (Smith et al., 1998), Ssal97 (O'Reilly et al., 1997), Sco200 (DeHaan, Ardren, 2005). Для них подбирались известные или конструировались новые праймеры с целью перекрестной амплификации у всех изучаемых нами видов. Также использовались данные, полученные по локусу ОкеЗ. Для его амплификации у разных видов лососевых рыб, а также последующего секвенирования полученных аллелей, пришлось прибегнуть ко многим вариантам праймеров, представленных в диссертационной работе С.Ю. Кордичевой (2011).

Для проведения ПЦР-амплификации использовали набор реагентов «GenPak PCR Core» ООО «Лаборатория Изоген», содержащий ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, lu, 200 цМ и 2,5 mM, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечный объем ПЦР-смеси 20 мкл, конечная концентрация праймеров в реакции 0,1-0,5 цМ, количество ДНК 20-100 нг. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler». Программа амплификации включала в себя следующие стадии: 1) предварительная денатурация при 95°С - 1мин, 2) 32 цикла: 95°С-20 сек, 56-58°С-20 сек, 74°С-30 сек, 3) заключительный синтез при 74°С-2 мин.

Фрагментный анализ проводили на приборе для капиллярного электрофореза QIAxcel фирмы QIAGEN®, размеры аллелей определяли на основании набора фрагментов ДНК, имеющих размер от 76 п.н до 556 п.н с шагом 24 п.н, используя программное обеспечение BioCalculator software фирмы QIAGEN®.

Для анализа нуклеотидных последовательностей исследуемых локусов, проводили разделение их аллелей в 2%-агарозном геле в lx TBE буффере, а также в блоке 6 или 8% неденатурирующего полиакриламидного геля в 0,5х TBE. Для элюции ПЦР-родуктов использовали набор «Diatom DNA elution» ООО «Лаборатория Изоген» согласно прилагаемой инструкции. Реамплификацию элюированных ПЦР-продуктов проводили при помощи набора «GenPak PCR Core» ООО «Лаборатория Изоген».

Очистка и секвенирование ПЦР-продуктов осуществлялась в компаниях ООО «Синтол» и ЦКП ОБН РАН «Генетический полиморфизм», используя те же варианты праймеров, что и для амплификации.

Анализ генетических данных. Статистический анализ данных проводили согласно руководству Weir (1996) с использованием пакета программ GDA (Lewis, Zaykin, 2001). В качестве мер внутрипопуляционной изменчивости рассматривали

2п

индекс разнообразия (ожидаемая гетерозиготность): # =-Ypf (где p¡ - это

2/1-1

частоты аллелей, а и - объем выборки), наблюдаемое число аллелей, а также число аллелей с поправкой на минимальный объем исследованных образцов (rarefaction method, Krebs 1999). Для оценки идентифицирующей способности маркеров определяли вероятность Рс случайного совпадения генотипов двух произвольно взятых особей, которую вычисляли как сумму квадратов частот генотипов в выборке по данным о частотах аллелей в предположении генотипического равновесия (соотношений Харди-Вайнберга): чем меньше величина вероятности, тем надёжнее идентификация. Значимость отклонений от соотношений Харди-Вайнберга проверяли точным критерием Фишера методом пермутаций (Guo, Thompson 1992, Zaykin et al. 1995), с последующим учетом поправки Бонферрони на множественные сравнения (Weir, 1996).

Для анализа полученных хромотограмм и редактирования последовательностей использовались программы Seqman, EditSeq пакета Lasergene фирмы DNASTAR. Для выравнивания редактированных нуклеотидных последовательностей использовались программа MegAlign пакета Lasergene фирмы DNASTAR.

Построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 5 используя дистанционные методы построения филогенетических деревьев: метод присоединения соседей - NJ (Neighbor-joining method) и метод минимума эволюции - ME (minimum evolution), а также методы анализа дискретных признаков: метод максимального правдоподобия — ML (maximum likelihood) и метод максимальной экономии MP (maximum parsimony). Длина анализируемого фрагмента 482 п.н. В качестве эволюционной модели использовалась 2-параметрическая модель Кимуры. Статистическая обработка полученных деревьев оценивалась с помощью «бутстреп» - анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Перекрестная амплификация микросателлитных локусов лососевых

рыб

Используя разные варианты праймеров - как ранее опубликованные, так и разработанные нами, удалось добиться стабильной и качественной амплификации восьми микросателлитных локусов у всех исследованных в работе видов

лососевых рыб, при практически одинаковых условиях (табл. З.1.). Семь из восьми микросателлитных локусов, кроме локуса OkilO у гольца, амплифицировались у всех исследуемых видов при помощи одних и тех же праймеров. Для амплификации локуса OkilO у Salvelinus albus использовали дополнительную пару праймеров.

Сравнительное изучение полиморфизма микросателлитных локусов

В табл. 3.2. и на рис. 3.1. представлены данные о полиморфизме исследованных нами микросателлитных локусов у изученных видов семейства Salmonidae. Полиморфизм, а также интервалы размеров аллелей исследуемых локусов у разных видов лососевых рыб проявляются по-разному. Некоторые локусы сохраняют высокий уровень аллельного полиморфизма у всех исследованных видов. В то же время полиморфизм, а также интервалы размеров аллелей в зависимости от видов могут заметно отличаться: локусы, проявляющие себя как полиморфные у одного вида, у других филогенетически близких видов проявляют себя как мономорфные.

Таблица 3.1. Характеристика исследованных микросателлитных локусов

Локуе Повторяющаяся последовательность Праймеры ТС отжига

OísG6S (TAGA)n F: 5'-tatgaactgcagcttgttatgttagtttg-3'** R: 5*-catgtcggctgctcaatgtataa-3' ** 58

OtslOl (GCCT)„(GTCT)„ F: 5'-ggatccaataaggagtgatatagtag-3'** R: 5*-tatcccctttaccatttcccttgcta-3' ** 58

One 103 (ATCT)nNn(ATCT)n F: 5'-aatgttgagagctatttcaatcc-3' * R: 5 *-gattgatgaatgggtggg-3' * 56

One109 (TAGA)„ F: 5 *-gagagggagagagtgtctttg-3' ** R: 5'-gtagcatcagctcactaatgggat-3' ** 58

OMMW37 (GAAAX, F: 5'-gaacggcgactggatttaatact-3' ** R: 5'-ccgctcaccctcgtctcttaa-3'" 58

OMM1050 (GATA)„N„(GATA)nNn(GATA)n F: 5'-accaacctgaacacagcctaat-3' ** R: 5'-gctgtaacatttcagggatcat-3' ** 58

OkilO (CTGT),, F,: 5'-gagtgctggacagattggatt-3' ** Ri: 5'-gggagctacagctttttacaaatc-3' ** F2: 5'-tccaaactcgtgttcgttggata-3' ** R2: 5'-cacataggggagctacagcttt-3' ** 58

Ssal97 (TG)„(TGAG)„ F: 5 '-gggttgagtagggaggcttg-3' * R: S'-tggcagggatttgacataac-S' * 58

** - праймеры разработанные в данном исследовании; * - праймеры, заимствованные

из первоисточника.

Таблица 3.2. Аллелыюе разнообразие (А — наблюдаемое число аллелей, Аг — число аллелей с поправкой на минимальное число образцов, Не - ожидаемая гетерозиготпность) исследованных маркеров.

Локус В среднем

на локус

ОММ1050 ОпеЮ9 &а/97 ОпеЮЗ ОММЮ37 0н102 Ойбб« ОШО

А 1 И 4 7 3 5 21 21 9.8

Кета Аг 1.0 9.5 3.7 6.4 2.9 4.5 17.0 17.5 8.1

Не 0 0.85 0.54 0.80 0.54 0.56 0.93 0.94 0.65

А 1 16 16 21 4 25 18 22 15.5

Горбуша Аг 1.0 14.0 13.7 18.7 4.0 21.1 14.2 19.2 13.3

Не 0 0.92 0.91 0.95 0.65 0.95 0.90 0.93 0.78

А 1 10 1 И 3 1 3 16 5.8

Нерка Аг 1.0 8.8 1.0 10.1 2.9 1.0 2.6 15.0 5.3

Не 0 0.84 0 0.84 0.22 0 0.51 0.92 0.42

А 2 1 1 2 2 1 13 17 4.9

Кижуч Аг 2.0 1.0 1.0 2.0 1.5 1.0 12.9 15.0 4.6

Не 0.28 0 0 0.33 0.02 0 0.90 0.92 0.31

А 1 1 28 3 3 22 15 25 12.4

Чавыча Аг 1.0 1.0 21.1 2.7 2.7 18.1 13.3 19.6 10.0

Не 0 0 0.95 0.50 0.20 0.95 0.91 0.94 0.56

А 19 6 10 9 9 4 17 20 11.8

Сима Аг 15.8 4.9 8.8 7.4 7.2 3.4 13.2 16.7 9.7

Не 0.92 0.69 0.84 0.76 0.75 0.38 0.91 0.94 0.77

А 5 1 2 2 10 4 5 7 4.5

Микижа Аг 4.9 1.0 2.0 2.0 9.1 3.8 4.9 6.2 4.2

Не 0.70 0 0.49 0.51 0.84 0.45 0.67 0.76 0.55

А 1 4 5 1 1 8 12 13 5.6

Кунджа Аг 1.0 3.8 4.5 1.0 1.0 6.1 11.0 10.9 4.9

Не 0 0.51 0.61 0 0 0.67 0.88 0.88 0.44

А 1 1 1 2 5 31 10 23 9.5

Б. голец Аг 1.0 1.0 1.0 1.9 4.5 22.2 7.7 18.1 7.3

Не 0 0 0 0.09 0.69 0.94 0.55 0.94 0.40

А 1 1 1 1 И 4 1 8 3.5

С. таймень Аг 1.0 1.0 1.0 1.0 11.0 4.0 1.0 8.0 3.5

Не 0 0 0 0 0.87 0.66 0 0.83 0.30

А 3.3 5.2 6.9 5.9 5.1 10.5 11.5 17.2

Среднее Аг 3.0 4.6 5.8 5.3 4.7 8.5 9.8 14.6

Не 0.19 0.38 0.43 0.48 0.48 0.56 0.72 0.90

Примечание. Для оценки числа аллелей по гаге/асйоп-методу (Аг) минимальное число образцов взяли равным 21 (количество исследованных проб по локусу ОММЮ37 у

тайменя.

ОММ1050

ОпеЮ9

ОММЮ37

ОХехо О.пегка О.Мйолуйсйл Омытой 5.!еи:огяаеп&

О^огЬмсЬа О.к/ЬиКк О.тук.'а 5 .а№лп Р.репу!

О.пегка О.&Ьащ'Чспа О.псиои ¿¿еисотаепк

ОмоЛииЬа О.ЫйиЬЛ О. ту к/а $.ЫЬиз Р.рагу<

Рисунок 3.1. Полиморфизм и интервал размеров аллелей микросателлитных локусов лососевых рыб

ОпеЮЗ

01x102

ОкС68

ОкИО

Рисунок 3.1. (Продолжение) Полиморфизм и интервал размеров аллелей микросателлитных локусов лососевых рыб.

Идентификация лососевых рыб с помощью разработанных микросателлитов

Исследованные нами локусы и обнаруженные по ним различия в полиморфизме оказались в определенном смысле «оптимальными» для идентификации лососевых рыб: на их основе можно проводить определение видовой принадлежности, идентификацию образцов на внутривидовом уровне и использовать для популяционно-генетических исследований.

Для видовой идентификации хорошо подходят маркеры с минимальной внутривидовой изменчивостью, особенно мономорфные - как, например, локус ОММ1050: с его помощью однозначно различаются виды для большинства попарных сравнений (табл. 3.3. и З.4.). В частности, локус ОММ1050 разделяет все виды тихоокеанских лососей, кроме нерки и чавычи, которые в исследованных выборках оказались мономорфными по идентичному аллелю.

Однозначные межвидовые различия имеются не только по локусам с малой внутривидовой изменчивостью, но и по локусам с хорошо выраженным внутривидовым полиморфизмом, так что в целом в исследованных выборках каждая пара видов различалась по трем или более маркерам (табл. З.4.). Например, нерка и чавыча взаимоисключаются по пяти локусам, а кижуч и нерка — по всем исследованным маркерам. Эти данные были успешно применены для конкретных практических целей, в частности для идентификации видового спектра лососей в пище тихоокеанских косаток, а так же для идентификации гибридов лососевых рыб.

Наличие полиморфных маркеров позволяет провести внутривидовую идентификацию биологических образцов. Например, можно рассмотреть возможность индивидуализации — ответить на вопрос происходит ли тестируемый биологический образец от данной рыбы или получены ли разные биологические образцы от одной и той же особи. Если два биологических образца имеют различные генотипы хотя бы по одному полиморфному маркеру, то они, очевидно, принадлежат разным особям. Напротив, доказательство индивидуальной идентичности биологических образцов не является 100%-м, даже если их генотипы совпадают по всем исследованным локусам и потому дается в виде вероятностей возможных версий. Одной из мер способности маркеров индивидуализировать образцы может быть вероятность Рс случайного совпадения генотипов двух произвольно выбранных особей. Вероятность эта тем меньше, чем выше полиморфизм идентифицирующих локусов. Для исследованных нами маркеров идентифицирующая способность удовлетворительна для индивидуализации биологических образцов для каждого из исследованных нами видов (табл. 3.6), поскольку вероятность Рс оказалась достаточно малой даже для тайменя, чья внутрипопуляционная изменчивость невелика (табл. 3.2).

Таблица 3.3. Пределы вариабельности размеров аллелей в исследованных выборках (минимальные/максимальные размеры аллелей в числе нуклеотидных пар)

Вид Локусы

ОММ1050 ОпеЮ9 5'¡а197 ОпеЮЗ ОММЮ37 0/5/02 СНзввв ОкИО

0. кеШ 155 93/137 125/131 114/154 169/177 148/208 166/298 98/246

О. ^огЬшска 139 109/177 123/187 178/286 173/185 224/392 138/222 182/298

О. пегка 152 105/149 107 278/326 205/213 314 125/137 218/298

О. ^¡ШсИ 160/164 85 109 98/102 189/193 148 170/270 102/178

0. 1$ка\чу1$ска 152 89 171/291 102/110 185/193 194/330 187/255 170/342

О. таяои 177/317 81/109 101/125 106/142 177/209 116/224 120/212 94/194

О. тук ¿гс 161/185 89 109/113 102/110 209/253 487/507 174/206 102/158

¡еисотаетз 144 93/109 113/121 86 187 164/212 153/229 158/210

5. а1Ьш 144 85 117 81/85 174/190 148/412 133/233 135/291

Р. реггуч 155 85 106 78 203/255 256/272 129 146/186

Примечание 1. Мономорфные локусы указаны размером единственного обнаруженного аллеля в исследованной выборке.

Примечание 2. Основная внутривидовая изменчивость основана на различиях между размерами аллелей кратными четырем парам нуклеотидов во всех локусах, кроме 8$а197. В этом локусе тетрануклеотидные различия изменчивость наблюдалась у горбуши и микижи, а динуклеотидные —у кеты, симы и кунджи; у чавычи аллельная изменчивость по локусу 8$а!97 комплексная: как с тетра-, так и с динуклеотидными различиями в размерах аллелей.

Таблица 3.4. Локусы, по которым сравниваемые пары видов однозначно различались в исследованных выборках.

0. ке!а О. gorbuscha О. пегка О. ЬяШсИ 0. иИамунсИа 0. тазои О. туИзя 5.1еисотаетз X а/Аш

0. &огЪюсЬа 146*

О.пегка 134567 13567

0. ЫшсИ 12345 1234568 12345678

0. Чкаи/у^ска 1234567 12467 23457 12367

0. тазои 167 1478 134678 1467 12367

0. туккха 123456 1234568 1234678 1256 135678 267

5. кисотаетз 13457 134567 1345678 1234567 1234567 1457 124567

а/Ьм 1234578 1234578 1234568 134578 12345678 145678 12345678 2458

Р. реггу! 234567 123457 12345678 134567 1234567 134567 1234567 1234567 134578

* означает, что данная пара видов взаимно исключаются полокусам 0тт1050, ОпеЮЗ и 0(5102, закодированным как 1,4 и 6; кодировкалокусов: ОММ1050 (1), ОпеЮ9 (2), 8за197 (3), ОпеЮЗ (4), ОММЮ37 (5), 0к102 (б), 0/^065 (7), ОкИО

(8).

Разработанные нами универсальные праймеры. и полученные результаты уже имеют непосредственное применение для решения популяционно-генетических проблем. В частности, с целью повышения точности популяционной идентификации кеты, помимо ранее разработанных десяти микросателлитных локусов, оказались востребованными изученные нами локусы ОММЮ37, 01я102 и ОкИО (Афанасьев и др., 2011). Эти же локусы были использованы для популяционных исследований сахалинского тайменя (Шитова и др. 2012). В настоящее время исследованные нами микросателлиты привлечены также для широких популяционно-генетических исследований и других видов лососевых рыб - нерки (Рубцова и др. 2013) и кунджи (Афанасьев и др. 2013). В будущих исследованиях важным шагом в развитии изученных нами маркеров в целях популяционных приложений является расширение географии выборок для более полного охвата видового спектра аллелей и оценки частот редких и частых аллелей в популяциях лососевых рыб.

Таблица 3.6. Идентифицирующая способность исследованных микросателлитных маркеров (Р,)

Вид Рс Вид Рс

О. ке1а 1.0-10"8 О. таБои 8.910-11

О. gorbuscha 7.9-10'13 О. туИ$з 5.7-10-6

О. пегка 9.2-10"6 5. 1еисотаетз 1.1-10-5

О. ИБШСИ 9.3-10"5 5. аПзия 2.1-10-6

О. 1зка\уу1$ска 2.2-10'9 Р. реггу1 4.4-1

Эволюция микросателлитных локусов лососевых рыб

Посредством прямого секвенирования аллелей данных микросателлитов у исследуемых видов, были выявлены значительные различия в их структуре. Наши исследования подтверждают, что эволюция микросателлитов - это сложный комплексный процесс, включающий в себя, помимо микросателлитных мутаций, также точковые мутации и протяженные делеции и инсерции.

При сравнении структуры локуса ОпеЮЗ у молодых видов рода ОпсогНупскш, таких как горбуша и нерка с сахалинским тайменем (род РагаИиско), который является наиболее древним среди исследуемых видов видно, что в ходе эволюции происходит развитие микросателлита от простой короткой

омт

ОпеЮЗ

f

ir ч:

ч:

к

аыа (AGAT),.« г- аь*> ТГТА(ТСТА)пТТААТСГА(ТСАТ^1ТСГТ

О, gorbusdu (АОАТ)„ JL ТТТА(ТСГА)пТСААТСГА(ТСА'1>1'11."П'

<Х nerka (AQATV„ Jl— О.лвЬi (1ХЛА^ТСТСТСТАТТААТОСА^1ХЛА^1ТААТСТАССАТ(ГСАТ^оТСТТ

аигтЛ (AGAT), (AGAT5, a baaeft ТТТАСПЛА^ТТААТСТАСГСА^ТСГГ

аЫикцЫЛа L- аЬЫгшуЬсЬа ТТТАТССАС1СТА>,ТГААТСТАС1САТ)МТСТТ

(X »акт (АОАТТи -c О. mason ТТТА(ТСТА)пТТААТСГА(ТСА'1>ТСТТ TTTA(TCTA),TTAATCTA(TCATImTCTT ' '

ацукЬг (AGA1%AAAT amrtbs

S ЫЬт (АОАТЪ -c Saba TTTATCTACTCAl^TCAC

ИююжатЬ (AGAT^ SIoomoII ТТТА(ТСТА)^ТСАТ)5

Л Р*Ы (AGAT), -c P.ptrryi TTTATCTAfTCAT),

ЯгЛг (AGAT), ¡Lacier ТТТАТСТА(ТСАТ%

OMMI037

О. lata (GA)sGQ(OAAA)aCGAAG>!OAAA

a gorbada (QA>lOO(GAAA)iTAAA(GAAA)jQAAOQAAA(GAAa)jGAAA a мгки (GA)5QO(QAAA)mSAAA(QAAA)jQAAO(QAAA)s(QAAG)j(GAAA)2 a timft* (GA)5GG(GAAA)t.5GAAGGAAA!0<3AA(GAAA)^JAAGGAAA O.Ohawytxha (GA)5GG(GAAA)«GAAG(GAAA)3GGAA(GAAG)iGAAA a живом (GA)sGG(GAAA)m,GAAC(GAAA)4GAAGGAAA a mykta (GA)sGG(GAAAV11GGAA(GAAA)j(GAAG))OAAA X оОш (GA)5OG(GAAAV4GGGAAGAAO<3AAAOGAAGGAAA

S-kacomaab (GA)j<3QGG(aAAA),GGAAGGAAAGAAGGAAA P./wryi (QA)/KJ(GAAA)0.j50AAG(GAAA)J(QAAG),GAAA

& ja&r (GA)5GG(GAAA>I(GAAG>jGAAA

Рисунок 3.2. Эволюция микросателлитных локусов лососевых рыб (Данные о топологии и направлении эволюции лососевых рыб заимствованы из исследований (Crespi, Fulton, 2003)).

последовательности, содержащей небольшое количество повторов, до более сложного микросателлита, имеющего высокий уровень полиморфизма (рис. 3.2., б).

На примере локуса ОММЮ37 видно, что напротив более древние эволюционные линии содержат более длинные совершенные повторы, а благодаря накопившимся по ходу эволюционного процесса точковым мутациям происходит деградация или полная утрата повторяющейся последовательности у более молодых видов (рис. 3.2., в). Таким образом, в работе наглядно продемонстрирована предложенная некоторыми авторами концепция жизненного цикла микросателлита от его «рождения» до полной деградации («смерти»).

Структура некоторых локусов по ходу эволюционного процесса практически не претерпевает никаких изменений, например это касается локуса ОпеЮ9 (рис. 3.2., а). Интересно, что несмотря на отсутствие точковых мутаций, как основного фактора лимитирующего рост количества повторов, полиморфизм локуса по количеству повторов в зависимости от вида демонстрирует существенные различия.

Филогенетический анализ микросателлитных локусов лососевых рыб

Кроме упомянутых мутационных изменений в самих микросателлитах, также в достаточным количестве обнаружены информативные для филогенетического анализа единичные нуклеотидные замены в уникальных фланкирующих регионах. Используя дистанционные методы построения филогенетических деревьев, а также методы анализа дискретных признаковнами были рассмотрены различные варианты топологии исследованных видов (Рис. 3.3. -3.4.).

Наши исследования показывают, что среди исследованных нами видов, представители рода Oncorhynchus образуют отдельную монофилетическую группу по отношению к представителям родов Salvelinus, Salmo, Parahucho. Однако, согласно многим данным, полученным на основании филогенетического анализа различных нуклеотидных последовательностей митохондриальной и ядерной ДНК, род Oncorhynchus был объединен в одну группу с родом Salvelinus (Crespi, Fulton, 2003, Crete-Lafreniere et al., 2012). Полученные же нами данные совпадают с данными анализа морфологических и кариологических признаков (Глубоковский, 1995, Викторовский и др., 1985).

Внутри рода Oncorynchus расположение видов кета горбуша и нерка, а также чавычи и кижуча соответствует общим представлениям о топологии рода Oncorhynchus. Что же касается позиции симы, то она располагается ближе к эволюционной линии, в состав которой входит микижа, что соответствует данным, полученным на основании филогенетического анализа ядерной и митохондриальной ДНК (Crespi, Fulton, 2003).

gg,--O.gorbuscha

I--O-kela

--O.nerks

I--O.Kisutch

53 i--O.tahawylsha

--O.masou

--0. my Kiss

66;--P.perryi

i--S.saar

j--S anus

g^i--S.kiucomaenia

Рисунок 3.3. Филогенетическое дерево, построенное с помощью метода максимального правдоподобия (ML - maximum likelihood). Эволюционные расстояния определены по модели Кимуры. Цифрами обозначены результаты "bootstrap "-анализа (значащими признаются

значения больше 50).

■ О.дэФи«'» < Окйэ

• 0.г***а Okisutch Otshwytsha

■ Q.snasou

P.pewyi SsaNr S abas

• S.teccomatfss

Рисунок 3.4. Филогенетическое дерево, построенное с помощью метода присоединения соседей (NJ- Neighbor-joining method). Эволюционные расстояния определены по модели Кимуры. Цифрами обозначены результаты "bootstrap"-анализа (значащими признаются

значения больше 50).

выводы

1. Разработаны универсальные праймеры, с помощью которых надежно амплифицируются восемь микросателлитных локусов у лососевых рыб родов Oncorhynchus, Salvelinus, Parahucho семейства Salmonidae. Уровень полиморфизма и интервал размеров аллелей данных микросателлитов значительно варьируют среди исследованных видов.

2. Обнаруженные межвидовые различия и уровень внутривидового полиморфизма по исследованным микросателлитным локусам позволяют решать задачи внутри- и межвидовой идентификации лососевых рыб.

3. Определены нуклеотидные последовательности изученных микросателлитных локусов, как повторов, так и фланкирующих регионов у видов семейства Salmonidae. Их филогенетический анализ показал четкую монофилию рода Oncorhynchus по отношению к родам Salvelinus, Salmo и Parahucho.

4. Филогенетический анализ внутри рода Oncorynchus выявил общеизвестную триаду «кета-горбуша-нерка», к которой примыкает кластер «чавыча-кижуч», что соответствует общим представлениям о топологии рода Oncorhynchus. Однако, в отличие от ряда других ДНК-исследований, наши данные показали, что сима располагается ближе к микиже, образуя вместе с ней более далекий кластер.

5. Структура микросателлитов значительно различается даже у филогенетически близких видов. Эволюция микросателлитов представляет собой сложный ненаправленный процесс: совокупность микросателлитных мутаций, точковых замещений и протяженных делеций/инсерций, приводящих как к образованию новых типов повторов, так и к деградации и возможной утрате микросателлитов.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Животовский Л.А., Е.Г. Шайхаев, М.В. Шитова. (2013) Идентификация биологических образцов лососевых рыб по микросателлитным маркерам с использованием идентичного набора ПЦР-праймеров // Биология моря. 5(6) (в печати).

2. Шитова М.В., A.A. Юрченко, Е.Г. Шайхаев, Л.А. Животовский. (2012) панель микросателлитных локусов для популяционных исследований сахалинского тайменя Parahucho penyi (Brevoort). Генетика 48: 976-982.

3. Афанасьев П.К., Г.А. Рубцова, М.В. Шитова, Е.Г. Шайхаев, и Л.А. Животовский. (2011) Расширение набора микросателлитных маркеров с целью повышения точности идентификации кеты (Oncorhynchus keta Walbaum) // Генетика 47: 1473-1480.

4. Афанасьев К.И., Г.А. Рубцова, Е.Г. Шайхаев, Л.А. Животовский. (2013) Микросателлитная изменчивость кунджи Salvelinus leucomaenis Сахалинской области // Генетика 49, №9 (в печати).

5. Животовский Л.А., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Шитова М.В., Малинина Т.В., Прохоровская В.Д., Ракицкая Т.А., Кордичева С.Ю., Афанасьев П.К., Шайхаев Е.Г., Юрченко A.A., Тетерина A.A. Исследования популяционной структуры лососевых рыб Дальнего Востока: фундаментальные и прикладные аспекты. 64-65 с. Проблемы популяционной и общей генетики. Материалы международной конференции, посвященной памятной дате — 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова. 14-16 ноября 2011, Москва, Россия.- М.: Цифровичок, 2011. 212-213.

6. Шайхаев Е.Г. Сравнительное изучение полиморфизма микросателлитных локусов тихоокеанских лососей // Воспроизводство естественных популяций ценных видов рыб. Тезисы докладов Международной конференции. - СПб. : Нестор-История, 2010. 235- 236 с.

7. Шайхаев Е.Г. Эволюция микросателлитных локусов лососевых рыб // Популяционная генетика: современное состояние и перспективы. Материалы международной молодежной конференции, посвященной памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова. 17-18 ноября 2011, Москва, Россия,- М.: Цифровичок, 2011. 212-213.

Подписано в печать 18.04.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1662. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шайхаев, Евгений Гаджирамазанович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ. Н.И. ВАВИЛОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201363535 На правах рукописи

Шайхаев Евгений Гаджирамазанович

Сравнительное изучение микросателлитной изменчивости лососевых рыб

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Животовский Лев Анатольевич

Москва - 2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................8

1.1. Тихоокеанские лососи, систематика и происхождение..................................8

1.2. Микросателлиты: общее представление........................................................11

1.3. Распространение микросателлитов в геномах разных организмов.............14

1.4. Функции микросателлитов в геноме..............................................................17

1.5. Мутационный уровень и факторы, влияющие на мутационную динамику микросателлитов........................................................................................................21

1.6. Механизм микросателлитных мутаций..........................................................23

1.7. Происхождение микросателлитов в геноме...................................................26

1.8. Модели микросателлитных мутаций..............................................................28

1.8.1. Модель бесконечного числа аллелей (Infinite Alleles Model-IAM).......28

1.8.2. Модель пошаговых мутаций (Stepwise Mutational Model - SMM)........29

1.8.3. Двухфазная модель (Two-Phase Model - TPM).......................................29

1.8.4. Балансовая модель (Proportional Slippage/Point Mutation - PS/PM)......30

1.9. Гомоплазия микросателлитов..........................................................................30

1.10. Перекрестная амплификация........................................................................31

1.11. Филогенетические исследования.................................................................33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................35

2.1. Биологический материал..................................................................................35

2.2. Анализ микросателлитной ДНК......................................................................38

2.3. Анализ генетических данных..........................................................................40

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ......................42

3.1. Перекрестная амплификация микросателлитных локусов лососевых рыб 42

3.2. Сравнительное изучение полиморфизма микросателлитных локусов.......44

3.3. Тетрануклеотидная изменчивость исследованных локусов........................52

3.4. Внутривидовое разнообразие..........................................................................53

3.5. Идентификации лососевых рыб с помощью микросателлитов...................54

3.5.1. Межвидовая идентификация.....................................................................57

3.5.2. Индивидуальная идентификация..............................................................63

3.5.3. Популяционная идентификация и популяционные исследования.......65

2

3.6. Эволюция структуры микросателлитных локусов лососевых рыб.............66

3.6.1. Эволюция микросателлитного локуса &а797.........................................67

3.6.2. Эволюция микросателлитного локуса ОпеЮЗ........................................69

3.6.3. Эволюция микросателлитного локуса ОММЮ37...................................74

3.6.4. Эволюция микросателлитного локуса ОММ1050...................................77

3.6.5. Эволюция минасателлитного локуса ОкеЗ..............................................81

3.6.6. Эволюция микросателлитного локуса 0^702........................................85

3.6.7. Эволюция микросателлитного локуса ........................................85

3.6.8. Эволюция микросателлитного локуса ОпеЮ9........................................87

3.6.9. Эволюция микросателлитного локуса ОкИО...........................................87

3.7. Общие особенности эволюции исследованных микросателлитных локусов ..............................................................................................................:..............88

3.8. Филогенетический анализ исследованных видов по структуре микросателлитов........................................................................................................94

3.8.1. Фланкирующие регионы........................................................................94

3.8.2. Внутрилокусные перестройки...............................................................98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................100

ВЫВОДЫ..............................................................................................................102

Список сокращений.............................................................................................103

Список литературы..............................................................................................104

Приложение 1.......................................................................................................132

Приложение 2.......................................................................................................147

ВВЕДЕНИЕ

Лососевые рыбы являются ценнейшим водным биоресурсом российского Дальнего Востока. Природные популяции тихоокеанских лососей широко распространены в бассейне Тихого океана и имеют разные по протяженности нерестовые ареалы на азиатском и северо-американском континентах.

В настоящее время как в России, так и за рубежом, лососевые рыбы, в частности тихоокеанские лососи рода Oncorhynchus, являются привлекательным объектом для многих генетических исследований. Например, имеется большое количество данных, полученых на основании различных признаков, в том числе анализа ядерной и митохондриальной ДНК, которые затрагивают такие основополагающие вопросы как происхождение, эволюция, филогения и систематика лососевых рыб (Oleinik, 2000; Shed'ko et al., 2002; Crespi, Teo, 2002; Phillipsa, 2001; Crespi et al., 2003; Matveev et al., 2007; Thomas, Beckenbach, 1989; Murata et al.,1992; Takasaki et al., 1994; Murata et al., 1995; Hamada et al., 1996; Jong-Young Lee et al., 1998; Oakley et al., 1998; Murata et al., 1995; Matveev, Okada, 2008; Ying Wang et al., 2011, Глубоковский, 1995).

Лососевые рыбы образуют сложные многоуровневые системы нерестовых популяций, в связи с этим они представляют большой интерес для изучения их популяционно-генетической структуры (Beacham et al., 1999; Beacham et al. 2008; Gharrett et al., 2007; Banks et al., 2000; Chen et al., 2005; Yoon et al., 2005; Афанасьев и др., 2006; Small et al., 2006; Хрусталева, 2007; Афанасьев и др., 2008; Животовский и др., 2008, 2010; Каев и др., 2008; Рубцова и др., 2008; Шитова и др., 2009).

Последние два десятилетия наиболее популярными маркерами для популяционно-генетических исследований являются микросателлиты -последовательности, состоящие из большого количества коротких повторов и отличающиеся высоким уровнем аллельного полиморфизма (Ellegren, 2004;

Bhargava, Fuentes, 2009). Микросателлиты, ввиду высокого уровня полиморфизма, обильного распространения в геноме, простоте генотипирования и относительно невысокой стоимости анализа, приобрели большую популярность в различных областях биологии (Chistiakov et al., 2005). На их основе исследованы популяции человека, растений, животных. Если говорить об исследованиях лососевых рыб в нашей стране, то по данным о микросателлитах подробно описана популяционная организация одного из важнейших видов тихоокеанских лососей - кеты Дальнего Востока, а также заложены принципы решения таких важных прикладных задач, как генетическая идентификация стад и сертификация промысла лососей (Животовский и др. 2010).

Микросателлиты могут амплифицироваться не только у тех видов, у которых они были идентифицированы, но и у других филогенетически близких видов (Ellegren, 2004). Важно подчеркнуть возможность амплификации у разных видов с использованием одной и той же пары праймеров - т.н. перекрестная амплификация (трансферабельность). Хотя возможность перекрестной амплификации снижается с увеличением эволюционной дистанции между видами, тем не менее, при ее успешности можно получить универсальные праймеры сразу для нескольких видов. Такие универсальные праймеры могут быть полезными для решение некоторых прикладных задач.

Микросателлиты, вне зависимости от вида, могут сохранять свои свойства

высоко-полиморфных генетических маркеров. В связи с этим, универсальные

праймеры позволяют расширить уже известный набор локусов, избавив

исследователя от сложных и продолжительных по времени работ по

обнаружению и разработке новых локусов для популяционно-генетических

исследований и индивидуальной идентификации. В свою очередь, полиморфизм

одних и тех же локусов в зависимости от вида может отличаться - вплоть до

того, что локус, проявляющий высокий уровень полиморфизма у одного вида,

5

может быть мономорфным у другого, даже филогенетически близкого вида (Morin et al., 1998; Ellegren et al., 1995). Обнаруженные между видами различия в полиморфизме, а также интервалах размеров аллелей, могут использоваться для целей внутривидовой идентификации и выявления межвидовых гибридов (Routtu et al., 2003; Vanhaecke et al., 2012).

В связи с тем, что промысел и воспроизводство ценных видов лососевых рыб постоянно увеличивается, разработки генетических маркеров для их идентификации на видовом и внутривидовом уровне становятся особенно актуальными.

Микросателлитная изменчивость на межвидовом уровне характеризуется не только различиями в количестве повторов, но также и изменениями структуры повторов и фланкирующих регионов. Лососевые рыбы представляют большой интерес для филогенетических исследований. Несмотря на большое количество данных, полученных с помощью анализа различных признаков, как морфологических так и молекулярных, некоторые вопросы, касающиеся филогении лососевых рыб, остаются до конца не выясненными (Crespi, Тео, 2002; Crete-Lafreniere et al., 2012). С помощью универсальных праймеров, уже посредством секвенирования аллелей микросателлитных локусов, можно изучить их структуру у разных видов. Данные о структуре микросателлитов могут использоваться для филогенетических исследований, направленных на реконструкцию эволюционного процесса и установления родственных связей между таксонами (Zardoya et al., 1996; Martin et al., 2001; Zhao Jun Shao, Rivais et al., 2011).

Кроме того, сравнительное изучение структуры микросателлитов может внести вклад в понимание сложных мутационных процессов, происходящих в них в ходе эволюции (Taylor et al., 1999; Angers et al., 1997).

Целью данной работы является изучение изменчивости

микросателлитных локусов у разных видов рыб семейства Salmonidae и

6

применение полученных данных для эволюционных исследований, а также решения прикладных задач идентификации. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать праймеры для перекрестной амплификации микросателлитов у разных видов лососевых рыб российского Дальнего Востока.

2. Провести фрагментный анализ выбранных нами локусов у исследуемых видов и оценить их полиморфизм.

3. Выявить локусы наиболее подходящие для внутри- и межвидовой идентификации лососевых рыб и проверить их на конкретных примерах.

4. Секвенировать аллели микросателлитных локусов и выявить филогенетические отношения исследуемых видов лососевых рыб по данным маркерам.

5. Определить характер эволюционных изменений в микросателлитных локусах: точковых замен, микросателлитных мутаций, протяженных делеций/инсерций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Тихоокеанские лососи, систематика и происхождение

Тихоокеанские лососи рода Oncorhynchus являются чрезвычайно важной группой видов, занимающей огромный ареал бассейна Тихого океана азиатского и американского континентов. По существующей классификации тихоокеанские лососи вместе с представителями родов Salmo, Salvelinus, Brachymystax, Hucho и Parahucho принадлежат к подсемейству Salmoninae семейства Salmonidae, отряд Salmoniformes (Nelson, 1984; www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy). К роду тихоокеанских лососей, обитающих на территории российского Дальнего Востока, относят кету О. keta Walbaum, горбушу О. gorbuscha Walbaum, нерку О. nerka Walbaum, чавычу О. tshawytscha Walbaum, кижуча O.kisutch Walbaum, симу О. masou Brevoot и микижу О.ту kiss Walbaum; последнюю раньше выделяли в отдельный род тихоокеанских Salmo -Parasalmo (Nelson, 1984; Vladykov, 1963; Behnke, 1972; Дорофеева, 1985, Глубоковский, Глубоковская, 1981; www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy).

Считается, что род Oncorhynchus произошел от предка тихоокеанских Salmo (О. mykiss), по мнению Нива, конкретно от предка современного вида Oncorhynchus mykiss gairdneri (Salmo gairdneri) (Neave, 1958). По мнению Дорофеевой предковой формой мог быть эндемик Охотского моря близкий к О. mykiss (Дорофеева, 1985). Исследуя проблему эволюции тихоокеанских лососей, Neave и Глубоковский пришли к выводу, что благоприятные условия для дивергенции и быстрого видообразования в этом роде возникали в период плейстоценовых регрессий океана, вызывавших географическую изоляцию дальневосточных морей, а также в результате похолодания климата и оледенений, приводивших к значительным разрывам ареалов (Neave, 1958; Глубоковский, Глубоковская, 1981). Как считают Глубоковский и Глубоковская, ареалы смещались на юг, что способствовало обособлению

азиатских и американских стад. После разделения видов, внутривидовая дивергенция также была непрерывно связана с аналогичными процессами, происходящими в позднем плейстоцене и создавшими длительную изоляцию отдельных частей вида в ледниковых рефугиумах (Глубоковский, Глубковская, 1981; Waplesetal, 2007).

Филогения лососевых рыб является предметом интенсивных исследований. На основании самых разнообразных признаков, как морфологических так и молекулярных, с использованием различных методов филогенетического анализа, было получено множество вариантов филогенетических взаимоотношений тихоокеанских лососей и лососевых рыб в целом.

Из всех них следует, что среди представителей рода Oncorhynchus

наиболее филогенетически молодыми, является триада видов {нерка, кета, и

горбуша}, причем кета и горбуша по многим признакам является наиболее

эволюционно продвинутыми. По некоторым данным дивергенция данных видов

произошла 6-8 миллионов лет назад. Соседнюю с ними линию образуют чавыча

и кижуч. (Oleinik et al., 2000; Shed'ko et al., 2002; Crespi, Teo, 2002; Phillipsa,

2001; Matveev et al., 2007; Thomas, Beckenbach, 1989; Murata et al., 1992;

Takasaki et al., 1994; Murata et al., 1995; Hamada et al., 1996; Jong-Young Lee et

al., 1998; Oakley et al, 1998; Murata et al., 1995; Matveev, Okada, 2008; Ying,

Wang et al., 2011; Waples et al, 2007; www. time tree. org). Противоречия имеются в

связи с позицией симы. На пример, в работе Crespi and Fulton, согласно

объединенным данным по ядерным и митохондриальным генам, сима образует

сестринскую кладу с микижей и лососью Кларка (рис. 1.1.(в)) (Crespi, Fulton,

2003). В исследованиях Crete-Lafreniere et al, филогенетический анализ ядерных

и митохондриальных генов методом максимальной экономии показал, что сима

образуют отдельную эволюционную линию по отношению ко всем остальным

видам рода Oncorhynchus (рис. 1.1. (а)). Филогенетический анализ методом

9

максимального правдоподобия показал, что сима располагает внутри рода ОпсогЬ-упсЬиз отдельной линией, ближе к триаде кета, горбуша, нерка (рис. 1.1.(6)) (Сге1е-Ьай-ешеге е1 а1., 2012). Согласно морфологическим признаком сима входит в состав кластера {кижуч, чавыча} (Глубоковский, 1995).

Sr a'ptovt

tr malm* I»4i

1» еьпИчШи* <191 Jf Гопьп!*

\-

I 'OP |-

toe I С —f*l*tvt I Ctfapflfec I-с nfoi m

IBS

(в)

Jti

54

ft:

uu— О - О

O.myki»» OcltrVi O.masou O.tshawytscba O.kisutch О floituKha ket*

О. norki

12«- Sv.alpinus

aj I '- Sv.milmj

КЯЯ— Sw.fontlnaU*

Sv.na may tush Sv confluervtus Sv.ltucomaenls S.salar S orhidana S trutta

H.perryi

C.lavanctus

H.hucfro

Li.lonok

(Г)

у сЬив almoo I— ptakulmou

tn—«

1

cbioook salmoo cofeoaalmoa eel bead trail

(Д)

• brown trout

■ Atlantic nirson

• Doll j Virden

• white-ipotted dur

• Japanese badua

%7 и sj л* SJ o.: v

Рисунок 1.1. Филогенетические исследования лососевых рыб. (а) - филогенетический анализ ядерных и митохондриальных генов методом максимальной экономии (Crete-Lafreniere et al., 2012), (б) - филогенетический анализ ядерных и митохондриальных генов методом максимального правдоподобия (Crete-Lafreniere et al., 2012), (в) - филогенетический анализ ядерных и митохондриальных генов методом Байеса (Crespi, Fulton, 2003), (г)-филогенетических анализ SINE-элементов (Murata, et al, 1995), (д)- филогенетический анализ 45 морфологических признаков методом взвешанной средней связи (Глубоковский, 1995).

Также имеются противоречия в связи с позицией рода Oncorhynchus по отношению к другим родам лососевых рыб. Анализ SINE-элементов показал, что, сестринскую с родом Oncorhynchus кладу формирует род Salmo (рис. 1.1 (г))(МтаХа et al., 1995). Согласно большинству данных, в частности анализа ядерных и митохондриальных генов, род Oncorhynchus образует сестринскую кладу с родом Salvelinus (Crespi, Fulton, 2003; Crete-Lafreniere et al., 2012) (рис.

1.1. (а),(б)). Данные по морфологическим признакам показывают, что род Oncorhynchus, образует отдельную монофилетическую кладу по отношению к другим родам (рис. 1.1 (д)) (Глубоковский, 1995). О монофилии рода Oncorhynchus, также свидетельствуют и кариологические признаки (Викторовский и др., 1985).

В ещё большей степени тихоокеанские лососи являются интересным объектом для генетических исследований из-за их сложной внутривидовой популяционной структуры (Коновалов, 1980; Алтухов, 1974; Алтухов и др., 1997). Особенности формирования популяционной структуры лососей определяются их биологией. Мигрируя в разном возрасте из мест морского нагула в различные географические регионы, а затем, расходясь там по нерестилищам озер и рек, они создают сложную пространственную и временную систему нерестовых популяций. Изучение генетических характеристик стад лососей позволяет решить фундаментальную проблему выявления их популяционно-генетической структуры и в то же время создает фундамент для проведения практических мероприятий по воспроизводству и прогнозированию их численности, времени и мощности подходов.

1.2. Микросателлиты: общее представление

Среди генетических маркеров, использующихся для популяционно-генетических исследований, большую популярность приобрели микросателлиты (Goldstein, Schlotterer, 1999; Животовский и др., 2006). В

последние годы как в России, так и за рубежом, с помощью микросателлитов проведены круп