Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микросателлитная изменчивость кеты

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Микросателлитная изменчивость кеты"

На правах рукописи

РУБЦОВА Галина Алексеевна

МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КЕТЫ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ии3452744

Москва-2008

003452744

Работа выполнена в лаборатории генетических проблем идентификации

Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Афанасьев Константин Иванович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

Рубанович Александр Владимирович

Кандидат биологических наук

Семенова Анна Викторовна

Ведущее учреждение

Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Защита состоится «_»

года в «,

jjtth,

/ ( » ча

» часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.З Факс: (499) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

у7"

Полухина Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тихоокеанские лососи рода Oncorhynchus имеют большое экономическое значение и характеризуются сложной популяциошюй организацией (Коновалов 1980, Алтухов и др., 1997). Для решения теоретических проблем популяциошюй структуры вида и прикладных задач генетической идентификации и сертификации стад лососей важным является наличие информации о генетических особенностях исследуемых стад, позволяющей различать их популяциомные компоненты.

Одним из основных видов тихоокеанских лососей на Российском Дальнем Востоке является кета О. keta Walbaum. Кета - второй по численности вид тихоокеанских лососей после горбуши на азиатской части ареала: нерестится по преимуществу в реках Сахалина, Южных Курил, охотоморского побережья материка, Камчатки. Пополнение запасов кеты идет как путем естественного воспроизводства, так и за счет искусственного разведения на лососевых рыборазводных заводах.

До недавнего времени в генетических исследованиях лососей, в т.ч. кеты, использовали аллозимные маркеры (Алтухов и др., 1997; Seeb et al., 2004; Варпавская, 2006; Салменкова и др., 2008,). Но их малый полиморфизм не позволял провести детальную дифференцировку популяций. В настоящее время наиболее перспективными для популяционно-генетических исследований являются маркеры ДНК, в особенности микросателлиты (Schlötterer, 1998; Brown and Epifanio, 2003; Животовский, 2006). Изучение микросателлитной изменчивости кеты только начинается. На основе анализа микросателлитных маркеров исследована структура популяций кеты отдельных рек Северной Америки, Китая и Японии (Yoon et. al., 2005; Scribner et. al., 1998; Chen J.-P. et. al., 2005; Small M.P. et. al., 2005). Было начато детальное изучение дифференциации популяций кеты, нерестящихся в реках Сахалинской области (Афанасьев и др., 2006, 2008; Рубцова и др., 2008), и кеты отдельных речных бассейнов о. Итуруп в связи с проблемами различения локальных стад этого лосося (Животовский и др., 2008).

Однако сравнительного анализа дифференцирующей способности микросателлитных и аллозимных маркеров и определения степени дифференциации стад кеты Российского Дальнего Востока по микросателлитам не проводилось. Цель и задачи исследования. Цель работы - сопоставить эффективность использования микросателлитных и аллозимных маркеров в популяционных исследованиях кеты, имея в виду их дифференцирующую способность и провести исследований по выявлению популяционно-генетической организации природных популяций на большом ареале с использованием маркеров с большей разрешающей способностью.

В связи с этим необходимо решить следующие основные задачи:

1. сравнить внутри- и межпопуляционную изменчивость кеты по микросателлитным и аллозимным маркерам;

2. изучить популяционную структуру кеты Российского Дальнего Востока с использованием микросателлитных маркеров;

3. оценить возможности идентификации стад кеты по микросателлитам в целях практического использования.

Научная новизна работы. Впервые показано, что внутри- и межрегиональная дифференциация популяций кеты по микросателлитным маркерам выше, чем по аллозимным. Впервые выявлена популяционная структура кеты по микросателлитным маркерам и исследована дифференциация популяций этого вида в различных регионах Дальнего Востока. В частности, показано, что существует две генетически сильно различающиеся группировки кеты: южно-Курильская и остальной части исследованного ареала. Показано, что наиболее информативные микросателлитные маркеры - разные для группировок кеты разных регионов и для разных уровней популяционной иерархии, что свидетельствует о том, что для более детального исследования кеты следует развивать больший набор микросателлитных маркеров.

Научно-практическое значение. Показано на примере кеты о. Итуруп, что популяции даже близко расположенных бассейнов различаются по микросателлитным маркерам, что может быть использовано для целей идентификации и сертификации стад. Различные экологические формы кеты (речная и озёрная) репродуктивно значительно изолированы друг от друга, что необходимо учитывать при организации рыбоводного процесса.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представлены на заседаниях Семинара «Популяционная и эволюционная генетика» (ИОГен РАН, 7 февраля 2007г. и 17 сентября 2008г.), 6-й Международной конференции по биоииформатике геномной регуляции и структуры (ВС118-2008, Новосибирск, ИЦиГ СО РАН, 22-27 июня 2008г.), Международной конференции «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб» (Санкт-Петербург, Ин-т цитологии РАН 10-12 сентября 2008г.), Международной школе-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (Санкт-Петербург, 10-13 ноября 2007 г.), Международной научно-практической конференции «Рациональное использование

пресноводных экосистем - перспективное направление реализации национального проекта «Развитие АПК» (Москва, 17-19 декабря 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации вышло из печати 7 статей в периодических журналах, опубликовано 5 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена па 131 странице машинописного текста, состоит из Введения, Обзора литературы (гл.1), главы 2 «Материалы и методы», результатов и обсуждения (главы 3 и 4), Заключения, Выводов, Списка литературы из 99 ссылок (50 на русском и 49 - на английском языках) и 3-х Приложений. Содержит 28 рисунков и 14 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Методика исследования микросателлитных и аллозимных маркеров. В

сравнительной части работы брали два типа образцов для генетического исследования кеты. Один - это кусочек мышцы и печени в целях изучения аллозимной изменчивости. Другой - кусочек ткани или органа, в основном края плавника для изучения микросателлитных маркеров.

Всего нами было изучено 40 микросателлитных локусов, описанных ранее для семги и лососевых рода Oncorhynchus и которые мы опробовали для популяционного изучения кеты. В ряде случаев при рекомендованных условиях ПЦР-продукт получен не был. Часть локусов оказались мономорфными. Среди локусов, показавших полиморфизм, некоторые (Oki2, ОИ13 и ОкИ8), судя по продуктам амплификации, являются дуплицированными, и выявляемый полиморфизм невозможно однозначно интерпретировать, поэтому в популяционном исследовании этим локусы не рассматривались. При использовании праймеров Okil амплифицируются два локуса, значительно отличающиеся по размеру и демонстрирующие независимую изменчивость. Предположительно, это может быть результатом дупликации с последующей дивергенцией двух локусов. В дальнейшем анализе учитывались оба локуса, обозначенные нами как Okil-] (176-276 b.p.) и Oki¡-2 (90-102 b.p.). Фенотипы локуса OiielOl у всех исследованных рыб показали аналогичную изменчивость таковым ОпеЮЗ, отличаясь лишь по величине амплифицированпых фрагментов на одно и то же значение (18 пар нуклеотидов). В дальнейших анализах использовали микросателлитный локус ОпеЮЗ. Из локусов с выявленным полиморфизмом мы выбрали 10 локусов, оказавшимся наиболее надежными в наших исследованиях (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика выбранных микросателлитных локусов

Локус Повторяющаяся последовательность t° отжига Интервал аллельных весовых значений

Ssa20.19 (AC/TG)„ 60° 76-90

Ояо2 (GA)„ 58° 178-202

Ssa 197 (GT)nC(TG)„TC(TG)„A(GTGA)„ 56° 113-133

ОпеЮЗ (ATCT)nN 1 б(АТСТ)„ 56° 111-243

Ots3 (ТС), 48° 74-118

Okil (1 и 2) (CTGT)„ 54° 176-276/90-102*

ОпеЮ9 (TAGA)„ 56° 111-191

ОкеЗ (TCCCTCTCGTCTC)„ 56° 210-327

Оке! I (CA)„GA(CA)„ 54° 85-103

Выделение тотальной ДНК проводили стандартным методом из ткани мышц или плавников, зафиксированных спиртом (Маниатис и др. 1982). Был использован также способ выделения препаратов ДНК с набором реагентов Diatom DNA Prep 200 фирмы «ИзоГеп» (Россия).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе MJResearch РТС-100. Использовали готовые лиофилизированные смеси для ПЦР GenePakPCR Core фирмы «ИзоГен» (Россия). Инкубационная смесь 20мкл содержала буфер для ПЦР, 200мкМ каждого дезоксирибонуклеотида (dTTP, dCTP, dATP, dOTP), l,5mM MgCl2, 50нг геномной ДНК и ЮОнг специфического праймера. Реакцию начинали процессом денатурации в течение 2 мин. при 94° С, затем проводили 8 циклов, включающих 1 минуту денатурации ДНК-матрицы при температуре 94°С, 30 секунд отжига праймеров при Х°С и синтез новых цепей в течение 30 секунд при 72°С; затем следовал 21 цикл, включающий 30 секунд при 94°С, ЗОсекунд - Х°С и 15 секунд при 72°С; элонгация 3 мин. при 72° С. Х° -температура отжига для индивидуальной пары праймеров дана в таблице 1.

Аликвоты амплифицированных продуктов разделяли в вертикальном блоке 6% неденатурирующего полиакриламидного геля в 0,5х TBE буфере pH 8,0 (Маниатис и др., 1992) при ЗООв в течение 2-5 часов. Полученные электрофореграммы визуализировали путем окрашивания бромистым этидием и просмотром на ультрахемископе.

В качестве маркеров длин фрагментов использовали ДНК плазмиды рВг322, обработанную рестриктазой НаеШ, Hpall. Размеры аллелей по каждому локусу

определяли с использованием программы ID Image Analysis Software Version3,5 фирмы «Кодак».

Для четырех локусов были отработаны два мультиплекса: локус Опе№9, амплифицировался и анализировался одновременно с локусом Ssa20.I9, и локус ОкеЗ совместно с локусом Okel 1, для этого проведена модификация состава реакционной смеси и условий амплификации. А именно - количество праймеров более длинных локусов в смеси для амплификации было увеличено в полтора два раза. Также при проведении ПЦР-реакции было увеличено число циклов с 21-го до 25-ти.

Для изучения белкового полиморфизма брали пробы белых мышц и печени. Экстракты мышц готовили растиранием кусочка ткани в равном объеме PIPES-буфера, а печени - в фосфатном буфере с рН7.0 с дальнейшим центрифугированием при 14000об/мин при охлаждении. Электрофоретический аллозимный анализ проводили в крахмальном и полиакриламидном гелях с использованием нескольких буферных систем, описанных ранее и специфическим гистохимическим окрашиванием (Peacock et al. 1965, Ridgway et al. 1970, Show and Prasad 1970, Aebersold et al. 1987). Всего были проанализированы 12 полиморфных белковых локусов это: ESTD* LDH-A1*, PEPB-J*, PEPLT*, sMDH-Bl.2* inMEP-2*,G3PGH-2*, PGDH*, ALAT*, MPI*, mlDHP-1*, sAAT-1,2* обозначения, которых даны в соответствии с рекомендациями (Shaklee et al. 1990).

Электрофоретическое разделение аспартатаминотрансферазы (sAAT-1,2*), эстеразы-Д (ESTD*), маннозофосфатизомеразы (MPI*) и аланинаминотрансферазы (ALAT*) проводили в 7,5% ПААГ в системе трис-ЭДТА-боратного буфера с рН 8,3. Лактатдегидрогеназу (LDH-A1*) разделяли в 12% крахмальном геле в буферной системе Ridgway с рН8,1 для электродного буфера и рН8,5 - для гелевого буфера. В аминопропилморфолиновой системе (CAME) рН7,2 проводили электрофоретическое разделение малатдегидрогеназы (sMDH-Bl,2*), альфа глицерофосфатдегидрогепазы (G3PDH-2*), пептидаз (РЕРВ-1* и PEPLT*), изоцитратдегидрогеназы (IDHP*), маликэнзима (тМЕР-2*), 6-фосфоглкжонатдегидрогеназы (PGDH*).

Материал популяцпонных исследований. Всего было исследовано 89 выборок кеты Дальнего Востока - рис.1, (из них 29 выборки по аллозимным и микросателлитным локусам), взятых как из природных популяций, так и стад лососевых рыбоводных заводов (данные по лососевым рыбоводным заводам Сахалина и частично Итурупа предоставлены нам Шитовой М.В. и данные по аллозимной изменчивости за 20032004 год нам были предоставлены Салменковой Е.А.).

' г /fe-

Охотомороюе побережье

f|Ííe

¡g í I

J

р. Камчатка

Амур

Южная Камчатка

Сахалин

i

Итуруп •'Кунашир

Рис. 1. Места сбора биологических образцов кеты в целях исследования дифференциации по

микросателлитным маркерам (2003-2007гг.). Примечание: На Сахалине и Итурупе, а также в Магаданской области в каждой точке обычно собирали по несколько выборок в течение нескольких лет и повторно в течение сезона. Всего исследовано 89 выборок (в среднем - по 50 образцов на выборку) - более 4 тыс. рыб.

В нашем материале имеется две больших по числу выборок и по кластеризации группировки кеты: южнокурильская и «материковая» (куда мы включаем «северную» кету, т.е. кету северной части ареала - Магадана, Камчатки, Чукотки; к материковой кете мы также условно относим и кету о. Сахалин). Северная кета мало затронута искусственным воспроизводством, хотя как на восточной, так и западной Камчатке есть несколько рыборазводных заводов, и представляет интерес в плане естественной подразделенное™ составляющих её группировок. В отличие от неё, кета Сахалина (и отчасти кета южно-Курильского острова Итуруп) сильно затронута искусственным воспроизводством. Однако там ещё сохранились естественные популяции кеты. Поэтому мы также провели отдельно подробный анализ дифференциации кеты Итурупа, взяв для сопоставления данные М.В.Шитовой по микросателлитам популяций кеты Сахалина, воспроизводимых на рыбоводных заводах.

Для сравнения дифференцирующей способности микросателлитных и аллозимных маркеров, дополнительно генотипировали по аллозимам производителей кеты, взятых в период нерестового хода в 2003-2004 гг. на рыбоводных заводах Сахалина и Итурупа. Кроме того, поскольку стадо одного бассейна в каждом году может полно характеризоваться не одной выборкой, а лишь совокупностью выборок, взятых в течение всего нерестового хода, в октябре-ноябре 2006 г. мы провели подробный генетический стад кеты ЛРЗ Рейдовый и Курилка о. Итуруп, полностью покрывая основную динамику промыслового изъятия рыбы в заливах и время закладки икры на инкубацию на ЛРЗ - рис.2.

Для исследования экологической дифференциации было проведено сравнительное изучение озёрной и речной кеты (Иванков 1985, Kaev and Romasenko 2003), обитающих в водоёмах о. Итуруп (озёрная форма - в оз. Куйбышевское и Сопочное, речная - в р. Курилка и Рейдовая, а также в руч. Порожистый, впадающем в оз. Сопочное).

Статистический анализ данных вели согласно руководству Вейра (Вейр, 1995; Weir, 1996) с использованием компьютерных программ GDA (Lewis and Zaykin, 2001) и SPSS (SPSS for Windows, 2002). В частности, вычисляли коэффициенты попарного сходства популяций в (аналога F,«-статистики: Вейр 1995), а на их основе определяли координаты каждой выборки в пространстве главных компонент (с вращением) по программе SPSS (SPSS for Windows, 2002).

Рис. 2. Время взятия проб в системе р. Рейдовая (зачерненные кружки) н р. Курилка (светлые кружки) на фоне динамики уловов кеты в соответствующих заливах: зал. Простор (сплошная линия) и зал. Курильском (штриховая линия).

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ И АЛЛОЗИМНЫХ МАРКЕРОВ.

Полиморфизм изученных маркеров. Исследовав выборки кеты Сахалина и Итурупа сбора 2003-2004гг., в которых анализировали одновременно микросателлитные и аллозимные маркеры, мы нашли, что среди 852 исследованных рыб число различных аллелей по микросателлитным локусам колеблется от 4 (&а20./9) до 28 (ОпеЮЗ). Всего в исследованных нами популяциях найдено 125 различных аллелей по 10-ти локусам, в то время как по аллозимным маркерам число аллелей колебалось от 2 до 6 и суммарно по 12-ти локусам составило 39 аллелей. Таким образом, полиморфизм микросателлитных локусов намного выше, чем аллозимных (табл. 2).

Таблица 2. Полиморфизм микросателлитных и аплозимных локусов

Показатель | Аллозимы | Микросателлиты

Среднее число аллелей на локус 3.3 12.5

Ожидаемая гетерозиготность 0.25 0.67

Межрегиональная дифференциация (на примере кеты Сахалина и Южных Курил). Раздельный анализ дифференциации исследованных выборок по микросателлитным и аллозимным маркерам показал значительное расхождение между ними. А именно, на диаграмме главных компонент, построенной по данным о микросателлитной изменчивости (рис. ЗА), выборки кеты Итурупа отдалены от выборок с Сахалина. В то же время, по данным об аллозимных маркерах выборки юго-западного Сахалина удалены от всех остальных выборок, включая выборки с Итурупа (рис. ЗБ).

Анализ частот аллелей всех исследованных локусов показал, что найденное несоответствие вызвано резким отличием частот аллелей по аллозимному локусу ЕБТй* у кеты юго-западного Сахалина: дифференциация между Ю.-З. Сахалином и остальными выборками Сахалина по ЕБЮ* чрезвычайно высока: в =37.5%, в то время как в среднем по остальным одиннадцати аллозимным локусам она неизмеримо меньше: в =1.51% с 95%-ым доверительным межлокусным бутстреп-интервалом [0.33, 2.98]. Вызвано это тем, что в популяциях Юго-Западного Сахалина частый аллель диаллельного локуса ЕБТО* имеет частоту 0.82-0.85, в то время как его средняя частота во всех остальных исследованных популяциях Сахалина и Курил -

0.33. Однако это единственный известный локус, чётко ассоциированный с этой группировкой кеты. Без ЕБТй* топология взаимного расположения выборок коренным образом меняется, становясь более соответствующей географическому расположению популяций и возможной их экологической подразделенности: по остальным 11-ти аллозимиым локусам дифференциация выглядит, как и по микросателлитным маркерам (рис. ЗВ).

Уровень межрегиональной дифференциации кеты по микросателлитам выше, чем по аллозимиым маркерам. А именно, дифференциация между Юго-Западным Сахалином и остальным Сахалином по микросателлитам достигает 3.75% с 95%-ым доверительным интервалом [2.17, 5.82], против в =1.51% для аллозимов без Дифференциация между Сахалином (без Ю.-З. Сахалина) и Итурупом достигает 0=6.23% с доверительным интервалом [3.69, 9.67], в то время как по аллозимам 0=2.13% с доверительным интервалом [0.84, 5.05].

Внутрирегиональная дифференциация (на примере кеты рек Рейдовая и Курилка о. Итуруп). Средний уровень дифференциации стад Рейдового и Курильского ЛРЗ, выявляемый по микросателлитным локусам (0.41%), на порядок выше, чем по аллозимным локусам (0.044%); последний при этом незначим. Более того, среди аллозимных маркеров лишь два локуса из 12-ти исследованных (тМЕР-2* и ЕБЮ*) сопоставимы по дифференцирующей способности с микросателлитными маркерами. Эти данные и «перемешанность» выборок из этих двух стад в пространстве главных компонент (рис. 4а) указывают на недостаточную разрешающую способность аллозимных маркеров в целях идентификации столь близких стад.

Рис. 4. Расположение выборок кеты, взятых из Рейдовского (темные кружки) и Курильского (светлые кружки) стад в координатах главных компонент по аллозимным (а) и микросателлитным (б) маркерам.

Каковы причины более выраженной дифференциации популяций кеты по микросателлитным маркерам по сравнению с аллозимами? Одна из них - возможный отбор по аллозимным локусам, доказанный в экспериментах на горбуше (Алтухов и др. 1987; Животовский и др. 1987). Кроме того, вне зависимости от механизма дифференциации популяций кеты, наличие многих аллелей в микросателлитном локусе приводит к тому, что их возможно различные вклады в уровни дифференциации популяций усредняются, в отличие от аллозимных маркеров, изменчивость которых ограничивается в основном двумя-тремя аллелями.

Следует заметить, что, несмотря на невысокий уровень внутрирегиональной дифференциации кеты по микросателлитам, его может оказаться достаточным для

выявления устойчивых различий между стадами. Например, различия между кетой двух смежных речных бассейнов Итурупа (р. Рейдовая и р. Курилка) чётко выявляются по всем выборкам, взятым в течение всего рунного хода (рис. 46). Данный результат имеет большое практическое значение для целей идентификации и сертификации стад кеты, так как используемые нами микросателлитцые локусы позволяют различать даже столь близкие популяции.

Таким образом, дифференциация популяций кеты гораздо чётче выявляется по микросателлитным локусам по сравнению с дифференциацией по аллозимиым маркерам. Это прослеживается как на уровне различий между региональными стадами кеты, так и между популяциями в пределах региона. Всё это подтверждает, что микросателлиты являются более подходящими генетическими маркерами в целях дифференциации популяций кеты и что именно на них следует в первую очередь направить работу по созданию референтных баз популяционно-генетических данных по кете.

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЕТЫ РОССИЙСКОГО ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ

Результаты предыдущей главы показали преимущество использования микросателлитных маркеров в целях дифференциации популяций. Поэтому важно изучить видовую структуру кеты по микросателлитным локусам. При этом встает задача создания исходной базы данных по этим маркерам у кеты, в первую очередь -российского Дальнего Востока, которая была решена нами для природных популяций из основных регионов воспроизводства кеты.

Крупномасштабная дифференциация кеты

Кета российского Дальнего Востока имеет чёткую структуру с несколькими уровнями кластеризации. Самый первый уровень - дифференциация на два больших кластера, отделяющая кету Южных Курильских островов от «материковой» кеты (рис. 5). Степень дифференциации этих кластеров - 6.4% в единицах в (табл. 3). В пределах каждого из кластеров кета подразделяется на субкластеры, соответствующие географическим районам нереста. А именно, южнокурильская кета разбивается на кету Итурупа и кету Кунашира (рис. 5), а материковая кета делится на свои региональные

У"

I'

South Kun Is

• Kunashir j Iturup

РС1 (50 6%)

Рис. 5. Разделение кеты Южных Курил (островов Итуруп и Кунашир) и кеты остальной части ареала в пространстве главных компонент по микросателлитным локусам.

. SE&S Sakhalin

Southwest Sakhalin

#o Northeast Sakhalin

Northern V Habitat /

PC1 (50 7%)

Southv&st * SE&S

Sakhalin * Sakhalin

t • ••

Со Northeast

о Sakhalin *

<2,

см О CL • Northern • «{ Habitat • v % \ ** * Amur •

PC3 (14 8%)

Рис. 6. Дифференциация второго большого кластера кеты Дальнего Востока.

субкластеры: три на о. Сахалин, речной системы Амур, и северный субкластер, включающий кету охотоморского побережья материка (Магаданская обл.), Камчатку и Чукотку (рис. 7). Деление кеты внутри субкластеров неравнозначно в смысле количественной меры подразделенности в разных регионах: кета Сахалина, Амура, Магадана, Камчатки и Чукотки намного более дифференцирована, чем кета Южных Курил (рис. 6), что соответствует различиям в протяженности указанных географических районов. Это также соответствует различиям в количественной мере подразделенности в (табл. 3, 4). Следует отметить следующую важную особенность.

Вклад разных микросателлитных маркеров в дифференциацию разный - в зависимости от того какие популяции вовлечены в сравнения (табл. 3, 4).

Таблица 3. Уровень дифференциации кеты Российского Дальнего Востока

на основных уровнях иерархии популяций (показатель в, в %)

Статистика Южные Курилы / остальные Между не-курильскими субкластерами

Уровень дифференциации, в 6.4 4.0

95%-ый доверительный бутстреп-интервал [3.7, 10.41 [2.7, 5.41

Наиболее дифференцирующие локусы Okil-2, Ssa20.19, Оке 11, ОкеЗ Ssa20.19, ОкеЗ, ОпеЮЗ, Ots3

Таблица 4. Уровень дифференциации внутри основных субкластеров кеты Дальнего Востока (показатель 9, в %)____

Статистика Между районами Сахалина Между районами Магадана, Камчатки и Чукотки Между кетой Итурупа и Кунашира

Уровень дифференциации, 0 2.9 1.2 1.2

95%-ый доверительный бутстреп-интервал [1.7,4.41 [0 8, 1.81 [0.7, 1.61

Наиболее дифференцирующие локусы Ssa20.¡9 ,Ogo2, ОкеЗ, Оке 11 Ssa20. ¡9, ОпеЮЗ, Okil-2, Ogo2 ОкеЗ, Ogo2, Ols3, One 109

Дифференциация кеты сахалнио-курильского региона

Характер и уровень отделения кеты Южных Курил от всех остальных выборок данного исследования, а в пределах Южных Курил - дифференциация кеты Итурупа и Кунашира в целом уже были указаны на рис. 5 и в табл. 3.

В целях более глубокого исследования этой дифференциации, мы детально проанализировали материал, взяв данные по кете Сахалина и Курил за 2003-2005гг. Такое выделение выборок этих лет связано с тем, что исследование 2006г. на Итурупе было посвящепо подробному анализу двух речных систем - рек Рейдовой и Курилки - описанному в предыдущей главе, а выборки 2007г. были связаны в основном с анализом озерной кеты, приводимому ниже. Из не-курильских выборок в этом разделе взяты только сахалинские с тем, чтобы с одной стороны, проанализировать

различия между двумя большими кластерами, а с другой стороны, избежать влияния отличий друг от друга сахалинских, амурских выборок и выборок северной части ареала; кроме того, Сахалин и Курильские острова входят в один экономико-административный округ России.

Среди исследованных нами в 2003-2005гг. 1519 рыб по десяти микросателлитным локусам обнаружено 147 различных аллелей. Из них общих для Сахалина и Южных Курил - 107 аллелей, число регион-специфичных: для Сахалина-23, для Курил - 17. Регион-специфичные аллели имеют низкую частоту, но чаще встречаются у сахалинской кеты:

Максимальная частота среди аллелей специфичных для Курил - 0.0054 при их средней частоте 0.0012, а среди аллелей специфичных для Сахалина - максимальная частота 0.0310 при средней частоте 0.0063. Что касается общих аллелей, т.е. тех, которые имеются и в стадах кеты Сахалина, и кеты Южных Курил, то по частоте их встречаемости сахалинская и южнокурильская кета также значительно отличаются друг от друга, что и обеспечивает высокий уровень дифференциации между кетой Сахалина и Южных Курил (0=5.9%).

На Южных Курилах наибольшие различия отмечены между выборками кеты разных островов - Итурупа и Кунашира, с уровнем дифференциации 0=1.2%. Что касается дифференциации популяций кеты в пределах южнокурильских островов, то два бассейна о. Кунашир представлены единичными выборками, поэтому невозможно надежно, без повторных выборок, оценить /^-/-статистику дифференциации между ними; тем не менее, различия между ними статистически высокозначимы, что говорит о наличии генетически различающихся стад Кунашира. На рис. 7 показано, что кета Итурупа, несмотря на небольшие размеры этой части ареала вида, значимо дифференцирована, хотя количественно уровень дифференциации меньше, чем между островами: |9=0.74%. Более того, анализ показал, что повторные выборки производителей с двух соседних крупных рек Итурупа (Рейдовой и Курилки), взятые в разные годы (2004 и 2005) и в разное время нерестового хода в течение путины 2006г., воспроизводят эти различия.

Kunlka » River °

Lake

.о о о о

Rybatskaya River

> R9y3f/aya

River ш

РогогкэЬу Спек

Reydovaya River .

Rybatskaya River

PC1 (34 4%)

РС1 (34 4%)

Рис. 7. Подразделение кеты о. Итуруп в пространстве главных компонент. Обозначения: открытые и зачерненные кружки - кета рек Курилка (зал. Курильский) и Рейдовая (зал. Простор); квадратом в кластере р. Курилки обозначена выборка из оз. Лебединое; звездочки - кета река Рыбацкая (зал. Курильский); открытые ромбы - кета озерной формы (оз. Сопочное и Куйбышевское); зачерненные ромбы - выборки из руч. Порожистый, впадающего в оз. Сопочное; открытый треугольник - кета р. Осенняя; зачерненные треугольники - кета р. Благодатная океанского побережья.

Для оценки того насколько дифференциация кеты Итурупа вызвана репродуктивной изоляцией стад, в экспедиции 2006г. мы исследовали возврат от молоди, выпущенной в 2004г. с Курильского ЛРЗ, выделив группу двухлеток 0.2 (2+). Для этого все 12 выборок кеты, взятых в течение всего нерестового хода на р. Курилка и реки соседнего залива Рейдовая, проанализированных по микросателлитам, подразделили на подвыборку возраста 0.2 (если число рыб этой возрастной группы в выборке было больше пяти) и подвыборку из рыб остальных возрастных групп (0.3 и старше). В целом в исследованных выборках наблюдалось преобладание рыб возраста 0.3, затем возраста 0.4; рыбы возраста 0.5 редки; рыбы возраста 0.2 встретились преимущественно в р. Курилка вследствие большого возврата от заложенной на инкубацию икры в 2003г. Рис. 8 чётко указывает на то, что рыбы 0.2, зашедшие в р. Курилка, попадают в один генетический кластер с остальными выборками из бассейна Курилки; при этом группа возраста 0.2 выборки №12 из бассейна р. Рейдовая легла в кластер Рейдового стада кеты. Эти факты указывают на то, что производители кеты Рейдового и Курильского стад, вернувшиеся в 2006г. от ската 2004г., остались в целом генетически изолированными друг от друга.

Рис. 8. Расположение выборок кеты с выделением возраста 0.2, взятых из Рейдовского (темные кружки) и Курильского (светлые кружки) стад в пространстве главных компонент.

Примечание'. Возрастная структура выборки указана в её обозначении: например, 7_2 означает рыб выборки №7 возраста 0.2, в то время как 7 означает остальных рыб этой выборки. Возрастную группу 2+ выделяли, если только в данной выборке количество рыб возраста 2+, исследованных по микросателлитам, превышала пять.

Возможный обмен между стадами кеты Рейдового н Курильского ЛРЗ. Рис. 8 указывает на промежуточное положение выборки №5 из Рейдовского стада. Для более детального исследования этого факта, мы разделили все выборки на возрастные группы, при этом принимали во внимание группы с количеством рыб одного возраста не меньшим 14. В целом наблюдается преобладание рыб возраста 0.3, затем возраста 0.4.

Анализ показал, что рыбы возраста 0.3 выборки №5 находятся в кластере с остальными выборками из Рейдовского стада (рис. 9), в то время как рыбы 0.4 этой же выборки находятся в скоплении выборок Курильского стада. Наиболее вероятное объяснение этого факта - это то, что скатившаяся в 2002 г. молодь Курильского стада затем, в местах нагула или во время анадромной миграции, примкнула к одной из группировок Рейдовского стада и подошла вместе с ними к забойке Рейдовского ЛРЗ. Примечательно, что взятая в этот же день выборка №4 на соседней забойке Рейдовского ЛРЗ имеет «рейдовский» генотипический профиль и располагается в том же, «рейдовском» кластере.

Генетическая дифференциация кеты озёрного и речного экотипов на о. Итуруп

Мы провели сравнительный анализ озёрной и речной форм кеты Итурупа для оценки их различий по микросателлитным маркерам. Как видно на рис. 10, выборки озерной и речной кеты кластеризуются раздельно. При этом, что очень важно, в ручье Порожистом, впадающем в оз. Сопочное, нерестится речная форма и генетически она попадает именно в кластер речной кеты.

Уровень дифференциации озерной и речной кеты 0=0.73%; наибольший вклад внесли локусы ОкИ-2 (0=3.1%) и ОкеЗ (0=2.1%) (отметим, что дифференциация

между популяциями речной кеты Итурупа обусловлена другими наборами микросателлитных маркеров).

Важно отмстить расположение выборок производителей, зашедших на нерест в руч. Порожистый, впадающий в оз. Сопочное. А именно, одна из двух выборок (Пор-

5_3 • в20_ • 18 4

РС1 (31 3%)

Рис. 9. Расположение выборок кеты различного возраста, взятых из Рейдовского и Курильского стад, в проекциях главных компонент по всем 10-ти микросателлитным локусам.

Примечание: Возраст указан в соответствующем обозначении выборки, например, 5_4 означает выборку №5 с выделением возрастной группы 0.4

-------- Í

/ Con-Cg.1 \ ¡ ™ Соп-04\

^РсГ'05-3 у Куйб-04 ,

ш .....*' Ж ГЬр-05

tN 1

СМ О / о \ ;

ож',Пор-06 i

! о • ;

0: i

\<ь /

РС1 (57.2%)

Рис. 10. Расположение выборок озерной и речной форм кеты в пространстве главных компонент, полученным по частотам аллелей 10-ти микросателлитных локусов: штриховые овалы очерчивают выборки озерной и речной кеты; темные символы -кета из озер Сопочное (Con) п Куйбышевское (Куйб), цифры указывают год взятия выборки (Соп-05_1 и Соп-05_3 означают две разных выборки из оз. Сопочное в 2005 г.); светлые символы-выборки из рек Рейдовой и Курилки в 2004, 2005, 2006 гг.; звездочки - лве выборки из руч. Порожистый (приток оз. Сопочное).

05) лежит между кластерами речной и озёрной форм, а другая (Пор-06), как и ожидается, находится в кластере речной формы. Скорее всего, это говорит о том, что иногда часть рыб озерной формы может заходить на нерест в ручьи, впадающие в

озеро. Это подтверждается нашими визуальными наблюдениями: некоторые рыбы, отловленные нами в р. Порожистый, по форме и размерам тела больше отвечали озёрной форме. Таким образом, не исключен генный поток между этими формами. Однако генный обмен не должен быть велик в общей массе речных и озерных рыб, иначе обнаруженные генетические различия между этими двумя формами не могли бы поддерживаться, поскольку исследованные микросателлитные маркеры не несут явной функциональной нагрузки и, скорее всего, являются селективно нейтральными или близкими к таковым. Это говорит о том, что эти две формы репродуктивно значительно изолированы друг от друга.

Таким образом, озерная форма кеты, вероятно, представляет собой отдельную экологическую «расу» этого вида, и поэтому кета оз. Сопочное и кета удаленного от него оз. Куйбышевское попадают в один генетический кластер. Наличие двух кластеров (озерной и речной форм) говорит о том, что популяции озерной расы менее изолированы друг от друга, чем озериая кета от речной. Это также имеет большое практическое значение, так как диктует необходимость раздельного искусственного воспроизводства речной и озерной кеты. Отметим, что различение озерной и речной форм кеты стало возможным благодаря использованию именно микросателлитных маркеров. Исследование по аллозимным локусам не выявило, каких либо различий между этими формами (Салменкова и др. 2008).

Дифференциация северных группировок кеты (Магадан, Камчатка, Чукотка)

Рис. 11 отчетливо указывает на генетические различия между группировками кеты из северной части ареала дальневосточной кеты. Уровень дифференциации между ними 1.2%, т.е. того же порядка, что между кетой Итурупа и Кунашира южнокурильского кластера (табл. 3 и 4). Наиболее интересное здесь - это то, что кета р. Анадырь располагается ближе к кете североохотоморского побережья материка, чем к кете Камчатки, а кета р. Хайлюля имеет промежуточное положение - по крайней мере, отдалена от камчатских выборок в направлении магаданских. Объяснение этому лежит в недавней истории региона: в период времени интенсивного таяния ледников после последнего оледенения (это время порядка 10 тысячи лет назад), Камчатский перешеек был затоплен, водораздел Палеоанадыря соединился с Палеопенжиной и Палеопаланой системой озер, и кета из Палеоанадырского рефугиума расселялась, по-видимому, вдоль северного побережья Охотского моря на материковое и камчатское побережье (Варнавская, 2006).

----------------------- . ------------ ..

South

Kamchatka •"1

* Khailula

ю „ V „ River Kamchatka River

S2- •

сч О CL *• * Magadan ,

Anadyr* • Region

Rwer •

PC1 (35 7%)

South Kamchatka

Kamchatka River

Khailula River

Magadan Region

PC3 (15 7%)

AnaJyr River•

Рис. 11. Дифференциация кеты северной части ареала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наше исследование дает основу для разработки базы данных по микросателлитным маркерам природных популяций кеты Российского Дальнего Востока.

Следует отметить, что именно использование микросателлитных маркеров позволило выявить дифференциацию нерестовых группировок кеты даже в пределах небольшого региона, например, такого как о. Итуруп. Ранее проведенный анализ аллозимных маркеров привел к заключению, что характер кластеризации внутри группировки кеты о. Итуруп не согласуется с географическим расположением мест нереста и что озерная кета не отличается генетически от речной кеты (Салменкова и др. 2008). Однако это заключение оказалось ошибочным. Используя микросателлитные маркеры, мы смогли показать подразделеппость кеты не только разных регионов, но даже в пределах региона: например, двух соседних речных бассейнов Итурупа - рек Рейдовой и Курилки, а также дифференциацию других популяций кеты Итурупа, и выявили четкие генетические различия между озёрной и речной формами кеты.

Рельефная генетическая структура популяций кеты, соответствующая географической подразделенности районов нереста, а также различие между озёрным и речным экотипами, свидетельствуют о том, что между этими популяциями кеты существует значительная репродуктивная изоляция, тем более что микросателлитная изменчивость, в общем, характеризуется как селективно нейтральная, по крайней мере более нейтральная, чем аллозимная вариация.

Наше исследование позволяет сформулировать следующие принципы популяционно-генетических исследований тихоокеанских лососей при создании популяционных баз ДНК-данных, ориентированных на задачи воспроизводства, генетической идентификации и сертификации популяций лососей.

1). Каждая популяция должна характеризоваться рядом выборок, взятых с учетом пространственной и временной структуры стада: в течение нерестового хода (по крайней мере, выборки из начала, середины и конца хода), речные и озерные формы, сезонные формы, на забойках рыбоводных заводов и на нерестилищах и т.п.

2). Объём каждой выборки должен быть не менее 50-100 особей.

3). Генотипирование выборок должно быть обязательно совмещено с их биологическим анализом, по крайней мере - с определением пола и возраста.

4). Наиболее подходящими генетическими маркерами в целях дифференциации популяций являются микросателлиты. Именно на них следует в первую очередь направить работу по созданию референтных баз генетических данных по тихоокеанским лососям; при этом использование других типов генетического полиморфизма (в первую очередь, мононуклеотидных замен - БИР, а также рестрикционных фрагментов и нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК и ядерных генов, фингерпринтов, аллозимов) может привнести важную дополнительную информацию.

5). В целях создания надёжной базы генетических данных по стадам лососей следует наращивать число вовлекаемых генетических локусов, тем более что для каждой группы популяций дифференцирующим может оказаться свой специфический набор маркеров.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что внутри- и межрегиональная дифференциация популяций кеты по микросателлитам выше, чем по аллозимным маркерам. Единственное исключение -аллозимный локус ЕБТй* оказавшийся высокоспецифичным маркером кеты юго-западного Сахалина.

2. Структура исследованных популяций кеты российского Дальнего Востока по микросателлитным маркерам - высокорельефная: состоит из двух больших кластеров: кеты Южных Курильских островов и кеты остальных регионов. Южнокурильский кластер популяций кеты состоит из двух субкластеров: кеты о. Итуруп и кеты о. Кунашир. Другой кластер также имеет региональную подразделенность: субкластеры кеты Сахалина , кеты р. Амур, кеты северной части дальневосточного ареала.

3. Показано, что популяции кеты даже близкорасположенных бассейнов могут различаться по микросателлитам, что позволяет использовать эти маркеры для целей идентификации и сертификации стад.

4. Речная и озёрная формы кеты различаются по микросателлитным маркерам, что свидетельствует об их значительной репродуктивной изоляции друг от друга. Это необходимо учитывать при организации рыбоводного процесса.

5. Отмечено, что наиболее информативные микросателлитные маркеры -различны для группировок кеты разных регионов и разных уровней популяционной иерархии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Опубликованные статьи в журналах:

1. Афанасьев К.И. Мнкросателлитная изменчивость и дифференциация популяций кеты (Oncorhynchus keta Walbaum), воспроизводимых сахалинскими рыбоводными заводами / Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Малинина Т.В., Салменкова Е.А., Омельченко Т.В., и Животовский JI.A. // Генетика. 2006. Т. 42. №12. С. 1694-1702.

2. Афанасьев К.И. Межрегиональная дифференциация кеты Сахалина и Южных Курил по микросателлитным локусам / Афанасьев К.И., Г.А. Рубцова, М.В. Шитова, Т.В. Малинина, и Л.А. Животовский. // Генетика. 2008. Т. 44. №7. С. 956-963.

3. Животовский Л.А. О создании базы ДНК-данных для решения проблем воспроизводства, идентификации и сертификации популяций тихоокеанских лососей на примере кеты о. Итуруп / Животовский Л.А., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Шитова М.В., Малинина Т.В., Ракицкая Т.А., Прохоровская В.Д., Салменкова Е.А., Фёдорова Л.К., Борзов С.И., Погодин В.П. // Вопросы рыболовства. 2008. Т. 9. № 1. С. 96-109.

4. Рубцова Г.А. Дифференциация популяций кеты по микросателлитным и аллозимным маркерам / Рубцова Г.А., Афанасьев К.И., Малинина Т.В., Шитова М.В., Ракицкая Т.А., Прохоровская В.Д., и Животовский Л.А. // Генетика. 2008. Т. 44. №7. С. 964-971.

5. Салменкова Е.А. Генетическое разнообразие азиатской кеты Oncorhynchus keta Walbaum (Salminidae, Salmoniformes) и динамика генофондов сахалинских популяций при искусственном воспроизводстве / Салменкова Е.А., В.Т. Омельченко, К.И. Афанасьев, Г.А. Рубцова. // Вопросы ихтиологии. 2008. Т. 48. №3. С. 361-373.

6. Салменкова Е.А. Генетическое разнообразие североохотоморских популяций кеты с естественным и искусственным воспроизводством / Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Политов Д.В., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А. // Биология моря. 2007. Т.ЗЗ. №4. С.299-308.

7. Каев A.M. О генетической дифференциации кеты речного и озёрного экотипов на о. Итуруп (Курильские острова) / Каев A.M., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Малинина Т.В., Шитова М.В., Борзов С.И., Фёдорова Л.К., и Животовский Л.А. // Современное состояние водных биоресурсов: Материалы научной конференции, посвященной 70-летию С.М.Коновалова. Владивосток: ТИНРО-центр. 2008. С.372-374.

Тезисы:

8. Zhivotovsky L.A. Microsatellitc variation in chum salmon Oncorhynchus kela Walbaum / Zhivotovsky L.A., G.A. Rubtsova, T.V. Malinina, M.V. Shitova, T.A. Rakitskaya, V.D. Prokhorovskaya, and K.I. Afanasiev // The Sixth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2008). 22-27 июня 2008 r. Novosibirsk. 2008. Institute of Cytology and Genetics

9. Рубцова Г.А. Сравнительный анализ дифференциации популяций кеты по микросателлитным и аллозимиым маркерам / Рубцова Г.А., Афанасьев К.И., Шитова М.В., Прохоровская В.Д., Ракицкая Т.А. и Животовский J1.A. // Междун. конф. «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб»,10-12 сентября 2008 г. С.-Петербург. 2008. Ин-т цитологии РАН

10. Шитова М.В. Микросателлитная изменчивость кеты (Oncorhynchus kela Walbaum) / Шитова М.В., Рубцова Г.А., Животовский JI.A., Малинина Т.В., Афанасьев К.И. // Тезисы докладов Международной школы - конференции посвященной 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» 10-13 ноября 2007 г. С.Петербург. 2007. С. 97-98.

11. Шитова М.В. Микросателлитная изменчивость кеты (Oncorhynchus kela Walbaum) о. Сахалин / Шитова М.В., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Животовский Л.А., Малинина Т.В. // Материалы и доклады Международной научно-практической конференции «Рациональное использование пресноводных экосистем - перспективное направление реализации национального проекта «Развитие АПК», 17-19 декабря 2007 г. М.: Изд-во Россельхозакадемии. 2007. С. 313-316.

12. Афанасьев К.И. Межрегиональная дифференциация азиатской кеты / Афанасьев

К.И., Рубцова Г.А., Шитова М.В., Малинина Т.В., Животовский Л.А. // Междун. конф. «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб», 10-12 сентября 2008 г. С.-Петербург. Ин-т цитологии РАН

Для заметок

Заказ № 23/11 /08 Подписано в печать 05.11.2008 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

; г о, ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ni; е-таИ:'т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рубцова, Галина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткие сведения по биологии и экологии кеты

1.2. Генетические маркеры кеты

1.2.1. Аллозимные маркеры

1.2.2. ДНК маркеры

1.2.2.1. Митохондриальная ДНК (мтДНК)

1.2.2.2. Микросателлитные и минисателлитные маркеры

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1с. Методика взятия проб для генетического исследования

2.2. Методика исследования микросателлитных маркеров

2.3. Методика анализа аллозимного полиморфизма

2.4. Материал популяционных исследований

2.4.1. Материал для сравнительного исследования дифференциации стад кеты по микросателлитным и аллозимным маркерам

2.4.1.1. Материал для изучения межрегиональной дифференциации

2.4.1.2. Материал для изучения внутрирегиональной дифференциации (на примере стад кеты Рейдового и Курильского ЛРЗ)

2.4.2. Материал для изучения дифференциации кеты российского Дальнего Востока по микросателлитным локусам

2.4.3. Материал для исследования экологической дифференциации (на примере озёрной и речной форм кеты о. Итуруп)

2.5. Статистический анализ данных

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ И АЛЛОЗИМНЫХ МАРКЕРОВ

3.1. Межрегиональная дифференциация

3.1.1. Полиморфизм изученных маркеров

3.1.2. Особенности дифференциации кеты юго-западного Сахалина по аллозимным локусам как следствие влияния маркера ЕБТИ*

3.1.3. Дифференциация популяций кеты Итурупа и Сахалина без юго-запада)

3.1.4. Корреляция величин в, оцененных по микросателлитным и аллозимным маркерам

3.2. Внутрирегиональная дифференциация (на примере кеты рек Рейдовая и Курилка о. Итуруп)

ГЛАВА 4. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЕТЫ РОССИЙСКОГО ДАЛЬНЕГО

ВОСТОКА ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ

4.1. Крупномасштабная дифференциация кеты

4.2. Дифференциация кеты сахалино-курильского региона

4.3. Внутрирегиональная дифференциация (на примере стад кеты о. Итуруп)

4.3.1. Данные по возврату от выпущенной молоди

4.3.2. Возможный обмен между стадами кеты Рейдового и Курильского ЛРЗ

4.3.3. Дифференциация других стад кеты о. Итуруп

4.4. Генетическая дифференциация кеты озёрного и речного экотипов на о. Итуруп

4.5. Дифференциация северных группировок кеты (Магадан, Камчатка, Чукотка)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микросателлитная изменчивость кеты"

Тихоокеанские лососи рода Oncorhynchus имеют большое экономическое значение и характеризуются сложной популяционной организацией (Коновалов 1980, Алтухов, 1974, 1983; Алтухов и др., 1997). Особенности формирования популяционной структуры лососей определяются их биологией. Мигрируя в разном возрасте из мест морского нагула в различные географические регионы, а затем, расходясь там по нерестилищам озер и рек, они создают сложную пространственную и временную систему нерестовых популяций. Поэтому изучение генетических характеристик стад позволяет решить фундаментальную проблему выявления их популяционно-генетической структуры и в то же время создает фундамент для проведения практических мероприятий по воспроизводству и оценке запасов лососей.

Актуальность проблемы. Для решения теоретических проблем популяционной организации вида и прикладных задач генетической идентификации и сертификации стад лососей важно знать наследственное своеобразие популяций. При этом одним из требований, предъявляемых к оцениваемым объектам и процедурам рыболовства, является наличие информации о генетических особенностях исследуемых стад, позволяющей различать их популяционные компоненты.

Одним из основных видов тихоокеанских лососей на Российском Дальнем Востоке является кета О. keta Walbaum. Кета — второй по численности вид тихоокеанских лососей после горбуши на азиатской части ареала: нерестится по преимуществу в реках Сахалина, Южных Курил, охотоморского побережья материка, Камчатки. Пополнение запасов кеты идет как путем естественного воспроизводства, так и за счет искусственного разведения на лососевых рыборазводных заводах.

До недавнего времени в генетических исследованиях лососей, в т.ч. кеты, использовали аллозимные маркеры (Алтухов и др., 1972, 1997; Seeb et al., 2004; Варнавская, 2006; Салменкова и др., 1978, 1983, 2008,). Но их малый полиморфизм не позволял провести детальную дифференцировку популяций. В настоящее время наиболее перспективными- для. популяционно-генетических исследований являются маркеры ДНК, в особенности микросателлиты (Schlotterer, 1998; Brown and Epifanio, 2003; Животовский, 2006). Изучение микросателлитной изменчивости кеты только начинается. На основе анализа микросателлитных маркеров исследована структура популяций кеты отдельных рек Северной Америки, Китая и Японии (Abe S. et. al., 2002; Yoon et. al., 2005; Scribner et. al., 1998; Chen J.-P. et. ah, 2005; Small M.P. et. al., 2005). Было начато детальное изучение дифференциации популяций кеты, нерестящихся в реках Сахалинской области (Афанасьев и др., 2006, 2008; Рубцова и др., 2008), и кеты отдельных речных бассейнов о. Итуруп в связи с проблемами различения локальных стад этого лосося (Животовский и др., 2008).

Однако сравнительного анализа дифференцирующей способности микросателлитных и аллозимных маркеров и определения степени дифференциации стад кеты Российского Дальнего Востока по микросателлитам не проводилось. По этой причине важным является исследование популяционно-генетической организации кеты. Для этого необходимо разработать методы, позволяющие отличать одни популяции кеты от других, и создать базу популяционных данных, содержащих генетические характеристики рыб различных группировок.

Цель и задачи исследования. Цель работы - сопоставить эффективность использования микросателлитных и аллозимных маркеров в популяционных исследованиях кеты, имея в виду их дифференцирующую способность и провести исследования по выявлению популяционно-генетической организации природных популяций на большом ареале с использованием маркеров с большей разрешающей способностью.

В связи с этим необходимо решить следующие основные задачи:

1. сравнить внутри- и межпопуляционную изменчивость кеты по микросателлитным и аллозимным маркерам;

2. изучить популяционную структуру кеты Российского Дальнего

Востока с использованием микросателлитных маркеров;

3. оценить возможности идентификации стад кеты по микросателлитам в целях практического использования.

Научная новизна работы. Впервые показано, что внутри- и межрегиональная дифференциация популяций кеты по микросателлитным маркерам выше, чем по аллозимным. Впервые выявлена популяционная структура кеты по микросателлитным маркерам и исследована дифференциация популяций этого вида в различных регионах Дальнего Востока. В частности, показано, что существует две генетически сильно различающиеся группировки кеты: южно-Курильская и» остальной части исследованного ареала. Показано, что наиболее информативные микросателлитные маркеры - разные для группировок кеты разных регионов и для разных уровней^ популяционной иерархии, что свидетельствует о том, что для глобального исследования кеты следует развивать больший набор микросателлитных маркеров.

Научно-практическое значение. Показано на примере кеты о. Итуруп, что популяции даже близко расположенных бассейнов различаются по микросателлитным маркерам, что может быть использовано для целей идентификации и сертификации стад. Различные экологические формы кеты речная и озёрная) репродуктивно значительно изолированы друг от друга, что необходимо учитывать при организации рыбоводного процесса.

Работа выполнена при поддержке программ Президиума РАН «Динамика генофондов» и «Молекулярная и клеточная биология» руководитель JI.A. Животовский.

Автор признателен научному руководителю К.И. Афанасьеву руководство работой и помощь в подготовке и обработке материала на всех стадиях данного исследования.

Автор благодарен JI.T. Бачевской (ИБПМ ДВО РАН, г. Магадан), A.M. Каеву (СахНИРО), В.А. Брыкову (ИБМ ДВО РАН, г. Владивосток) за предоставление нам ряда выборок кеты, Г.П. Вяловой (СахНИРО), М.Ю. Ковалёву и В.Т. Омельченко (ИБМ ДВО РАН, г. Владивосток), Е.А. Шевлякову (КамчатНИРО, г. Петропавловск-Камчатский) за помощь в сборе ряда выборок; Е.А. Салменковой, В.Т. Омельченко за предоставленные данные по аллозимной изменчивости за 2003-2004г.г., а также Т.В. Малининой В.Д. Прохоровской, Т.А. Ракицкой за помощь в обработке материала по аллозимным локусам, и М.В. Шитовой - за помощь в обработке материала сбора 2006г. по микросателлитным маркерам.

Автор признателен JI.K. Фёдоровой, С.И. Борзову и В.П. Погодину (ООО «Гидрострой»), а также коллективам Курильского и Рейдового JIP3 за помощь в проведении экспедиционных работ на о. Итуруп.

Особую благодарность автор выражает проф. Животовскому JI.A. за организацию исследования и помощь в подготовке диссертационный работы.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рубцова, Галина Алексеевна

выводы

1. Показано, что внутри- и межрегиональная дифференциация популяций кеты по микросателлитам выше, чем по аллозимным маркерам. Единственное исключение - аллозимный локус ТО*, оказавшийся высокоспецифичным маркером кеты юго-западного Сахалина.

2. Структура исследованных популяций кеты российского Дальнего Востока по микросателлитным маркерам - высокорельефная: состоит из двух больших кластеров: кеты Южных Курильских островов и кеты остальных регионов. Южно-Курильский кластер популяций кеты состоит из двух субкластеров: кеты о. Итуруп и кеты о. Кунашир. другой кластер также имеет региональную подразделенность: субкластеры кеты Сахалина, кеты р. Амур, кеты северной части дальневосточного ареала.

3. Показано, что популяции кеты даже близкорасположенных бассейнов могут различаться по микросателлитам, что позволяет использовать эти маркеры для целей идентификации и сертификации стад.

4. Речная и озёрная формы кеты различаются по микросателлитным маркерам, что свидетельствует об их значительной репродуктивной изоляции друг от друга. Это необходимо учитывать при организации рыбоводного процесса.

5. Отмечено, что наиболее информативные микросателлитные маркеры -различны для группировок кеты разных регионов и для разных уровней популяционной иерархии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нашим исследованием заложена основа для создания базы данных по микросателлитным маркерам природных популяций кеты, а совместно с данными по искусственно воспроизводимым рыбоводными заводами стадам (Шитова 2008) - кеты Российского Дальнего Востока.

Следует отметить, что именно использование микросателлитных маркеров позволило выявить дифференциацию нерестовых группировок кеты даже в пределах небольшого региона, например, такого как о. Итуруп. Ранее использование аллозимных маркеров привело к заключению, что характер кластеризации внутри группировки кеты о. Итуруп не согласуется с географическим расположением мест нереста и что озерная кета не отличается генетически от речной кеты (Салменкова и др. 2008). Однако это заключение оказалось ошибочным. Используя микросателлитные маркеры мы смогли показать подразделенность кеты не только разных регионов, но даже в пределах региона: например, двух соседних речных бассейнов Итурупа - рек Рейдовой и Курилки, а также дифференциацию других (природных) популяций кеты Итурупа, и выявили четкие генетические различия между озёрной и речной формами кеты.

Рельефная генетическая структура популяций кеты, соответствующая географической подразделенности районов нереста, а также различие между озёрным и речным экотипами, свидетельствуют о том, что между этими популяциями кеты существует значительная репродуктивная изоляция, тем более что микросателлитная изменчивость, в общем, характеризуется как селективно нейтральная, по крайней мере, более нейтральная, чем аллозимная вариация. Наши данные показывают, что в одной из собранных нами 89-ти выборок часть её (точнее, одна возрастная группа) претендует на то, чтобы её отнести к другой реке (выборка из р. Рейдовая легла в кластер р. Курилки); таким образом, интенсивность обмена особями (стрэинга) между кетой из рек соседних заливов (зал. Простор и Курильский о. Итуруп) можно оценить как 0.6%. Это соответствует литературным данным, показывающим, что интенсивность обмена у кеты - порядка одного-двух процентов на поколение. В частности, мечение рыб, анализ зараженности паразитами, анализ структуры чешуи и морфологических признаков дал даже более высокую оценку стрэинга между субпопуляциями в 4,2%, а между реками - 1,5% (Варнавская, 2006). Есть и более высокие оценки обмена между субпопуляциями на основе меченья молоди и учета взрослых производителей (Окагакл, 1982); однако надо иметь в виду, что физический стрэинг ещё не означает потока генов, поскольку мигранты могут иметь меньший успех в размножении. Так, интенсивность стрэинга меченой кеты из трех североамериканских популяций кеты была на порядок выше уровня обмена генами (ТаИтап, Неа1еу, 1994 - цит. по: Алтухов и др., 1997). Кроме того, надо иметь в виду место поимки рыб. В частности выборка из устья Найбы (юго-восточный Сахалин) оказалась в генетическом кластере северо-восточного Сахалина, что легко объясняется тем, что рыба на анализ была взята из морских неводов и могла быть на самом деле по происхождению из более северных районов Сахалина.

Кластеризация выборок из разных географических районов может свидетельствовать также о древних миграционных процессах. По нашим данным, кета рек Анадырь и Хайлюля тихоокеанского побережья объединяются по микросателлитным маркерам с популяциями охотоморского побережья материка (Магаданская область). Это соответствует некоторым данным по аллозимным и морфологическим маркерам, поскольку в период последнего максимального таяния ледников (порядка 10-ти тысячи лет назад), перешеек в низменной части Камчатки, соедиеняющий Камчатку с Чукоткой, был затоплен и рыба шла на нерест в материковые реки Охотского моря через образовавшийся пролив, обеспечивая возможность стрэинга между указанными популяциями тихоокеанской и охотоморской кеты.

Выявленная нами дифференциация географически близких популяций, вероятно, вызвана высоким хомингом кеты. Поэтому для нерки и чавычи также следует ожидать хорошего разрешения подобных межпопуляционных различий. Что касается горбуши, то ввиду большего стрэинга (Глубоковский, Животовский, 1986) у этого вида не ожидается столь заметной генетической дифференциации как у кеты, тем более что у горбуши имеется много микросателлитных нуль-аллелей, затрудняющих интерпретацию полученных генетических данных (А.ОЬаггей, личное сообщ.). Это диктует необходимость тщательной разработки методов анализа микросателлитных локусов горбуши, что даст возможность дифференцировать, по крайней мере, большие региональные стада этого вида.

Наше исследование позволяет сформулировать следующие принципы популяционно-генетических исследований тихоокеанских лососей при создании популяционных баз ДНК-данных, ориентированных на задачи воспроизводства, генетической идентификации и сертификации популяций лососей.

1). Каждая популяция должна характеризоваться рядом выборок, взятых с учетом пространственной и временной структуры стада: в течение нерестового хода (по крайней мере, выборки из начала, середины и конца хода), речные и озерные формы, сезонные формы, на забойках рыбоводных заводов и на нерестилищах и т.п.

2). Объём каждой выборки должен быть не менее 50-100 особей.

3). Генотипирование выборок должно быть обязательно совмещено с их биологическим анализом, по крайней мере - с определением пола и возраста.

4). Наиболее подходящими генетическими маркерами в целях дифференциации популяций являются микросателлиты. Именно на них следует в первую очередь направить работу по созданию референтных баз генетических данных по тихоокеанским лососям; при этом использование других типов генетического полиморфизма (в первую очередь, мононуклеотидных замен — 8МР, а также рестрикционных фрагментов и нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК и ядерных генов, фингерпринтов, аллозимов) может привнести важную дополнительную информацию.

5). В целях создания надёжной базы генетических данных по стадам лососей следует наращивать число вовлекаемых генетических локусов, тем более что для каждой группы популяций дифференцирующим может оказаться свой специфический набор маркеров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рубцова, Галина Алексеевна, Москва

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. и др. О числе мономорфных и полиморфных локусов в популяции кеты - одного из тетраплоидных видов тихоокеанских лососей // Генетика. 1972. Т. 8. №2. С. 251-259.

2. Алтухов Ю.П. Популяционная генетика рыб. М.: Пищ. пром-сть. 1974. 247 с.

3. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Рябова Г.Д., Куликова Н.И. Генетическая дифференциация популяций кеты Oncorhynchus keta (Walb.) и эффективность некоторых акклиматизационных мероприятий // Биология моря. 1980. № 3. С. 23-38.

4. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М.: Наука. 1983. 279с.

5. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Популяционная генетика лососевых рыб. М.: Наука. 1997. 289с.

6. Алтухов Ю.П. (под ред.). Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях. М.: Наука. 2004. 619с.

7. Афанасьев К.И., Г.А. Рубцова, М.В. Шитова, Т.В. Малинина, и Л.А. Животовский. Межрегиональная дифференциация кеты Сахалина и Южных Курил по микросателлитным локусам // Генетика. 2008. Т. 44. №7. С. 956-963.

8. Бачевская JI.T. Генетическая дифференциация кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) североохотоморского побережья и некоторых рек Камчатки // Популяционная биология лососей Северо-востока Азии. Владивосток: ДВО АН СССР. 1992. С. 42-45.

9. Бачевская Л.Т. Генетическое разнообразие кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) рек североохотоморского побережья // Чтения памяти В.Я. Леванидова. Владивосток: Дальнаука. 2003. Вып. 2 . С. 500-505.

10. Бачевская Л.Т. Пустовойт С.П., Хованский Е.И. Генетическая изменчивость популяций кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) рек северного побережья Охотского моря в условиях искусственного воспроизводства // Вопросы рыболовства. 2001. Т. 2. №1(5). С. 125139.

11. Берг Л.С. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. 1948. Ч. 1. М.; Л.: Изд-во АН СССР. 466с.

12. Бирман И.Б. Морской период жизни и вопросы динамики стада тихоокеанских лососей. М.: Агропромиздат. 1985. 208с.

13. Брыков В.А., Кириллова О.Н., Кухлевский А.Д., Скурихина Л.А. Анализ изменчивости митохондриальной ДНК у кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) в популяциях рек Приморья и Сахалина // Генетика. 2000. Т. 36. №10. С. 1388-1393.

14. Брыков В.А., Полякова Н.Е., Прохорова A.B. Филогенетический анализ кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) в азиатской части ареала, основанный на изменчивости митохондриальной ДНК // Генетика. 2003. Т. 39. № 1. С. 75-82.

15. Варнавская H.B. Генетическая дифференциация популяций тихоокеанских лососей // КамчатНИРО. 2006. 488с.

16. Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир. 1995. 399с.

17. Викторовский P.M., Бачевская Л.Т., Ермоленко Л.Н. и др. Генетическая структура популяций кеты Северо-востока СССР и проблемы рационального использования ее запасов // Биология моря. 1986. № 2. С. 51-59.

18. Глубоковский М.К., Животовский Л.А. Популяционная структура горбуши: система флюктуирующих стад // Биология моря. 1986. №2. С. 39-44.

19. Гриценко О.Ф. Популяционная структура сахалинской горбуши Oncorhynchus gorbuscha // Вопросы ихтиологии. 1990. Т. 30. Вып. 5. С. 825-835.

20. Гриценко О.Ф., Ковтун A.A., Путивкин C.B. Экологические последствия крупномасштабного искусственного разведения кеты // Мировой океан. Использование биологических ресурсов. 2001. М.: Вып. 2. С. 162-174.

21. Ефремов В.В. Генетическая изменчивость и дифференциация популяций кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) юга Дальнего Востока // Генетика. 2001. Т. 37. №3. С. 365-362.

22. Животовский Л.А. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы ее изучения // Информационный Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. №1. С.74-96.

23. Животовский Л.А., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А. Селективные процессы по ферментным локусам у горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) // Генетика. 1987. Т.23. №10. С. 1876-1883.

24. Иванков В.Н. Экотипы лососевых рыб // Морфология и систематика лососевидных рыб. Л.: ЗИН АН СССР. 1985. С. 85-91.

25. Каев A.M., Ардавичус А.И., Ромасенко Л.В. Внутрипопуляционная изменчивость кеты Oncorhynchus keta острова Итуруп в связи с топографией нерестилищ // Сб. науч. трудов СахНИРО. 1996. Т. 1. С. 713.

26. Каев A.M. Идентификация происхождения и истории жизни охотоморской кеты Oncorhynchus keta по чешуе // Вопросы ихтиологии. Т. 38. №5. С. 650-658.

27. Коновалов С.М. Популяционная биология тихоокеанских лососей. М.: Наука. 1980. 937с.

28. Макоедов А.Н. Кариология, биохимическая генетика и популяционная фенетика лососевых рыб Сибири и Дальнего Востока: сравнительный аспект. М.: УМК Психология. 1999. 291с.

29. Полякова Н.Е., Семина A.B., Брыков В.А. Изменчивость митохондриальной ДНК кеты Oncorhynchus keta (Walbaum) и ее связь с палеогеологическими событиями в северо-западной части Пацифики // Генетика. 2006. Т. 42. № 10. С. 1388-1396.

30. Рослый Ю.С. Влияние условий обитания в пресноводный период жизни на численность и структуру популяций молоди амурской кеты. Автореферат диссертации на соиск. уч.ст. канд. биол. наук. Хабаровск. 1974.21с.

31. Рухлов Ф.Н. Жизнь тихоокеанских лососей. Далн. книж. изд. Сах. Филиал. 112с.

32. Рубцова Г.И., Афанасьев К.И., Малинина Т.В., Шитова М.В., Ракицкая Т. А., Прохоровская В. Д., и Животовский JI.A. Дифференциация популяций кеты по микросателлитным и аллозимным маркерам // Генетика. 2008. Т. 44. № 7. с. 964-971.

33. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Полиморфизм белков в популяциях диплоидных и тетраплоидных видов рыб // Биология моря. 1978. №4. С. 67-74.

34. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Полиморфизм НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в популяциях кеты и горбуши // Биология моря. 1983. №3. С. 24-28.

35. Салменкова Е. А., Омельченко В.Т., Победоносцева Е.Ю. и др. Популяционно-генетический анализ эффективности перевозки икры Курильской кеты на юго-западный Сахалин // Генетика. 1983. Т. 19. № 10. С. 1660-1666.

36. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Рослый Ю.С. Различия в генетической структуре летней и осенней рас амурской кеты // Генетика в аквакультуре. JL: Наука. 1989. С. 80-86.

37. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Политов Д.В., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А. Генетическое разнообразие североохотоморских популяций кеты с естественным и искусственным воспроизводством // Биология моря. 2007. Т. 33. №4. С. 299-308.

38. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Рослый Ю.С. и др. Генетическая дифференциация кеты бассейна Амура // Генетика. 1994. Т. 30. № 4. С. 518-528.

39. Салменкова Е.А., Алтухов Ю.П., Викторовский P.M. и др. Генетическая структура популяций кеты, размножающихся в реках Дальнего Востока и северо-востока СССР // Журнал общей биологии. 1986. Т. 47. №4. С. 529548.

40. Салменкова Е.А., Омельченко В.Т., Алтухов Ю.П. Геногеографическое исследование популяций кеты, Oncorhynchus keta (Walbaum), в азиатской части видового ареала// Генетика. 1992. Т. 28. №1. С. 76-91.

41. Шитова М.В., Афанасьев К.И., Рубцова Г.И., Малинина Т.В., Сидорова C.B., и Животовский JI.A. Микросателлитная изменчивость заводских популяций кеты {Oncorhynchus keta Walbaum) о. Сахалин // Вопросы рыболовства (сдана в печать)

42. Шитова М.В. Дифференциация заводских популяций кеты Сахалинской области по микросателлитным маркерам. Диссертация на соискание степени канд. биол. наук (рукопись, ИОГЕН РАН). 2008.

43. Aebersold P.B.,Winans G.A.,Teel D.J., et al. Manual for starch gel electrophoresis: a method for the detection of genetic variation. NOAA Technical Report NMFS 61.1987. 19p.

44. Altukhov Yu.P., Salmenkova E.A. Stock transfer relative to natural organization, management, and conservation of fish population // Population genetics and fishery management. Seattle; L.: Univ. Wash. Press. P. 1987. P. 333-343.

45. Altukhov Yu.P., Salmenkova E.F., Omelchenko V.T. Salmonid fishes: Population biology, genetics and management. Oxford: Blackwell Sci. 2000. 368p.

46. Banks M.A., Blouin M.S., Baldwin B.A., Rashbrook V.K., Fitzgerald H.A., Blankenship S.M., and Hedgecock D. Isolation and inheritance of novel microsatellites in Chinook Salmon (Oncorhynchus tschawytschci) II Heredity. 1999. V. 90. №2. P. 281-288.

47. Banks M.A., Rashbrook V.K., Calavetta M.J. Analysis of microsatellite DNA resolves genetic structure and diversity of chinook salmon (Oncorhynchustschawytscha) in Californias Central Valley // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 2000. V. 57. P. 915-927.

48. Beachem T.D., Withler R.E., Gould A.P. Biochemical genetic stock identification of chum salmon {Oncorhynchys keta) in Southern British Columbia // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1985. V. 42. № 3. P. 437-448.

49. Beachem T.D., Gould A.P., Withler R.E., Murray C.B., Barner L.W. Biochemical genetic survey and stock identification of chum salmon {Oncorhynchys keta) in British Collumbia // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1987. V. 44 №10. P. 1702-1713.

50. Beachem T.D., Le K.D., Candy J.R. Population structure and stock identification of chum salmon (Oncorhynchys keta) based upon microsatellite analysis //NPAFC Tech. Rep. 2004. №5. P.l-3.

51. Brown B. and J. Epifanio Nuclear DNA. In: E.M. Hallerman (ed.) Population Genetics: Principles and Applications for Fisheries Scientists. Amer. Fish. Society. Bethesda, Maryland. USA. 2004. P. 101-126.

52. Buchholz W.G., Miller S.J., Spearman W.J. Isolation and characterization of chum salmon microsatellite loci and use across species // Animal Genetics. 2001. V. 32. №3. P. 162-165.

53. Burger C.V., Scribner K.T., Spearman W.J., et. al. Genetic contribution of three introduced life history forms of sockeye salmon to colonization of Frazer Lake, Alaska // Can. J. Fish Aquat. Sci. 2000. V. 57. №10. H. 20962111.

54. Cairney M., Taggart J.B. and Heryheim B. Characterization of microsatellite and minisatellite loci in Atlantic salmon {Salmo salar L.) and cross-species amplification in others salmonids // Molecular Ecology. 2000. V. 9. P. 21752178.

55. Chen J.-P., Sun D.-J., Dong Ch.-Zh., et al. Genetic analysis of four wild chum salmon Oncorhynchus keta populations in China based on microsatellite markers // Environmental Biology of Fishes. 2005. V.73. P. 181-188.

56. Estoup A., Presa P., Kreig F., Viaman D., Guyomard R. (CT) and (GT) microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout) //Heredity. 1993. V. 71. P. 488-496.

57. Kaev A.V., Romasenko L.V. Some results of studying chum salmon in Ilushin and Sernovodka rivers on the Kunashir Island (Kuril Islands) // NPAFC. 2003. Doc. .670. P. 1-14.

58. Lewis P.O., Zaykin D. Genetic Data Analysis: Computer program for the analysis of allelic data. Version 1.0 (dl6c). (Free program distributed by the authors from http://lewis.eeb.uconn.edu/lewishome/software.html). 2001.

59. Peacock A.C., Bunting S.L., Queen K.G. Serum protein electrophoresis in acrylamide gel: patterns from normal human subjects // Science.1965, V.147. P. 1451-1452.

60. Ridgway G.L., Shernburne S.W., Levis R.D. Polymorphism in the serum esterases of Atlantic herring // Trans. Am. Fish. Soc. 1970. V.99. P. 147151.

61. Sanchez J.A., Clabby C., Ramos D., Blanco G., Flavin F., Vazquez E., Powell R. Protein and microsatellite single locus variability in Salmo salar L. (Atlantic salmon) // Heredity. 1996. V. 77. P.423-432.

62. Sato S., Ando J., Ando H., Urawa S., Urano A., Abe S. Genetic variation among Japanese populations of chum salmon inferred from nucleotide sequences of the mitochondrial DNA control region // 2001. Zool. Sci. V. 18. P. 99-106.

63. Sato S., Kojima H., Ando J. Genetic population structure of chum salmon inferred from mitochondrial DNA sequence variation // Environ. Biol. Fishes. 2004a. V. 69. P. 37-50.

64. Schlotterer C. Microsatellites // Molecular Genetic Analysis of Populations ed. Hoelzel A.R., Oxford University Press. 1998. P. 237-260.

65. Scribner K.T., Gust J.R. and Fields R.L. Isolation and cycracterrization of novel salmon microsatellite loci: cross-species amplification and population genetic applications // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1996.V.53. P. 833-841.

66. Seeb, L.W. and Crane P.A. High genetic heterogeneity in chum salmon in Western Alaska, the contact zone between northern and southern lineages // Trans. Amer. Fish. Soc. 1999.V. 128. P. 58-87.

67. Seeb L.W., Crane P.A., Kondzela Ch.M., Wilmot R.L., Urawa Sh., Varnavskaya N.V., and Seeb J.E. Migration of Pacific Rim chum salmon of the high seas: insights from genetic data // Environmental Biology of Fishes. 2004. V. 69. P. 21-36.

68. Shaklee J.B., Allendorf F.W., Morizot D.C., Whitt G.S. Gene nomenclature for protein-coding loci in fish // Trans. Amer. Fish. Soc. 1990. V.119. P. 283292. ;

69. Shaw P.W., Turan C., Wright J.M. et. al. Microsatellite DNA analysis of population structure in atlantic herring {Clupea harengus), with direct comparison to allozyme and mtDNA RFLP analysis // Heredity. 1999. V. 83. P. 490-499.

70. Show C.R., Prasad R. Starch gel electrophoresis of enzymes a compilation of recipes//Biochem. Genet. 1970. V.4. P. 297-320.

71. Small M.P., Beacham T.D., Withler R.E., Nelson R.J. Discriminating coho salmon (Oncorhynchus kisutch) populations within Fraser River, British Columbia, using microsatellite DNA markers // Molecular Ecology. 1998. V.7. №2. P.141-155.

72. Smith C.T., Koop B.F., Nelson RJ. Isolation and characterization of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) microsatellites and their use in other salmonids //MolecularEcology. 1998. V.7. № 11. P. 1614-1616.

73. Smith C.T., Seeb L.W., Seeb J.E. Use of sequence data from rainbow trout and Atlantic salmon for SNP detection in Pacific Salmon // Molecular Ecology . 2005. V. 44. P.4193-4203.

74. Springer M. SNPs a great catch for salmon genotyping // American Laboratory. 2006. V. 38, Num.10. P. 34-38.

75. SPSS for Windows. Release 11.5.0 . Standard version. 2002 // SPSS Inc.

76. Weber J.L., Wong J. Mutation of human short tandem repeats // Human Molecular Genetics. 1993. V. 2. P. 1123-1128.

77. Weir B.S. Genetic Data Analysis II. Methods for Discrete Population Genetic Data // Sinauer Ass., Sunderland Mass. 1996. 445 p.

78. Wilson A.C., Cann R.L., Carr S.M., et.al. Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics //Biological J. of the Linnean Society . 1985. V. 26. P. 375-400.

79. Wirth T., Bernatchez L. Genetics evidence against panmixia in the European eel //.Nature. 2001. V. 409. P. 1037-1040.