Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая структура нерки, Oncorhynchus nerka (Walbaum), полуострова Камчатка

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая структура нерки, Oncorhynchus nerka (Walbaum), полуострова Камчатка"

На правах рукописи

ПИЛЬГАНЧУК Оксана Александровна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА НЕРКИ, ОЖОШГГЖНт №ПКА (\VALBAUM), ПОЛУОСТРОВА КАМЧАТКА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005554227

Петропавловск-Камчатский - 2014

005554227

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Шпигальская Нина Юрьевна Официальные оппоненты:

Олейник Алла Геннадьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики

Зеленина Дарья Александровна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии», ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова Российской академии наук

Защита состоится « 26 » сентября 2014 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета Д.005.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17. Факс: (423)2310-900, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук (http://www.imb.dvo.ru/arch/r_260314.htm)

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru Автореферат разослан « » июня 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ващенко Марина Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тихоокеанские лососи (род Oncorhynchns) наиболее значимые в промысловом отношении объекты ихтиофауны для многих государств, расположенных на побережье Тихоокеанского бассейна и, главным образом, России. В 30-40-е годы XX в. их уловы достигали 500-600 тыс. тонн (Кляшторин, 2000). Тихоокеанские лососи относятся к анадромным видам рыб, нерестятся один раз в течение жизненного цикла в реках или озерах, молодь мигрирует в Тихий океан, где нагуливается от одного до пяти лет и возвращается обратно к местам нереста. Представителям этого рода свойственна сложная популяционная организация.

Нерка Oncorhynchus nerka (Walbaum) — на территории России третий по численности вид тихоокеанских лососей (Burgner, 1991; Синяков, 2006). Наиболее важные и многочисленные стада азиатской части ареала воспроизводятся на Камчатке, в бассейнах оз. Курильское и р. Камчатка.

Для сохранения и увеличения запасов нерки необходимы детальные и всесторонние исследования популяционных комплексов этого сложно организованного вида, результаты которых позволят разработать рекомендации и создать оптимальные условия для эксплуатации и воспроизводства стад, рационального ведения промысла в прибрежной зоне и нерестовых реках. Полученная информация поможет понять эволюционные закономерности формирования популяционной структуры и видового ареала.

Для регулирования морского промысла на международном уровне, распределения промысловой нагрузки, описания путей миграций, определения происхождения браконьерских уловов необходимо идентифицировать локальные стада разных регионов в смешанных скоплениях молоди и производителей.

В современных условиях одними из самых эффективных и точных методов идентификации являются молекулярно-генетические. Анализ на основе аллельной изменчивости микросателлитной ДНК наиболее часто и успешно в последние два десятилетия используется в популяционно-генетических исследованиях различных видов рыб, в том числе лососевых (Beacham et al., 1998, 1999, 2000, 2006а,b; Афанасьев и др., 2006; Варнавская, 2006; Хрусталева, 2007; Животовский, 2013).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является оценка уровня дифференциации нерки Камчатки по микросателлитным локусам и возможности региональной идентификации смешанных уловов по данной системе популяционно-генетических маркеров.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. осуществить апробацию и подбор дифференцирующих микросателлитных локусов;

2. оценить степень внутри- и межпопуляционной изменчивости нерки Восточной Камчатки;

3. оценить гетерогенность нерки бассейна оз. Курильское;

4. оценить темпоральную стабильность микросателлитных локусов как системы популяционных маркеров;

5. определить разрешающую способность полученной базы реперных данных и провести ее апробацию на примере смешанных выборок молоди и производителей.

Научная новизна. Апробированы тридцать шесть микросателлитных локусов, из них для анализа нерки Камчатки было отобрано девятнадцать, использование которых в исследовании популяций данного региона представляется перспективным. Показана временная устойчивость использованной системы маркеров в течение более чем десятилетнего периода, что позволяет использовать для идентификации смешанных скоплений единожды созданные базы данных.

Впервые методами молекулярно генетического анализа (микросателлитные последовательности ДНК) исследована нерка рек Навыринваям, Хайлюля, Апука, Пономарка, верхнего течения р. Камчатка и озера Саранное (Командорские о-ва). Показано соответствие степени генетического сходства всех исследованных популяций их географической близости, выявлено наличие достоверной корреляционной связи между географическими расстояниями и величиной генетических различий. В соответствии с генетической дифференциацией нерки восточного побережья Камчатки, выделены пять региональных групп, уровень различия между которыми превышает уровень межпопуляционной изменчивости.

На основании анализа частот микросателлитных локусов оценена гетерогенность нерестового хода в р. Озерная. Особей, анадромная миграция которых проходит до середины июля, с большой степенью вероятности можно охарактеризовать как раннюю речную форму.

Продемонстрирована возможность идентификации выделенных популяционных групп восточного побережья Камчатки в смешанных уловах молоди нерки в западной части Берингова моря и производителей ранней и поздней форм нерки в течение нерестового хода в р. Озерная.

Практическая значимость. Аллельные частоты микросателлитных локусов использованы для создания реперной базы данных в целях индивидуальной и популяционной идентификации особей нерки в смешанных скоплениях, а так же генетического мониторинга исследованных популяций и популяционных комплексов. Данные по составу траловых уловов молоди в Беринговом море могут служить

основой для количественной оценки особей из выявленных популяционных групп: «оз. Азабачье», «бассейн р. Камчатка», «Карагинский р-н», «север Олюторского р-на» и «Командорские о-ва» и, в дальнейшем, использоваться для прогноза численности производителей в соответствующих районах Восточной Камчатки.

Полученные результаты также могут быть использованы с целью получения идентификационных оценок уловов в р. Озерная и пропорционального распределения промысловой нагрузки на субпопуляции нерки бассейна оз. Курильское, т.е. рациональной эксплуатации данного запаса с учетом популяционной структуры и сохранения природного биоразнообразия.

Основные положения, выносимые на защиту:

- определен набор наиболее информативных для популяционно-генстических исследований нерки Камчатки микросателлитных локусов;

- выявлена значительная дифференциация нерки восточного побережья Камчатки по частотам аллелей микросателлитных локусов, генетическое сходство популяций соответствует их географической близости, имеет место достоверная связь между географическими расстояниями и величинами популяционно-генетических различий;

- нерка оз. Курильское (бассейн р. Озерная) представлена несколькими сезонно-экологическими формами, генетическая изменчивость которых отражена в гетерогенности особей различных периодов нерестового хода в р. Озерная;

- показано, что микросателлитная ДНК является темпорально стабильным маркером популяционной изменчивости, что позволяет длительное время использовать единожды созданные базы реперных данных при осуществлении идентификационных оценок;

- на основе изменчивости частот аллелей микросателлитных локусов в популяциях нерки Камчатки возможно с достаточно высокой точностью идентифицировать в смешанных выборках популяционные группы восточного побережья и сезонно-экологические формы бассейна оз. Курильское.

Апробация результатов. Основные положения и результаты работы были представлены на X Всероссийском популяционном семинаре «Современное состояние и пути развития популяционной биологии» (Ижевск, 17-22 ноября 2008 г.), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 21-28 июня 2009 г.), Всероссийской научной конференции «Водные биологические ресурсы северной части Тихого океана: состояние, мониторинг, управление» (Петропавловск-Камчатский, 26-27 сентября 2012 г.), Международной рабочей группе Северотихоокеанской комиссии по анадромным видам рыб (NPAFC) «International Workshope on Application of Stock Identification in Defining Marine Distribution and

Migration of Salmon» (Санкт-Петербург, 7-12 октября 2012 г.), отчетной сессии ФГУП «КамчатНИРО» по итогам научно-исследовательских работ в 2012 г. (Петропавловск-Камчатский, 2013 г.), а также в виде научных годовых отчетов ФГУП «КамчатНИРО» в 2000-2001 гг. и 2007-2009 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в числе которых 5 статей в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора или кандидата наук».

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах исследования. Диссертация написана лично автором с использованием собственных результатов, а так же самостоятельного анализа находящихся в свободном доступе данных, ранее опубликованных Н.В. Варнавской (2006). Доля личного участия в экспериментальных исследованиях составила не менее 90%.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах, состоит из введения, обзора литературы (гл. 1), характеристики материалов и методов (гл. 2), результатов и обсуждения (гл. 3-6), заключения, выводов, списка литературы, включающего 220 цитированных источников, из которых 108 на английском языке. Работа иллюстрирована 37-ю рисунками и содержит 25 таблиц.

Благодарности. Автор выражает признательность научному руководителю — Н.Ю. Шпигальской, за создание творческой атмосферы, советы и всестороннюю помощь в организации и проведении исследований, обобщении и анализе результатов. Автор искренне благодарен д.б.н. Н.В. Варнавской, под руководством которой были начаты исследования популяционной структуры нерки, и оказавшей влияние на формирование научного мировоззрения и становление автора как самостоятельного исследователя.

Автор благодарен коллективу лаборатории: У.О. Муравской, В.В. Савенкову, A.C. Кустовой, А.И. Косицыной за моральную поддержку и неослабевающий интерес к работе, и отдельно О.Н. Сараванскому за многолетнее совместное сотрудничество, помощь в выделении ДНК, обучение технике сбора материала в полевых условиях.

Автор искренне признателен сотрудникам лаборатории генетических проблем идентификации Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН за неоценимую помощь в освоении методики анализа изменчивости микросателлитных локусов, а так же сотрудникам ФГУП «КамчатНИРО», принимавшим участие в сборе материала в сложных условиях Камчатки — В.А Дубынину, А.Н. Климову, Г.В. Базаркину, С.А. Травину, И.Н. Сиротенко, И.В. Шатило, E.H. Збоевой, C.B. Шубкину, А.Н. Ходько, В.А. Романову.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Настоящая глава состоит из двух разделов. В первом разделе на основе литературных данных кратко изложены сведения по биологии нерки, дан обзор работ, посвященных проблемам структуры этого вида.

Таблица 2.1. Места сбора и объем проанализированного Во втором раз-материала при исследовании популяционно-генетической деле приводится

описание характерных особенностей основных ДНК-маркеров, которые успешно используются при проведении попу-ционно-генетичес-ких исследований тихоокеанских лососей.

Глава 2. ХАРАКТЕРИСТКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал Всего в процессе работы было проанализировано 39 выборок нерки из нерестовых водоемов п-ова Камчатка и морских смешанных скоплений в количестве 1946 экземпляров (табл. 2.1).

изменчивости нерки Камчатки

№ Локальность Дата сбора Кол-во, экз.

1 2 Оз. Азабачье (бас. р. Камчатка) р. Пономарка р. Бушуйка 30.06.2009 14.08.2010 50 48

3 4 5 6 Бас. р. Камчатка р. Камчатка (верховья) р. Киревна р. Еловка оз. Двухюрточное 01.07.2009 24.07.2003 18.06.2010 13.07.2003 50 50 50 50

7 8 9 Карагинский залив р. Хайлюля р. Ивашка р. Навыринваям 7-10.07.2010 23.07.2010 02.10.2010 48 50 50

10 11 12 Олюторский залив р. Апука лагуна Анана лагуна Северная 26.0501.06.2010 06.07.2010 23.06.2010 46 48 48

13 Командорские о-ва оз. Саранное 14.06.2011 50

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Бас. оз. Курильское р. Озерная р. Озерная р. Озерная р. Озерная оз. Курильское, РУЗ оз. Курильское, РУЗ р. Выченкия* Р. Кирушутк* р. Кирушутк* бух. Южная* бух. Южная* бух. Озерная* бух. Северная ближняя* р. Гаврюшка* бух. Гаврюшка* бух. Гаврюшка* бух. Гаврюшка, * р. Этамынк* бух. Северная дальняя* бух. Хакыцин* бух. Оладочная* бух. Оладочная* 13.07.2011 02.08.2011 22.07.2011 16.08.2011 06.08.2010 25.08.2010 28.07.2000 15.08.1989 31.07.2000 28.08.2000 24.08.1989 09.10.2000 09.10.2000 02.08.2000 23.08.1989 17.08.2000 18.08.2000 05.08.2000 30.08.2000 31.08.2000 23.09.1989 08.10.2000 50 50 50 50 50 50 100 72 50 53 50 50 50 50 35 50 50 50 50 50 45 50

36 37 38 39 Морские смешанные выборки 51°52'1" с.ш., 161°36'7" в.д 54°40'4" с.ш., 162°50'5" в.д 58°24'2" с.ш., 165°08'7" в.д 55°29'9" с.ш., 164°48'1" в.д 22.10.2010 20.10.2010 15.10.2010 16.10.2010 48 43 28 34

Всего 1946

Примечание. РУЗ - рыбоучетное заграждение; * - использованы опубликованные данные по частотам аллелей микросателлитных локусов (Варнавская, 2006).

В исследовании так же использованы опубликованные ранее Н.В. Варнавской частоты аллелей микросателлитных локусов в 16 выборках нерки (855 экз.) с нерестилищ оз. Курильское (1989 и 2000 гг.) (Варнавская, 2006).

Весь материал из нерестовых водоемов включает только производителей нерки. Морские смешанные выборки — это молодь из нагульных скоплений. Тканевые пробы — фрагменты грудных плавников или сердечной мышцы, отбирали у недавно пойманных рыб и фиксировали в 96% этаноле. Пробы хранили в низкотемпературной морозильной камере (от -40 до -70 °С).

Молекулярно-генетические методы Выделение и очистку тотальной ДНК проводили стандартным способом с использованием метода протеиназного гидролиза в присутствии додецил сульфата натрия (SDS) (Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989; Коничев и др., 2012). Амплификацию проводили с использованием наборов, содержащих готовую лнофилизированную смесь для полимеразной цепной реакции (ПЦР) — Gene Рак PCR Core (ООО «ИзоГен»), ПЦР проводили по ранее описанной для кеты схеме (Афанасьев и др. 2008). Продукты амплификации разделяли в 6% неденатурирующем полиакриламидном геле в 0.5х ТБЕ-буфере (рН 8.0) с помощью вертикального электрофореза при постоянном напряжении 300 В в теченне 2.0-3.5 ч. В качестве маркера длины фрагментов использовали ДНК плазмиды pBR322, обработанную рестриктазами Hpall или НавIII (ООО «СибЭнзим»). С целью подбора полиморфных и достаточно объективно интерпретируемых микросателлитных маркеров популяционной структуры нерки Камчатки были апробированы тридцать шесть локусов, из них для анализа генетической изменчивости выборок нерки из р. Озерная было отобрано девятнадцать — Okila, Okilb, OtsGG8, Oís 107, Oki6, One 104, One 109, Omyll, Oív 100, 0tól03, One 105, OtsG253, ОттМПО, O tú, 0/sl08, Omy№7, ОШЗ, OmyiOX, OísGS5, характеризующихся достаточно высоким уровнем полиморфизма. Для анализа нерки восточного побережья Камчатки были отобраны восемь полиморфных микросателлитов — О Is [01, Oki la, OkiVo, OnelO 4, One 109, OlsG6S, OtsGS5, Oki6, использование которых в исследовании популяций данного региона представляется достаточно перспективным.

Методы статистического анализа В программном пакете GDA рассчитывали частоту аллелей, ожидаемую Не и наблюдаемую Н„ гетерозиготности, среднее число аллелей на локус, оценку межпопуляционной дифференциации (0„), бутстрэп-интервал для 0st, индекс фиксации /, а также соответствие распределению Харди-Вайнберга (Lewis, Zaykin, 2001). Показатель генетической дифференциации — Fsl, был рассчитан с помощью специализированного макроса GenALExó для MS-Excel (Peakall, Smouse, 2006) и

программы Arlequin2000 (Schneider et al., 2000). Для оценки внутри- и межпопуляционной изменчивости, а также различий между группами популяций использовали программу AMOVA в пакете программ Arlequin2000. Оценка генетического разнообразия проведена с использованием информационного индекса разнообразия Шеннона-Уивера (Schennon, Weaver, 1949; Lewontin, 1972; Chalmers, 1992) в специализированном макросе для MS-Excel GenALExö. Генетическую гетерогенность выборок оценивали с помощью критерия х (Лакин, 1990; Животовский, 1991) и критерия «G-тест» (log-likelihood analysis) (Sokal, Rolf, 1981).

В качестве меры количественной оценки различий между популяциями использовали генетические расстояния по методу Нея (Nei, 1972, 1987), а также хордовые генетические расстояния по Кавалли-Сфорца и Эдвардса (Cavalli-Sforza, Edvards, 1967), которые рассчитывали с использованием программы NTSYS 2.0 (Rohlf, 1998). На основе матриц генетических расстояний выполняли кластерный анализ, с представлением его результатов в виде COMPLET-дендрограмм (Sneath, Sokal, 1973), а также NJ-дендрограмм (Saitou, Nei, 1987) в программах GDA и NTS YS 2.0. Бутстреп-тест выполняли в пакете программ PHYLIP (Felsenstein, 2004). Графическое изображение дендрограмм было получено в программе TreeView (http://taxonorny.zoology.gla.ac.uk/rod/rteeview.html). Оценка генетического сходства популяций также проводилась методом многомерного шкалирования (NTSYS 2.0).

Для оценки точности определения популяционной и региональной принадлежности смешанных выборок из уловов траловой съемки и промышленных речных неводов использовали метод анализа симулированных выборок по нулевому сценарию в программе SPAM (Masuda et al., 1991). Программу SPAM использовали также для идентификации состава смешанных выборок.

Географические расстояния между водоемами, в которых были отобраны выборки, определяли в картографическом программном обеспечении Garmin MapSourse, Version 6.5 (http://www.garmin.com/software/MapSource_65beta.exe).

Глава 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ НЕРКИ ВОСТОЧНОЙ

КАМЧАТКИ

Характеристика уровня изменчивости микросателлитов

Мнкросателлитные локусы, отобранные для проведения исследования нерки Восточной Камчатки и Командорских о-вов, позволили получить хорошо воспроизводимые информативные профили известных фрагментов генома, характеризующихся удобными для интерпретации размерами (от 74 до 242 п. н.) (табл. 3.1). Семь из восьми локусов имеют тетрануклеотидные повторы, ОШ6 является динуклеотидом.

В ряду выборок (р. Пономарка, р. Киревна, оз. Двухюрточное и лагуна Анапа) по одному или двум из исследованных локусов наблюдались значимые отклонения от равновесия Харди-Вайнберга. Оценки гетерозиготности по всем, включенным в анализ выборкам, наиболее высоки для локусов 0/геЮ4, 0/лС85, наименьшие значения получены для локуса (9/5107. Наиболее значительный дефицит гетерозигот отмечен для локусов Од? 107 и О И1Ь (индекс фиксации 0.174 и 0.113, соответственно).

Таблица 3.1. Характеристика микросателлитных локусов нерки восточного побережья Камчатки и Командорских островов, показатель дифференциации 0К, (%)

Локус Число аллелей/ число исследованных экз. Размер фрагмента, п. н. Не Н0 / Восточное побережье Камчатки Восточное побережье Камчатки [г оз. Саранное

Ots 107 9/635 84-132 0.370 0.306 0.174 9.78 9.79

Oki\ а 8/624 124-160 0.506 0.492 0.027 1.56 2.89

O/d lb 5/626 104-120 0.475 0.422 0.113 6.33 7.00

One104 24/624 104-204 0.929 0.902 0.029 1.48 1.60

One 109 18/620 108-180 0.887 0.845 0.047 1.18 1.38

0/$G68 8/629 128-156 0.570 0.552 0.031 5.12 6.67

ошв 9/619 74-100 0.531 0.493 0.073 3.55 3.22

OtsG 85 26/605 128-242 0.925 0.937 -0.014 0.46 0.47

Среднее 13.4/622 0.649 0.619 0.047 2.93 3.30

95%-ный бутстреп интервал 1.60-5.00 1.78-5.56

Примечание, п. н. - пары нуклеотидов, Не - средняя ожидаемая гетерознготность, Н„ - средняя наблюдаемая гетерознготность,/- индекс фиксации.

Одним из возможных объяснений недостатка гетерозигот может являться «эффект Валунда». Однако еще более вероятным представляется наличие нуль-аллелей, возникающих в результате мутаций во фланкирующей микросателлнтный локус области.

Характеристики генетической изменчивости выборок из исследованных популяций представлены на рис. 3.1. В соответствии с приведенными данными, выборки из нерестовых водоемов северной части исследуемого региона — Карагинского и Олюторского районов, характеризуются меньшим количеством аллелей и меньшей гетерозиготностью по сравнению с выборками из бассейна р. Камчатка.

Оценки генетического разнообразия выборок — индекс Шеннона-Уивера, варьировали в популяциях восточного побережья Камчатки от 1.33±0.312 (р. Апука) до 1.54±0.329 (р. Киревна), при среднем значении 1.42±0.317. В целом, можно отметить относительно низкие значения данного показателя в выборках из северных рек (Карагинский и Олюторскнй районы) по сравнению с бассейном р. Камчатка. Для командорской популяции индекс Шеннона-Уивера составил 1.36±0.331, и оказался сходным с величинами данного показателя в водоемах Карагинского и Олюторского районов.

Пространственная

изменчивость аллельных частот

Нерка, как и все представители рода тихоокеанских лососей, в морской период жизни совершает обширные миграции, охватывающие большую часть Рис. 3.1. Аллельные профили нерестовых популяций нерки

восточного побережья Камчатки и Командорских о-вов (Na - субарктической зоны среднее число аллелей на локус; Na > 5% - среднее число тихого океана Для информативных аллелей на локус; Ne - среднее число

эффективных аллелей на локус). многих популяций

рыб, в том числе и для лососей, известны случаи постепенного изменения генных частот в широтном, или в каком-либо другом направлении (Withler, 1985; Кирпичников, 1987; Olsen et al., 1998a,b; Seeb, Crane, 1999; Варнавская, 2006 и т.д.).

В настоящем исследовании по частотам аллелей микросателлитных локусов рассчитаны генетические дистанции Нея между выборками, а также значения F„ при попарном их сравнении. Были определены географические расстояния между устьями рек, в которых отобраны выборки. Между генетическими дистанциями, коэффициентами Fs, и географической удаленностью популяций Восточной Камчатки рассчитали коэффициенты корреляции.

В результате обоих вариантов анализа выявлено наличие связи между географическими расстояниями и величиной генетических различий. С увеличением географических расстояний между нерестовыми водоемами возрастают генетические различия между локальными популяциями — показатели генетических дистанций Нея и коэффициенты Fsl (рис. 3.2). Поскольку у нерки различают реофильные (нерестящиеся в реках) и озерные (нерестящиеся на литорали и в притоках озер) формы, речные выборки были проанализированы отдельно. Для выборок из рек коэффициенты корреляции между географическим расстоянием и показателями генетических различий оказались несколько выше, чем при анализе всей совокупности исследованного материала.

Для анализа географической изменчивости был рассчитан коэффициент корреляции между частотами всех аллелей исследованных локусов и географической широтой водоемов, в которых отбирались пробы. Значимая связь между частотой

11=0.613 р<0.05

• •

¿у .Л->

К=0.677 р<0.05

• • «• •

- > •• Л-" 4 • •

встречаемости аллелей в выборках и значениями широты соответствующих водоемов была обнаружена в 18 из 107 (19.26%) вариантов анализа. Только для одного из исследованных локу-сов — ОМ1а, корреля-

Рис. 3.2. Корреляция между географическим расстоянием (ось абсцисс, км) и значениями (ось ординат) при попарных сравнениях всех исследованных выборок нерки восточного побережья Камчатки (слева) и только выборок из нерестовых рек (справа).

ции частот аллелей с географической широтой выявлено не было. У трех локусов (0/^107, О/с/1Ь, ОИ6) в широтном направлении изменяются частоты ярко выраженных доминирующих аллелей (рис. 3.3).

1 - р. Пономарка

2 - р. Бушуйка

3 - р. Камчатка (верхов!.«)

4 - р. Кнрсвна

5 - р. Еловка

6 - оз. Двухюрточное

7 - р. Ивашка

8 - р. Хайлюля

9 - р. Навыринваям 10- р. Аиука

] 1 - лаг. Лиана 12 - лаг. Северная

Рис. 3.3. Изменчивость частот доминирующих аллелей трех микросателлитных локусов, значимо коррелирующих с географической широтой нерестовых водоемов (круговые дендрограммы располагаются снизу вверх, согласно порядковым номерам выборок).

Межпопуляционная генетическая дифференциация

В настоящей работе на основе изменчивости частот восьми микросателлитных локусов был рассчитан показатель дифференциации — для популяций нерки восточного побережья Камчатки и для этих же популяций, включая дополнительно выборку из оз. Сарайное (о. Беринга, Командорские о-ва). Средние значения величины межпопуляционной дифференциации (в,,) по восьми локусам для двух вышеуказанных вариантов анализа составили 2.93 и 3.30%, соответственно (табл. 3.1), и оказались статистически значимыми (95%-ный бутстреп-интервал положительный).

Представление полученных результатов в виде бескорневого Ш-дерева отражает четкое соответствие генетических различий географической удаленности исследованных локальностей и последовательность формирования (заселения) водоемов неркой с юга на север (рис. 3.4). Относительная обособленность рек Пономарка и Бушуйка (бассейн оз. Азабачье), вероятно, может объясняться принадлежностью нерестящихся в них особей не к речной, а к озерной форме.

Кластеризация выборок нерки Восточной Камчатки, выполненная по хордовым дистанциям Кавалли-Сфорца и Эдвардса и представленная в виде консенсусного N.1-дерева. также, позволяет выделить два основных кластера с высокой бутстреп-поддержкой (80%) — бассейн р. Камчатка и северо-восточные популяции (Карагинский, Олюторский районы).

Рис. 3.4. Ю-дендрограмма, построенная по дистанциям Нея. и отражающая соответствие степени генетического сходства популяций их географической близости.

Использование многомерного шкалирования на основе дистанций Нея (рис. 3.5) позволило в пределах группы выборок из бассейна р. Камчатка более четко выделить оз. Азабачье (рр. Бушуйка и Пономарка), а северо-восточные популяции разделить на два кластера, соответствующие их географическому положению. Таким образом, включенные в анализ выборки образовали пять относительно дифференцированных групп — «оз. Азабачье», «бассейн р. Камчатка», «Карагинский р-н» (включающий р. Навыринваям, расположенную на юге Олюторского р-на), «север Олюторского р-на» и «Командорские о-ва».

ф бас. оз. Азабачье бас. р. Камчатка ф Карагинский р-н . юг Олюторского р-на о. Беринга

север Олюторского р-на

Рис. 3.5. Результаты многомерного шкалирования выборок из восточнокамчатских популяций нерки (генетические дистанции Нея).

Для количественной оценки величины генетических различий между выделенными группами провели иерархический анализ молекулярной вариансы, для чего разложили общую молекулярную дисперсию на три иерархических уровня. Было показано, что основная часть молекулярного разнообразия (95.47%) имеет место внутри выборок, на долю межгрупповой компоненты приходится 3.33%, что значительно превосходит дисперсию между выборками внутри групп (1.20%).

Дифференциация популяцион-ных групп статистически значима во всех случаях попарных сравнений по критерию

Следует отметить, что по исследованным микросателлитам величины заметно различаются, и в ряде случаев относительно малоинформативные локусы вносят значительный вклад в межгрупповую дифференциацию. Так, по Oki 1а имеют место значительные различия между особями групп «оз. Азабачье» и «Командорские о-ва», по локусу Oki6 — групп «бас. р. Камчатка» и «север Олюторского р-на».

При формировании наборов маркеров для анализа генетической изменчивости популяций в пределах пяти выделенных групп, необходимо учитывать, что вклад отдельных локусов во внутригрупповую (межпопу-ляционную) дифференциацию неодинаков (рис. 3.6).

Таким образом, исходя из вышеизложенного, можно заключить, что нерка исследованных локальностей Восточной Камчатки харак-

э 6%

иДЛл.ляд!

Jku

4 5 6 7 8 В Группах» 1 □ Групла№ 2 Ш) Группа№ 3 □Грушш№4

Рис. 3.6. Вклад отдельных локусов в дифференциацию популяций в пределах каждой из четырех выделенных групп (<?„, %); I - Ом 107, 2 - ОН 1а, 3 - ОШЪ, 4 - Опе 104, 5 - Опе 109, 6 - 0(лв68, 7 - ОМ6, 8 - Окв85; группы выборок: № 1 - «оз. Азабачье», № 2 - «бассейн р. Камчатка», № 3 - «Карагинский р-н, юг Олюторского р-на», № 4 «север Олюторского р-на».

теризуется статистически значимой неоднородностью распределения частот аллелей микросателлитных локусов. Имеет место соответствие степени генетического сходства популяций их географической близости. Уровень различий между популяционными группами значительно превышает уровень межпопуляционной дифференциации.

Глава 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ НЕРКИ ЗАПАДНОЙ КАМЧАТКИ (на примере бассейна р. Озерная) Дифференциация сезонно-экологических форм нерки оз. Курильское (бассейн р. Озерная)

Долгое время существовала точка зрения, что озерновское стадо нерки однородно и представлено только одной сезонной расой — поздней (Егорова, 1970, 1977; Селифонова, 1978; Крогиус, 1983). Однако по результатам анализа аллозимных генов были выявлены отличия между выборками различного времени нерестового хода (Мацак, 1983а,б, 1989; Варнавская, 1988а, 2006).

В настоящей работе был проведен сравнительный анализ выборок нерки с

Рис. 4.1. Результаты многомерного шкалирования выборок из бассейна оз. Ку- литоральных и речных типов нерестилищ в

рильское 1989 и 2000 гг. на основе бассейне оз. Курильское, относящихся к раз хордовых дистанций. Красным цветом

обозначены речные выборки раннего хода, личным периодам нерестового хода.

синим литоральные раннего хода, Результаты подтвердили наибольшее гене-зеленым - литоральные позднего хода.

тическое своеобразие нерки раннего времени хода и позволили выделить выборки из рр. Кирушутк, Выченкия, Этамынк и Гаврюшка, относящиеся к ранней речной форме, в достаточно обособленную группу (рис. 4.1).

Характеристика дискриминирующей способности микросателлитных локусов

нерки бассейна р. Озерная

Массовый ход нерки в р. Озерная наблюдается с середины июля до начала сентября, рунный ход — с конца июля по середину августа. Для проведения исследования были отобраны четыре выборки производителей нерки из уловов закидных неводов в нижнем течении реки, относящихся к различным периодам нерестового хода. Особи, пойманные 13.07.2011, условно отнесены к «ранним», а выборка от 16.08.2011, считалась «поздней».

Таблица 4.1. Характеристика 19 микросателлит-ных локусов «ранней» и «поздней» выборок нерки

№ п/п Число Размер

Локус алле- фрагмента. Не Н0 / в*

лей п. н.

1 OkiU 4 144-160 0.463 0.495 -0.069 5.96

2 ОкИЪ 4 108-120 0.513 0.606 -0.183 1.20

3 OtóG68 6 136-152 0.561 0.542 0.034 1.48

4 Otó 107 4 88-120 0.257 0.253 0.018 2.87

5 от 4 76-92 0.432 0.417 0.036 6.71

6 One 104 18 120-188 0.910 0.926 -0.018 0.86

7 One 109 16 120-180 0.903 0.857 0.051 0.62

8 Omyll 6 105-121 0.554 0.528 0.046 -0.10

9 Otó 100 13 156-200 0.819 0.740 0.097 -0.27

10 Otó 103 25 108-232 0.928 0.865 0.069 -0.24

11 One 105 8 126-154 0.656 0.680 -0.036 0.25

12 OtóG253 13 114-158 0.823 0.828 -0.006 -0.76

13 Отт 1070 21 144-260 0.898 0.818 0.089 0.04

14 0/5 3 6 76-98 0.308 0.327 -0.060 7.10

15 О/.? 108 17 176-242 0.913 0.860 0.059 -0.03

16 Оту 1037 7 193-221 0.621 0.560 0.098 0.05

17 Oki 23 3 218-238 0.539 0.470 0.129 0.00

18 ОтуЗО 1 4 64-70 0.134 0.140 -0.048 2.56

19 OtóG85 15 152-208 0.889 0.882 0.008 0.23

Среднее 10.21 0.639 0.621 0.029 0.95

95%-ный бутстреп-интервал

0.2-2.0

Примечание, п. н. - пары нуклеотидов, Не - средняя ожидаемая гетерозиготность, Н„ - средняя наблюдаемая гетерозиготность, / - индекс фиксации, показатель дифференциации - <?„, в %.

Для анализа генетической изменчивости выборок нерки р. Озерная была проведена апробация тридцати шести микросателлитных локусов. Из них для анализа «ранней» и «поздней» выборок было отобрано девятнадцать (табл. 4.1).

Показатель дифференциации вя по всем локусам составил 0.96% (бутстреп-интервал положительный), что указывает на достоверные отличия частот аллелей в исследованных выборках. Двухмерное распределение «ранней» и «поздней» выборок по принадлежности к собственной популяции на основании анализа полиморфизма 19-ти микросателлитных локусов показано на рисунке 4.2. Разделение особей в соответствии с принадлежностью к собственной популяции (выборке) представленное на основании наличия и частоты встречаемости аллелей микросателлитов, общих для каждой из групп, показало, что обе анализируемые выборки консолидированы и формируют два достаточно обособленных и относительно слабо

Рис. 4.2. Двухмерное распределение «ранней» «поздней» выборок нерки р. Озерная по принадлежности массива. Вероятность к собственной популяции.

перекрывающихся отнесе-

ния особи к собственной популяции (выборке) составила 94%. Тем не менее, наличие между ними перекрывающейся области указывает на отсутствие полной репродуктивной изоляции (рис. 4.2). Таким образом, можно подчеркнуть, что выборки нерки из р. Озерная, собранные с разрывом во времени более месяца, статистически достоверно отличаются по частотам аллелей 19-ти локусов, хотя вклад отдельных локусов в дифференциацию значительно различается.

Полученные результаты позволили для дальнейшего анализа отобрать только семь относительно информативных локусов — О/а 1а, О/а 1Ь, О/яС68, О/я 107, Ок\6, 0/53, 0ту301 (табл. 4.2). Для данных локусов показатель дифференциации в,, превышал 1.0%, находясь в интервале от 1.2% до 7.1% (табл.4.1).

Таблица 4.2. Показатель дифференциации четырех выборок нерки р. Озерная по семи микро-

сателлитным (0«, в %) локусам

Локус

ОН 1а 1.95

ОкПЪ 0.65

Ог$С()& 1.05

О/э 107 0.60

от 1.91

ОА?3 2.82

0ш)'301 1.08

Среднее 1.44

95%-ный 0 9_2 0 бутстреп-интервал

На основе изменчивости частот аллелей семи вышеуказанных локусов были проанализированы особи из четырех выборок различного времени нерестового хода. В соответствии с распределениями частот алельных вариантов, представлен-

Рис. 4.3. Распределение частот семи микросателлитных локусов в выборках нерки р. Озерная различных периодов нерестового хода (по оси абсцисс - размер аллелей (п. н.), ных на рисунке 4.3, в ряде по оси ординат - частота встречаемости аллелей).

случаев имеет место заметная тенденция к уменьшению или увеличению данных

значений в выборках в зависимости от времени их сбора. По семи локусам среднее

значение вл, указывая на значимую дифференциацию выборок, оказалось несколько

выше, чем в предыдущем варианте анализа двух выборок по девятнадцати

микросателлитам, хотя по каждому отдельному локусу величины оценок изменились в меньшую сторону (табл. 4.1 и 4.2).

Гетерогенность нерестового хода нерки р. Озерная

Представление полученных результатов анализа дифференциации четырех, различающихся по времени хода, выборок в виде Ш-дендрограммы, построенной по стандартным генетическим расстояниям Нея, подтвердило генетические различия между неркой раннего и позднего хода — в наибольшей степени отличной от других

Таблица 4.3. Оценки уровня попарной является выборка самой ранней генетической дифференциации между выбор- даты сбора. Статистические ками нерки: - над диагональю (* - различия статистически незначимы, Р>0.05), дистанции Нея - под диагональю

№ Выборка 1 2 3 4

I р. Озерная, ¡3.07 0.009 0.012 0.037

2 р. Озерная, 22.07 0.012 0.006* 0.008*

3 р. Озерная, 02.08 0.015 0.010 0.004*

4 р. Озерная, 16.08 0.039 0.013 0.090

оценки попарных различии представлены в таблице 4.3 и соответствуют предыдущим результатам — выборка от 13.07 значимо отличается от всех остальных.

Глава 5. ОЦЕНКА ТЕМПОРАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ

Результаты совместного анализа выборок из нерестовых водоемов Восточной Камчатки (2003 и 2009-2011 гг.) и из р. Озерная (2010 и 2011 гг.) методом многомерного шкалирования на основе хордовых дистанций по восьми микросателлитным локусам — Ой 107, ОкПа, Ок\ 1Ь, Оле 104, ОпеЮ9, 0й068, ОйС85, ОШ, а также вариант анализа на основе четырех локусов — Ой 107, ОМ 1а, ОкИЪ и ОМ6, позволяющий включить в состав анализируемых локальностей выборки с нерестилищ оз. Курильское 1989 и 2000 гг. сбора (использованы частоты общих для обоих исследований локусов), представлены на рисунке 5.1. Независимо от величины временного интервала между выборками, в первом и во втором вариантах многомерного шкалирования выборки из бассейна оз. Курильское образовали компактные, достаточно обособленные группы, что свидетельствует о меньшей межгодовой генетической изменчивости, чем межпопуляционной и, тем более, межрегиональной. Объяснением того, что при использовании в анализе данных по частотам аллелей четырех локусов, в состав группы выборок бассейна оз. Курильское вошли выборки из рек Карагинского залива, является отсутствие в анализе локусов, дифференцирующих данный регион. Для количественной оценки величины генетических различий между неркой смежных лет воспроизводства выборки из р. Озерная проанализировали, объединив их в две группы — 2010 и 2011 гг. (табл. 5.1). Для исследования использовали частоты восьми микросателлитных локусов. В соответствии с полученными результатами, различия между группами выборок

бас. оз. Азабачье ^^ бас. р. Камчатка

Щ} Карагииский р-н. юг Олюторского р-на

т

о. Беринга север О.иоторскогор-па бас. р.Озерная

Рис. 5.1. Результаты многомерного шкалирования выборок из популяций нерки Камчатки (трехмерные диаграммы построены с использованием хордовых дистанций на основе аллельной изменчивости восьми микросателлитных локусов в выборках из восточно-камчатских популяций и из р. Озерная (2010 и 2011 гг.) - слева, и на основе аллельной изменчивости четырех микросателлитных локусов в выборках из восточно-камчатских популяций и из р. Озерная (1989, 2000, 2010 и 2011 гг.) - справа).

Таблица 5.1. Результаты иерархического анализа генетических различий выборок 2010 и 2011 гг.

Уровень разнообразия с'/ Абсолютные оценки Процент дисперсии

Между выборками 4 0.01677 0.88

Между смежными годами 1 -0.00042 -0.02

Внутри выборок 594 1.89508 99.14

Общее 599 1.91144 100

Таблица 5.2. Оценка темпоральной стабильности аллельных частот микросателлитных локусов в выборках 1989 и 2000 гг. с нерестилищ в бух. Оладочная (литоральная

Локус бух. Оладочная # р. Кирушутк $

ОкПа 0.07 1 1.14 1

ОЫ 16 3.20 4 5.39 3

ошв 0.89 2 2.89 2

О/У 10 8.28 9 29.58* 12

ОМ 1Ь 0.19 1 1.58 1

Ш29 3.89 5 8.98 6

Оту 77 0.17 2 1.37 2

Опе 8 1.97 4 3.58 4

Ой2 5.53 4 7.84 4

ОЫОО 6.31 6 13.51 8

ОЛ5ЮЗ 10.94 1 1 3.35 10

Ой 107 0.76 2 3.35 2

Ой 3 4.80 3 0.48 3

Ой 108 18.31 8 17.2 11

Р<0.05, Л/ - число

степеней

смежных лет отсутствуют.

Для оценки стабильности и воспроизводимости результатов, получаемых на основе изменчивости микросателлитных локусов, были оценены различия выборок нерки, собранных с интервалом в 11 лет на каждом из двух типов нерестилищ в бассейне оз. Курильское — бух. Оладочная (литоральная форма) и р. Кирушутк (речная форма) (табл. 5.2). По результатам в-теста, между выборками 1989 и 2000 гг., отобранными на нерестилище в бух. Оладочная, статистически подтвержденных различий по четырнадцати микросателлитным локусам не выявлено. Отсутствие различий имеет место и для выборок из р. Кирушутк по всем локусам, за исключением наиболее полиморфного ОкИО (69 аллелей), для оценки

Примечание, свободы.

временной устойчивости которого требуется значительное увеличение объема

выборок. Полученные результаты позволили заключить, что данные по частотам аллелей микросателлитных локусов, являющихся темпорально стабильными маркерами популяционной структуры, могут служить эффективным инструментом долговременного мониторинга популяционных генофондов, а так же использоваться для создания устойчивых во времени реперных баз данных 'с целью получения идентификационных оценок при решении практических задач рыбопромысловой науки.

Глава 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОРСКИХ СМЕШАННЫХ ВЫБОРОК НЕРКИ НА ОСНОВЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ АЛЛЕЛЬНЫХ ЧАТОТ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ Оценка разрешающей способности реперных данных

По результатам симуляционного анализа выборок по нулевому сценарию точность популяционной идентификации нерки исследованных локальностей находится в пределах 67.9-82.1%. Наибольшая погрешность (=32%) вероятна при идентификации особей р. Камчатка, имеющих относительно высокий показатель раз-

Таблица 6.1. Оценка регионального состава (в %) нообразия, тогда как с симулированных смешанных выборок Восточной Камчатки точностью 82.1% мож-по восьми микросателлитным локусам (в скобках указано _

ГТЯН71ЯПТНПР птгппнрнирЧ - но определить наиЬолее

однородную популяцию р. Апука. При оценке состава симулированных выборок на уровне популяционных групп выявлено, что точность идентификации в данном случае повышается до 91.8% для северовосточных популяций, и до 89.7% для нерки бассейна р. Камчатка

I вариант анализа

№ Популяционная группа 1 2

1 Северо-восток п-ова Камчатка 91.8 (2.6) 6.9

2 Бассейн р. Камчатка 6.5 89.7,2.8,

Неизвестные 1.7 3.4

Е 100 100

II вариант анализа

№ Популяционная 1 2 3 4 5

1 Оз. Азабачье 87.2(4.6) 2.6 1.5 2.7 3.6

2 Бассейн р. Камчатка 5.3 88.4,3.3) 4.5 2.9 4.1

3 4 Карагинский р-н, юг Олюторского р-на север Олюторского р- 2.1 2.7 3.6 1.9 87.0(4.0) 4.7 5.8 86.9(З.9) 7.1 0.9

5 Командорские о-ва 0.5 0.6 1.4 0.2 80.9,5.8)

Неизвестные 2.2 2.9 0.9 1.5 3.4

I 100 100 100 100 100

(табл. 6.1, I вариант анализа). При раздельном анализе пяти групп популяций восточного побережья Камчатки точность их идентификации снижается по сравнению с объединенным вариантом расчетов (табл. 6.2, II вариант анализа).

Точность идентификации нерки с основных нерестилищ оз. Курильское, относящихся к сезонно-экологическим формам: речные раннего хода, литоральные раннего хода и литоральные позднего хода, находится на уровне 72% (табл. 6.2, I вариант анализа). С еще большей вероятностью можно определять в смешанных

Таблица 6.2. Оценка состава (в %) симулированных выборках долю особей смешанных выборок различных сезонно-экологических различных сезонных

форм нерки оз. Курильское по пяти микросателлитным

локусам (в скобках указано стандартное отклонение)_форм. Точность иден-

I вариант анализа_тификации в данном

варианте анализа превышает 83% (табл. 6.2, II вариант анализа).

Апробация базы реперных данных Апробацию базы реперных данных, созданной на основе частот аллельных вариантов микросателлитных локусов, выявленных в исследованных локальностях, проводили на примере четырех выборок производителей различных периодов нерестового хода из р. Озерная и четырех выборок молоди из траловых уловов НИС «Профессор Кагановский». Выборка производителей нерки из р. Озерная от 13.07 генетически наиболее близка к особям из группы реперных выборок, которые были охарактеризованы как ранняя форма;

№ Сезонно-экологические формы 1 2 3

1 Речные раннего хода 72.9(9.2) 17.2 10.3

2 Литоральные раннего хода 15.2 72.4„.7, 16.3

3 Литоральные позднего хода 11.4 9.9 73.1(9.2)

Неизвестные 0.5 0.5 0.3

Е 100 100 100

II вариант анализа

№ Сезонные формы 1 2

1 Раннего хода 83.4,7. п 15.0

2 Позднего хода 16.1 84.6,8 0)

Неизвестные 0.5 0.4

Е 100 100

Таблица 6.3. Соотношение (в %) производителей ранней и поздней форм нерки в смешанных выборках из уловов закидных неводов в р. Озерная (в скобках указано стандартное отклонение)

выборка р. Озерная от 16.08 почти на 100% состоит из особей поздней формы (табл. 6.3). В целом, можно отметить, что при оценке состава выборок из уловов в устье р. Озерная, начиная со второй половины июля, прослеживается четкая тенденция замещения особей ранней формы представителями поздней.

Оценка регионального состава четырех выборок неполовозрелой нерки из морских смешанных уловов траловых съемок молоди выявила относительно большое число особей с неопределенной региональной принадлежностью — 14,38% (табл. 6.4), что указывает на необходимость продолжения исследований в направлении расширения реперной базы данных и набора информативных популяционных маркеров.

Выборка Доля «ранней» формы Доля «поздней» формы

13.07.2011 84.86(15.5, 15.14(15.1)

22.07.2011 59.15(21.9) 40.85(21.9)

02.08.2011 40.44(24.1) 59.56(24.1)

16.08.2011 00.37(0.1) 99.63,0.1,

Таблица 6.4. Оценка регионального состава (в %) смешанных выборок молоди нерки из траловых уловов (в скобках указано стандартное отклонение)

№ Регион Выборки

15.10.10 16.10.10 20.10.10 22.10.10 Все

1 Бассейн р. Камчатка 30.63(12.2) 52.95,11.7) 21.68,8.7) 28.72,7.8) 32.86,4.8)

2 оз. Азабачье 13.39,7.9) 12.88,9.2) 9.25,5.2) Ю.10,8.4) 13.74,4.1)

3 Карагинский р-н, юг Олюторского р-на 12.31,6.5, 21.69„2.1, 42.03,9.8) 31.07,10.0) 25.74,5.4)

4 север Олюторского р-на 22.24,12.4, 3.66,9.6) 13.09,5.5) 15.53,6.5) 13.28,4 2)

Неизвестные 21.43 8.82 13.95 14.58 14.38

I 100 100 100 100 100

ВЫВОДЫ

1. Определен набор из девятнадцати наиболее информативных для популяционно-генетических исследований нерки Камчатки микросателлитных локусов.

2. Выявлена значительная дифференциация нерки восточного побережья Камчатки по частотам аллелей микросателлитных локусов, генетическое сходство исследованных популяций соответствует их географической близости, имеет место достоверная связь между географическими расстояниями и величинами популяционно-генетических различий.

3. Оценка гетерогенности нерки оз. Курильское на основе аллельной изменчивости микросателлитных локусов подтвердила генетическое своеобразие различных сезонно-экологических форм; в течение нерестового хода нерки в р. Озерная, начиная со второй половины июля, прослеживается четкая тенденция замещения особей «ранней» формы представителями «поздней».

4. Микросателлитная ДНК является эффективным, темпорально стабильным маркером популяционной изменчивости, что позволяет длительное время использовать единожды созданные базы реперных данных при осуществлении идентификационных оценок.

5. Разрешающая способность базы реперных данных для идентификации популяционных групп восточного побережья Камчатки в смешанных выборках находится на уровне 82-89%, для определения сезонно-экологических форм нерки в бассейне р. Озерная — на уровне 72%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК:

1. Пильганчук O.A., Варнавская Н.В. Изменчивость микросателлитных локусов в популяции нерки Oncorhynchns nerka (Walbaum) оз. Курильское // Исследования водных биологических ресурсов Камчатки и северо-западной части Тихого океана. 2010. Вып. 17. С. 92-96.

2. Пильганчук O.A., Варнавская Н.В., Бичем Т.Д. Характеристика внутрипопуляционной структуры нерки оз. Курильское и р. Камчатка по

изменчивости микросателлитной ядерной ДНК // Исследования водных биологических ресурсов Камчатки и северо-западной части Тихого океана. 2010. Вып. 18. С. 28-37.

3. Шпигальская Н.Ю., Пильганчук O.A., Савенков В.В., Кустова A.C., Муравская У.О., Сараванский О.Н. Результаты исследований внутривидовой структуры промысловых видов рыб методами популяционной генетики // Исследования водных биологических ресурсов Камчатки и северо-западной части Тихого океана. 2012. Вып. 25. С. 69-97.

4. Пильганчук O.A., Шпигальская Н.Ю., Савенков В.В., Сараванский О.Н., Базаркин Г.В., Ельников А.Н. Изменчивость микросателлитных локусов нерки Oncorhynchus nerka (Walbaum, 1792) восточного побережья Камчатки // Биология моря. 2013. Т. 39, № 4. С. 272-280.

5. Пильганчук O.A., Шпигальская Н.Ю. Популяционно-генетическая дифференциация нерки Oncorhynchus nerka (Walbaum, 1792) восточного побережья Камчатки // Биология моря. 2013. Т. 39, № 5. С. 371-379.

Работы, опубликованные в материалах всероссийских и международных

конференций:

1. Пильганчук O.A., Варнавская Н.В. Темпоральная и пространственная изменчивость структуры микросателлитной ядерной ДНК у нерки, Oncorhynchus nerka (Walbaum), оз. Курильское // Современное состояние и пути развития популяционной биологии: Материалы X Всероссийского популяционного семинара. 17-22 ноября 2008 г., г. Ижевск. - Ижевск: КнигоГрад, 2008. С. 382-384.

2. Пильганчук O.A., Варнавская Н.В. Темпоральная изменчивость аллельных частот микросателлитных локусов в популяции нерки, Oncorhynchus nerka (Walbaum), оз. Курильское / Тезисы докладов V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г. - Москва, 2009. Ч. II. С. 178.

3. Bugaev A.V., Shpigalskaya N.Yu., Pilganchuk O.A., Shaporev R.A., Savin V.A., Chistyakova A.I., Muravskaya U.O., Saravansky O.N. Review of some results of Russian population studies of Pacific salmon in 2010 and 2011 // North Pacific Anadromous Fish Comission (NPAFC) Doc. 1397. 2012. 18 p.

4. Пильганчук O.A., Шпигальская Н.Ю., Дубынин B.A., Шевляков Е.А., Нигматулина Е.А., Косицына А.И., Сараванский О.Н. Предварительные результаты оценки генетической гетерогенности нерестового хода нерки р. Озерная // Материалы Всероссийской научной конференции «Водные биологические ресурсы северной части Тихого океана: состояние, мониторинг, управление». - Петропавловск-Камчатский: КамчатНИРО, 2012. С. 431-438.

5. Шпигальская Н.Ю., Пильганчук O.A., Косицына А.И., Муравская У.О., Кустова А.И., Савенков В.В., Сараванский О.Н. Результаты исследований, проведенных лабораторией популяционной генетики промысловых видов рыб // Материалы отчетной сессии ФГУП «КамчатНИРО» по итогам научно-исследовательских работ в 2012 г. - Петропавловск-Камчатский: КамчатНИРО, 2013. С. 97-112.

6. Пильганчук O.A., Шпигальская Н.Ю. Популяционно-генетическая структура нерки Камчатки на основе изменчивости микросателлитных локусов // Материалы отчетной сессии ФГУП «КамчатНИРО» по итогам научно-исследовательских работ в 2012 г. - Петропавловск-Камчатский: КамчатНИРО, 2013. С. 331-342.

Оксана Александровна Пильганчук

Генетическая структура нерки, Опсогкупскт пегка (\Valbaum), полуострова

Камчатка

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 09.06.2014 г. Заказ от 5.06.2014 г. Издательство ФГУП «КамчатНИРО» 683600, г. Петропавловск-Камчатский, ул. Набережная, 18 Объем 24 стр. А5. Тираж 100 экз.

Отпечатано: «Оперативная Полиграфия» Частный предприниматель Романенко М.И. Лиц. Пд № 14-2 002305 от 14.07.2000 г. г. Петропавловск-Камчатский, ул. Лениская, 46 телефон: 423-008

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пильганчук, Оксана Александровна, Петропавловск-Камчатский

г

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ КАМЧАТСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЫБНОГО

ХОЗЯЙСТВА И ОКЕАНОГРАФИИ

04201460910

Пильганчук Оксана Александровна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА НЕРКИ, ОЖОЛНУМСНШ Ш11КА (\VALBAUM), ПОЛУОСТРОВА КАМЧАТКА

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Н.Ю. Шпигальская

На правах рукописи

<

Петропавловск-Камчатский — 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................10

1.1. Ареал, краткая биологическая характеристика и внутривидовая организация нерки.....................................................................10

1.2. Генетическая дифференциация нерки Азии и Северной Америки: состояние изученности данного вопроса.........................................16

1.2.1. Биохимический полиморфизм...............................................16

1.2.2. Полиморфизм мтДНК.........................................................21

1.2.3. Изменчивость микросателлитных локусов...............................24

1.2.4. Однонуклеотидный полиморфизм (БЫР).................................27

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................................30

2.1. Материалы..............................................................................30

2.2. Методы..................................................................................34

2.2.1. Молекулярно-генетические методы........................................34

2.2.2. Методы статистического анализа..........................................41

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ НЕРКИ ВОСТОЧНОЙ КАМЧАТКИ....................................................................................47

3.1. Характеристика уровня изменчивости микросателлитов.....................47

3.2. Пространственная изменчивость аллельных частот............................62

3.3. Межпопуляционная генетическая дифференциация...........................66

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ НЕРКИ ЗАПАДНОЙ КАМЧАТКИ (на примере бассейна р. Озерная).........................................80

4.1. Дифференциация сезонно-экологических форм нерки оз. Курильское (бассейн р. Озерная)..........................................................................80

4.2. Характеристика дискриминирующей способности микросателлитных локусов нерки бассейна р. Озерная.......................................................84

4.3. Гетерогенность нерестового хода нерки р. Озерная............................93

л

I

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ТЕМПОРАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ

МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ...................................................97

ГЛАВА 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОРСКИХ СМЕШАННЫХ ВЫБОРОК НЕРКИ НА ОСНОВЕ ИЗМЕНЧИВ ОСТИ АЛЛЕЛЬНЫХ ЧАСТОТ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ...................................................102

6.1. Оценка разрешающей способности реперных данных........................102

6.2. Апробация базы реперных данных...............................................105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................110

ВЫВОДЫ.....................................................................................112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................113

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Тихоокеанские лососи (род Опсогкупс}гт~) наиболее значимые в промысловом отношении объекты ихтиофауны для многих государств, расположенных на побережье Тихоокеанского бассейна и, главным образом, России. В 30-40-е годы XX в. их уловы достигали 500-600 тыс. тонн (Кляшторин, 2000). Тихоокеанские лососи относятся к анадромным видам рыб, нерестятся один раз в течении жизненного цикла в реках или озерах, молодь мигрирует в Тихий океан, где нагуливается от одного до пяти лет и возвращается обратно к местам нереста. Представителям этого рода свойственна сложная популяционная организация.

Нерка Опсогкупскш пегка "\Ма1Ьаит — на территории России третий по численности вид тихоокеанских лососей (Виг^ег, 1991; Синяков, 2006). Наиболее важные и многочисленные стада российской части ареала воспроизводятся на Камчатке, в бассейнах оз. Курильское и р. Камчатка.

Для сохранения и увеличения запасов нерки необходимы детальные и всесторонние исследования популяционных комплексов этого сложно организованного вида, результаты которых позволят разработать рекомендации и создать оптимальные условия для эксплуатации и воспроизводства стад, рационального ведения промысла в прибрежной зоне и нерестовых реках. Полученная информация поможет понять эволюционные закономерности формирования популяционной структуры и видового ареала.

Для регулирования морского промысла на международном уровне, распределения промысловой нагрузки, описания путей миграций, определения происхождения браконьерских уловов необходимо идентифицировать локальные стада разных регионов в смешанных скоплениях молоди и производителей.

В современных условиях одними из самых эффективных и точных методов идентификации являются молекулярно-генетические. Анализ на основе аллельной изменчивости микросателлитной ДНК наиболее часто и

успешно в последние два десятилетия используется в популяционно-генетических исследованиях различных видов рыб, в том числе лососевых (ВеасЬат & а1., 1998, 1999, 2000, 2006а,Ь; Афанасьев и др., 2006; Варнавская, 2006; Хрусталева, 2007; Животовский, 2013).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является оценка уровня дифференциации нерки Камчатки по микросателлитным локусам и возможности региональной идентификации смешанных уловов по данной системе популяционно-генетических маркеров.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. осуществить апробацию и подбор дифференцирующих микросателлитных локусов;

2. оценить степень внутри- и межпопуляционной изменчивости нерки Восточной Камчатки;

3. оценить гетерогенность нерки бассейна оз. Курильское;

4. оценить темпоральную стабильность микросателлитных локусов как системы популяционных маркеров;

5. определить разрешающую способность полученной базы реперных данных и провести ее апробацию на примере смешанных выборок молоди и производителей.

Основные положения, выносимые на защиту:

- определен набор наиболее информативных для популяционно-генетических исследований нерки Камчатки микросателлитных локусов;

- выявлена значительная дифференциация нерки восточного побережья Камчатки по частотам аллелей микросателлитных локусов, генетическое сходство популяций соответствует их географической близости, имеет место достоверная связь между географическими расстояниями и величинами популяционно-генетических различий;

- нерка оз. Курильское (бассейн р. Озерная) представлена несколькими сезонно-экологическими формами, генетическая изменчивость которых

отражена в гетерогенности особей различных периодов нерестового хода в р. Озерная;

- показано, что микросателлитная ДНК является темпорально стабильным маркером популяционной изменчивости, что позволяет длительное время использовать единожды созданные базы реперных данных при осуществлении идентификационных оценок;

— на основе изменчивости частот аллелей микросателлитных локусов в популяциях нерки Камчатки возможно с достаточно высокой точностью идентифицировать в смешанных выборках популяционные группы восточного побережья и сезонно-экологические формы бассейна оз. Курильское.

Научная новизна. Апробированы тридцать шесть микросателлитных локусов, из них для анализа нерки Камчатки было отобрано девятнадцать, использование которых в исследовании популяций данного региона представляется перспективным. Показана временная устойчивость использованной системы маркеров в течение более чем десятилетнего периода, что позволяет использовать для идентификации смешанных скоплений единожды созданные базы данных.

Впервые методами молекулярно генетического анализа (микросателлитные последовательности ДНК) исследована нерка рек Навыринваям, Хайлюля, Апука, Пономарка, верхнее течение р. Камчатка и озера Саранное (Командорские о-ва). Показано соответствие степени генетического сходства всех исследованных популяций их географической близости, выявлено наличие достоверной корреляционной связи между географическими расстояниями и величиной генетических различий. В соответствии с генетической дифференциацией нерки восточного побережья Камчатки, выделены пять региональных групп, уровень различия между которыми превышает уровень межпопуляционной изменчивости.

На основании анализа частот микросателлитных локусов оценена гетерогенность нерестового хода в р. Озерная. Особей, анадромная миграция

которых проходит до середины июля, с большой степенью вероятности можно охарактеризовать как раннюю речную форму.

Продемонстрирована возможность идентификации выделенных популяционных групп восточного побережья Камчатки в смешанных уловах молоди нерки в западной части Берингова моря и производителей «ранней» и «поздней» форм нерки в течение нерестового хода в р. Озерная.

Практическая значимость. Аллельные частоты микросателлитных локусов использованы для создания реперной базы данных в целях индивидуальной и популяционной идентификации особей нерки в смешанных скоплениях, а так же генетического мониторинга исследованных популяций и популяционных комплексов. Данные по составу траловых уловов молоди в Беринговом море могут служить основой для количественной оценки особей из выявленных популяционных групп: «оз. Азабачье», «бассейн р. Камчатка», «Карагинский р-н», «север Олюторского р-на» и «Командорские о-ва» и, в дальнейшем, использоваться для прогноза численности производителей в соответствующих районах Восточной Камчатки.

Полученные результаты также могут быть использованы с целью получения идентификационных оценок уловов в р. Озерная и пропорционального распределения промысловой нагрузки на субпопуляции нерки бассейна оз. Курильское, т.е. рациональной эксплуатации данного запаса с учетом популяционной структуры и сохранения природного биоразнообразия.

Апробация результатов. Основные положения и результаты работы были представлены на X Всероссийском популяционном семинаре «Современное состояние и пути развития популяционной биологии» (Ижевск, 17-22 ноября 2008 г.), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 21-28 июня 2009 г.), Всероссийской научной конференции «Водные биологические ресурсы северной части Тихого океана: состояние, мониторинг, управление» (Петропавловск-Камчатский, 26-27 сентября 2012 г.), Международной рабочей группе Северотихоокеанской комиссии по

анадромным видам рыб (NPAFC) «International Workshope on Application of Stock Identification in Defining Marine Distribution and Migration of Salmon» (Санкт-Петербург, 7-12 октября 2012 г.), отчетной сессии ФГУП «КамчатНИРО» по итогам научно-исследовательских работ в 2012 г. (Петропавловск-Камчатский, 2013 г.), а также в виде научных годовых отчетов ФГУП «КамчатНИРО» в 2000-2001 гг. и 2007-2009 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в числе которых 5 статей в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора или кандидата наук».

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах исследования. Диссертация написана лично автором с использованием собственных результатов, а так же самостоятельного анализа находящихся в свободном доступе данных, ранее опубликованных Н.В. Варнавской (2006). Доля личного участия в экспериментальных исследованиях составила не менее 90%.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах, состоит из введения, обзора литературы (гл. 1), характеристики материалов и методов (гл. 2), результатов и обсуждения (гл. 3-6), заключения, выводов, списка литературы, включающего 220 цитированных источников, из которых 108 на английском языке. Работа иллюстрирована 37-ю рисунками и содержит 25 таблиц.

Благодарности. Автор выражает признательность научному руководителю — Н.Ю. Шпигальской, за создание творческой атмосферы, советы и всестороннюю помощь в организации и проведении исследований, обобщении и анализе результатов. Автор искренне благодарен д.б.н. Н.В. Варнавской, под руководством которой были начаты исследования популяционной структуры нерки,; и оказавшей влияние на формирование

научного мировоззрения и становление автора как самостоятельного исследователя.

Автор благодарен коллективу лаборатории: У.О. Муравской, В.В. Савенкову, A.C. Кустовой, А.И. Косицыной за моральную поддержку и неослабевающий интерес к работе, и отдельно О.Н. Сараванскому за многолетнее совместное сотрудничество, помощь в выделении ДНК, обучение технике сбора материала в полевых условиях.

Автор искренне признателен сотрудникам лаборатории генетических проблем идентификации Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН за неоценимую помощь в освоении методики анализа изменчивости микросателлитных локусов, а так же сотрудникам ФГУП «КамчатНИРО», принимавшим участие в сборе материала в сложных условиях Камчатки — В.А Дубынину, А.Н. Климову, Г.В. Базаркину, С.А. Травину, И.Н. Сиротенко, И.В. Шатило, E.H. Збоевой, C.B. Шубкину, А.Н. Ходько, В.А. Романову.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Ареал, краткая биологическая характеристика и внутривидовая

организация нерки

Нерка Oncorhynchus nerka Walbaum — один из ценнейших промысловых видов рыб на Дальнем Востоке России. Наиболее крупные и значимые для экономики государства стада нерки, дающие почти 100% уловов, обитают на Камчатке (Синяков, 2006). Практически все популяции воспроизводятся на природных нерестилищах, вклад рыборазводных заводов (ЛРЗ) очень мал (Синяков, 2006). В связи с этим, для поддержания нативных популяций в оптимальном состоянии, повышения качества промысла, для решения других теоретических и практических задач, необходимо оценить дифференциацию популяций отдельных регионов и бассейнов крупных рек, собрать максимально полную, валидную и современную информацию о популяционно-генетическом своеобразии изучаемых стад. Достаточно полные знания о популяционной структуре вида составят необходимую научную основу для оценки сырьевой базы, создания точных прогнозов.

Нерка является представителем отряда Salmoniformes, подотряда Salmonnoidea, надсемейства Salmonoidea, семейства Salmonidae (лососевые), подсемейства Salmoninae, рода Oncorhynchus (Nelson, 1984; Глубоковский, 1995; Алтухов и др., 1997). На территории России она является третьим по численности видом тихоокеанских лососей после горбуши и кеты (Синяков, 2006), на американской части ареала — вторым (Burgner, 1991).

Ареал нерки весьма обширный. На азиатском побережье она воспроизводится в бассейнах рек, впадающих в Тихий океан, от Курильских островов до северной части Берингова (реки Чегитунь и Амгуэма) и Охотского (реки Пенжина, Гижига, Наяхан, Яма, Ола и Тауй) морей. На материковом побережье Охотского моря достигает промысловой численности в реке Охота, встречается на о-ве Хоккайдо, Командорских о-вах (Бугаев, 1995, 2011; Черешнев и др., 2002; Шунтов, Темных, 2008). На североамериканском

побережье нерка особенно многочисленна и встречается от арктического побережья Аляски до р. Кламатч в Южной Калифорнии (Виг§пег, 1991; Бугаев, 1995, 2011; Шунтов, Темных, 2008). В морской период жизни основными районами нагула неркй азиатских стад являются западная часть Берингова моря, тихоокеанские воды Камчатки и северных Курильских островов. Охотское море для нагула используется мало (Бирман, 1967, 1985; Коновалов, 1980; Бугаев, 1995, 2011; Шунтов, Темных, 2008).

Нерка относится к проходным моноцикличным видам с длительными пресноводным и морским периодами жизни, после нереста все рыбы погибают (Смирнов, 1975; Бугаев, 1995, 2011). Основная масса нерки скатывается в море в возрасте от одного года до 4-х лет, где нагуливается 1—4, чаще — 2-3 года, и затем совершает преднерестовую (анадромную) миграцию в родные реки (Смирнов, 1975; Коновалов, 1980; Алтухов и др., 1997; Бугаев, 1995, 2011; Шунтов, Темных, 2008). Относительно постоянная возрастная структура в каждом из районов- воспроизводства сохраняется на протяжении ряда поколений и поддерживается «хомингом» — возвратом производителей к местам нереста их родителей (Бугаев, 1995, 2011; Алтухов и др., 1997).

Скат молоди в море по всему ареалу азиатской нерки продолжается с конца февраля-марта до середины сентября (Бугаев, 1995, 2011; Черешнев и др., 2002; Шунтов, Темных, 2008). Средние размеры покатников зависят от возраста и места нереста и, соответственно, значительно варьируют (Бугаев, 1995, 2011; Карпенко, 1998). Так, в 1978-1979 гг. из р. Камчатка скатывались сеголетки нерки длиной 2,6-7,7 см (Бугаев, Карпенко, 1983; Карпенко, 1998), а смолты из оз. Красивое мигрировали в возрасте 2+, достигая длины 17-22 см (Иванков, 1984). Скатившаяся молодь держится вблизи берегов обычно в течение непродолжительного времени и осенью мигрирует в открытый океан (Карпенко, 1998; Бирман, 1985).

Следует отметить, что в некоторых водоемах (например, в оз. Кроноцкое на Камчатке, оз. Сопочное на о. Итуруп) не рка, п омимо проходной формы, образует карликовую или жилую форму, которая созревает, н�