Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуль-аллели в микросателлитных локусах кеты (Oncorhynchus keta Walbaum)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Нуль-аллели в микросателлитных локусах кеты (Oncorhynchus keta Walbaum)"

На правах рукописи

КОРДИЧЕВА 4844240

Светлана Юрьевна

Нуль-аллели в микросателлитных локусах кеты (Опсогкупскт ке1а \Valbaum).

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 АПР 2011

Москва-2011

4844240

Работа выполнена в лаборатории генетических проблем идентификации Учреждения Российской академии наук Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, г. Москва.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Животовский Лев Анатольевич Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Сулимова Галина Ефимовна Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Москва

кандидат биологических наук Строганов Андрей Николаевич

доцент Московский государственный университет

им. Ломоносова, Биологический факультет, г. Москва

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт рыбного хозяйства и океанографии, г. Москва

Защита состоится «28» апреля 2011 года в «14-00» часов на заседании диссертационног совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институт общей генетик! им. Н. И. Вавилова РАН, по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: 8(499) 132-89-62, электронный адрес: aspirantura@,vigg.ru. адрес в интернете: www.vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии нау! Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «28» марта 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.А. Синельщикова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Тихоокеанский лосось - кета (Oncorhynchus keta Walbaum), имеет большое промысловое значение и является важным элементом продовольственной безопасности России. Изучение генетического состава популяций кеты важно не только для решения фундаментальных научных проблем, например, такой как популяционная организация вида, но и для формирования представления о том, как лучше сохранять, воспроизводить этот вид, а так же оптимизировать процессы рыбоводства и рыболовства. Актуальным вопросом на данный момент является изучение популяционной структуры разных видов с помощью микросателлитных маркеров. Микросателлиты обладают высоким полиморфизмом и хорошо дифференцируют популяции (Schlotterer С., 1998; Животовский JI.A., 2006). На данный момент уже проведены большие исследования по микросателлитной изменчивости кеты и показано, что они являются хорошими маркерами для исследования межпопуляционных различий этого вида (Brown, Epifanio 2003; Афанасьев и др., 2008; Животовский и др. 2008). Однако, при проведении широкомасштабных популяционных исследований на разных видах животных, исследователи сталкиваются с проблемой нуль-аллелей. В популяционных исследованиях нуль-аллелем принято называть явление отсутствия ПЦР-продукта, которое вызвано мутациями (единичная замена, инсерция, делеция, инверсия) во фланкирующих микросателлит последовательностях ДНК, на которую гибридизуются праймеры. Это приводит к некорректной интерпретации популяционных данных, создавая «фальшивые» гомозиготы вместо гетерозигот и увеличивая тем самым уровень наблюдаемой гомозиготности, что тестируется отклонением от равновесия Харди-Вайнберга (Carlsson, 2008). Следует заметить, что нуль-аллели встречались и в исследованиях полиморфизма аллозимных маркеров, где они проявлялись отсутствием энзиматической активности, и могут встретиться при исследованиях иных типов полиморфизма ДНК. Так что наличие нуль-аллелей приводит к появлению проблем скрытого полиморфизма в виде «фальшивой» гомозиготности, возникающей в популяционных исследованиях, как фундаментального, так и прикладного характеров.

Так как ещё не разработаны надежные способы определения и учета данного явления, во многих популяционных исследованиях те локусы, в которых предположительно выявляются нуль-аллели, исключаются из популяционного анализа (Senn Н, Pemberton J., 2009; Zhan А., Hu J., Hu X. et al. 2009). Однако, такой путь решения проблемы этого явления неприемлем при масштабных исследованиях, поскольку при увеличении самой выборки или расширении исследуемых популяций, возрастает вероятность появления нуль-аллеля на каждый локус, что может привести к исключению большого числа локусов из популяционного анализа, а это отрицательно сказывается на качестве исследований. Причем, у одного вида в одной популяции нуль-аллели могут присутствовать, а в другой популяции -нет. Кроме того, важно знать какие именно мутации приводят к появлению нуль-аллелей. Данную задачу можно решить через исследование нуклеотидной последовательности ДНК праймерной области.

Чтобы подробно изучить указанное явление, мы выбрали объект, достаточно хорошо изученный на большой части ареала по микросателлитным локусам - кету, которая уже подробно охарактеризована по набору из десяти микросателлитных маркеров (Афанасьев и др. 2008; Животовский и др. 2008; Рубцова и др. 2008; Шитова и др. 2009). Одним из локусов, попадающим под «подозрение» на наличие в нем нуль-аллеля при крупномасштабном исследовании популяций кеты, является Оке3 (Buchholz W.G., et al., 2001). По этому локусу были выявлены достоверные отклонения от равновесия Харди-Вайнберга в сторону увеличения гомозигот в ряде выборок кеты островов Сахалин, Кунашир и Итуруп.

Отклонение от равновесия Харди-Вайнберга может появляться по разным причинам: отбор, действующий на данный локус, инбридинг, смесь нескольких популяций, в которых отличаются частоты аллелей, или наличие нуль-аллеля. Гипотеза о действующем на этот

локус отборе была отвергнута, так как микросателлитные локусы считаются селективно нейтральными. Возможность инбридинга исключается, иначе отклонения от равновесия Харди-Вайнберга наблюдались бы по всем исследуемым локусам. Гипотеза смешения популяций (эффект Валунда) нами была поставлена под сомнение в подавляющем большинстве случаев, так как в исследованных ранее популяциях кеты наблюдались слишком сильные отклонения от равновесия Харди-Вайнберга, чтобы объяснять имеющуюся относительно невысокую локальную генетическую дифференциацию кеты. Поэтому, мы остановились на гипотезе о наличии нуль-аллелей в локусе Оке3 и в связи с этим, были поставлены следующие цели и задачи исследования.

Цели и задачи исследования.

Цель работы: выявить нуль-аплели в микросателлитном локусе Оке3 в популяциях кеты (ОпсогИупсИш Ша WaIbaum), изучить первичную структуру этих аллелей и исследовать их географическое распространение.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать праймеры, с помощью которых можно добиться амплификации нуль-аллелей в микросателлитном локусе Оке3.

2. Изучить географическое распределение выявленных нуль-аллелей, а также их влияние на интерпретацию популяционных данных.

3. Локализовать мутации, которые приводят к появлению нуль-аллелей.

4. Секвенировать аллели локуса Оке3 для его подробного структурного анализа на разных видах рыб рода ОпсогИупсИш.

Научная новизна работы.

Наибольший интерес представляет способ выявление нуль-аллелей в микросателлитном локусе и изучение их влияния на интерпретацию популяционных данных на примере различных стад кеты Дальнего Востока. Если не выявлять нуль-аллели, то наблюдаемые различия между стадами (популяциями) могут быть, как завышены, так занижены в зависимости от спектра скрытых аллелей: скрытые аллели снижают истинну дифференциацию между популяциями в случаях, когда в разных регионах встречаютс разные нуль-аллели и завышают, когда они одинаковы.

При помощи секвенирования нуклеотидной последовательности локуса ОкеЪ кеть были выявлены мутации, приводящие к появлению нуль-аллелей. Проведено секвенировани и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных видов рыб род-ОпсогИупсИия по локусу Оке3.

Выявлено, что представленный локус Оке3, как микросателлитный, можно считат только у трех видов рода - кеты, горбуши и нерки, так как гандемные повторы встречаютс только у этих видов.

Практическая значимость работы.

В ходе выполнения данной работы при изучении и добавлении полученно информации в уже существующую базу данных по микросателлитным локусам ке-обнаружено, что в 20 выборках из 25, в которых ранее было выявлено отклонение о равновесия Харди-Вайнберга по локусу Оке3, вызванное ложной гомозиготностыо из-з наличия нуль-аллелей, оно не наблюдалось при использовании альтернативных праймеро Предложенный метод позволил выявить весь спектр аллельного разнообразия, ране «скрытого» за нуль-аллелями. Это позволило получить несмещённые оценки степен дифференциации популяций кеты.

При помощи секвенирования нуклеотидной последовательности локуса ОкеЪ кет были выявлены мутации, приводящие к появлению нуль-аллелей. Эти мутации в дальнейше

можно учитывать не только для подбора праймеров к данному локусу, но и в качестве дополнительных маркеров при популяционных исследованиях кеты.

В результате, перед проведением популяционных исследований различных видов по одним и тем же микросателлитным локусам, желательно предварительно изучить их нуклеотидную последовательность для уточнения микросателлитного статуса данного локуса.

Апробация результатов работы: Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Научном семинаре «Популяционная и эволюционная генетика» (Москва, 2010), Международной конференции «Воспроизводство естественных популяций ценных видов рыб» (г. Санкт-Петербург, 2010), Международной конференции "Проблемы экологии: чтения памяти профессора М.М. Кожова" (г. Иркутск 2010), Четвертой международной школе молодых ученых по генетике "Геномика и биология клетки": (Звенигород, 2010).

Публикации: По теме диссертации опубликовано трое тезисов в сборниках отечественных конференций и одна научная статья в журнале, рекомендованном ВАК.

Участие автора в получении результатов исследования: Диссертация написана автором лично с использованием собственных результатов, а также результатов, полученных ранее в совместных экспериментах в лаборатории генетических проблем идентификации ИОГен РАН им. Н. И. Вавилова. Процент личного участия в экспериментальных исследованиях составил не менее 90%.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает 13 таблиц, б рисунков и 6 приложений. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 135 цитированных источников, из которых 110 на иностранных языках.

Автор выражает искреннюю благодарность: Л.А. Животовскому за организацию данного исследования, научную дискуссию, и ценные советы; К.И. Афанасьеву, Г.А. Рубцовой, М.В. Шитовой за наставления в освоении методов и проведении эксперимента; К.И. Афанасьеву, Г.А. Рубцовой, М.В. Шитовой и Л.А. Животовскому за предоставленные по естественным и заводским популяциям кеты Дальнего Востока; Т.В. Малининой, П.К. Афанасьеву, Т.В. Ракицкой, В.Д. Прохоровской за моральную поддержку; Е.Г. Шайхаеву за помощь в освоении программ и подбор праймеров; коллективам рыбоводных заводов Дальнего Востока за предоставленную возможность сбора биологических образцов; всем сотрудникам лаборатории генетических проблем идентификации за творческую и стимулирующую атмосферу.

Основное содержание работы

ГЛАВА 2. Обзор литературы

Настоящая глава подготовлена по литературным данным и состоит из двух разделов.

В первом разделе приводится краткое описание биологии кеты {ОпсогИупсЫк кеШ \Valbaum) и её хозяйственное значение.

Во втором разделе приводится описание различных ДНК маркеров. Подробное описание тандемных повторов их особенностей и недостатков. Описаны проблемы возникающие при использовании микросателлитных локусов в качестве маркеров для различных популяционных исследований; в виде появления нуль-аллелей и представлены возможные варианты решения данного вопроса.

ГЛАВА 3. Материалы и методы.

Характеристика исследуемых проб.

Пробы кеты.

Для выявления и подробного исследования нуль-аллелей в микросателлитном локусе ОкеЪ были взяты образцы ткани производителей кеты из 66 выборок разных регионов, взятых во время нерестового хода, как с естественных нерестилищ, так и с лососевых рыбоводных заводов (JIP3) ( Афанасьев и др. 2008.) Список всех выборок представлен в таблице 1.

Молекулярно-генетическая методика анализа.

Для изучения ДНК-маркеров от каждой рыбы брали образец печени (выборки 2003, 2004гг.) или край плавника (выборки 2005-2007гг.). Полученные образцы фиксировали в 96%-м растворе этанола. Ранее в лаборатории во всех выборках, кроме выборок из Приморского края и США, уже была сделана работа по определению генотипа исследуемых рыб по локусу ОкеЪ и выявлены гомозиготные особи. Из 57 выборок, изученных ранее в лаборатории, в 23 наблюдалось сильное отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, в сторону увеличения гомозигот. Поэтому в данной работе изучались уже только те образцы, которые при анализе микросателлитного локуса Оке3 вели себя как гомозиготы. А в семи выборках из Приморского края и двух выборках из США (213 и 98 образцов соответственно) сначала были определены генотипы всех рыб по локусу при помощи оригинальных праймеров к локусу Оке3, и только после этого для исследования отобраны те образцы, которые являлись гомозиготами по данному локусу. В итоге в исследовании были изучены 932 особи из разных регионов, имеющие гомозиготный генотип по локусу Оке3. В таблице 1 приведены данные по количеству исследуемых в нашей работе гомозигот в каждой выборке.

Таблица 1. Места н даты взятия выборок производителей кеты.

№ Место взятия выборки Дата выборки Число рыб в выборке Число исследуемы гомозиго

О.Сахалин:

1 Адо-Тымовский ЛРЗ 04.09.2003 51 14

2 Адо-Тьшовский ЛРЗ 17.09.2004 50 18

3 Калининский ЛРЗ 30.08.2003 50 14

4 Калининский ЛРЗ 08.09.2004 50 7

5 Таранайский ЛРЗ 16.09.2003 50 10

6 Таранайский ЛРЗ 23.09.2004 50 14

7 Ударница (Охотский ЛРЗ) 15.09.2003 50 16

8 Ударница (Охотский ЛРЗ) 24.09.2004 50 20

9 Ударница (Охотский ЛРЗ) 05.10.2005 50 9

10 Б.Такой (Соколовский ЛРЗ) 11.09.2003 50 9

11 р. Белая (Соколовский ЛРЗ) 13.09.2004 50 12

12 р.Найба, устье 20.09.2004 50 13

13 Сокольниковский ЛРЗ 14.09.2004 50 11

14 р. Ай 03.10.2005 17 4

15 Буюклинский ЛРЗ 24.09.2005 50 19

16 ЛРЗ Монетка 29.09.2005 50 17

17 Побединский ЛРЗ 24.09.2005 50 13

18 Ясноморский ЛРЗ 30.09.2005 50 16

О.Итуруп:

19 оз. Сопочное 06.10.2004 50 9

20 оз. Сопочное 13.11.2005 50 22

21 оз. Сопочное (устье) 21.10.2005 50 18

22 оз. Сопочное 26.10.2007 50 16

23 оз. Сопочное(протока) 26.10.2007 50 29

24 руч. Порожистый 13.11.2005 50 17

25 руч. Порожистый 24.10.2006 50 23

26 Рейдовский ЛРЗ 11.10.2004 50 14

27 Рейдовский ЛРЗ, выборка 1 14.10.2005 50 19

28 Рейдовский ЛРЗ, выборка 2 19.10.2005 50 6

29 Рейдовский ЛРЗ, выборка 3 26.10.2005 50 17

30 р. Рыбацкая 08.10.2004 50 22

31 р. Рыбацкая 23.10.2005 50 19

32 Кетовый (Курильский ЛРЗ) 12.10.2004 51 22

33 овый, выборка 1 (Курильский ЛРЗ) 06.10.2005 50 15

34 овый, выборка 2 (Курильский ЛРЗ) 17.10.2005 50 16

35 овый, выборка 3 (Курильский ЛРЗ) 26.10.2005 50 14

36 оз. Куйбышевское 13.10.2004 50 13

37 оз. Куйбышевское 24.10.2006 50 23

38 оз. Куйбышевское 14.10.2007 50 8

39 оз. Благодатное 11.10.2005 50 16

40 оз. Благодатное 13.10.2007 50 18

41 оз. Лебединое 08.11.2007 50 12

О.Кунашир

42 р. Ильюшина 12.10.2005 50 25

43 р. Серноводка 13.10.2005 50 20

Приморский край

44 р. Нарва 1995 51 11

45 р. Нарва 2005 20 8

46 р. Нарва 2006 42 9

47 р. Нарва 2007 51 13

48 р. Киевка 2002 12 6

49 р. Киевка 2003 11 4

50 р. Авакумовка 1994 26 7

Магаданская область

51 р. Яна, выборка 1 18.07.2007 17 2

52 р. Яна, выборка 2 18.08.2007 31 7

53 р. Яма(молодь) 2007 50 24

54 р. Кулькуты 08.09.2007 50 13

55 р. Кулькуты (молодь) 2007 50 19

Чукотский Автономный Округ

56 Анадырь, выборка 1 20.08.2007 50 14

57 Анадырь, выборка 2 11.08.2007 50 17

58 Анадырь, выборка 3 04.09.2007 50 19

Камчатский край

59 р. Камчатка 26.07.2007 50 12

60 р. Налычева 08.08.2007 16 5

61 р. Паратунка 07.08.2007 50 16

62 р. Авача 02.08.2007 50 13

63 р. Большая 09.08.2007 50 13

64 р. Быстрая 04.08.2007 14 4

США

65 Teslin 2004 48 16

66 Snake 2004 48 11

Итого: 3006 932

Рис. 1. Места взятия проб. В скобках указано количество выборок с данного региона.

Другие виды рыб рода ОпсогИупсЫк.

Для подробного и сравнительного изучения структуры микросателлитного локуса Оке3, мы исследовали по 5 образцов рыб рода ОпсогИупсИт: горбуша {О. ОвгЬюсИа \Valbaum), нерка (О. пегка \¥а1Ьаит), чавыча (О. /.уйаи^с/га \Уа1Ьаит), кижуч (О. ЫзгисИ "\Уа1Ьаит) и сима (О. тазои Вгеуоой).

Пробы горбуши были собраны на о. Итуруп, в устье реки Курилка в 2007 году. Образцы нерки, микижи, кижуча и чавычи собирались на п-ве Камчатка, на биостанции «Радуга» из реки Камчатка в 2008 году. Пробы симы были взяты от рыб, выловленных в реке Знаменка, острова Сахалин в 2008 году. Также как и у кеты, для исследования ДНК от рыб отрезали кусочек плавника и фиксировали в 96%-м растворе этанола. Далее в лаборатории в Москве проводили все необходимые биотехнологические манипуляции.

Методика исследования микросателлитного локуса ОкеЗ.

Тотальную ДНК выделяли по стандартной методике с помощью набора реактивов! «Diatom DNA Prep 200» ООО «Лаборатория Изоген». Концентрацию ДНК определяли по интенсивности свечения в УФ-свете в сравнении с интенсивностью свечения ДНК фага X с уже известной концентрацией. Для определения генотипа по локусу Оке3 изначально' использовались праймеры синтезированные согласно опубликованным данным (Buchholz W.G 2001), далее называемые «оригинальные праймеры». Так как последовательность локуса! Оке3 известна и находится в открытом доступе в National Center for Biotechnology Information database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/13241991, NSBI), то для поиска нуль-аллелей к! фланкирующим участкам были подобраны различные варианты праймеров, далее называемые "альтернативными праймерами", представленные в таблице 2. Все праймеры! были синтезированы ЗАО «Синтол» (Россия). Для выявления нуль-аллелей были поставлены

ПЦР с каждой парой альтернативных праймеров, на тех образцах, у которых наблюдался гомозиготный генотип по микросателлитному локусу ОкеЪ.

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали набор реагентов для амплификации ДНК «GenePak PCR Core» ООО «Лаборатория Изоген», содержащий ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, lu, 200 мкМ и 2,5 mM, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечная концентрация праймеров в реакции 0,1-0,5 мкМ, количество ДНК 50-100 нг. Амплификацию микросателлитного локуса Оке3 проводили в термоциклере «Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler» при следующем режиме: предварительная денатурация ДНК: 95°С - 5 мин; 8 циклов: плавление 94°С - 1мин, отжиг праймеров, синтезированных согласно опубликованным данным проходил при температуре - 54°С - 30с, отжиг альтернативных праймеров, при температуре -Х°С - 30с (Таблица 2), синтез ДНК - 72°С - 30с; затем следовал 21 цикл, включающий: плавление 94°С - 30с, отжиг праймеров, синтезированных согласно опубликованным данным - 54°С, и отжиг альтернативных праймеров - Х°С - 30с, синтез ДНК - 72°С - 15с.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6 %-ном неденатурирующем полиакриламидном геле в 0,5 х ТБЕ-буфере (трис-ЭДТА-боратная система), pH 8,0 (Маниатис и др., 1984) при напряжении 300В в течение 2,5 ч. Гель окрашивали бромистым этидием 5 мкг/мл в течение 10 минут и фотографировали в УФ-свете на ультрахемископе. В качестве маркеров длины фрагментов использовали ДНК плазмиды рВЯУ12, обработанную рестриктазой Пае III. Размеры аллелей определяли с использованием программы ID Image Analysis Software Version 3,5 фирмы «Кодак».

Таблица 2. Последовательности праймеров, подобранные к локусу ОкеЪ для

поиска нуль-аллелей.

№ Прямые праймеры Xt отжига DC

1 (1890) 5'-GGATCTGGGCATGTTATCAC-3' 58

2(1891) 5'-GGGCATGTTATCACTTTCAGACA-3' 56

3(1892) 5'-CAGACACCACAGCAGTATG-3' 56

4(1893) 5'-GCAGTATGCCCTACCTGAGAT-3' 56

5(1894) 5'-GCCCTACCTGAGATTCAAAC-3' 56

6(1895) 5'-CTCTCTGAACACTACTCTATCT-3' 56

7(1896) 5'-CTACTCTATCTCCTACACCACTTTA-3' 56

8(1897) 5'-CCACTTTAGGCATCGAGCTAAACA-3' 56

9 (ОкеЗ) 5-ACCCTGAGAGCAATCAAC-3' 52

10 (ОкеЗ G) 5'-CTCTTGTTCTTTCTCACTCTTACACTTT-3' 56

11 (ОкеЗ L) 5'-GGATCTGGGCATGTTATCACTTTCAGACACCACA-3' 54

12 (ОкеЗ S) 5'-ATCTGGGCATGTATCACTTT-3' 56

Обратные праймеры

13 (1898) 5'-GAGATAAGAGAGAAAACAAGGATCA-3' 56

14(1899) 5'-GGATCAGGGATATGCAGTAAATAGTA-3' 56

15(1900) 5'-GGGATATGCAGTAAATAGTAGTGTTTAG-3' 56

16(1901) 5'-GTAGTGTTTAGACATTTGTGAAAATAGATATC-3' 56

17(1902) 5'-CACCACAACCCCTGTGTTTCA-3' 56

18(1903) 5'-CTGTGTTTCAGGGGGTTGA-3' 56

19(1904) 5'-GGGGTTGAGAGAGAGAGAAAG-3' 56

20(1905) 5'-GAGAGAGAAAGAGCGAAGGAGA-3' 56

21 (ОкеЗ) 5'-TCAGGOATATGCAGTAAATAGTA-3' 52

22 (ОкеЗ G) 5'-CAGGGATATGCAGTAAATAGTAGTGTTTA-3' 56

23 (ОкеЗ L) 5'-GAGATAAGAGAGAGAAAACAAGGATCAGGATATGCAGTAA-3' 56

24 (ОкеЗ JR) 5'-GAGATAAGAGAGAGAAAACAAG-3' 56

25 (1S98-L R) 5'-GAGATAAGAGAGAGAAAAC-3' 56

26 (ОкеЗ S) 5'-GAGATAAGAGAGAGAAA-3' 56

Секвенирование локуса Оке3.

Для детального изучения структуры микросателлитного локуса Оке3 и его фланкирующих участков были изучены образцы ДНК разных видов рыб рода Oncorhynchus при помощи секвенирования. Секвенирование и очистку ПЦР продукта осуществляла ЗАО «Евроген» (Россия). Для максимального охвата нуклеотидной последовательности всего локуса у всех видов мы старались подобрать праймеры, которые лежат в самых крайних известных фланкирующих участках. Предварительную амплификацию микросателлитного локуса Оке3 для секвенирования проводили в термоциклере «Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler» при использовании набора реагентов для амплификации ДНК «GenePak PCR Core» ООО «Лаборатория Изоген», при следующем режиме: денатурация ДНК: 94°С - 30 с; отжиг праймеров - 60°С - 30с, синтез ДНК - 72°С - 30с. Номер используемых (таблица 2) праймеров и температура их отжига для каждого вида, указаны в таблице 3. Для постановки одной реакции секвенирования объем реакционной смеси составлял не менее 8 мкл раствора. Конечная концентрация ПЦР продукта, требуемая для секвенирования составляла 40-50 нг/мкл.

Таблица 3. Используемые праймеры и температуры их отжигов для секвенирования локуса Оке3 на разных видах. _____

вид кета горбуша нерка сима микижа чавыча кижуч

№ праймеров (таблица 1) 1, 13 1, 13 1,24 1,24 1,24 1,24 1,24

t отжига °C 59-60 61 60 60 60 60 58

Для обработки полученных секвенированных последовательностей локуса Оке3 использовались пакеты программ «Lasergene» и «SeqMan Ngen», предоставленные биоинформационной кампанией DNASTAR (http://www.dnastar.com).

Статистическая обработка данных.

Статистическую обработку данных проводили согласно руководству Вейра (Вейр, 1995; Weir, 1996) при помощи программы GDA (Lewis, Zaykin, 2001). Были вычислены значения ожидаемой (Не) и наблюдаемой (Но) гетерозиготностей, оценки межпопуляционной дифференциации (Theta-P), индекса фиксации (/), а также проведены статистические тесты на соответствие наблюдаемых генотипических распределений равновесию Харди-Вайнберга.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

Поиск нуль-аллелей.

Подбор праймеров для определения нуль-аллеля в выборке с о. Куиашир.

При широкомасштабном исследовании кеты по 10 микросателлитным локусам в одном из исследуемых локусов - Оке3, ранее было выявлено сильное отклонение от равновесия Харди-Вайнберга в большом количестве выборок из различных регионов Дальнего Востока. Нами было выдвинуто предположение, что причиной отклонения является наличие нуль-аллелей при постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием оригинальных праймеров. Для решения поставленной задачи нами были подобраны альтернативные праймеры к фланкирующим областям микросателлитного локуса.

Для этого были подобраны праймеры: прямой № 11 (ОкеЗ в) и обратный № 22 (Оке3 в) (см. главу «Методы и материалы»). После подбора условий для проведения ПЦР было решено использовать в исследовании две выборки с острова Кунашир, собранные на реках Серноводка и Илюшенка (выборки № 42, 43), так как в них наблюдалось сильное отклонение от равновесия Харди-Вайнберга по исследуемому локусу. При использовании альтернативных праймеров были исследованы все гомозиготы, ранее обнаруженные в данных выборках. В результате использования альтернативных праймеров были обнаружены истинные гетерозиготы, которые ранее, определялись как гомозиготы при использовании оригинальных праймеров. На фореграмме хорошо видны четкие гетерозиготы. Основными аллелями, обнаруживающимися как нуль-аллели были аллели №4 и №5 из 12 аллельных вариантов.

Для исключения артефактов и определения локализации мутации относительно тела микросателлита (5' или 3' фланкирующей зоны) были поставлены ПЦР для всех новообнаруженных гетерозигот с различными комбинациями оригинальных и альтернативных праймеров. В результате проведенных экспериментов не было выявлено каких-либо артефактов, а все размеры полученных ПЦР-продуктов соответствовали тому количеству нуклеотидов, на которое были смещены альтернативные праймеры (15 п. н).

После статистической обработки, проведенной с учетом полученных данных по исследуемому локусу, в двух выборках с о. Кунашир не наблюдалось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга (Таблица 5).

Таблица 5. Результаты теста на равновесие Хардн-Вайнберга в двух выборках с о. Кунашир при использовании оригинальных и альтернативных праймеров._

Кунашир 2005г. Число рыб в выборке Количество Гетерозигот (оригинальные праймеры) Р 1 Количество Гетерозигот (альтернативные праймеры) Р 2

Р. Ильюшенка 50 25 0,0001 37 0,4447

Р. Серноводка 50 30 0,0015 39 0,3987

Р1 - тест на отклонение от равновесия Х.-В. При использовании оригинальных праймеров Оке3; Р2 - тест на отклонение от равновесия Х.-В. при использовании альтернативных праймеров Оке3; Порог достоверности - Р<0,05.

Получив положительные результаты по определению нуль-аллелей в двух выборках с о. Кунашир, было решено исследовать все ранее обнаруженные гомозиготы, при использовании оригинальных праймеров по всем 66 выборкам из разных регионов Дальнего Востока. Однако, дальнейшее использование данных праймеров не принесло ожидаемых результатов в обнаружении нуль-аллелей в этих выборках. Обнаружены только единичные нуль-аллели, в основном на острове Сахалин, которые никак не повлияли на результаты в оставшихся 66-х выборках кеты, где по-прежнему наблюдалось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. Нами было высказано предположение, что на о. Кунашир выявлена специфическая мутация, вызывающая появление нуль-аллелей, характерная только для данного региона. На основании полученных результатов было решено подобрать праймеры, которые бы охватывали всю фланкирующую область микросателлитного локуса ОкеЗ, позволяя исследовать его наиболее полно.

Подбор праймеров для определения нуль-аллелей в выборках с различных регионов Дальнего Востока.

Для дальнейшего обнаружения нуль-аллелей было подобрано 16 вариантов праймеров. К 5' фланкирующей зоне микросателлитного локуса подобрали праймеры с номерами - с 1-го по 8-ой, а к 3' зоне - с 13-го по 20-ый (таблица 2). Нами были использованы различные комбинации альтернативных праймеров на всех гомозиготах, обнаруженных ранее в выборке с реки Рыбацкая (2004г.), острова Итуруп в которой наблюдалось сильное отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. В итоге, при использовании оригинальных праймеров, из 50 исследуемых образцов, 22 были идентифицированы как гомозиготы по локусу Оке3.

По результатам экспериментов, была подобрана пара праймеров (№8 и №20), при использовании которой из 22 исследуемых гомозигот, 14 были идентифицированы как истинные гетерозиготы. В дальнейшем было решено использовать праймеры № 8 и № 20 для исследования всех образцов, представленных ранее как гомозиготы по локусу Оке3 из 66 выборок кеты с различных регионов Дальнего Востока.

Определение нуль-аллелей в локусе Оке3.

При использовании оригинальных праймеров в 66 выборках кеты из различных регионов Дальнего Востока было обнаружено 932 образца имеющих гомозиготный генотип по локусу ОкеЪ. Для всех представленных гомозигот были проведены ПЦР с использованием альтернативных праймеров № 8 и № 20. В результате данного исследования были выявлены 332 истинные гетерозиготы. Для исключения артефактов и сопоставления значений молекулярного веса нуль-аллелей, обнаруженных при использовании альтернативных праймеров, с аллелями, обнаруженными при использовании оригинальных праймеров, проводились ПЦР с использованием различных комбинаций оригинальных и альтернативных праймеров. В результате проведения экспериментов было установлено соответствие размеров аллелей, с учетом смещения праймеров (58 п.н), для оригинальных и альтернативных праймеров. Также было обнаружено, что ранее обнаруженные нуль-аллели с острова Кунашир при использовании для ПЦР альтернативных праймеров №11 и 22, выявлялись и при использовании для ПЦР праймеров №8 и 20. Это свидетельствует о том, что данная пара праймеров является универсальной для выявления нуль-аллеля в нашем случае.

Результаты теста на равновесия Харди-Вайнберга в 66 выборках кеты.

Полученные данные по нуль-аллелям были внесены в наш массив данных по популяциям кеты Российского Дальнего Востока. Была проведена статистическая обработка полученных результатов, которые были получены при использовании альтернативных праймеров. Сравнение данных, полученных при использовании оригинальных и альтернативных праймеров, выявило результаты, представленные в таблицах № 6.1-6.4.

Таблица 6.1. Результаты теста на равновесие Харди-Вайнберга при использовании оригинальных и альтернативных праймеров в выборках с острова Сахалин._

Места взятия проб N ' Есследуемых гомозигот )бнаруженных нуль-аллелей Р1 Р2

Сахалин 2003 Адо-Тымово 50 14 1 0,6953 0,4078 Калининский 50 14 4 0,5965 0,3901 Таранай 50 10 4 0,8256 0,9506 Ударница 50 16 7 0,0403 0,2547 ■Б.Такой 50 9 2 0,6859 0,8656

Сахалин 2004 Адо-Тымово 50 18 7 0,0006 0,0053 р.Найба 50 13 8 0,0059 0,0951 Калининский 50 7 1 0,3144 0,4325 Таранай 50 14 4 0,1669 0,5425

Ударница 50 20 13 0,0001 0,2437

р.Белое 50 12 6 0,1431 0,2197

Сокол 50 И 1 0,5409 0,6271

р.Ай 17 4 0 0,8937 0,8937

Буюклы 50 19 7 0,0159 0,5565

Монетка 50 17 4 0,4456 0,6181

Сахалин 2005 Ударница 50 9 5 0,0593 0,1062

Победино 50 13 5 0,0675 0,2631

Ясноморский 50 16 1 0,3306 0,3734

Р1 - тест на отклонение от равновесия Х.-В. при использован™ оригинальных праймеров Оке3; Р2 -отклонение от равновесия Х.-В. при использовании альтернативных праймеров Оке3; порог достоверности -Р<0,05.

Таблица 6.2. Результаты теста на равновесие Харди-Вайнберга при использовании оригинальных и альтернативных праймеров в выборка» с островов Итуруп и Кунашир.

1еста взятия проб N * следуемых о гомозигот знаруженных нуль-аллелей Р1 Р2

оз.Сопочное 50 9 3 0,2209 0,1843

р.Рыбацкая 50 22 14 0,0001 0,0528

Итуруп 2004 Рейдово 50 14 И 0,4359 0,8328

Кетовый 50 22 6 0,0001 0,0928

оз.Куйбышевское 50 13 2 0,2391 0,2871

Оз.Сопочное (ус.) 50 18 9 0,0106 0,2056

руч.Порожистый 50 17 8 0,3253 0,9043

оз.Сопочное 50 22 5 0,0343 0,4784

Рейдово 1 50 19 5 0,0553 0,0759

Рейдово 2 50 6 1 0,1059 0,4047

Итуруп 2005 Рейдово 3 50 17 9 0,0346 0,6356

Кетовый 1 50 15 7 0,1437 0,7203

Кетовый 2 50 16 7 0,0012 0,0091

Кетовый 3 50 14 5 0,0553 0,2051

р.Рыбацкая 50 19 8 0,0012 0,1965

оз.Благодатное 50 16 7 0,0851 0,9409

Кунашир 2005 р.Серноводка 50 20 12 0,0015 0,4447

р.Ильюшенка 50 25 13 0,0001 0,3987

Итуруп 2006 р.Порожистый 50 23 9 0,0003 0,0337

оз.Куйбышевское 50 23 6 0,0021 0,0406

оз.Благодатное 50 18 9 0,0001

оз.Сопочное(пр.) 50 29 8 0,0086 0,1797

оз.Сопочное 50 16 5 0,1918 0,0887

Итуруп 2007 оз .Лебединое 50 12 6 0,1597 0,2831

оз.Куйбышевское 50 8 4 0,4187 0,7151

Таблица 6.3. Результаты теста на равновесие Харди-Вайнберга при использовании оригинальных и альтернативных праймеров в выборках с Приморского Края, Магаданской области, Аляски.

Места взятия проб N исследуемых гомозигот обнаруженных нуль-аплелей Р1 Р2

р. Нарва 2007 51 13 2 0,4019 0,5213

р. Нарва 1995 51 11 2 0,2886 0,4263

Приморский Край р. Нарва 2006 р. Нарва 2005 42 20 9 8 2 5 0,7081 0,0151 0,7501 0,9969

р. Киевка 2002 12 6 4 0,0044 0,7625

р. Киевка 2003 11 4 3 . 0,0256 0,7294

р. Авакумовка 1994 26 7 2 0,1343 0,4213

Аляска Teslin (48) Snake (48) 48 48 16 11 0 0 0,4375 0,5544 0,4813 0,4875

р. Яна2+3 49 9 2 0,5012 0,5743

Магаданская область р. Яма 50 24 12 0,4672 0,9662

р. Кулькуты М 50 19 9 0,0428 0,4318

р. Кулькуты 50 13 7 , 0,0472 0,3137

Р1 - тест на отклонение от равновесия Х.-В. при использовании оригинальных праймеров Оке3; Р2 -отклонение от равновесия Х.-В. при использовании альтернативных праймеров Оке3; порог достоверности - Р<0,05.

Таблица 6.4. Результаты теста на равновесие Харди-Вайнберга при использовании оригинальных и альтернативных праймеров в выборках с п-ва Камчатка и Чукотского Автономного Округа.

р.Анадырь 1 50 14 4 0,3431 0,4512

Чукотский

Автономный р.Анадырь 2 50 17 6 0,0031 0,0369

Округ 2007

р.Анадырь 3 50 19 7 0,0093 0,0931

р. Камчатка 50 12 5 0,5251 0,4675

р. Паратунка 52 16 6 0,2275 0,7731

р. Большая 50 13 1 0,0341 0,1839

Камчатка 2007 р. Быстрая 14 4 2 0,2344 0,7251

р. Налычева 16 5 2 • 0,0566 0,4819

р. Авача 50 13 2 0,4341 0,5894

Р1 - тест на отклонение от равновесия Х.-В. при использовании оригинальных праймеров Оке3; Р2 -отклонение от равновесия Х.-В. при использовании альтернативных праймеров Оке3; порог достоверности -Р<0,05.

Выявленные в ходе работы нуль-аллели, существенно повлияли на интерпретацию популяционных данных. Ранее в 25 из 66 выборок кеты с Дальнего Востока выявлялось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. После использования альтернативных праймеров для проведения ПЦР локуса ОкеЪ, в 20 выборках кеты с различных регионов отклонение от равновесия Харди-Вайнберга не наблюдалось. Но, в 5 выборках кеты при использовании альтернативных праймеров, по прежнему наблюдалось отклонение от равновесия Х-В. В данном случае это явление может быть объяснено тем, что исследуемые выборки представляют собой смесь различных популяций (Адо-Тымовский ЛРЗ (2004), Курильский ЛРЗ-2 (2005г.), руч. Порожистый, оз. Куйбышевское и р. Анадырь-2). Особенно

это касается выборок из ручья Порожистый с озер Сопочное (о.Итуруп) и Куйбышевкое (о.Итуруп), так как предполагается, что в данных выборках могли присутствовать особи как, речной так, и озерной формы кеты. Имея различные частоты аллелей в популяциях, их смешивание могло привести к возникновению эффекта Валунда. Выборка №2 с Курильского ЛРЗ за 2005 год, была собрана из ставников, находящихся в прибрежной зоне в заливе, а не в реке на нерестилище, что дает возможность предположить, что в данной выборке, также может иметь место смесь рыб из различных нерестовых субпопуляций, этим объясняется обнаруженное отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. Не исключается, возможность наличия не определенной нами мутации в зоне отжига альтернативных праймеров, что может приводить к возникновению нового нуль-аллеля.

При обработке результатов были рассчитаны и сопоставлены значения ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготностей при использовании оригинальных и альтернативных пар праймеров при постановки ПЦР в исследуемых выборках кеты (Рис. 2.1; 2.2).

Рис.2.1. Показатели ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности в выборках кеты по локусу Оке3

без учета нуль-аллелей.

Показатели гетерозиготности в различных выборках кеты по локусу ОкеЗ без учета нупь-аппепей

в о.есю | 0,600 | 0,400 I 0,200

/ -»-Не / / / / ■/ / // У /////// /// / / / /у//// И Но | выборки

Рис. 2.2. Показатели ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности в выборках кеты по локусу Оке3 с учетом нуль-аллелей.

Показатели гетерозиготности в различных выборках кеты по локусу ОкеЗ с учетом нуль-

аллелей

| 0,800

й 0,400

| 0,000

'////////////////////////////

выборки

Как видно на рисунках 2.1., 2.2., при использовании оригинальных праймеров к локусу Оке3 в исследуемых выборках кеты кривая ожидаемой гетерозиготности (Но) значительно отклоняется от кривой наблюдаемой гетерозиготности (Не), в сторону недостатка гетерозигот. После применения альтернативных праймеров № 8 и № 20 кривая характеризующая ожидаемою гетерозиготность, практически совпадает с кривой наблюдаемой гетерозиготности, за исключением нескольких случаев, описанных выше. В результате использования альтернативных праймеров при проведении ПЦР по локусу ОкеЪ выявлено, что данный метод исследования нуль-аллелй позволяет существенно уточнить и исправить полученные ранее результаты, что не может не сказаться на более точной интерпретации популяционных данных.

Географическое распределение выявленных нуль-аллелей по локусу Оке3.

Выявление редкого аллеля №11.

Следующим этапом работы было изучение географического распространения обнаруженных нуль-аллелй во всех исследуемых нами выборках кеты. В ходе работы был выявлен очень редкий аллель №11. Данный аллель при использовании оригинальных праймеров встречался ранее только у шести из исследуемых 4000 образцов кеты. При использовании модифицированных праймеров частота этого аллеля для некоторых выборок с острова Итуруп, возросла с 0 до 12%. Наибольшая частота этого аллеля при использовании альтернативных праймеров наблюдалась на островах Итуруп и Сахалин.

Самые высокие частоты аллеля №11 наблюдались на острове Итуруп. По-видимому, мутация находящаяся в зоне отжига оригинального праймера сцеплена с определенным количеством повторов в микросателлитном локусе, формируя так называемый «снипстер» (БИРвт). В дальнейшем возможно использование таких мутаций в качестве дополнительных маркеров для дифференциации различных популяций кеты.

Распределение выявленных нуль-аллелй локуса Оке3 по всему исследуемому ареалу кеты.

Нам было интересно узнать, как распределяются новообнаруженные нуль-аллели по регионам Дальнего Востока, то есть определить частоты обнаруженных аллелей в различных выборках. Было выдвинуто предположение, что для крупных регионов, таких как Камчатка, Курильские острова или Сахалин, характерны определенные нуль-аллели, которые могут влиять на дифференцирующую способность локуса Оке3. Ранее, было выявлено, что аллель №4, обнаруженный как нуль-аллель особенно распространен на о. Кунашир и в Магаданской области, а аллель №11 чаще встречается на островах Итуруп и о. Сахалин. В Чукотском Автономном Округе чаще выявлялись аллели №6 и №8. Интересно, что хотя на о. Сахалин чаще распространен аллель№11, на нем встречаются все обнаруженные типы нуль-аллелей, характерные для других регионов. По данным американских исследователей (ВеасЬат Т. О. 2009), в локусе Оке3 в различных выборках американской кеты, не было обнаружено отклонения от равновесия Харди-Вайнберга и не были выявлены нуль-аллели. Это было подтверждено и нами, при исследовании двух выборок из Аляски.

Данные по географическому распределению обнаруженных нуль-аллелей, при использовании для проведения ПЦР альтернативных праймеров, представлены в таблице №8. Интересньм фактом является, что на о. Кунашир наиболее распространенным является аллель №4, а на о. Итуруп - аллель№11, но эти два острова Курильской гряды расположены в непосредственной близости друг от друга. Таким образом, полученные результаты позволяют увеличить дифференцирующую способность локуса ОкеЪ не только для крупных регионов, но и для субпопуляций в пределах небольшого географического региона.

Дифференциация популяций кеты различных регионов по локусу ОкеЗ при использовании альтернативных праймеров.

Следующим этапом нашей работы было определение дифференцирующей способности локуса Оке3 с использованием альтернативных праймеров №8 и №20 при постановке ПЦР. При сравнении полученных данных по крупным регионам, таким, как северная часть ареала кеты (выборки с Чукотского Автономного Округа, Магадана и Камчатки) с южной частью (выборки с о.Сахалин, южных островов Курильской гряды Кунашир и Итуруп и Приморского края) не выявило различий в показателях дифференциации (Таблица 7).

Сравнивая значение дифференциации между выборками о. Сахалина и Курильских островов наблюдалось даже небольшое снижение этого показателя за счет того, что в этих регионах с высокой частотой встречаются одинаковые аллели №11 и №4. Такой же эффект и по тем же причинам, наблюдается при сравнении между собой популяций Сахалина и Камчатки, Южного и Северного Сахалина. Но на островах Итуруп и Кунашир, распространение различных нуль-аллелей приводит к небольшому увеличению показателя дифференциации между этими выборками.

В итоге при сравнении популяций кеты крупных регионов в большинстве случаев дифференциация не меняется, в некоторых случаях незначительно снижается. Причиной этого является наличие сходных типов выявленных нуль-аллелей, либо их незначительное количество в исследуемых популяциях.

Таблица 7. Дифференциация между различными популяциями кеты по локусу ОкеЗ.

Выборки Показатели дифференциации ТЬе1а-Р (СБА)

Крупные регионы: без нуль-аллеля с нуль-аллелем

Север*; Юг** 0,0332 0,0368

Сахалин; Курилы 0,0921 0,0858

о.Итуруп; о.Кунашир 0,0278 0,0307

Зап. Сах; Вост. Сах. 0,0511 0,0478

Сахалин; Камчатка 0,0456 0,0395

Камчатка; Магадан 0,0048 0,0075

Камчатка; Анадырь 0,0225 0,0233

Анадырь; Магадан 0,0197 0,0321

Отдельные популяции:

Серноводка; Ильюшенка 0,0124 0,0085

Ипьюшенка; Сопочное Е 0,0358 0,0441

Сопочное (устье); Анадырь 3 0,0616 0,0739

Яма (Магадан); Ильюшенка 0,0447 0,0643

Яма (Магадан); Сопочное Е 0,0428 0,0843

*- все исследуемые выборки Чукотского Автономного Округа, п-ва Камчатки, Магаданской области **- все исследуемые выборки островов Сахалин, Кунашир, Итуруп и выборки Приморского Края.

При сравнении отдельно взятых выборок принадлежащих разным регионам, было выявлено увеличение показателей дифференциации. Например, при сравнении выборки с озера Сопочное 2005 (о.Итуруп) и выборки - Яма(Магадан), было выявлено увеличение дифференциации с 4,3% до 8,4% по локусу Оке3. Такой эффект появляется за счет того, что нуль-аллелем в выборке с озера Сопочное (о.Итуруп) вьмвляется только аллель №11, а в выборке с Магадана аллель №4 (Таблица 8).

Таблица 8. Дифференциация между выборками Сопочное 05(Итуруп) и Яма (Магадан)

от Показатели дифференциации (ТЬе1а-Р)

аллели без нуль-аллеля с нуль-аллелем

все 0,0428 0,0843

12 0,0204

11 0,0816

9 *<м ***

10 0,0136 0,0102

2 *** ***

1 0,1641 0,2037

7- 0,0078 0,0069

8 0,0341 0,0271

5 0,0085 0,0058

3 0,0097 0,0109

6 0,0131 0,0084

0,1219 0,2467

*** - отсутствие данного аллеяя в исследуемых выборках

Приведенные выше примеры свидетельствуют, что выявление нуль-аплелей приводит к значительным уточнениям статистических данных при изучении популяционной структуры кеты по микросателлитным локусам. Поскольку изучаемый объект представляет собой ценный промысловый вид лососевых рыб, воспроизводство которого, в последнее время только увеличивается, то данный метод позволяет более точно интерпретировать полученные популяционные данные. Такие исследования необходимы для дальнейшей сертификации и идентификации отдельных популяций и стад кеты.

Выявление локализации мутаций, вызывающих появление нуль-аллелей.

Следующим этапом нашей работы для более детального анализа было выявление локализации мутации. Для всех образцов, в которых были обнаружены нуль-аллели по локусу Оке3 требовалось определить с какой 5' или 3' зоны относительно тела микросателлита произошла мутация. Для решения поставленной задачи проводились ПЦР с различными комбинациями оригинальных и альтернативных праймеров. Пример определения локализации мутации показан на рисунке 4.

Для этого был взят образец, в котором при помощи альтернативных праймеров ранее был выявлен нуль-аллель и поставлены следующие ПЦР.

Дорожки №1, 2, 3: продукт амплификации образца №1 с использованием прямого альтернативного праймера №8 (Таблица №2) и оригинального обратного праймера №21. В результате, на фореграмме мы можем наблюдать гомозиготу, что говорит о том, что мутация находится в зоне обратного оригинального праймера, взятого из статьи.

Для получения ПЦР продуктов видимых на дорожке № 2а были использованы прямой оригинальный праймер №9 и обратный альтернативный праймер № 20. На фореграмме видна четкая гетерозигота, позволяющая сказать, что данные праймеры отжигаются вне зоны искомой нами мутации. То же, можно сказать и про дорожку № За, где визуализируется гетерозигота, полученная при использовании прямого и обратного альтернативных праймеров (№ 8, № 20).

Рис. 4. Поиск мутаций в области отжига прямого и обратного альтернативных праймеров.

1А, 2А, ЗА-образец№1; 4Б, 5Е, 6Б - образец №2; 7В, 8В, 9В - образец №3; Маркировка праймеров'. Ра-прямой альтернативный, Бо - прямой оригинальный, Яа - обратный альтернативный, Ид - обратный оригинальный. Внутри рамок указаны цифрами - 4, 5, 6, 11 типы аллелей, выявленные при использовании праймеров указанных под дорожкой.

Способом, описанным выше, были изучены все 332 образца, в которых были обнаружены нуль-аллели.

В результате исследований выявлено, что для большинства образцов несущих в себе нуль-аллель мутация произошла в зоне обратного оригинального праймера. Интересно что, для аллеля №4 мутация произошла как в зоне прямого, так и в зоне обратного праймера. Обнаружено, что мутация, локализованная в зоне прямого праймера, чаще встречается на о. Сахалин и о. Итуруп, а мутация в зоне отжига обратного оригинального праймера чаще выявляется, в основном, в Магаданской области, и в единичных случаях в других регионах Дальнего Востока. Это увеличивает дифференцирующую способность локуса Оке3.

ГЛАВА 5. Секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных видов рыб рода ОпсогкупсЬт по локусу Оке3.

Подбор праймеров для секвенирования локуса Оке3 для всех видов рыб рода Опсогкупскт.

Используя известные данные о первичной нуклеотидой последовательности ДНК микросателлитного локуса Оке3, имеющиеся в открытой международной базе 1<ГСВ1, нами были сконструированы праймеры для проведения секвенирования исследуемого локуса, представленные в таблице 9. С помощью сконструированных праймеров были секвенированы образцы всех видов рыб рода ОпсогЪупсЬт по локусу Оке3: кета, нерка, горбуша, сима, кижуч, чавыча. Для подробного изучения нуклеотидной последовательности этого локуса праймеры подбирались так, чтобы охватить весь известный участок. Данные, полученные в результате секвенирования исследуемых образцов, обрабатывались при помощи пакета программ «Ьаэе^епе» и «SeqManNgen».

Таблица №9. Праймеры для секвенирования, подобранные к локусу ОкеЪ

виды праймеры дня секвенирования 1 отжига

Кета 00: З'-СОАТСТОООСАТОТТАТСАС-З' (Я): 5'-ОАОАТААОАОАОААААСААООАТСА-3' 58

(Р): 5'-ООАТСГСООСАТОТТАТСАС 60

(Я): 5'-АТСАОООТАТООАТАТОСАО

Горбуша (Г): 5'-ООАТСТОООСАТОТТАТСАС-3' СЮ: У-ОАОАТААОАаАОААААСААООАТСА-З' 58

Нерка 5'-СОАТСТООаСАТОТТАТСАС.З' (Я) 5'-ОАОАТААОАОАОААААСААООАТСА-3' 56

Сима ТО 5'-ООАТСТОООСАТОТТАТСАС-3' (Л): 5'-ОАОАТААОАОАОААААСААООАТСА-3' 58

Кижуч (П: З'-ООАТСТОСОСАТОТТАТСАС-З' (Я): 5'-САОООАТАТССАОТАААТАСТ-3' 58

Чавыча (И): 5'-ООАТСТОООСАТОТТАТСАС-3' (Я): 5'-ОаАТСАСООАТАТОСАОТАААТАОТА -3' 58

р-прямой прамер; Я-обратный праймер.

Результаты секвенирования 5' фланкирующей зоны микросателлитного локуса кеты - Оке3.

Для подробного изучения нуклеотидной последовательности локуса ОкеЪ у кеты были исследованы 6 образцов, в которых ранее были обнаруженны нуль-аллели. При изучении 5' фланкирующей зоны микросателлитного локуса Оке3 у кеты, мы обнаружили единичную замену (БОТ) цитозина на тимин, в позиции 126 по отношению к секвенированной последовательности АР330220, зарегистрированной в открытой международной базе N081. Данный БОТ приводит к тому, что оригинальный праймер не отжигается на ДНК образца. Это приводит к ложной гомозиготности, или полному отсутствию ПЦР продукта и соответственно - появлению эффекта нуль-аллеля. Использование альтернативного праймера, последовательность которого лежит вне зоны этой мутации, позволяет вьивить аллель №4. Также в 5' фланкирующей зоне был обнаружена ещё одна единичная замена цитозина на тимин, лежащая вне зоны отжига оригинального праймера, в позиции 84 по отношению к секвенированной последовательности АР330220. В итоге все выявленные снипы в дальнейшем можно учитывать не только для подбора праймеров, но и как дополнительные маркеры при популяционных исследованиях кеты.

Результаты секвенирования 3' фланкирующей зоны микросателлитного локуса кеты - Оке3.

Для выявления причин возникновения нуль-аплелей в 3' фланкирующей зоне микросателлитного локуса ОкеЪ мы проводили ПЦР, комбинируя различные праймеры, но в большинстве случаев амплификация нуль-аллеля не происходила. Изначально, нуль-аллели были обнаружены при помощи альтернативного обратного праймера №20, который расположен наиболее близко к телу микросателлита, а дальнейший сдвиг альтернативных праймеров в сторону 3' конца от тела микросателлита, не приводило к положительным результатам в выявлении ранее обнаруженных нуль-аллелей. Поэтому на данном этапе работы нам не удалось определить мутации, приводящие к появлению нуль-аллелей со стороны 3' фланкирущей зоны от тела микросателлита.

Для решения поставленной проблемы было решено укоротить один из обратных праймеров (№4 в таблице 10). И в результате амплификации с обратным праймером №4 была получена гетерозигота, у которой в дальнейшем и была исследована нуклеотидная последовательность. Было выявлено большое количество БОТ во 3' фланкирующей тело

микросателлита зоне. Выяснилось, что эффект нуль-аллеля вызывала мутация, находящаяся в позиции 356 по отношению к известной секвенированной последовательности АР330220 (N081) и представляющая собой трансзицию тимина на цитозин.

Все выявленные однонуклеотидные замены описаны в таблице 10.

злнца 10. Мутации, выявленные во фланкирующих микросателлит зонах локуса ОкеЗ.

Позиция к АР330220 выявленные SNP

В 5' фланкирующей зоне

84 c/t

127 c/t

В 3' фланкирующей зоне

327 t/a

342 g/a

350 а/с

357 t/g

368 c/g

370 a/t

381 t/c

В результате можно сказать, что мы обнаружили мутации, приводящие к возникновению нуль-аллелей. Благодаря полученным данным, при дальнейшей работе с этим локусом можно подбирать праймеры, избегая тех мест, где обнаружены

Сравнительный анализ нуклеотидиых последовательностей тела микросателлитного локуса ОкеЗ у разных видов рыб рода ОпсогИупс/ик.

В результате секвенирования микросателлитного локуса Оке3 у разных видов рыб рода ОпсогИупсИш, были обнаружены некоторые закономерности.

У микросателлиитного локуса ОкеЗ тело самого микросателлита, которое состоит из 13 нуклеотидиых пар и повторяется несколько раз, обнаружено только у кеты, горбуши и нерки, то есть у группы видов эволюционно близких друг к другу. Похожие мотивы встречается у симы, микижи, кижуча и чавычи, но они не идентичны по нуклеотидному составу, так как имеются единичные нуклеотидные замены, делеции и вставки нуклеотидиых оснований.

w Sequence Nam □ Pos= 167

№ И Consensus 7 Sequences TCCCTCTOGTCTCTCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCTTTTTTCCCTXXXXXXXC

10 2D 30 40 50 60

Ш Ц 1 C400 F_E3.stf H470 FJTCD-.S M450_FJT<r^«. G450_r DS.seq AF33022Q.seq CH35Q_F_C4.se KIG_F_E3.seq TTCCTCTCGTCTCTCTCTCTCAT CTTT GCCTCT CGT GTTTCTCCCCCTCGTCTС TCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCATCTCTCCCT CTCGT GT CTTT стст стсттт CTCT с TTCCTCTCGTCTTTCCCTCTCGTCTCTCTCTCTCGT CT CTCCCTCTT GTGCTT CTCTCTCTCGTС TCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCGTCTCTCCCTCTCGTCTC TCCCT CTCGTCT CTCCCT CTCGT CT CTCCCT CTCGTCT CTCCCT CTCGTCT CTCCCT CTCGTCTC TCCTCTTGTCTTTCCCTCACGTGTCTCTACCCCTCGTCTCTCTCTCGTCTT TCCTCTCCTCTCTCTCTCGTCTATCCCTCTCGTCTCTCTCTCTCT CGCTTCTCTCTCGCTCTTCC

Рис. 6. Результаты секвенирования микросателлитного тела локуса ОкеЗ у 7 видов рыб рода Опсог11упсЬ1К . С400 - сима; Н470 - нерка; М450 - микижа; С450 - горбуша; АI'330220 - кета; СН350 -чавыча; К1С - кижуч.

Главное, что все представленные мотивы у выше перечисленных видов не имеют повторений, то есть встречаются только 1 раз в цепочке ДНК, не представляя собой тандемные повторы. В результате, представленный локус Оке3, как микросателлитный, можно считать только у кеты, горбуши и нерки. По-видимому, данный микросателлитный локус ОкеЗ, является эволюционно новым образованием, сформировавшимся вместе с группой тихоокеанских лососей, в которую входят кета, горбуша и нерка.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фланкирующих зон микросателлитного локуса ОкеЗ у разных видов рыб рода Опсог/цтскш.

В результате изучения нуклеотидной последовательности 5' фланкирующей зоны от тела микросателлитного локуса Оке3 у всех видов рыб рода ОпсогИупсИш были обнаружен консервативный участок. На этом участке, расположенном в позиции от 104 до 140 по отношению к известной секвенированной последовательности АР330220 (ЫСВ1) не было обнаружено нуклеотидных замен, делеций или инсерций. Можно предположить, что данный участок у описанных видов играет какую-либо функцию в структурной организации ДНК. Обнаружены некоторые единичные замены, локализованные у разных видов в различных позициях по отношению к известной секвенированной последовательности АР330220 (ЫСВ1).

У кеты в позиции 156 обнаружена делеция, протяженностью в 18 нуклеотидов (acggtcacttcaccttct), по отношению ко всем остальным видам рыб рода ОпсогИупскш. Причем данного участка ДНК не было у всех 12 исследованных при помощи секвенирования аллелей микросателлитного локуса Оке3. Возможно, в дальнейшем, выявленную делецию можно использовать в качестве маркера для идентификации кеты, особенно при отборе мальков на исследование.

При исследовании нуклеотидной последовательности 3' фланкирующей зоны от тела микросателлитного локуса Оке3 также было обнаружено большое количество единичных замен. Обнаружен еще один консервативный участок ДНК у всех исследуемых образцов рыб рода ОпсогИупсИш, находящийся в положении 295-324 по отношению к известной секвенированной последовательности АР330220 0МСВ1). При исследовании двух аллелей чавычи был выявлен сателлитный повтор протяженностью в 119 нуклеотидных пар. В дальнейшем эту последовательность также можно использовать в качестве дополнительного маркера у этого вида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате нашей работы было показано влияние нуль-аллелей на интерпретацию популяционных данных на примере различных стад кеты Дальнего Востока.

При исследовании 66 выборок кеты из различных регионов по локусу ОкеЪ, в 25 выборках было выявлено отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. Причиной данного явления оказалось наличие нуль-аллелей в данном локусе. Для выявления нуль-аллелей было подобрано большое количество альтернативных праймеров и обнаружены те, которые выявляют нуль-аллель. Причем было показано, что для некоторых крупных регионов (о. Сахалин, Курильские острова, п-ов Камчатка) характерны свои, определенные нуль-аллели. При сопоставлении полученной информации с существующей базой данных обнаружено, что в 20 выборках из 25, в которых ранее было выявлено отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, оно не наблюдается, т. е. предложенный метод позволяет выявить весь спектр аллельного разнообразия, ранее «скрытого» за нуль-аллелями.

В результате использования альтернативных праймеров при проведении ПЦР по локусу Оке3 выявлено, что данный метод исследования нуль-аллелей позволяет существенно уточнить и исправить полученные ранее результаты, что обеспечивает более точную интерпретацию популяционных данных. На основании результатов этой работы можно сделать общее заключение, что в случае обнаружения ДНК-маркера, в котором есть подозрения на наличие в нем нуль-аллелей, необходимо проводить аналогичную работу.

Нами изучено географическое распределение различных нуль-аллелей, выявленных в локусе Оке3 в выборках кеты с разных регионов Дальнего Востока. Обнаружено, что выявление нуль-аллелей приводит к значительным уточнениям популяционной структуры кеты по микросателлитным локусам. Если не выявлять нуль-аллели, то наблюдаемые различия между стадами (популяциями) могут быть, как завышены, так и занижены в зависимости от спектра скрытых аллелей: скрытые аллели снижают истинную дифференциацию между популяциями в случаях, когда в разных регионах встречаются разные нуль-аллели, и увеличивают, когда они одинаковы. Поскольку изучаемый объект

представляет собой ценный промысловый вид лососевых рыб, воспроизводство которого в последнее время значительно увеличивается, а данный прием позволяет более точно интерпретировать полученные популяционные данные, то такие исследования необходимы для прикладных вопросов сертификации промысла и идентификации популяций кеты.

При помощи секвенирования нуклеотидной последовательности локуса Оке3 кеты были выявлены мутации, приводящие к появлению нуль-аллелей. Эти мутации в дальнейшем можно учитывать не только для подбора праймеров к данному локусу, но и в качестве дополнительных маркеров при попупяционных исследованиях кеты.

Проведено секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных видов рыб рода ОпсогИупсИих по локусу ОкеЗ. Выявлено, что представленный локус Оке3, как микросателлитный, можно считать только у трех видов рода - кеты, горбуши и нерки, так как тандемные повторы встречаются только у этих видов. По-видимому, данный микросателлитный локус Оке 3, является эволюционно новым образованием, сформировавшимся вместе с этой группой видов рода ОпсогЬупсЬш. У микижи, симы, кижуча и чавычи как такового тандемного повтора нет. У чавычи был выявлен сателлитный повтор протяженностью в 119 нуклеотидных пар. В результате при популяционных исследованиях различных видов по одним и тем же микросателлитным локусам, необходимо предварительно изучить их нуклеотидную последовательность для уточнения статуса данного локуса.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны альтернативные праймеры к микросателлитному локусу Оке3 кеты, которые позволили выявить нуль-аллели и устранить вызванную ими ложную гомозиготность. Выявлено, что причиной появления нуль-аллелей в некоторых случаях являются мононуклеотидные замены (ЭИР) в праймерной зоне.

2. Изучено географическое распределение обнаруженных нуль-аплелей в популяциях кеты и показано, что в каждом регионе чаще распространен свой определенный нуль-аллель. В большинстве выборок, в которых до использования альтернативных праймеров выявлялось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, с их применением оно исчезло вместе с ложными гомозиготами. А в пяти выборках, в которых осталось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, его причиной предполагается смесь различных популяций.

3. Выявлено влияние нуль-аллелей на дифференцирующую способность локуса: они смещают оценку степени дифференциацию как в большую, так и в меньшую сторону. Показано, что при сравнении выборок кеты из регионов с высокой частотой различающихся нуль-аллелей локуса Оке3 степень дифференциации занижается из-за их присутствия и поэтому может значительно возрасти при использовании альтернативных праймеров. Напротив, степень дифференциации может быть завышена, если в различных популяциях встречаются одинаковые нуль-аллели; использование альтернативных праймеров позволяет оценить фактическую степень дифференциации.

4. Анализ нуклеотидной последовательности локуса ОкеЗ показал существенные различия первичной структуры ДНК для всех видов рыб рода ОпсогИупсИш. Сам микросателлит обнаружен только у кеты, горбуши и частично у нерки, а у всех остальных видов он как таковой не выявлен. Поскольку указанная триада видов является самой молодой среди тихоокеанских лососей, то это говорит о том, что данный микросателлит в эволюционном плане является новым образованием, сформировавшимся у этой группы.

5. Обнаружены консервативные участки ДНК в 5' и 3' фланкирующих зонах локуса Оке3 для всех видов тихоокеанских лососей (в позиции 104-140 и 295-324 по отношению к известной секвенированной последовательности АР330220), возможно играющие важную роль в структурной организации ДНК.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

Статья в реферируемом журнале: 1. С. Ю. Кордичева, Г. А. Рубцова, М. В. Шитова, Г. О. Шайхаев, К. И. Афанасьев, JI. А. Животовский. ВЫЯВЛЕНИЕ НУЛЬ_АЛЛЕЛЕЙ В МИКРОСАТЕЛЛИТНОМ ЛОКУСЕ КЕТЫ (Oncorhynchus keta Walbaum). ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 8, с. 1143-1147

Тезисы:

1. С.Ю. Кордичева. Г.А.Рубцова. М.В.Шитова, Г.О.Шайхаев, К.И.Афанасьев, Л.А.Животовский Географическое распределение нуль-аллелей в популяциях кеты (Oncorhynchus keta Walbaum)// Воспроизводство естественных популяций ценных видов рыб. Тезисы докладов Международной конференции. - СПб.: Нестор-История, 2010, с.89-91. (2022 апреля 2010 г)

2. Кордичева С.Ю.. Рубцова Г.А., Шитова М.В., Шайхаев Г.О., Афанасьев К.И., Животовский Л.А. Влияние нуль-аллелей на интерпретацию популяционных данных (на примере кеты Oncorhynchus keta Walbaum)// Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М. Кожова: тез. док. междунар. науч. конф. и междунар. шк. для мол. ученых (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.) - Иркутск: Изд-во, Иркут. гос. ун-та, 2010, с.202

3. Кордичева С.Ю.. Рубцова Г.А., Шитова М.В., Афанасьев К.И., Животовский Л.А. Интерпретация популяционных данных при выявлении нуль-аллелей на примере кеты

(Oncorhynchus keta Walbaum)// Геномика и биология клетки: тез. док. IV междунар. шк. мол. уч. по молек. генетике (Звенигород, 29 ноября - 3 декабря 2010), с. 120-121

Подл, в печать2Ч.03.Ч Объем?.? с^. Тираж 100 зкз. Ззхзз21Б ВНИРО. 107140, Москва В. Красносельская, 17

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кордичева, Светлана Юрьевна

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Кета - биология вида и его хозяйственное значение.

2.2. ДНК маркеры.

2.2.1. Случайные маркеры.

2.2.2. Специфические маркеры.

2.2.3. Митохондриальная ДНК.

2.2.4. Повторяющиеся последовательности.

2.2.5. Сателлитная, мини- и микросателлитная ДНК.

2.2.6. Микросателлиты.

2.2.7. Краткая история исследований микросателлитов.

2.2.8. Минисаттелиты.

2.2.9. Сателлитная ДНК.

2.2.10. Скорости мутаций в микро- и минисателлитных локусах.

2.3.1. Проблемы, возникающие при изучении микро- и минисателлитных локусов.

2.3.2. Нуль-аллели.

2.3.3. Возможные пути решения проблемы пуль-аллелей.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 .Характеристика исследуемых проб.

3.1.1. Пробы кеты.

3.1.2.Другие виды рыб рода Опсогкупскиз.

3.2.1. Методика исследования микросателлитного локуса ОкеЪ.

3.2.2. Секвенирование локуса ОкеЗ.

3.3. Статистическая обработка данных.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1.Поиск нуль-аллелей.

4.1.1. Первые шаги. Подбор праймеров для определения нуль-аллеля в выборке с о. Кунашир.

4.1.2. Подбор праймеров для определения нуль-аллелей в различных регионах Дальнего Востока.

4.2.1. Определение нуль-аллелей в локусе Оке3.

4.2.2. Результаты теста на равновесия Харди-Вайнберга в выборках кеты.

4.3. Географическое распределение выявленных нуль-аллелей по локусу Оке3.

4.3.1. Выявление редкого аллеля №11.

4.3.2. Распределение выявленных нуль-аллелй локуса ОкеЪ по всему исследуемому ареалу кеты.

4.4.1. Дифференциация популяций кеты различных регионов по локусу ОкеЪ при использовании альтернативных праймеров.

4.4.2. Выявление локализации мутаций, вызывающих появление нуль-аллелей.

ГЛАВА 5. Секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных видов рыб рода Опсогкупскиз по локусу ОкеЪ.

5.1. Подбор праймеров для секвенирования локуса ОкеЪ для всех видов рыб рода Опсогкупскт.

5.2.1 Результаты секвенирования 5' фланкирующей зоны микросателлитного локуса кеты - ОкеЪ.

5.2.2. Результаты секвенирования 3' фланкирующей зоны микросателлитного локуса кеты - ОкеЪ.

5.3.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей тела микросателлитного локуса ОкеЪ у разных видов рыб рода Опсогкупскш.

5.3.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фланкирующих зон микросателлит локуса ОкеЪ у разных видов рыб рода Oncorhynchus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нуль-аллели в микросателлитных локусах кеты (Oncorhynchus keta Walbaum)"

Актуальность проблемы. Тихоокеаиский лосось - кета (Oncorhynchus keta Walbaum), имеет большое промысловое значение и является важным элементом продовольственной безопасности России. Изучение генетического состава популяций кеты важно не только для решения фундаментальных научных проблем, например, такой как популяциониая организация вида, но и для формирования представления о том, как лучше сохранять, поддерживать и воспроизводить этот вид, а также как оптимизировать процессы рыбоводства и рыболовства. Актуальным вопросом на данный момент является изучение популяционной структуры разных видов с помощью микросателлитных маркеров. Микросателлиты обладают высоким полиморфизмом и хорошо дифференцируют популяции (Животовский, 2006; Schlotterer, 199В). На данный момент уже проведены большие исследования по микросателлитной изменчивости кеты и- показано, что микросателлитныс маркеры являются хорошими маркерами для исследования межпопуляционных различий этого вида (Афанасьев и др., 2008; Животовский и др. 2008; Brown, Epifanio 2003). Однако, при проведении широкомасштабных популяционных исследований на разных видах животных, исследователи сталкиваются с проблемой нуль-аллелей. В популяционных исследованиях нуль-аллелем принято называть явление отсутствия ПЦР-продукта, которое вызвано мутациями (единичная замена, инссрция, дслеция, инверсия) во фланкирующих микросателлит последовательностях ДНК, па которую гибридизуются праймеры. Это приводит к некорректной интерпретации популяционных данных (Carlsson 2008), создавая «фальшивые» гомозиготы .вмсстогетерозигот,.и.увеличивая., тем . самым уровень наблюдаемой гомозиготности, что тестируется отклонением от равновесия Харди-Вайнберга. Следует заметить, что нуль-аллели встречались и. в исследованиях полиморфизма аллозимных маркеров, где они проявлялись отсутствием энзиматической активности, и могут встретиться при исследованиях иных типов полиморфизма ДНК. Так что наличие нуль-аллелей приводит к общим проблемам скрытого полиморфизма и появления мнимой, «фальшивой» гомозиготносги, возникающим как в фундаментальных популяционных исследованиях, так и в прикладных задачах, например в судебно-медицинских генетических исследованиях.

Так как ещё не разработаны надежные способы определения и учета данного явления, во многих популяционных исследованиях, те локусы, в которых предположительно выявляются нуль-аллели, исключаются из популяциониого анализа (Zhan, Hu, Hu et al. 2009; Senn II, Pemberton, 2009). Однако, такой путь решения проблемы этого явления неприемлем при масштабных исследованиях, поскольку в дальнейшем, при увеличении самой выборки или расширении исследуемых популяций, возрастает вероятность появления нуль-аллеля на каждый локус, что может привести к исключению большого числа локусов, а это отрицательно сказывается на качестве исследований. Причем, в одной популяции одного вида иуль-аллель может присутствовать, а в другой популяции - пет. Кроме того, важным представляется выяснить, какие мутации приводят к появлению нуль-аллелей через исследование структуры праймерпой области.

Чтобы подробно изучить указанное явление, мы выбрали объект, достаточно хорошо изученный на большой части ареала по микросателлитным локусам. В качестве такого объекта исследовали тихоокеанского лосося - кету, которая подробно охарактеризована по набору из десяти микросателлитных маркеров (Афанасьев и др. 2008; Животовский и др. 2008; Рубцова и др. 2008; Шитова и др. 2009). Одним из локусов, попадающих под «подозрение» на наличие в нем нуль-аллеля при крупномасштабном исследовании популяций кеты, является ОкеЪ (Buchholz et al., 2001). По этому локусу были выявлены достоверные отклонения от равновесия Харди-Вайиберга в сторону увеличения гомозигот в ряде популяций кеты островов Сахалин, Кунашир и Итуруп (наши неопубликованные данные).

Отклонение от равновесия Харди-Вайнберга может появляться по разным причинам: отбор, действующий на данный локус, инбридинг, смесь нескольких популяций, в которых отличаются частоты аллелей, или наличие нуль-аллеля. Гипотеза о действующем па этот локус отборе была отвергнута, так как микросателлитные локусы считаются селективно нейтральными. Возможность инбридинга исключается, иначе отклонения от равновесия Харди-Вайнберга наблюдались бы по всем исследуемым локусам. Гипотеза смешения популяций (эффект Валунда) нами была поставлена под сомнение, так как в исследуемых ранее популяциях кеты наблюдались сильные отклонения от равновесия Харди-Вайнберга, чтобы объясняться имеющейся относительно невысокой локальной генетической дифференциацией кеты. Поэтому, мы остановились на гипотезе о наличии нуль-аллеля в локусе ОкеЪ и в связи с этим были поставлены следующие цели и задачи исследования.

Цели и задачи исследования.

Цель работы: выявить нуль-аллели в микросателлитном локусе ОкеЪ в популяциях кеты (Опсогкупских ке1а \Уа1Ьаит), изучить первичную структуру этих аллелей и исследовать их географическое распространение.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать праймеры, с помощью которых можно добиться амплификации нуль-аллелей в микросателлитном локусе ОкеЪ.

2. Изучить географическое распределение выявленных пуль-аллелей, а также их влияние на интерпретацию популяционпых данных.

3. Локализовать мутации, которые приводят к появлению нуль-аллелей.

4. Секвенировать аллели локуса Оке 3 для его подробного структурного анализа на разных видах рыб рода ОпсогкупсНш.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кордичева, Светлана Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Подобраны альтернативные праймеры к микросателлитному локусу ОкеЗ кеты, которые позволили выявить нуль-аллели и устранить вызванную ими ложную гомозиготность. Выявлено, что причиной появления нуль-аллелей в некоторых случаях являются мононуклеотидные замены (БМР) в праймерной зоне.

2. Изучено географическое распределение обнаруженных нуль-аллелей в популяциях кеты и показано, что в каждом регионе чаще распространен свой определенный нуль-аллель. В большинстве выборок, в которых до использования альтернативных праймеров выявлялось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, с их применением оно исчезло вместе с ложными гомозиготами. А в пяти выборках, в которых осталось отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, его причиной предполагается смесь различных популяций.

3. Выявлено влияние нуль-аллелей на дифференцирующую способность локуса: они смещают оценку степени дифференциацию как в большую, так и в меньшую сторону. Показано, что при сравнении выборок кеты из регионов с высокой частотой различающихся пуль-аллелей локуса Оке3 степень дифференциации занижается из-за их присутствия и поэтому может значительно возрасти при использовании альтернативных праймеров. Напротив, степень дифференциации может быть завышена, если в различных популяциях встречаются одинаковые нуль-аллели; использование альтернативных праймеров позволяет оценить фактическую степень дифференциации.

4 .Анализ иуклеотидной последовательности локуса Оке3 показал существенные различия первичной структуры ДНК для всех видов рыб рода Опсогкупскт. Сам микросателлит обнаружен только у кеты, горбуши и частично у нерки, а у всех остальных видов он как таковой не выявлен. Поскольку указанная триада видов является самой молодой среди тихоокеанских лососей, то это говорит о том, что данный микросателлит в эволюционном плане является новым образованием, сформировавшимся у этой группы.

5. Обнаружены консервативные участки ДНК в 5' и 3' фланкирующих зонах локуса Оке3 для всех видов тихоокеанских лососей (в позиции 104-140 и 295-324 по отношению к известной секвенированной последовательности АБЗ30220), возможно играющие важную роль в структурной организации ДНК.

81

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате нашей работы было показано влияние нуль-аллелей на интерпретацию популяционных данных на примере различных стад кеты Дальнего Востока.

При исследовании 66 выборок кеты из различных регионов по локусу Оке3, в 25 выборках было выявлено отклонение от равновесия Харди-Вайиберга. Причиной данного явления оказалось наличие нуль-аллелей в данном локусе. Для выявления нуль-аллелей было подобрано большое количество альтернативных праймеров и обнаружены те, которые выявляют нуль-аллель. Причем было показано, что для некоторых крупных регионов (о. Сахалин, Курильские острова, п-ов Камчатка) характерны свои, определенные нуль-аллели. При сопоставлении полученной информации с существующей базой данных обнаружено, что в 20 выборках из 25, в которых ранее было выявлено отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, оно не наблюдается, т. е. предложенный метод позволяет выявить весь спектр аллельного разнообразия, ранее «скрытого» за нуль-аллелями.

В результате использования альтернативных праймеров при проведении ПЦР по локусу Оке3 выявлено, что данный метод исследования нуль-аллелей позволяет существенно уточнить и исправить полученные ранее результаты, что обеспечивает более точную интерпретацию популяционных данных. На основании результатов эюй работы можно сделать общее заключение, что в случае обнаружения ДНК-маркера, в котором есть подозрения па наличие в нем нуль-аллелей, необходимо —проводить аналогичную работу. - - - — - -—

Нами изучено географическое распределение различных нуль-аллелей, выявленных в локусе ОкеЪ в выборках кеты с разных регионов Дальнего Востока. Обнаружено, что выявление нуль-аллелей приводит к значительным уточнениям популяционной структуры кеты по микросателлитным локусам. Если не выявлять нуль-аллели, то наблюдаемые различия между стадами (популяциями) могут быть, как завышены, так и занижены в зависимости от спектра скрытых аллелей: скрытые аллели снижают истинную дифференциацию между популяциями в случаях, когда в разных регионах встречаются разные иуль-аллели, и увеличивают, когда они одинаковы. Поскольку изучаемый об7>ект представляет собой ценный промысловый вид лососевых рыб, воспроизводство которого в последнее время значительно увеличивается, а данный прием позволяет более точно интерпретировать полученные популяционные данные, то такие исследования необходимы для прикладных вопросов сертификации промысла и идентификации популяций кеты.

При помощи секвенирования нуклеотидной последовательности локуса Оке3 кеты были выявлены мутации, приводящие к появлению нуль-аллелей. Эти мутации в дальнейшем можно учитывать не только для подбора праймеров к данному локусу, но и в качестве дополнительных маркеров при популяционных исследованиях кеты.

Проведено секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных видов рыб рода ОпсогкупскиБ по локусу ОкеЗ. Выявлено, что представленный локус ОкеЗ, как микросателлитный, можно считать только у трех видов рода - кеты, горбуши и нерки, так как тандемные повторы встречаются только у этих видов. По-видимому, данный микросателлитный локус Оке3, является эволюционно новым образованием, сформировавшимся вместе с этой группой видов рода ОпсогИупсИш. У микижи, симы, кижуча и чавычи как такового таидемного повтора нет. У чавычи был выявлен сателлитный повтор протяженностью в 119 нуклеотидныхпар. В результате при популяционных исследованиях различных видов но одним и тем же микросателлитным локусам, необходимо предварительно изучить их нуклеотидную последовательность для уточнения статуса данного локуса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кордичева, Светлана Юрьевна, Москва

1. Алтухов Ю.П. Динамика нопуляционных генофондов // Москва, Наука, 2004.

2. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях // Москва ИКЦ «Академкнига». 2003.

3. Алтухов Ю. П. , Е. А. Салменкова, В. Т. Омельченко, Г. Д. Сачко,

4. B. И. Слынько. О числе мономорфных и полиморфных локусов в популяции кеты Oncorhynchus keta Walb. одного из тетраплоидных видов лососевых // Генетика. 1972. VIII №2. С. 67-75.

5. Алтухов Ю. П. , Е. А. Салменкова, Г. Д. Рябова, Н. И. Куликова. Генетическая дифференциация популяций кеты и эффективность некоторых акклиматизационных мероприятий // Биология моря. 1980. Т. 3.1. C. 23-38.

6. Алтухов Ю. П., Салменкова Е. А., Омельченко В. Т. Популяционная генетика лососевых рыб // М., Наука. 1997. 288 с.

7. Алтухов Ю. П., Салменкова Е. А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 38. № 9. С. 1173-1195.

8. Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Шитова М.В. Межрегиональная дифференциация кеты Сахалина и Южных Курил по микросателлитным локусам // Генетика. 2008. Т. 44. № 7. С. 956-963.

9. Афанасьев К. И., Рубцова Г. А., Шитова М. В. И др. Популяционная структура кеты ONCORHYNCHUS КЕТА Российского Дальнего востока, выявленная по микросателлитным маркерам // Биология моря. 20H-.-TOM-37. №1тсг39-47.- ~-------- ----------- "

10. Варнавская II. В. Генетическая дифференциация популяций тихоокеанских лососей // Петропавловск-Камчатский, Изд-во КамчатНИРО, 2006. 488 с.

11. Вейр Б. Анализ генетических данных // Москва. Мир. 1995.400 с.

12. Гинатулина Л. К., Машкин С. А. Исследование внутривидового полиморфизма митохоидриальной ДНК кеты из Приморья и Сахалина.// Генетика. 1990. Т. 26. № 4. С. 729-738.

13. Гриценко О. Ф. Проходные рыбы острова Сахалин (систематика, экология, промысел) // Москва. Издательство ВНИРО. 2002. 248 с.

14. Животовский Л.А. Микросагеллитная изменчивость в популяциях человека и методы её изучения // Ипформацион. Вести. ВОГиС. 2006. Т. 10. № 1. С. 74-96.

15. Иванов В. И., Киселев Л.Л. Геномика-медицине // ИКЦ «Академкнига», 2005. 392с.

16. Куликова Н. И. Внутривидовая изменчивость кариотипов кеты ОпсогИупскш ке1а // Вопросы ихтиологии. 1971. Т. 11. Вып. 6. С. 11071111.

17. Малышев С.В., Картель Н.А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений //Молекулярная биология. 1997. Т. 31 № 62 С. 197-208.

18. Макоедов А.Н., Ермоленко Л. Н., Бачевская Л.Т., Овчинников К.А. Генетическая изменчивость кеты Опсогкупскт ке1а (\Уа1Ьаит), размножающейся в реках Охотоморского побережья Камчатки // Генетика. 1995.31 (11). С. 1552-1556.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование // М.: Мир. 1984. 480 с.

20. Никитина Т. В., Назаренко С. А. Микросателлитные последовательности ДНК человека: мутационный процесс и эволюция // Генетика. 2004. Т. 40. № 10. С. 1301-1318.

21. Оганисян А. С., Кочиева Е. 3., Рысков А. П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR // Генетика. 1996. 32(3): С. 448-451.

22. Рубцова Г.А., Афанасьев К.И., Малипина Т.В., Шитова М.В., Ракицкая Т.А., Прохоровская В.Д., Животовский JLA. Дифференциация популяций кеты по микросатсллитным и аллозимным маркерам. // Генетика 2008. Т. 44, №7. С. 964-971.

23. Рысков А. П. Мультилокусны ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. №6. С. 997-1011.

24. Салменкова Е. ' А., Омельчепко В. Т., Алтухов Ю.П. Гепогеографическое исследование популяций кеты, Oncorhynchus keta (Walbaum), в Азиатской части видового ареала // Генетика. 1992. Т. 28. № 1. С. 76-92.

25. Хлесткииа Е. К., Салииа Б. А. SNP-маркеры: методы анализа, способы разработки и сравнительная характеристика на примере мягкой пшеницы // Генетика. Т. 42. № 6. С. 725-736.

26. Хрусталева А. М. Комплексный метод дифференциации нерки (Oncorhynchus пегка) азиатских стад // Москва. 2007. ВНИРО. 164с.

27. Шершнев А. П. Биология молоди кеты Oncorhynchus пегка в прибрежных водах юго-восточной части Татарского пролива // Автореф. Дисс. на соиск. уч. ст. биол. наук. 1971. Владивосток. 20 с.

28. М.В. Шитова, К.И. Афанасьев, Г.А. Рубцова, Т.В. Малинина С. В. Сидорова, Л. А. Животовский. Микросателлитная изменчивость заводских популяций кеты (Oncorhynchus keta Walbaum) о. Сахалин // Вопросы рыболовства. 2009. Т. 10. №1-37. С. 102-115.

29. Шубина Е. А., Пономарева Б. В., Глубоков А. И. Популяционно-генетический анализ^ минтая Theragra chalcogramma{Teleostei, Gadidae) из Беренгового и Охотского морей // Молекулярная Биология. 2009. Т 43. № 5. С. 918-930.

30. Allenorf F. W., Leary R. F. Conservation and distribution of genetic variation in a polytypic spccies, the cutthroat trout // Conserv. Biol. 1988. Vol. 2. P. 170-184,

31. Arden W. R., Borer S., Thrower F., Joyce J. E. and Kapuscinski A. R. Inheritance of 12 microsatellite loci in Oncorhynchus mykiss // J Hered. 1999. 90: 529-536.

32. Avise J. Molecular markers, natural history and evolution // Champan & Hal 1.2003.TTP Internatiorial Thomson Pub". CompT USAT РГ 5 IT:----

33. Banks M. A., Blouin M. S., Baldwin B. A., Rashbrook V. K., Fitzgerald H. A., Blankenship S. M., Hedgecock D. Isolation' and inheritance of novel microsatellites in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawylscha) IIJ Hered . 1999.90:281-288.

34. Bagley M. J., Anderson S.L., May B. Choice of methodology for assessing genetic impacts of environmental stressors: polymorphism and reproducibility of RAPD and AFLP fingerprints // Ecotoxicology. V. 10. P. 239244.

35. Beacham T. D., Gould A. P., Withler R. E., et. al. Biochemical genetic survey and stock identification of chum salmon (Oncorhynchus keta) in British Columbia // Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1987. 44(№10). P. 1702-1713.

36. Beacham T. D., Le K. D., Candy J. R. Population structure and stock identification of chum salmon (Oncorhynchus keta) based upun microsatellite analysis // NPAFC Tech. Rep. 2004. № 5. p. 1-3.

37. Beamount A. R., Hoare K. Biotechnology and genetics in fisheries and aquaculture // Blackwell Science. 2003. UK. P. 158.

38. Bensch S., Akesson M. Ten years of AFLP in ccology and avolution: why so few animals? // Molecular Ecology. V. 14. P. 2899-2914.

39. Bermingham E., Forbes S. H., Friendland K., Pla C. Discrimination between Atlantic salmon (Salmo salar) of North American and European origin using restriction analyses of mitochondrial DNA // Canad. J. Fish. Aquat. Sci. 1991. Vol. 48. P. 884-893.

40. Billington N., Hebcrt P. D. I-I. Mitochondrial DNA diversity of fishes and its implications for introduction // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1991. Vol. 48. suppl. 1. P. 80-94.

41. Bhargava A., Fuentes F. Mutational Dynamics of Microsatellites // Mol Biotechnol. 2010. V. 44, P. 250-266.

42. Bornet B., Branchard M. Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers: Reproducible and Specific Tools for Genome Fingerprinting // Plant Molecular Biology Reporter. 2001. 19: P. 209-215

43. Bowen N. J. and Jordan I.K. Transposablc elements and the evolution ofeukaryotic complexity // Curr Issues Mol. Biol. 2002. 4(3): P. 65-76

44. Bowcoclc, A. M. et al. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites // Nature 1994. 368. P. 455-457.

45. Brookes A. The essence of SNP // Gene. 1999. V. 234. P. 177-186.

46. Brown B., Epifanio J. Nuclear DNA. Population Genetics: Principles and Applications for Fisheries Scientists // Ed. E.M. Hallerman. amer. Fish. Society. Bethesda, Maryland, USA. 2003. P. 101-126.

47. Brykov VI. A., Polyakova N., Skurihina L. A., Kukhlevsky A. D., Geographical and temporal mitochondrial DNA variability in populations of pink salmon. // J. Fish. Biol. 1996. Vol. 48. P. 899-909.

48. Buchholz W. G., Miller S. J., Spearman W. J. Isolation and Characterization of Chum salmon microsatellite loci and use across species amplification//Animal Genetics. 2001. V.32. № 3. P. 162-165.

49. Cooper G, Miller PL, and Holland PWH. Molecular genetic analysis of sperm competition in the damselfly Ischnura elegans (Vander Linden) // Proc R Soc Lond Ser B Biol Sci. 1996. 265: P. 1343-1349.

50. John M. Butler. Forensic DNA typing biology, technology, and genetics of STR markers // Second edition. Copyright © 2005, Elsevier (USA)

51. Callen DF, Thompson AD, Shen Y, Phillips FLA, Richards Rl, Mulley

52. JC, and Sutherland GR, 1993. Incidence and origin of "null" alleles in thei

53. AC)n microsatellite markers // Am J Hum Genet 52: P. 922-927.

54. Carlsson J. Effects of Microsatellite Null Alleles On Assignment

55. Testing // Fleredity. 2008. V.99. № 6. P. 616-623.

56. Cavalli-Sforza L. L. The DNA revolution in population genetics // Trends Genet. 1998. Vol. 14. N 2. P. 60-65.

57. Chang H. W., Tan K. Y. and Chou Y. C. The complete sequence of Oncorhynchus keta mitocondrial genome // Department of Medical Technology,

58. College of Edical Technology.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF 105341) 2006.

59. Cnops G., den Boer B., Gerats A., Van Montagu M. and Van Lijsebettens M. Chromosome landing at the Arabidopsis TORNADO 1 locus using an AFLP-based strategy II Mol Gen Genet. 1996. 253(1-2): P. 4 32.

60. Crow J. F. Exp. // Clin. Immunogenet. 1995. V. 12. № 3. P. 121.

61. Ellegren, H. DNA typing of museum birds // Nature 1991. 354. P.113.

62. Ellegren, H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution //Nature Reviews Genetics. 2004. V. 5. P. 435-445.

63. Falque M., Keurentjes J., Bakx-Schotman J., and van Dijk P. J. Development and characterization of microsatellite markers in the sexual-apomictic complex Taraxacum officinale (dandelion) // Theor Appl Genet. 1998. 97: P. 283-292.

64. Fisher P. J, Richardson T. E, and Gardner R. C. Characteristics of single- and multi-copy microsatellites from Pinus radiate II Theor Appl Genet. 1998.96: P. 969-979.

65. Galandc A. A., Tiwari R., Ammiraju J.S.S., Santra D.K., Lagu M.D., Rao V.S., Gupta V.S., Misra B.K., Nagarajan S., Ranjckar P.K. Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 103: P. 601-606.

66. Garza, J. C., Slatkin M., and Freimer N. B. Microsatellite allele frequencies in humans and chimpanzees, with implications for constraints on allele size // Mol. Biol. Evol. 1995. V. 12: P. 594 603.

67. Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J.L. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats // Theorct. Appl. Genet. 1994. V.89. P.998-1006.

68. Hamada, H. & Kakunaga, T. Potential Z-DNA forming sequences are highly dispersed in the human genome // Nature 1982. V. 298, P. 396-398.

69. Hayashi J. I., Yoshida M. C., Tagashira Y. Absence of extensive recombination between interspecies and interspecies mitochondrial DNA in mammalian cells // Exp. Cell Res. 1985. V. 160. Iss. 2. P. 378-395.

70. Hicks M., Adams D., O'Keefe S., Macdonald E., and Hodgetts R. The development of RAPD and microsatellite markers in lodgcpole pine (Pinus contorta var. latifolia) // Genome 1998. V. 41: P. 797-805.

71. Hilbert P.; Lindpaintner K.; Beckmann J.S.; Serikawa T.; Soubrier F.;t

72. Dubay C.; Cartwright P.; Dcgouyon B.; Julicr C.; Talcahasi S.; Vincent M.; Ganten D.; Georges M.; Lathrop G.M. //Nature (London), 1991. V. 353, P. 521529.

73. Ho Pauline, A. Barton, J. Worthington, W.Thomson, A. J Silman, and I.N Bruce. HLA-Cw6 and HLAr)DRBl*07 together are associated with less severe joint disease in psoriatic arthritis // Ann Rheum Dis. 2007 June; 66(6): P. 807-811.

74. Therapy in Multiple Sclerosis // Am J Hum Genet. 2008 August 8; 83(2): P. 219227.

75. Holt, C.L., Buoncristiani, M., Wallin, J.M., Nguyen, T., Lazaruk, K.D. and Walsh, P.S. TWGDAM validation of the AmpFSTR PGR amplification kits for

76. Forensic DNA casework // Journal of Forensic Sciences, 2002.47, P. 66-96.

77. Hu J., Quiros C.F. Identification of brokkoli and cauli-flower cultivarswith RAPD markers // Plant Cell Rep., 1991. V. 10. P.505-511

78. Huang Q. Y., Xu F. H., Shen H., Deng H. Y., Liu Y. J., Liu Y. Z., J. Li L., Recker R. R., and Deng H. W. Mutation patterns at dinuleotide microsatellite loci in humans // Am. J. Hum. Genet. 2002, 70:625-634

79. Hummel S. Ancient DNA typing: Methods, strategies and applications // Springer-Verlag. New York. 2003. P. 298.

80. Jeffreys, A. J., Wilson, V. & Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA // Nature 1985. 314, P: 67-73.

81. Jiang C. and Sink K.C. RAPD and SCAR markers linked to the sex expression locus M in asparagus // Euphytica 1997. 94: P. 229-333.

82. Li W. H. Ellsworth D. L. Krushkal. J., Chang B. H., Hewett-Emmet D. Rates of nucleotide substitution in primates and rodents and the generationtime effect hypothesis // Mol. Phylogenet. Evol. 1996 V. 5. № 1. P. 182-187.

83. Li Y. C., Korol A. B., Fahima T. ct al. Microsatellites: genomic distribution, putative function and mutayional mechanism: a review // Molrcular Ecology. 2002. V. 11. P. 2453-2465.

84. Kimura M., Crow J. The number of alleles that can be maintained in a finite population // Genetics. 1964. V. 49. P. 725-738.

85. Kruglyak S., Durett R. T., Shug M. D., Aquardo C. F. Equilibrium distribution of microsatellite repeat length resulting from a balance between slippage events and point mutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 10774-10778.

86. Krutovskii K.V., Vollmer S.S., Sorenscn F.C. et. al. RAPD genome map of Douglas-fir // J. Heredity. 1998. V. 89. P. 197-205.

87. Konieczny A. and Ausubel F.M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers // Plant J, 1993. 4(2): P. 403-410.

88. Lai E. Application of SNP technologies in medicine: lessons learned and future challenges // Genome Res. 2001. VI. 1. № 6. P.927-929.

89. Lazaro A. ML, Xiao Y., Regenscheid A., Ng J., Hurley C. K., Posch P.E. Characterization of 104 novel alleles at the HLA-A, -B, and -BKH1 loci from National Marrow Donor Program volunteer donors // Tissue Antigens. 2009. V. 73. P. 364-372.

90. Lewis P.O., Zaykin D. Genetic Data Analysis: Computer program for the analysis of allelic data. 2001, Version 1.0 (dl6c). Free program distributed by the authors over the internet from http://lewis.eeb.uconn.edu/lewishome/software.html

91. Liewlaksaneeyanawin C., Ritland C. E., El-Kassaby Y. A. Inheritance of Null Alleles for Microsatellites in the White Pine Weevil (Pissodes strobe Coleóptera: Curculionidae.) // Heredity. 2002. № 93(1). P. 67-70.

92. Litt, M. & Luty, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 397-401.

93. Lodhi M.A., Daly M.J., Yc G.N. et al. A molecular marker based linkage map of Vitis // Genome. 1995. V.38. p.786-794,

94. Malik H.S. and Henikoff S. Adaptive evolution of Cid, a centromcrcspecific histonc in Drosophila//Genetics. 2001. 157(3): 1293-1298,

95. Metzgar D., Bytof J. and Wills C. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA // Genome Res. V. 10(1): 2000. P. 72-80.

96. Miesfeld, R., Krystal, M. & Arnheim, N. A member of a new repeated sequence family which is conserved throughout eucaryotic evolution is found between the human and-globin genes // Nucleic Acids Res 1981. V. 9. P. 59315947.

97. Mikac K. M., Fitzsimmons N.N., Genetic structure and dispersal patterns of the invasive procid Liposcelis decolor (Pearmen) in Australian grain storage systems // Bull Entomol Res. 2010. Feb 2: P. 1-7.

98. Morgante M., Hanafey M. and Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes // Nature Genetics 2002. 30(2): P. 194-200.

99. Moxon R. and Wills C. DNA Microsatellites: Agents of Evolution? // Scientific American January 1999 V. 280: P. 94-99.

100. Mullis K., Erlich H., Faloona F., Horn G., Saiki R., Scharf S., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction // Cold Spring Harbor symp. Quant. Biol. 1986. V. 51. P. 263-273

101. Pcreira S. Mitochondrial genome organization and vertebrate phylogenenetics // Genet Mol Biol 2000. P. 745-752.

102. Phillips RB, DeKonirig J, Morasch MR, Park LK, Devlin RH. Identification of the sex chromosome pair in chum salmon (Oncorhynchus keta) and pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha) // Cytogenet Genome Res. 2007. V. 118(4): P. 298-304. " 1 . . . V'V ; - '

103. Rakoczy-Trojanowska M. and Bolibok II. Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants // Cell. Mol. Biol 2004. Lett V. 9(2): P. 221-238.

104. Schlotterer, C., Amos, B. & Tautz, D. Conservation of polymorphic simple sequence loci in cetacean species. Nature 1991, 354, 63-65.'

105. Schlottcr C. Microsatellites. Molecular Genetic analysis of Populations// Ed. Hoelzel a. R. Oxford Univ. Press., 1998. P. 237 260.

106. Schlotter C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA *// Chromosoma. 2000. V. 109. P. 365-371.

107. Schlotter C. Opinion: The evolution of molecular markers -just a matter of fashion // Nature Rev. Genet. 2004. Vol. 5. P. 63-69.

108. Schumm, J.W., Lins, A.M., Miclca, K.A., Sprecher, C.J., Rabbach, D.R. and Bacher, J.WProceeding of the Seventh International Symposium on Human Identification // Madison. Wisconsin. 1996. Promega Corporation P. 7088.

109. Seeb L.W., Crane P.A. Allozymes and mitochondrial DNA Discriminate Asian and Noeth American populations of chum salmon in mixed-stock fisheries along the south coast of the Alaska peninsula // Trans. Am. Fish. Soci. 1999. V. 128. P. 88-103.

110. Senn H, Pembcrton J. Variable extent of hybridization between invasive sika (Cej*vus nippon) and native red deer (C. elaphus) in a small geographical area 11 Molecular Ecology. 2009. № 18. P. 862-876.

111. Sharma S. and Raina S.N. Organization and evolution of highly repeated satellite DNA. sequences in plant chromosomes // Cytogenet Genome Res. 2005. V. 109: P. 15 26.

112. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975. 98(3): P. 503-517.

113. Spritz, R. A. Duplication/deletion polymorphism 5'- to the human a-globin gene. Nucleic Acids Res 1981. V. 9. P. 5037-5047.

114. Tautz, D. tlypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 6463-6471.

115. Tiercy J., Sivakumar R. Rathinam, Marianne Gex-Fabry, and Edoardo Baglivo. A shared IILA-DRB1 epitope in the DR beta first domain is associated with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome in Indian patients Mol Vis. 2010; 16: P. 353 358.

116. Tishkoff S. A., Dietzsch E., Speed W. et al. Global patterns of linkage disequilibrium at the CD4 locus and modem human origins // Science. 1996. Vol. 271. P. 1380-1387.

117. Treuren R. Estimating null allele frequencies at a microsatellite locus in the oystercatcher (Haematopus ostralegus) // Molecular Ecology . 1998. №7. P. 1413-1417.

118. Van de Goor L. H. P., Koskinen M. T., van Haeringen W. A. Population studies of 16 bovine STR loci for forcntsic purposes // SpringerVerlag 2009. Int J. Legal Med.

119. Vergnaud G. and Denoeud F. Minisatellites: Mutability and Genome Architecture // Genome Research 2000. V. 10: P. 899-907.

120. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Rejans M., van de Lee T., Homes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., and Zabeau M. AJFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucl. Acids Res. 1995. 23: P. 4407-4414.

121. Weber, J. L. & May, P. E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 388-396.

122. Weber, J. L. & Wong, C. Mutation of human short tandem repeats // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 1123 1128.

123. Weising K., Nybom H., Wolff K., Kahl G. DNA fingerprinting in plants: principles, methods, and application // 2nd. Taylor and Francis Group. Boca Raton. 2005. USA. P.444.

124. Weissenbach, J. A second-generation linkage map of the human genome. Nature. 1992. V. 359 P. 794-801.

125. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A. and Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research. 1990. 18(22): P. 6531-6535.

126. Wilson A. C., Cann R. L., Carr S. M. ct. al. Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics // Biological J. of the Linnean Society. 1985. V. 26. P. 375-400.

127. Xu X., M. Peng, Z. Fang, and X. Xu. The direction of microsatellitc mutations is dependent upon allele length //Nat. Genet. 2000. 24:396-399.

128. Yinglei L. and Fengzhu S. The Relationship Between Microsatellite Slippage Mutation Rate and the Number of Repeat Units // Mol. Biol. Evol. 2003. 20(12):2123—2131.

129. Yonsei Sung Yoon Choo. The IILA System: Genetics, Immunology, Clinical Testing, and Clinical Implications // Med J. 2007 February 28; 48(1): 11-23.

130. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchorcd polymerase chain reaction amplification //Genomics. 1994. 20: 176-183.

131. Zhan A., IIu J., I-Iu X. et al. Construction of microsatellite-based linkage maps and identification of size-related quantitative trait loci for Zhikong scallop {Chlamys farreri) II Animal Genetics. 2009. № 40. P. 821-831.

132. Zhivotovsky, L.A., M.W. Feldman, and S A. Grishechkin. Biased mutations and microsatellite variation // Mol. Biol. Evol. 1997.14: 926-933.