Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование метода телевизионного микромеирического анализа для повышения эффективности методов серодиагностики и иммуноиндикации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование метода телевизионного микромеирического анализа для повышения эффективности методов серодиагностики и иммуноиндикации"

РГб од

2 5 НОЯ 19915

На правах рукописи

ХОТЮЩЕНКО Татьяна Ивановна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ТЕЛЕВИЗИОННОГО

МИКРОМЕТРИЧЕСКОГО / МЛИЗА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ СЕРОДИАГНОСТИКИ И ИММУНОИНДИКАЦИИ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 1996

Работа выполнена на кафедре микробиологии Саратовского государственного медицинского университета.

Научный руководитель - академик Российской академии естественных наук, доктор медицинских наук, профессор Г. М. Шуб

Научный консультант - кандидат биологических

наук, доцент Д. В. Тупикин

Официальные оппоненты- заслуженный деятель

науки, доктор медицинских наук, профессор Л. В. Самойлова

- кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник О. В. Турковская

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится « » 1996 г.

в/^часов на заседании диссертационного совета К 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИГ1ЧИ «Микроб».

Автореферат разослан « М..У> 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор Г. А. Корнеев

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛВИ. Борьба с инфекционными заболеваниями, повышение качества эпиднадзора требуют совершенствования методов микробиологической диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей в объектах окружающей среды. Классические методы бактериологической диагностики, основанные на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации, не могут сегодня удовлетворить запросам практического здравоохранения.

В этой связи разработаны и внедряются в практику новые поколения методик, не связанных с выделением чистой культуры. Это физико-химические, генетические и иммунологические методы анализа. Именно последние являются в настоящее время наиболее распространенными. Высокая специфичность, достаточная простота реализации делают методики, основанные на реакции взаимодействия антиген-антитело (АГ-АТ), конкурентноспособными, а возможность получения результатов в течение короткого промежутка времени создает юл неоспоримые преимущества /Бойд У., 1969; Петров Р.В., 1982; Томпсон P.A., 1983; Фримель X., Брон Й., 1986/.

Отличаясь простотой постановки, доступностью компонентов, экспрессностыо, экономичностью, что не мало важно в современных условиях, эти реакции занимают достойное место в арсенале методов микробиологической диагностики. Основным недостатком методик, основанных на реакциях иммунитета осадочного типа (РА, РПГА, РТПГА, латекс-, коагглютинации и др.), является субъективный характер учета результатов. Предложенный еще в конце прошлого века принцип "4-х плюсов" не может сегодня удовлетворить ни исследователей, ни практических работников, использующих агглютинационные тесты. Приводимая далее выписка из наставления по применению эритроци-тарных диагностикумов:"... титром антител испытуемой сыворотки считается последнее разведение сыворотки, которое еще дает четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее, чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ и на 3+"- наглядно иллюстрирует сказанное.

В то же время достижения современной оптики и электроники позволили создать устройства, регистрирующие результаты реакции агглютинации (РА) на основе изменения размеров ее компонентов. Одним из таких приборов является телевизионная микрометрическая система для серологической диагностики инфекционных заболеваний и иммуноиндикации их возбудителей, разработанная на одном из предп-

риятий города Саратова в содружестве с кафедрой микробиологии Саратовского медицинского университета.

Показана принципиальная возможность использования этой системы для регистрации различных вариантов РА (бактериальной РА, РИГА и др.) /Иванов Н.Р., Тупикин Д.В., Шуб Г.М., 1988; Тупикин Д.В., Шуб Г.М., 1988/.

Существуют и зарубежные технические аналоги этой системы, основанные на принципе анализа видеоизображения: SYSTEM 3 фирмы ANALYTICAL MEASURING SYSTEMS LTD (Великобритания), "Видас" фирмы KONTRON ELEKTRONIK (Германия), ОРТОМАХ 5 и VIDS 3 фирмы AI ТЕКТ-R0N (Германия), LEITZ MIAMED MF фирмы WILD LEITZ (Германия), которые однако для регистрации результатов РА не использовались.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Разработка и апробация в условиях практической работы конкретных методик оценки состояния иммунной прослойки населения, серодиагностики инфекционных заболеваний и иммуноиндика-ции их возбудителей, основанных на принципе телевизионного микрометрического анализа (ТМА) результатов РА.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Применить метод ТМА для оперативного текущего контроля качества эритроцитарных диагностикумов.

2. Применить метод ТМА для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотках крови различных возрастных групп населения города Саратова.

3. Применить метод ТМА для серодиагностики сальмонеллеза и бруцеллеза.

4.. Применить метод ТМА для индикации патогенных энтеробакте-рий в молоке.

В работе получены следующие основные результаты:

- метод ТМА позволяет проводить оперативный текущий контроль качества эритроцитарного дифтерийного антигенного диагностикума;

- метод ТМА с успехом использован для объективной оценки РПГА по выявлению дифтерийного антитоксина в сыворотках крови;

- метод ТМА сокращает сроки получения результатов и позволяет существенно увеличить объем проводимых исследований, что особенно важно в условиях массовых эпидемических обследований;

- метод ТМА позволяет объективно оценивать состояние иммунной прослойки и отбирать контингента, подлежащие ревакцинации;

- метод ТМА обладает большей чувствительностью, титры выявляемо-

го антитоксина в 2-8 раз превышают таковые в сравнении с визуальным методом учета результатов РИГА;

- показано, что особую группу риска по дифтерии составляют иностранные студенты, прибывшие для обучения в г.Саратов.

- метод ТМА эффективно использован для серодиагностики сальмо-неллеза и бруцеллеза. Показаны его экономичность, простота, высокая чувствительность и специфичность.

- разработан, комиссионно испытан и апробирован метод индикации патогенных энтеробактерий в молоке, который по своей чувствительности (5*103 м.т./мл), специфичности и экономичности не уступает другим методам иммуноиндикации и позволяет обнаруживать не Аг, а клетки возбудителей.

Таким образом, разработаны и использованы в практическичес-кой работе оптимальные режимы применения метода ТМА для решения широкого круга диагностических задач. Показаны преимущества учета результатов агглютинационных тестов методом ТМА перед традиционными визуальными методами.

НАУЧНАЯ НОВШНА.

Впервые показана возможность использования метода ТМА для контроля качества эритроцитарных диагностикумов и отбраковки некондиционных серий препаратов.

Впервые метод ТМА использован для оценки напряженности противодифтерийного иммунитета.

Метод ТМА впервые применен при серодиагностике саяьмонеллеза и бруцеллеза. Показаны его преимущества перед традиционными методами.

Впервые разработана и апробирована методика, основанная на использовании метода ТМА для индикации патогенных энтеробактерий в молоке.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

1. Метод ТМА использован для оперативного текущего контроля качества эритроцитарного дифтерийного антигенного диагностикума.

2. Метод ТМА использован в практической работе Саратовского городского центра санэпиднадзора для оценки напряженности противодифтерийного иммунитета различных возрастных групп населения города Саратова.

3. Метода ТМА использован в практической работе по серодиагностике бруцеллеза и сальмонеллеза у больных, находившихся на ле-

чении в стационаре клиники инфекционных болезней второй городской клинической больницы имени В.И.Разумовского.

4. Метод ТМА использован в практической работе в баклабора-тории Саратовского городского центра санэпиднадзора для индикации патогенных энтеробактерий в молоке.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы обсуждались на научно-практической конференции "Современные проблемы медицинской науки" /Саратов, 1994 г./, научной конференции молодых ученых и студентов Саратовского медицинского университета /Саратов, 1995 г./, на 56-й научно-технической конференции "Диагностика, информатика и метрология - 95" /Санкт-Петербург, 1995 г., 4-6 июль/, на Международном симпозиуме "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" /Санкт-Петербург, 1995 г., 6-10 июнь/.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка используемой литературы, включающего /^отечественных и (^зарубежных авторов. Она изложена на i73 страницах машинописи, содержит 29 таблиц и 21 рисунок.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Практическое применение метода ТМА для контроля качества эритроцитарных диагностикумов и определения напряженности противодифтерийного иммунитета.

2. Практическое применение метода ТМА для серодиагностики бруцеллеза и сальмонеллеза.

3. Практическое применение метода ТМА для индикации патогенных энтеробактерий в молоке.

1.МАТЕРИАЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах по отработке методики обнаружения патогенных энтеробактерий в молоке использовались стандартные штаммы Salm.typhlmurium, Escherichia coll 0124, Escherichia coli 0111, Shigella Sonnei, полученные из музея живых культур кафедры микробиологии Саратовского государственного медицинского университета. Штаммы по своим морфологическим, биохимическим, кудьтаральным свойствам и антигенной структуре были типичны.

Для створаживания молока использовался сычужный фермент.

В работе использованы питательные среды: МПБ, МПА, бульон Хоттингера, желчный, селенитовый бульоны, агар Хоттингера, агар Дифко, кровяной агар с 5% дефибринированной кровью, среда Эндо, Плоскирева, Левина.

При оценке напряженности противодифтерийного иммунитета была использована 431 сыворотка крови жителей г.Саратова различных возрастов й социальных групп.

В исследованиях по серодиагностике сальмонеллеза и бруцеллеза использованы 245 сывороток больных , которые находились на лечении в стационаре клиники инфекционных болезней второй городской клинической больницы имени В.И.Разумовского, а также 49 сывороток крови доноров.

В исследованиях по разработке методики экспресс-индикации возбудителей ОКИ в молоке было использовано молоко бутылочное натуральное.

В ходе исследований использовались стандартные бактериальные сыворотки производства Ташкентского НИИ вакцин и сывороток, а гагаке предприятий по производству бактериальных, препаратов Ленинградского НИИ и Московского КШВС им. И.И. Мечникова, Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Тбилисского НИИ вакцин и сывороток.

В качестве основной аппаратуры для реализации телемикромет-эического способа регистрации реакции, агглютинации нами использо-зан полуавтоматический телевизионный микрометр, серийно выпускаемый отечественной промышленностью и применяемый для технологического контроля в электронной промышленности и система анализа мик-эоизображений "VIDAS" (производство Германия).

Для автоматизированной обработки результатов регистрации реакций агглютинации телевизионным микрометрическим методом был ис-юльзован пакет прикладных программ с применением ЭВМ /Тупикин I.B., 1989/. Программа обеспечивает автоматизированный анализ эводимых первичных данных телевизионного контроля-микроструктур гсследуемых проб при оценке агглютинации и выдает окончательный юзультат реакции по выявленным аналитическим признакам. Програм-ja работает в диалоговом автономном режиме, проста в эксплуатации ï не требует специальной подготовки пользователя.

Все математические операции осуществлялись на компьютере IBM >С-АТ с использованием электронных таблиц QUATTRO-PRO и статисти-

ческих*интегральных систем Б1а1егаГ и графического редактора Гох^гарЬ.

II. СОДЕРШШЕ РАБОТЫ

Среди методик, используемых для серодиагностики инфекционных заболеваний и иммуноиндикации их возбудителей^ заслуженное место занимают и широко используются тесты, основанные на феномене агглютинации (бактериальная РА, РПГА, РТПГА, реакции латекс-, коагг-лютинации и др.). Простота их постановки, окспрессность, достаточно высокая чувствительность, экономичность делают их вполне конкурентноспособными с такими методами как иммунофлюоресценция, радиоиммунологшеский анализ, иммуноферментный анализ и др. Главным недостатком стандартных методик, основанных на реакции агглютинации, является субъективный, качественный характер учета их результатов (по четырехплюсовой системе). Этот недостаток легко преодолевается за счет применения современных технических устройств, использующих принцип лазерной нефелометрии, проточной ци-то-фотометрии, турбидиметрии. Однако падобные приборы позволяют оценить результаты РА лишь по косвенным физическим параметрам (интенсивность светорассеяния, светопоглощения и др.) без ее визуального контроля.

Этих недостатков лишен метод телевизионного микрометрического анализа (ТМА). Он позволяет не только увидеть исследуемый объект, но и объективно оценить его реальные размеры и соотнести их с размерами исходных компонентов реакции.

Мы впервые использовали метод ТМА в практической работе по решению некоторых вопросов микробиологической диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей. Наши исследования проводились в баклаборатории Саратовского городского центра санэпиднадзора и в инфекционном отделении второй городской клинической больницы имени В.И.Разумовского.

В условиях эпидемического неблагополучия по дифтерии для оценки напряженности противодифтерийного иммунитета жителей города Саратова различных возрастов и социальных групп мы использовали специально разработанную нами методику, основанную на методе ТМА для оценки результатов РПГА по выявлению дифтерийного антитоксина в сыворотках нрови.

Метод РИГА рекомендован для этих исследований приказом Гос-комсанэпиднадзора и Минздравом России N 266/86 от 07.10.92 года.

Практическое использование стандартного метода РПГА существенно затруднено в связи с нестабильностью эритроцитарного дифтерийного антигенного диагностикума (ЭДАД), отдельные коммерческие серии которого дают спонтанную агглютинацию. Это диктует необходимость оперативного контроля качества ЭДАД. С этой целью мы использовали метод ТМА . Всего было проконтролировано 13 серий препаратов, различавшихся по времени до истечения срока годности.

Результаты наших исследований убедительно свидетельствуют о том, что хранение ЭДАД даже в надлежащих температурных условиях (5±3°С) существенно сказывается на их качестве.

Параллельный контроль тех же серий препаратов с визуальным учетом результатов был весьма затруднен. Это особенно касается серий, до конца срока годности которых оставалось 2-3 месяца. Преимущество метода ТМА при контроле эритроцитарного дифтерийного антигенного диагностикума проявлялось не только в объективизации учета результатов, но и в' оперативном, уже через 35-45 минут, получении сведений о качестве препаратов. Это позволяло в самом начале рабочего дня отбраковывать непригодные для работы диагности-кумы.

Таким образом, метод ТМА может быть использован в работе практических учреждений, центров санэпиднадзора и других диагностических лабораториях для оперативного постоянного контроля качества эритроцитарных дифтерийных антигенных диагностикумов, а равно и других эритроцитарных диагностических препаратов. Это заключение базируется на нашем опыте работы с достаточно широкой номенклатурой эритроцитарных диагностикумов.

При использовании метода ТМА для оценки результатов РПГА с эритроцитарным дифтерийным антигенным диагностикумом для оценки напряженности противодифтерийного иммунитета нами была исследована 431 сыворотка крови жителей города Саратова различных возрастов и социальных групп. Эти же сыворотки исследовались и стандартным методом в РПГА с визуальным учетом результатов. Противодифтерийные АТ при учете результатов РПГА традиционным методом и методом ТМА не были обнаружены в сыворотках 21,20% обследованных. Таким образом, на первый взгляд, каких-либо преимуществ учет результатов методом ТМА по сравнению с традиционным не давал.

Однако, если принять во внимание что результаты исследования методом ТМА учитывались через 35-45 минут, а визуальный учет результатов РПГА с эритроцитарными дифтерийными антигенными диаг-ностикумами согласно инструкции проводился через 18-22 часа, то становится очевидным существенное преимущество разработанной нами методики.. Эти преимущества особенно очевидны в условиях массовых обследований, так как позволяют в короткие сроки получать значительный об^ем важной эпидемиологической информации.

Кроме того, при использовании метода ТМА более чем в половине исследованных сыворотках (54%) дифтерийный антитоксин обнаруживался в высоких титрах, высокие же и средние титры антител выявлены в 93% сыворотках. При использовании же визуального учета результатов РПГА в 20% сывороток определялись низкие титры антитоксина, при этом в 13% они были ниже защитного. Сывороток с высоким содержанием AT было всего лишь 27%.

Таким образом, из 431 обследованного при использовании метода ТМА восприимчивыми к дифтерии оказались 102 человека, а при визуальной оценке результатов РПГА - 136 человек. Это следует учитывать при проведении вакцинации и ревакцинации.

Среди обследованных нами лиц в возрасте 16-25 лет было 40 человек жителей зарубежных стран, прибывших на учебу в город Саратов. Полученные в этой группе "иностранные студенты" результаты существенно отличаются от таковых в аналогичной возрастной группе постоянных жителей г.Саратова. Так, если среди последних к незащищенным от дифтерии при использовании метода ТМА можно было отнести 11%, а при визуальном методе учета результатов РПГА - 27% обследованных, то в группе "иностранные студенты" таких было соответственно 48 и 58%.

Ни в одной из обследованных нами возрастных групп при использовании стандартных подходов иммунная прослойка не достигает необходимого уровня (90-95%). При использовании метода ТМА лишь в одной возрастной группе ( 9-15 лет ) количество незащищенных укладывалось в рекомендуемый стандарт (5% ) а в одной возрастной группе (16-25 лет) - приближалось к нему (11%).

Результаты наших исследований наглядно свидетельствуют о необходимости ревакцинаций не только среди'детей и подростков, но также и в старших возрастных группах. В то же время использование метода ТМА позволяет существенно сократить контингент лиц старших

возрастных групп, подлежащих ревакцинации.

Из 431 обследованного дифтерийный антитоксин был обнаружен в сыворотках 347 человек. При этом титры антитоксина при использовании ТМА и стандартного метода учета результатов совпали лишь в 48 случаях. Из 299 сывороток, в которых титры АТ не совпали в 287 (96%), они были выше при использовании метода ТМА и лишь в 12 случаях (4%) - при использовании стандартного метода визуального учета результатов. Это свидетельствует о несомненном преимуществе метода ТМА для учета результатов РИГА по определению уровня дифтерийного антитоксина в крови.

17 сывороток, отрицательных по ТМА дали положительный результат при визуальном учете, однако титры антитоксина в них были ниже защитного. Все же 12 сывороток отрицательных по визуальному учету и положительных по методу ТМА содержали антитоксин в титрах выше защитного.

Средний геометрический титр дифтерийного антитоксина при учете методом ТМА был равен 963,855, а при использовании стандартного визуального - 314,29.

Заслуживает существенного внимания и то, что при учете результатов РИГА с ЭДАД методом ТМА незащищенными от дифтерии оказались лишь 24% обследованных,тогда как при стандартном визуальном методе учета их количество было - 32%.

Можно полагать, что закономерности, выявленные нами при использовании метода ТМА при работе с эритроцитарным дифтерийным антигенным диагностикумом, могут быть с большой долей вероятности перенесены и на другие препараты, используемые для постановки РПГА. Это существенно расширяет диапозон использования метода ТМА для решения широкого круга диагностических и эпидемиологических задач.

Практическому использованию метода ТМА для серодиагностики сальмонеллеза и бруцеллеза предшествовали экспериментальные исследования, проведенные на модельных системах: сальмонеллезный диагностикам 0(9) + неадсорбированная сыворотка' к сальмонеллам группы Б (титр 1:1600) и диагностикум бруцеллезный + диагностическая бруцеллезная сыворотка (титр 1:3000).

Эти исследования показали, что метод ТМА позволяет уверенно обнаруживать АТ в разведениях сывороток, в 3-4 раза превышающих их титр. В контрольных исследованиях с использованием визуальных

методов- учета результатов сыворотки агглютинировали гомологичные диагностикуыы в разведениях, равных титру. Даже при двухкратном его превышении мы ни разу не получили положительных результатов. Время исследования сокращалось с 16-24 часов до 30-40 минут, что характеризует метод ТМА как экспрессный.

Ни в одном из вариантов с использованием гетерологичных систем АГ-АТ положительных реакций зарегистрировано не было.

Полученные результаты послужили основанием для применения метода ТМА для исследования сывороток больных с диагнозами "пищевая токсикоинфекция", хронический бруцеллез, "подозрение на бруцеллез" с целью серологической диагностики сальмонеллеза и бруцеллеза.

Всего исследовано 245 сывороток больных, в том числе 102 - с диагнозом пищевая токсикоинфекция (сальмонеллез), 120 - хронический бруцеллез, 23 - с подозрением на бруцеллез, а также 49 сывороток доноров.

У всех обследованных нами больных диагноз "сальмонеллез" был подтвержден выделением сальмонелл группы D (S. enteritidis, S. dublin), что обусловило использование для серодиагностики диаг-ностикума 0(9). Диагноз-бруцеллеза обосновывался клинически и серологически.

При использовании метода ТМА из 102 сывороток больных саль-монедлезом 89 (87Z) дали положительный результат. При этом у 82% больных титры АТ были 1:100 и выше. В FUTA (визуальный учет) положительные результаты были получены лишь с 41 (40%) сывороткой. При этом Ат • выявлялись преимущественно (61%) в низких титрах и лишь у 39% обследованных - в средних.

Все 13 сывороток, в которых методом ТМА РА была оценена как отрицательная, дали такой же результат и при исследовании традиционным способом.

В то же время из 61 сыворотки, в которых при визуальном учете РИГА АТ обнаружены не были, 44 дали положительный результат при использовании метода ТМА.

При исследовании 49 донорских сывороток АТ были обнаружены в 21. Однако, в 20 - титр их не превышал 1:50 и лишь в одной составил 1:100.

При исследовании 120 сывороток больных хроническим бруцеллезом АТ методом ТМА были обнаружены в 78. При использовании тради-

ционных методов визуального учета (реакций Райта, Хеддльсона и РПГА) AT обнаружены лишь в 36.

Все 42 сыворотки, в которых методом ТМА реакция агглютинации с бактериальными бруцеллезными диагностикумами была оценена как отрицательная, дали такой же результат и при использовании традиционных методов серодиагностики бруцеллеза. В то же время из 90 сывороток, в которых этими методами AT не были обнаружены, 53 дали положительный результат при использовании метода ТМА.

При исследовании 23 сывороток больных с "подозрением на бруцеллез" противобруцеллезные AT методом ТМА выявлены в 16, при этом в 14 - в высоких и средних титрах. Традиционные методы дали положительный результат лишь с 8-ю сыворотками. При исследовании 49 донорских сывороток противобруцеллезные AT в титрах• 1:25 -1:50 были выявлены лишь в 2.

Все это позволяет рекомендовать метод ТМА для внедрения в работу лечебных учреждений для серодиагностики сальмонеллеза и бруцеллеза, а также других инфекционных заболеваний..

Разработка и практическое использование ускоренных высокочувствительных и экономичных методов обнаружения возбудителей острых кишечных инфекций в пищевых продуктах и, в частности, в молоке является весьма актуальной задачей. Для ее решения мы использовали метод ТМА. Этот раздел работы проводился по заказу областного отдела здравоохранения.

Предварительно в экспериментальных исследованиях с использованием S. typhimurium, Е. coli 0-124, Е. coli 0-111, S. flexneri была показана принципиальная возможность обнаружения указанных бактерий в молоке с использованием стандартных агглютинирующих сывороток и метода ТМА для учета результатов РЛ. Разработанная методика может быть представлена следующим образом: к исследуемой пробе молока добавляется 1%-ый сычужный фермент из расчета 1:5, и она инкубируется в термостате при 37°С в течение 20-60 минут до разделения на жидкую и твердую фракции. Последняя отделяется центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут и отбрасывается, а жидкая фракция, содержащая бактерии, подвергается дальнейшему исследованию.

Постановка реакции агглютинации осуществлялась в одноразовых микропланшетах для иммунологических реакций. С этой целью в первую, опытную, лунку иммунологического планшета вносили 90 мкл

жидкой*фракции молока и 10 мкл цельной агглютинирующей сыворотки. Во 2-ую, контрольную, лунку вместо агглютинирующей сыворотки вносят 10 мкл изотонического раствора ИаС1. Пробы в планшете встряхивают, помешают в термостат при 37°С и инкубируют в течении 1 часа. По истечении указанного времени содержимое контрольной и опытной пробы отбирают и регистрируют результаты РА методом ТМА. Продолжительность методики составляет 1,5-2 часа.

Реакция микроагглютинации регистрировалась с помощью телевизионного микрометра и оценивалась . в соответствии с размерным (учитывались микроагрегаты размером > 5мкм) и статистическим критериями. Это позволяло исключить влияние артефактов, спонтанных агрегатов, капель жира на результаты учета РА. Чувствительность метода позволяет надежно выявлять сальмонеллы и шигеллы в молоке при их концентрации не менее 5*105 м.т./мл. Это достаточно высокая чувствительность не уступающая таковой при использовании других методов иммуноиндикации.

С целью повышения чувствительности методики мы применили подращивание жидкой фракции испытуемых проб молока в 10%-ом желчном бульоне. Это позволило повысить ее ,на два порядка и довести до величиины 103 м.т./мл. Продолжительность исследований при этом возрастает до 6-8 часов.

При проведении комиссионных испытаний методики все инфицированные пробы были идентифицированы в течении 6-8 часов.

Практическая апробация новой методики индикации патогенных энтеробактерий в молоке проводилась в баклаборатории Городского центра СЭН. Поступавшие в порядке планового исследования порции молока делились на две равные части и исследовались методом ТМА и по ГОСТу 9225-84. Всего за 1993 год исследовано 117 проб. Ни в одной из них ни методом ТМА, ни бактериологическим методом патогенных энтеробактерий не обнаружено. Результаты анализа методом ТМА получали через 6-8 часов, тогда как стандартным методом на 2-3 сутки.

Таким образом, нами разработан, комиссионно испытан и апробирован в практической работе ускоренный метод индикации патогенных энтеробактерий в молоке, который по своей чувствительности, специфичности и экономичности не уступает методам, основанным на использовании ИФА, РПГА, РТПГА, РНАт, а по некоторым параметрам превосходит их. Главное его достоинство состоит в обнаружении не

Аг, а клеток возбудителей.

Изложенные результаты позволяют считать, что разработанные методы регистрации результатов РА с помощью анализаторов телевизионного изображения должны занять достойное место в повседневной практической работе диагностических служб. Для этого имеется необходимое материально-техническое обеспечение (указанные приборы выпускаются отечественной промышленностью), а диагностические препараты, используемые для работы (бактериальные или эритроци-тарные диагностикумы, агглютинирующие сыворотки, моноклональные антитела), весьма доступны я относительно дешевы.

Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что метод ТМА может быть использован в практической работе для решения широкого круга диагностических задач, среди них серологическая диагностика инфекционных заболеваний и иммуноиндикация их возбудителей. Широкие возможности открывает использование метода ТМА для контроля за эффективностью вакцинации и оценки напряженности состояния иммунной прослойки населения. Решение этих вопросов приобретает особую актуальность в связи с эпидемическим неблагополучием по ряду инфекций, в частности, дифтерии. Метод ТМА может найти широкое применение на предприятиях для контроля качества эритроцитар-ных, латексных и других диагностикумов, предназначенных для постановки различных вариантов РА. Наконец, на основе метода ТМА могут быть созданы новые методики индикации патогенных бактерий в пищевых продуктах, аналогичных разработанной нами для молока.

ВЫВОДЫ

1. В практической работе показана возможность и высокая эффективность использования метода ТМА для решения широкого круга диагностических задач.

2. Метод ТМА позволяет оперативно оценивать качество эритро-цитарных диагностикумов, и может быть рекомендован для текущего оперативного контроля этих препаратов как в диагностических лабораториях, так и при их производстве.

3. Метод ТМА успешно применен для оценки результатов РПГА по выявлению дифтерийного антитоксина в сыворотках крови жителей города Саратова. Он обладает большой чувствительностью, экспресс-ностью, лишен субъективизма в сравнении с традиционным визуальным методом учета результатов РПГА.

4. Показаны преимущества метода ТМА при серодиагностике

сальмонеллеза.

5. Показаны преимущества метода ТМА при серодиагностике бруцеллеза. В сыворотках больных с диагнозом "хронический бруцеллез" и "подозрение на бруцеллез" АТ выявлялись чаще и в более высоких титрах по сравнению с традиционными методами (реакция Райта, Хедцльсона и РОТА).

6. На основе метода ТМА разработана методика, которая позволяет надежно выявлять сальмонеллы и шигеллы в молоке при их концентрации не менее 5*105 м.т./мл через 1,5-2 часа. Предварительное подращивание (5-6 часов) жидкой фракции инфицированного молока повышает чувствительность методики до 103 м.т./мл. При этом продолжительность исследования составляет 6-8 часов.

7. Для аппаратурного обеспечения метода ТМА могут быть использованы серийно выпускаемые приборы анализа видеоизображения (как отечественного, так и импортного производства).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шуб P.M., Хотющенко Т.И., Тупикин Д.В. Применение метода ТМА для оценки напряженности поствакцинального иммунитета // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Материалы Российской научной конференции.- Саратов.- 1993.-С.294.

2. Хотющенко Т.И., Дорогойкин Д.Л. Применение метода телевизионного микрометрического анализа (ТМА) для регистрации результатов РИГА у детей с ротавирусной инфекцией //Бактериально-вирусные инфекции (патоморфология, патогенез, клиника, лечение): Сборник научных работ Саратовского мед. института.- Саратов, 1993.- Ч. 3.- С. 35-37.

3. Шуб Г.М., Хотющенко Т.И., Дорогойкин Д.Л., Томников А.Ю., Тупикин Д.В. Использование метода ТМА для серодиагностики инфекционных заболеваний и иммуноиндикации антигенов их возбудителей // Современные проблемы медицинской науки: Тез. докл. научно-практической конференции по законченным научным исследованиям.- Изд. Сар. мед. университета, 1994.- Ч. 3,- С. 4-5.

4. Хотющенко Т.И., Шуб Г.М., Тупикин Д.В. Применение телевизионного микрометрического анализа для контроля напряженности

противодифтерийного иммунитета // "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" : Материалы международного симпозиума.- С.-Петербург, 1995.- С. 30.

5. Шуб Г.М., Хотоденко Т.И., Тупикин Д.В., Томников А.Ю., Коломиец В.В. Использование телевизионного микрометрического анализа для экспресс-индикации патогенных энтеробактерий в молоке // "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" : Материалы международного симпозиума.- С.-Петербург, 1995.- С.75.

6. Шуб Г.М., Тупикин Д.В., Томников А.Ю., Хотющенко .Т.И., Дорогойкин Д.Л. Применение телевизионного микрометрического анализа для серодиагностики инфекционных заболеваний и иммуноиндика-ции антигенов их возбудителей //"Диагностика, информатика и мет-рология-95": Тез. докл. научно-технич. конференции.- С.-Петербург, 1995.- С 277.

7. Шуб Г.М., Хотющенко Т.И., Тупикин Д.В., Томников А.Ю., Анфимова С.И., Коломиец В.В. Использование телевизионного микроскопического анализа для экспресс-индикации патогенных энтеробактерий в молоке //Журнал микробиологии, 1995.- N6.-0. 71-73.