Использование экзогенных предшественников в биосинтезе нуклеиновых кислот и ферменты фосфорилирования нуклеозидов в клетках морских бактерий

Немцева, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование экзогенных предшественников в биосинтезе нуклеиновых кислот и ферменты фосфорилирования нуклеозидов в клетках морских бактерий
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование экзогенных предшественников в биосинтезе нуклеиновых кислот и ферменты фосфорилирования нуклеозидов в клетках морских бактерий"

На правах рукописи

НЕМЦЕВА Юлия Александровна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В БИОСИНТЕЗЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ФЕРМЕНТЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ В КЛЕТКАХ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ

03.00.04 - биохимия Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК - 2005

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук Терентьев Л. Л.

доктор биологических наук,

профессор

Михайлов В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Пивненко Т.Н.

кандидат биологических наук Бакунина И.Ю.

Ведущая организация: Институт химической биологии и

фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится «<$ ¥ » 2005 г. в « SO » часов на заседании

диссертационного совета Д 005.Й05.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ. Факс: (4232) 31-40-50. E-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан « с? 2 » bt&tPfyUj? 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.х.н. ^ ^п^- Прокопенко Г.И.

г/51

( Ху ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время морские микроорганизмы, в частности бактерии, привлекают внимание исследователей в связи с особенностями их метаболизма, обусловленными средой обитания. На жизнедеятельность морских бактерий значительное влияние оказывают такие факторы, как колебания температур океанических вод, гидростатическое давление, состав и содержание в воде различных растворенных солей. Это дает основание предполагать наличие уникальных метаболических путей, обеспечивающих рост и размножение морских бактерий, а также возможность обнаружения в их клетках ферментов, отличающихся по своим свойствам от аналогичных ферментов наземных организмов.

Морская вода представляет собой естественную среду, в которой имеются все компоненты, необходимые для жизнедеятельности бактериальных клеток, это растворенные пептиды, аминокислоты, углеводы, различные компоненты нуклеиновых кислот и другие органические и неорганические соединения. Находящиеся в морской воде нуклеиновые кислоты и их компоненты являются для бактерий не только источником азота, углерода и фосфора, но и используются в качестве предшественников синтеза ДНК и РНК. Биосинтез нуклеиновых кислот является одним из основных показателей продуктивности бактериальных (и не только) клеток. Увеличение количества ДНК в экстрактах клеток свидетельствует об их делении (размножении), РНК - определяет рост и метаболическую активность клетки.

Молекулярный механизм утилизации морскими бактериями экзогенных предшественников практически не изучен. Широко применяемый метод определения биосинтеза ДНК с помощью радиоактивно меченного тимидина, а также РНК - с помощью меченного уридина, свидетельствует только о включении этих соединений в макромолекулы клетки, но не дает возможности определить, в какие именно биополимеры включается тот или иной предшественник и ферменты каких метаболических путей в этом задействованы. Экзогенные нуклеозиды транспортируются через клеточные мембраны и фосфорилируются в клетке до нуклеозидтрифосфатов, являющихся непосредственными субстратами для ДНК- и РНК-полимераз. Ключевую роль в этом процессе играют нуклеозидкиназы, катализирующие первую стадию фосфорилирования нуклеозидов до нуклеозидмонофосфатов. Хотя включение меченых нуклеозидов часто используется в качестве показателя продуктивности микробных сообществ, о наличии нуклеозидкиназ в клетках морских бактерий практически нет данных. Нет сведений ни о составе ферментов фосфорилирования нуклеозидов, ни об их свойствах и специфичности.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение процесса утилизации экзогенных предшественников синтеза нуклеиновых кислот клетками морских бактерий.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать способность морских бактерий включать экзогенные тимидин и уридин в состав нуклеиновых кислот.

2. Протестировать активности ферментов фосфорилирования нуклеозидов в экстрактах клеток морских бактерий.

3. Определить спектр нуклеозидкиназ, катализирующих фосфорилирование тимидина и уридина в клетках некоторых штаммов.

4. Разработать схемы выделения тимидин- и уридинкиназы и изучить свойства очищенных нуклеозидкиназ из трех бактериальных штаммов.

"рОСТ"

Положения, выносимые на защиту:

1. Клетки морских бактерий способны включать экзогенные рибо- и

дезоксирибонуклеозиды в состав нуклеиновых кислот. 2 В клетках морских бактерий присутствует активность ферментов фосфорилирования предшественников биосинтеза РНК и ДНК, набор нуклеозидкиназ может варьировать у разных штаммов бактерий. 3. Экзогенные нуклеозиды фосфорилируются клеточными нуклеозид- и нуклеотидкиназами, что может свидетельствовать о важной роли вспомогательного пути биосинтеза предшественников в синтезе нуклеиновых кислот морских бактерий.

Научная новизна и практическая ценность.

Показано, что клетки исследованных морских бактерий способны включать экзогенные тимидин и уридин в молекулы нуклеиновых кислот, при этом метка каждого из этих предшественников может обнаруживаться как в ДНК, так и в РНК.

Впервые установлено присутствие в клетках нуклеозидкиназ, обеспечивающих фосфорилирование экзогенных предшественников. Показана гетерогенность нуклеозидкиназ в разных штаммах морских бактерий.

Впервые обнаружена множественность форм тимидин- и тимидилаткиназ у бактерий рода Pseudoalteromonas и уридинкиназы штаммов Bacillus sp. КММ 3573 и Pseudoalteromonas haloplanktis КММ 223. Показана способность некоторых тимидинкиназ катализировать дальнейшее фосфорилирование образующегося тимидинмонофосфата.

Из клеток Pseudomonas sp. КММ 3694, Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033 и Yersinia pseudotuberculosis выделены и охарактеризованы тимидин- и уридинкиназы; исследованы их физико-химические свойства и субстратная специфичность.

Показано, что морские бактерии могут быть новым перспективным источником ферментов, в частности, нуклеозид- и нуклеотидкиназ. Очищенные ферменты могут быть с успехом использованы в биотехнологии и молекулярной биологии, а также при производстве меченых нуклеозидмоно-, -ди- и -трифосфатов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены автором на 3-м Международном симпозиуме "Химия и химическое образование" (Владивосток, 2003); VII Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2003); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 7 работ (2 статьи и 5 тезисов докладов конференций).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 32 рисунка Список литературы включает 243 публикации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Объектами исследования служили 77 штаммов морских прокариот. Бактерии были собраны в ходе экспедиций на НИС "Академик Опарин" в район Курильских островов и в заливах Японского моря - это микроорганизмы, обитающие в морской воде, фунте, а также бактерии, ассоциированные с бурыми водорослями (Fucus evanescens, Fucus sp.), микроорганизмы, выделенные из беспозвоночных (губка Fascaplysinopsis reticulata (Коралловое море, Австралия) и образец неидентифицированной губки) и хордовых (асцидия Halocynthia aurantium). Образцы губок и асцидий собирали при помощи трала и драги.

Типовые штаммы исследованных бактерий хранятся в Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, являющейся членом WFCC и имеющей официальный акроним КММ и регистрационный номер 644.

1. Определение скорости роста клеток морских микроорганизмов в присутствии

меченых нуклеозидов

Для изучения динамики роста микроорганизмов в присутствии меченых нуклеозидов и включения предшественников были проведены исследования двух штаммов КММ 3689 и КММ 636, принадлежащих к родам Arthrobacter и Pseudoalteromonas (рис. 1 и 2). Оба штамма способны включать меченые тимидин и уридин в нуклеиновые кислоты бактерий. Штамм КММ 3689 более эффективно включал метку из экзогенного уридина, а КММ 636 - из тимидина, причем уровень включения тимидина в нуклеиновые кислоты обоих штаммов был примерно одинаков. После 24 часов инкубации с мечеными предшественниками уровень их включения в состав нуклеиновых кислот снижался.

Эффективность включения меченых тимидина или уридина в нуклеиновые кислоты широко используется для определения скорости роста и продуктивности бактерий в водной среде. Радиоактивная метка во фракции, осаждаемой холодной 5% ТХУ, может принадлежать как ДНК, так и РНК, поэтому нельзя использовать показатели включения тимидина или уридина в кислотонерастворимый материал в качестве меры синтеза соответственно ДНК или РНК без учета специфичности и степени мечения макромолекул. Используя различную чувствительность нуклеиновых кислот к щелочному гидролизу, мы определили степень включения меченых тимидина и уридина в ДНК бактерий. В клетках штамма Arthrobacter sp. КММ 3689 практически весь экзогенный тимидин включался только в ДНК, тогда как у штамма Pseudoalteromonas maricaloris КММ 636 часть метки из тимидина обнаруживалась в РНК. После 30 часов инкубации доля тритиевой метки из тимидина в составе нуклеиновых кислот снижалась по сравнению с 24-часовой инкубацией. Практически весь уридин включался в РНК. Небольшая часть метки из уридина обнаруживалась в составе ДНК клеток Arthrobacter sp. КММ 3689. Бактерии КММ 636 включали уридин только в РНК.

Параллельно с измерением включения экзогенных предшественников в нуклеиновые кислоты определяли скорость роста клеток обоих штаммов. Увеличение количества клеток всех исследованных штаммов наблюдалось до 30 часов в присутствии в среде и тимидина, и уридина. Скорость роста микроорганизмов зависела и от штамма, и от присутствующего в среде нуклеозида. После 30 часов инкубации количество клеток не увеличивалось.

10 15 20 25 30 Время, ч

Рис. 1. Кривая роста и включение меченых предшественников в нуклеиновые кислоты клеток штамма Аг(ИгоЬас1ег ер. КММ 3689 (1 - рост культуры в присутствии тимидина, 2 - рост в присутствии уридина, 3 - общее включение метки из тимидина, 4 - включение метки из тимидина в ДНК, 5 - общее включение метки из уридина, 6 - включение метки из уридина в ДНК).

Время, ч Время, ч

Рис. 2. Кривая роста и включение меченых предшественников в нуклеиновые кислоты клеток штамма Р.чеис1оакегптопа$ таг1са!ог1х КММ 636 (1 - рост культуры в присутствии тимидина, 2 - рост в присутствии уридина, 3 - общее включение метки из тимидина, 4 - включение метки из тимидина в ДНК, 5 - общее включение метки из уридина, 6 - включение метки из уридина в ДНК).

Скорость роста Pseudoalteromonas maricaloris в присутствии уридина была в 2 раза выше скорости роста штамма Arthrobacter, но, несмотря на это, отмечался более низкий уровень включения данного нуклеозида для КММ 636, по сравнению с клетками КММ 3689. В присутствии меченого тимидина рост клеток обоих штаммов находился примерно на одном уровне. Соотношение уровня включения метки из тимидина в нуклеиновые кислоты клеток КММ 3689 и КММ 636 со скоростью роста в присутствии этого же нуклеозида также было одинаковым.

Следующим этапом работы было изучение включения экзогенных предшественников при инкубации клеток с радиоактивной меткой в течение одного часа (на ранней стадии экспоненциальной фазы роста бактерий) in vivo. Для этого из коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН было взято 57 штаммов бактерий, принадлежащих 12 различным родам. Эффективность включения экзогенных нуклеозидов в РНК и ДНК клеток морских бактерий определяли после их выращивания в среде, содержащей меченые тритием тимидин или уридин (табл. 1).

Таблица 1. Включение предшественников в нуклеиновые кислоты морских микроорганизмов in vivo

Когаекционн. номер штамма Таксон Включение тимидина (ед'/мин) Включение уридина (ел.'/мин)

* » **

1 2 4 5 6 7

КММ 3690 Alcaligenessp. 4300 2000 4300 2600

КММ 3726 Alteromonas/Pseudoalteromonas 300 300 700 50

КММ 3684 Arthrobacter яр. 10420 6350 27660 0

КММ 3685 Arthrobacter яр. 10100 8800 36660 5700

КММ 3686 Arthrobacter sp. 5200 5700 41260 6580

КММ 3687 Arthrobacter др. 35800 30200 114600 15300

КММ 3689 Arthrobacter sp. 3700 3700 1060 2500

КММ 3692 Arthrobacter sp. 19560 19020 62400 7520

КММ 3704 Arthrobacter sp. 13650 14600 32600 5000

КММ 3707 Arthrobacter sp 12450 9900 10000 4200

КММ 3708 Arthrobacter sp 12650 11500 10300 4200

КММ 3710 Arthrobacter эр 2700 1900 3250 850

КММ 3711 Arthrobacter sp 2600 2200 3600 1000

КММ 3723 Arthrobacter sp 19000 20000 71000 10450

КММ 3724 Arthrobacter sp 29400 33500 11300 5100

КММ 3572 Bacillus sp 3600 2250 3000 300

КММ 3573 Bacillus sp. 4500 1850 2900 900

КММ 3713 Вас ¡Rus sp 2900 1500 1600 300

КММ 3691 Corynebacteriumsp 59000 55100 115250 16660

КММ 3699 Corynebacterium sp 34570 20000 90640 5000

КММ 3700 Corynebacteriumsp 46650 29100 143000 12100

КММ 3701 Corynebacteriumsp 257000 136300 13000 3650

КММ 3722 Corynebacteriumsp 117000 114300 249600 59800

КММ 3716 FTawbacterium/Cytophaga 720 1600 650 300

КММ3717 Flawbacterium/Cytophaga 950 600 2600 50

Продолжение табл. 1.

КММ 3718 Flawbacterium/Cytophaga 500 900 1550 550

КММ 3719 Fhvabacterumi/Cytophagp 770 450 1000 1000

АТСС271181 Marinomonascommums 1750 1000 2350 150

КММ 3693 Pseudomonas sp 2300 2300 3600 2750

КММ3694 Pseudomonas sp 2960 820 3650 2850

КММ3695 Pseudomonas sp 2750 1500 59400 15660

КММ 3712 Pseudomonas sp 2200 1300 500 600

КММ 3715 Pseudomonas sp 1400 1100 2700 400

КММ 3720 Pseudomonas sp. 1430 700 1800 500

КММ 3721 Pseudomonas sp 1350 650 1650 550

КММ 3725 Pseudomonas sp. 1500 1900 2500 1600

КММ 232 Pseudoalteromonasaganvorans 11800 11800 39600 8000

КММ 3568 Pseudoaltemmonas/'Alteromonas 3800 3400 3800 1400

NCIMB 20331 Pseudoaltewmonas aurantia 45200 42900 118600 11800

КММ213 Pseudoaltemmonas haloplanktis 16000 16900 9000 8200

КММ 223 Pseudoalieromonas habpknktis 5700 6000 20500 3100

КММ 636 Pseudoaltemmonas maricaloris 1700 1150 4000 3000

КММ 253 Pseudoaltemmonas sp. 46000 45000 266000 30000

КММ 500 Pseudoaltemmonas sp 45000 45000 167000 13400

КММ215 Pseudoaltemmonas sp. 22800 16600 63400 7000

КММ 3702 Pseudoaüeromonassp 3000 3300 415000 24200

КММ 3574 Pseudoaltemmonas sp. 1500 1900 2850 1300

КММ 3570 Pseudoaltemmonas sp 1900 2100 3450 1500

КММ 3688 Rhodococcussp 7100 4050 4800 4500

КММ 3696 Xanthobactersp 2750 7900 17900 2500

КММ 3697 Xanthobactersp 6700 5300 43300 4800

КММ 3698 Xanthobactersp 3700 3200 12150 3300

КММ 3703 Xanthobactersp. 9600 9200 33280 9800

КММ 3705 Xanthobactersp 8060 9000 18000 2500

КММ 3706 Xanthobactersp 9250 8950 26500 4200

КММ 3709 Xanthobactersp 6000 7700 9050 4200

КММ 3714 Xanthobactersp. 8500 8100 26100 3800

В таблице приведены средние значения четырех независимых измерений (Р < 0,05). ' - За 1 ед. принимали количество радиоактивности (имп/мин), включившейся в клетки бактерий в 1 мл суспензии.

2 - Американская коллекция типовых культур, США;

3 - Национальная коллекция промышленных и морских бактерий, Великобритания; * - Общее включение [3Н]-тимидина или уридина в нуклеиновые кислоты.

** - Включение метки из нукпеозидов в ДНК.

Как видно из таблицы, все исследованные штаммы микроорганизмов способны включать радиоактивно меченые экзогенные предшественники в состав нуклеиновых кислот клеток.

Экзогенный тимидин с высокой скоростью включался в состав биополимеров клеток штаммов АгЛгоЬаМег ер. КММ 3687, АгМгоЬаМег ер. 3724, СогупеЬас1егшт эрр. КММ 3691, 3699-3701, 3722, РвеийоаНеготопав аигапНа.

Меченый тритием уридин эффективно включался в клетки штаммов Arthrobacter spp. КММ 3684-3687, 3723, Corynebacterium spp. КММ 3691, 3699-3701, Pseudomonas sp. KMM 3695 и Pseudoalteromonas aurantia. Клетки штаммов, у которых наблюдалось эффективное включение тимидина в состав биополимеров, хорошо включали и уридин.

После обработки бактериальных экстрактов 0,5 N КОН в течение 1 часа при 37°С для гидролиза РНК, было обнаружено, что примерно в половине исследованных штаммов родов Arthrobacter, Corynebacterium, Pseudomonas, Flavobacterium/Cytophaga, Xanthobacter и Marinomonas метка из радиоактивно меченого тимидина обнаруживается во фракции ДНК, в клетках остальных штаммов часть тритиевой метки включается и в РНК. Исключительно в состав ДНК включали экзогенный тимидин клетки исследованных микроорганизмов КММ 3686, 3689, 3693, 3696, 3702, 3704, 3705, 3706, 3709, 3714, 3718, 3568, 3570, 3723, 3725, 3726. В клетках микроорганизмов родов Bacillus, Rhodococcus и Alcaligenes по сравнению с остальными исследованными штаммами был достаточно высоким процент включения метки из тимидина в состав РНК.

Наиболее интенсивный синтез ДНК с использованием экзогенного тритиевого тимидина осуществлялся в клетках штаммов КММ 3701 и 3722 рода Corynebacterium, несколько меньший уровень включения метки в ДНК наблюдался в клетках штаммов КММ 3687, 3691, 3699, 3701, 3724 и NCIMB 2033, принадлежащих к родам Arthrobacter, Corynebacterium, Pseudoalteromonas. Включение радиоактивной метки из тимидина в РНК достигает значительного уровня в штаммах КММ 3699-3701 рода Corynebacterium

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что все исследованные в данной работе штаммы, относящиеся к 12 родам, включающие и грамположительные {Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium и Rhodococcus), и грамотрицательные {Alcaligenes, Alteromonas/Pseudoalteromonas, Flavobacterium/Cytophaga, Marinomonas, Pseudoalteromonas/Alteromonas, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Xanthobacter) бактерии, способны использовать экзогенные нуклеозиды для биосинтеза нуклеиновых кислот (табл. 1) Это свидетельствует о наличии в исследованных бактериях активного дополнительного {salvage) пути биосинтеза предшественников, а также транспортной системы, ответственной за перенос пиримидиновых нуклеозидов через клеточную мембрану. Различная эффективность включения меченых нуклеозидов клетками разных штаммов может быть обусловлена различиями уровня активности ферментов, ответственных за метаболизм тимидина и уридина в клетках различных штаммов микроорганизмов.

2. Определение активности нуклеозидкиназ в экстрактах морских микроорганизмов

Одним из необходимых факторов, определяющих включение экзогенных предшественников в нуклеиновые кислоты, является их внутриклеточное фосфорилирование до соответствующих рибо- или дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, являющихся субстратами для РЖ- или ДНК-полимераз. Поскольку ключевыми ферментами цепи фосфорилирования являются нуклеозидкиназы, катализирующие первый этап превращения нуклеозидов в нуклеозидмонофосфаты, в экстрактах из 46 штаммов морских микроорганизмов была определена активность тимидин- и уридинкиназ, а в 20 штаммах морских бактерий тестирована еще и активность ферментов фосфорилирования дезоксицитидина, аденозина и гуанозина. Выбор данных штаммов был обусловлен достаточно высокой скоростью включения радиоактивно

меченых тимидина и уридина в нуклеиновые кислоты микробных клеток, а также их хорошим ростом на используемой питательной среде.

Результаты исследования способности экстрактов ряда штаммов морских бактерий катализировать фосфорилирование in vitro тимидина, уридина, а также дезоксицитидина, аденозина и гуанозина представлены в табл. 2.

Как видно из таблицы, активность тимидинкиназы обнаруживается во всех исследованных экстрактах, при этом максимальный ее уровень наблюдался в экстрактах штаммов КММ 3697, 3699-3702, 3708, 3568, NCIMB 2033 видов родов Arthrobacter, Cory пе bacterium, Xanthobacter, Pseudoalteromonas, Pseudoalteromonas/Alteromonas. Максимальная активность уридинкиназы проявлялась в экстрактах, полученных из штаммов КММ 3691, 3697, 3699, 3701-3703, 3707 видов родов Arthrobacter, Corynebacterium, Xanthobacter. Следует отметить, что уровень активности фермента, катализирующего фосфорилирование уридина, был ниже активности тимидинкиназы в исследованных нами микроорганизмах.

В 17 исследованных штаммах, наряду с тимидин- и уридинкиназными активностями, была обнаружена также активность дезоксицитидинкиназы.

Таблица 2. Активность нуклеозидкиназ в экстрактах морских микроорганизмов

Колл. № штамма Таксон Акцепторы фосфатных групп

dThd Urd dCyd Ado Guo

1 2 3 4 5 6 7

КММ 3684 Arthrobacter sp. 140±7 11±4,7 7,1 ±0,1 0 0

КММ 3685 Arthrobacter sp. 146±8,3 24±2,7 7,7±0,3 0 0

КММ 3686 Arthrobacter sp. 100±2 21 ±0,4 8,3±0,2 0 0

КММ 3687 Arthrobacter sp. 42+0,8 87±3£ 21,7±0,9 0 0

КММ 3692 Arthrobacter sp. 170±21 14±6,7 14,7±0,3 0 23±4,3

КММ 3704 Arthrobacter sp. 198±12 45±12,2 41±6,3 0 17,5±0,8

КММ 3707 Arthrobacter sp. 80±21 110±19 0 75,5±0,7 35±2,9

КММ 3708 Arthrobacter sp. 300±9 65±14 93±4,3 0 30±8,7

КММ 3724 Arthrobacter sp. 95±6 40±17,7 0 105±17 75±18,9

КММ 3691 Corynebacterium sp. 168±28 140±20 7,1 ±0,7 0 0

КММ 3699 Corynebacterium эр. 280±20 110±6,7 15,3±0,2 7,5±0,7 67,5±1,8

КММ 3700 Corynebacteriumsp. 480±29 50±2,9 5±0,7 15,5±0,3 35±0,7

КММ 3701 Ccrynebacterhmsp. 330ttl3.2 llft+4,9 15±1,7 22,5 ±2 55±6,3

КММ 3722 Corynebacterium sp. 93±20,3 53±11 42±6,7 0 50±6,3

КММ 241 Glaciecola mesophila 120±14 27±10 - - -

КММ 227 Idiomarina abyssalis 142±11 56,8±5,3 - - -

КММ 254 Pseudoalteromonas agarivorans 107±18 2,5±0,4 - - -

КММ 255 Pseudoalteromonas agarivorans 37,5±4,7 3,8±1,3 - - -

КММ 3568 Pseudoalteromonas/ Alteromonas 242±24 75±21,7 17±1,7 32,5±1,6 36,5±3,4

NCIMB 2033 Pseudoalteromonas aurantia 310±54 25±7 0 32,5±2 0

Продолжение табл. 2.

1 2 3 4 5 6 7

КММ216 Pseudoaheromonas citrea 50±8,3 6,3±1,6 - - -

КММ 250 Pseudoaheromonas citrea 56,5±6,4 2±0,4 - - -

КММ 256 Pseudoaheromonas citrea 68,5±26 4±0,3 - - -

КММ 504 Pseudoaheromonas citrea 45±20,7 1±0,9 - - -

КММ 638 Pseudoaüeromonas eüstincta 51 ±8,6 25,5±6,7 - - -

КММ 213 Pseudoaüeromonas haloplanktis 225±66 19,5±6,9 - - -

КММ 214 Pseudoaheromonas haloplanktis 140±19 60±8,3 - - -

КММ 223 Pseudoaheromonas hafoptonktis 134±20 3,3±0,7 - - -

КММ 232 Pseudoaheromonas mariniglutinosa 76±17 11,4±0,8 - - -

КММ 215 Pseudoaheromonas sp. 330±66 45±6 - - -

КММ 217 Pseudoaheromonas яр. 30±32,9 49±15 - - -

КММ 218 Pseudoaheromonas sp. 74±17,3 48±7,6 - - -

КММ 239 Pseudoaheromonas sp. 193±23 39±14 - - -

КММ 253 Pseudoaheromonas sp. 350±39 17,5±1,9 - - -

КММ 500 Pseudoaheromonas sp. 310±68 29±12,9 - - -

КММ 3702 Pseudoaüeromonas sp. 260±18 144±17 22±4,9 0 0

КММ 8 Psei4domonas sp. 101±29 0 - - -

КММ 224 Pseudomonas sp. 70±47 0 - - -

КММ 226 Pseudomonas sp. 130±17 0 - - -

КММ 230 Pseudomonas sp. 145±29 89,3±21 - - -

КММ 411 Pseudomonas sp. 360±43 20,5±12 - - -

КММ 649 Pseudomonas sp. 60±23,6 40±6,9 - - -

КММ 225 Psychrobacter submarinus 91 ±20,7 0 - - -

КММ 3697 Xanthobacter sp. 360±52 129±25 3,3±0,07 0 70±2,9

КММ 3703 Xanthobacter sp. 94±10,9 142±22 90±6,9 0 0

КММ 3706 Xanthobacter sp. 170±49 94±6,3 27±0,15 20,5±0,4 10±2,9

В 12 штаммах морских бактерий была зарегистрирована активность гуанозинкиназы, а в 8 штаммах морских микроорганизмов была обнаружена активность аденозинкиназы.

Тестирование в клеточных экстрактах активностей нуклеозидкиназ, катализирующих фосфорилирование того или иного предшественника биосинтеза нуклеиновых кислот, не позволяет судить о том, какой именно фермент участвует в этом процессе. Нуклеозидкиназы могут обладать широкой субстратной специфичностью, фосфорилировать преимущественно пуриновые или пиримидиновые нуклеозиды, или

же использовать в качестве акцептора фосфата лишь конкретный рибо- или дезоксирибонуклеозид.

3. Анализ спектра нуклеозндкиназ морских бактерий с помощью ионообменной

хроматографии

Для определения спектра нуклеозидкииаз, белковые экстракты штаммов морских бактерий, принадлежащих родам Pseudoalteromonas, Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Flavobacterium/Cytophaga и Pseudomonas подвергли ионообменной хроматографии. Выбранные штаммы эффективно включали меченые тимидин и уридин в нуклеиновые кислоты, активность нуклеозидкииаз в экстрактах была достаточно высока. Во фракциях после DEAE-хроматографии определяли активности тимидин-, уридин- и тимидилаткиназ.

Несмотря на стандартные условия приготовления клеточных экстрактов и условий хроматографии, профили элюции белков, полученные после ионообменной хроматографии экстрактов разных штаммов, значительно отличаются (рис. 3 и 4).

Ионообменная хроматография экстракта штамма Pseudoalteromonas maricaloris КММ 636 показала несколько пиков активности тимидин- и тимидилаткиназ, причем в двух из пиков эти активности совпадали (рис. ЗА). Ферменты из обнаруженных четырех пиков с различной скоростью осуществляли также фосфорилирование дезоксицитидина, уридина, аденозина и гуанозина. Попытка разделить нуклеозидкиназы этого штамма с помощью фракционирования сульфатом аммония (0-50% и 50-80% насыщения) и последующей ионообменной хроматографии не привела к успеху, поскольку снова было получено несколько пиков активностей ферментов, способных фосфорилировать ряд рибо- и дезоксирибонуклеозидов. Наличие нескольких нуклеозидкииаз, обладающих широкой субстратной специфичностью было обнаружено еще в трех других штаммах рода Pseudoalteromonas (КММ 215, 223 и 253), причем ферменты, ответственные за превращение тимидина в его монофосфат, обладали и активностью тимидилаткиназы (рис. ЗБ, В и Г).

Ионообменная хроматография препарата, полученного из клеток Arthrobacter sp. КММ 3687, выявила наличие трех ферментов, катализирующих фосфорилирование тимидина, уридина и тимидинмонофосфата (рис. 4А). Элюирование белков экстракта клеток Pseudomonas sp. КММ 3694 с DEAE-toyopearl градиентом NaCl позволило разделить активности тимидин-, тимидилат- и уридинкиназ (рис. 4Б).

В экстракте штамма Corynebacterium sp. КММ 3701 (рис. 4В) наибольшая активность принадлежала ферменту, ответственному за фосфорилирование тимидинмонофосфата. Фракции, в которых обнаруживались активности тимидин- и уридинкиназы практически совпадали по положению с основным белковым пиком, а уровень активности ферментов фосфорилирования тимидина и уридина был значительно меньше уровня активности тимидилаткиназы.

Активности трех ферментов фосфорилирования обнаружены после хроматографии экстракта штамма Bacillus sp. КММ 3573 (рис. 4Г). Наиболее высока в этом штамме активность уридинкиназы, которая элюируется с ионообменника четырьмя пиками. Активность тимидинкиназы проявляется в виде одного пика, в котором обнаружен и небольшой уровень тимидилаткиназы.

10000

10 20 30 40 номер фракции

10 20 30 40 50 номер фракции

10000

8000-

6000

4000

2000

10000

20 30 40 номарфран*«

20 30 номер фракции

Рис. 3. Ионообменная хроматография ферментов фосфорилирования экстрактов штаммов рода Pseudoalteromonas: А - Р. maricaloris КММ 636, Б - Pseudoalteromonas sp. КММ 215, В - Р. haloplanktis КММ 223, Г - Pseudoalteromonas sp. КММ 253 (1 - белок (А280Х 2 - активность тимидинкиназы, 3 - активность тимидилаткиназы, 4 - активность уридинкиназы).

В процессе хроматографии на ионообменнике разделились активности тимидин-и уридинкиназы штамма Flavobacterium/Cytophaga КММ 3717 (рис. 4Д). Тимидилаткиназная активность также была зарегистрирована, хотя ее уровень был невысоким. После ионообменной хроматографии белкового препарата из клеток Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033 (рис. 4Е) обнаружена активность лишь уридинкиназы, хотя в экстрактах данного штамма активность тимидинкиназы присутствовала.

Таким образом, после ионообменной хроматографии активность тимидинкиназы была выявлена во всех анализируемых штаммах морских бактерий, за исключением Pseudoalteromonas aurantia.

номер фракции номер фракции

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 номер фракции

30 40 50 60 номер фракции

Рис. 4. Ионообменная хроматография ферментов фосфорилирования экстрактов штаммов: А - Arthrobacter sp. КММ 3687, Б - штамма Pseudomonas sp. КММ 3694, В -Corynebacterium sp. КММ 3701, Г - Bacillus sp. КММ 3573, Д - Flavobacterium/Cytophaga КММ 3717, Е - Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033 (1 - белок (А280), 2 - активность тимидинкиназы, 3 - активность тимидилаткиназы, 4 - активность уридинкиназы).

Активность уридинкиназы обнаружена в четырех штаммах: Bacillus sp. КММ 3573, Flavobacterium/Cytophaga sp. КММ 3717, Pseudoalteromonas haloplanktis КММ 223 и Р aurantia, причем в штамме КММ 3573 она выявляется в виде четырех пиков, а у КММ 223 - трех. Активность тимидилаткиназы была четко выражена в таких штаммах как КММ 223, 253, 3687, 3694, 3701 и 636, при этом у штаммов КММ 223 и 636 выявлено четыре пика активности этого фермента.

Исследованные в представленной работе десять штаммов морских бактерий (представители родов Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Flavobacterium/Cytophaga, Pseudoalteromonas и Pseudomonas) являются весьма гетерогенными по содержанию и уровню активности ферментов фосфорилирования нуклеозидов. Интересной особенностью некоторых штаммов микроорганизмов является наличие нескольких форм нуклеозидкиназ - тимидин- и тимидилаткиназы штаммов рода Pseudoalteromonas КММ 215, 223, 253 и 636 и уридинкиназы штаммов Bacillus sp. КММ 3573 и Pseudoalteromonas haloplanktis КММ 223.

Можно предположить, что присутствие нескольких пиков с активностью одной и i той же нуклеозидкиназы обусловлено наличием нескольких изоформ ферментов,

которые могут отличаться друг от друга, как по физико-химическим свойствам, так и по субстратной специфичности. Примеры такого рода изоформ тимидинкиназы с разными изоэлектрическими точками показаны для Phisarum polycephalum Уридинкиназа может также существовать и в различных агрегатных состояниях от мономера до десятков субъединиц.

Совпадение пиков активностей тимидин- и тимидилаткиназ в клетках штаммов рода Pseudoalteromonas КММ 215, 223, 253 и 636, штаммов Arthrobacter sp. КММ 3687 и Corynebacterium sp. КММ 3701 позволяет предположить, что ферменты этих бактерий, катализирующие фосфорилирование тимидина, могут отвечать и за дальнейшее фосфорилирование тимидинмонофосфата, образующегося в результате этой реакции. В других штаммах эти активности разделяются в процессе ионообменной хроматографии.

4. Свойства нуклеозидкиназ

Для препаратов нуклеозидкиназ, полученных в результате ионообменной хроматографии, были определены оптимальные условия протекания катализируемых ими реакций. В табл. 3 приведен ряд физико-химических свойств исследуемых ферментов из шести штаммов морских бактерий. Оптимум pH всех этих ферментов находится в области pH 8-9. Для проявления активности тимидин-, тимидилат- и уридинкиназы требуется присутствие ионов Mg*1", которые частично могут быть заменены ионами Мп2^ В качестве донора фосфатных групп используется АТР, причем оптимальная его концентрация в инкубационной смеси различается в зависимости от используемого акцептора фосфата и источника выделения фермента. Соли одновалентных металлов NaCl и KCl в концентрации до 100 мМ практически не влияли на активность всех выделенных ферментов, за исключением уридинкиназы Pseudoalteromonas aurantia, активность которой снижалась вдвое при этой концентрации.

Специфичность нуклеозидкиназ из разных штаммов микроорганизмов в отношении акцептора фосфата значительно варьирует. Нуклеозидкиназы, обнаруженные в клетках Pseudoalteromonas maricaloris КММ 636, не обладали строгой субстратной специфичностью и катализировали фосфорилирование не только тимидина и TMP, но и с разной эффективностью переносили фосфатные группы от АТР на пуриновые и пиримидиновые рибо- и дезоксирибонуклеозиды. Тимидилаткиназа из

Pseudomonas sp. KMM 3694 катализировала фосфорилирование только TMP, но не тимидина. Пиримидиновые нуклеозидмоно- и -трифосфаты (TMP, UMP, ТТР и UTP) не оказывали влияния на активность этой нуклеотидкиназы.

Активности тимидин- и уридинкиназ, обнаруженных в Bacillus sp. KMM 3573 и Flavobacterium/Cytophaga KMM 3717 не изменялись при добавлении в инкубационную среду рибо- и дезоксирибонуклеозидов, а также ТТР, UTP, dCTP и СТР. Хотя активность уридинкиназы Flavobacterium/Cytophaga KMM 3717, ингибировалась при добавлении UMP, являющегося продуктом реакции фосфорилирования уридина, пиримидиновые рибо- и дезоксирибонуклеозидмонофосфаты (TMP, UMP, dCMP и CMP) не оказывали ингибирующего действия на тимидинкиназу из этого же источника.

5. Выделение нуклеозидкиназ клеток морских микроорганизмов

Из клеток морских бактерий Pseudomonas sp. KMM 3694 и Pseudoalteromonas * aurantia NCIMB 2033 были очищены тимидин- и уридинкиназа, соответственно. Выбор этих штаммов обусловлен достаточно высокой скоростью роста микроорганизмов, способностью включать экзогенные нуклеозиды в состав нуклеиновых кислот, '« наличием активности нуклеозидкиназ в экстрактах бактериальных клеток. В процессе ионообменной хроматографии не наблюдалось перекрывания фракций, проявляющих активности тимидин-, тимидилат- и уридинкиназ.

Были разработаны схемы выделения нуклеозидкиназ из этих двух штаммов микроорганизмов и определены их физико-химические свойства.

5.1. Выделение и изучение физико-химических свойств тимидинкиназы штамма

Pseudomonas sp. KMM 3694

Ионообменная хроматография экстракта клеток Pseudomonas sp. KMM 3694 позволила разделить активности тимидин-, тимидилат- и уридинкиназ (рис. 4Б). Была разработана схема выделения тимидинкиназы из этого штамма (табл. 3).

Таблица 3. Очистка тимидинкиназы штамма Pseudomonas sp. KMM 3694

Стадия очистки Белок, мг Удельная активность, ед./мг белка Общая активность, ед. Степень очистки Выход, %

1. Экстракт 2520

2. 80 % насыщения сульфатом аммония 1819 60 109140 1 100

3. Хроматография на ОЕАЕ-Юуореаг1 75 1440 90586 24 83

4. Хроматография на оксиапатите 15,2 7200 66575 120 61

5. Гель-фильтрация на Т8К-СЕЬ-Тоуореаг! Н\У-60 4,8 22980 38199 383 35

За ед. принимали образование 1 нмоля тимидинмонофосфата на 1 мг белка бактериального экстракта за 1 мин при 37°С.

С помощью очистки на ионообменном сорбенте был получен препарат тимидинкиназы с удельной активностью 1440 ед./мг белка. Эта стадия очистки являлась

наиболее эффективной и позволила одноэтапно очистить фермент в 24 раза с довольно высоким выходом. При дальнейшей очистке стабильность фермента резко снижалась, и после гель-фильтрации тимидинкиназа при 4"С в течение суток инактивировалась.

Приведенная схема очистки позволила получить элекрофоретически чистый препарат тимидинкиназы Pseudomonas sp. КММ 3694 очищенной в 383 раза с выходом 35 % и удельной активностью 22980 ед./мг белка. Молекулярная масса тимидинкиназы, определенная методом гель-фильтрации на TSK-GEL-Toyopearl HW-60, составила -130 кДа. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле показал одну полосу с молекулярной массой -75 кДа. Вероятно, тимидинкиназа Pseudomonas sp. КММ 3694 состоит из двух одинаковых субъединиц.

Максимальная скорость реакции фосфорилирования, катализируемой тимидинкиназой штамма Pseudomonas sp., наблюдается при pH 8,5 в трис-HCl буфере, I мМ АТР и 10-15 мМ Mg2+. Эффективность ионов Мп2+ в этой реакции очень низка. Соли одновалентных металлов (NaCl, KCl) в концентрации до 100 мМ не ингибируют активность тимидинкиназы.

Тимидинкиназа штамма Pseudomonas sp. КММ 3694 переносит фосфатную группу от АТР на тимидин и не способна катализировать дальнейшее фосфорилирование образующегося TMP, а также уридина.

Тимидинкиназы из некоторых источников ингибируются по типу обратной связи ТТР, являющимся конечным продуктом цепи фосфорилирования тимидина. Пиримидиновые нуклеозидтрифосфаты - ТТР, а также UTP и СТР не оказывали ингибирующего действия на активность тимидинкиназы Pseudomonas sp. КММ 3694.

5.2. Выделение и изучение физико-химических свойств уридинкиназы штамма Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033

Штамм P. aurantia эффективно включал экзогенные нуклеозиды в состав нуклеиновых кислот, причем уровень включения уридина более чем в 2,5 раза превышал включение тимидина. Для этого штамма выявлено предпочтительное включение метки из уридина в РНК.

Схема выделения уридинкиназы из штамма Р aurantia включала фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию на TSK-GEL-Toyopearl HW-60 (табл. 4). В процессе очистки уридинкиназы, как и в случае тимидинкиназы Pseudomonas sp. КММ 3694, наиболее эффективной была стадия DEAE-хроматографии. Комбинация методов ионообменной хроматографии и гель-фильтрации позволила получить препарат уридинкиназы, очищенный в 210 раз, с удельной активностью 882 ед./мг белка и с выходом 30%.

Молекулярная масса уридинкиназы штамма Pseudoalteromonas aurantia, определенная с помощью гель-фильтрации, составила -160 кДа. После электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия уридинкиназа обнаруживалась в виде двух полос с молекулярной массой 90 кДа и 30 кДа.

Максимальная скорость реакции фосфорилирования уридина, осуществляемой уридинкиназой Р. aurantia, наблюдается при pH 8,0 в трис-HCl буфере и при pH 9,0 в глицин-NaOH, 5 мМ АТР и 1 мМ Mg2+, который может замещаться ионами Мп2+ с максимумом при 2-5 мМ.

Соли одновалентных металлов NaCl и KCl в концентрации 100 мМ ингибируют активность уридинкиназы из штамма Р aurantia на 50%. Реагент на сульфгидрильные группы N-этилмалеимид ингибирует активность уридинкиназы на 80% при

концентрации 1 мМ, что свидетельствует о присутствии в белковой макромолекуле уридинкиназы P. aurantia SH-групп.

Таблица 4. Очистка уридинкиназы штамма Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033

Стадия очистки Белок, мг Удельная активность, ед./мг белка Общая активность, ед. Степень очистки Выход, %

1. Экстракт 9552

2. 80 % насыщения сульфатом аммония 1365 4,2 5733 1 100

3. Хроматография на ОЕАЕ4оуореаг1 32,1 143 4589 34 80

4. Рехроматография на ОЕАЕ-и>уореаг1 23,7 174 4123 41 72

5. Гель-фильтрация на Т8К-ОЕЬ-Тоуореаг! ЬШ-60 1,94 882 1711 210 30

За ед. принимали образование 1 нмоля уридинмонофосфата на 1 мг белка бактериального экстрактаза 1 мин при 37°С.

В качестве наиболее эффективного донора фосфатных групп уридинкиназа Р. aurantia использует dGTP, с меньшей эффективностью переносит на уридин фосфатные группы от GTP и АТР. Остальные рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не используются в реакции, катализируемой выделенной уридинкиназой.

Уридинкиназа P. aurantia катализирует фосфорилирование уридина и не использует в качестве акцептора фосфатных групп тимидин. Добавление в реакционную смесь пиримидиновых нуклеозидов (тимидин и дезоксицитидин) незначительно снижает эффективность работы фермента, тогда как пуриновые рибо- и дезоксирибонуклеозиды практически не влияют на фосфорилирование уридина.

Продукт реакции фосфорилирования уридина, UMP, а также ТМР, СМР и dCMP не влияют на активность уридинкиназы P. aurantia, но UTP, конечный продукт цепи фосфорилирования уридинкиназой ингибирует ее активность. Аналогичное влияние на активность уридинкиназы Pseudoalteromonas aurantia оказывает и СТР. Пиримидиновые дезоксинуклеозидтрифосфаты (ТТР и dC'l Р) ингибируют реакцию фосфорилирования уридина в меньшей степени.

5.3. Нуклеозидкиназы бактерии Yersinia pseudotuberculosis

Традиционно считалось, что патогенные бактерии Yersinia pseudotuberculosis "наземного" происхождения и морская среда для них не характерна. Однако в настоящее время имеются сведения о выделении разных видов бактерий рода Yersinia из морских животных и морской воды (Тимченко и др., 2004). Авторы также показали, что эти бактерии могут свободно существовать в морской воде в течение длительного времени и вызывать инфекционные заболевания у морских животных. Биологические аспекты существования Y. pseudotuberculosis хорошо изучены (Сомов и др., 1991; Тимченко и др., 2004), однако биосинтез нуклеиновых кислот в клетках У pseudotuberculosis и ферменты, связанные с этим процессом, в литературе не описаны. В связи с этим большой интерес представляют исследования биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников у этой патогенной бактерии, обитающей как на суше, так

и в морской среде, а также сравнительный анализ состава и свойств ключевых ферментов фосфорилирования экзогенных предшественников у "истинно" морских бактерий и У. pseudotuberculosis.

Ранее было показано, что бактерии Y. pseudotuberculosis способны включать экзогенные тимидин и уридин в ДНК и РНК этого микроорганизма (Кузнецов и др., 2000). В представленной работе описаны результаты выделения, очистки и исследования ряда физико-химических свойств нуклеозидкиназы, катализирующей фосфорилирование тимидина и уридина в клетках Y pseudotuberculosis.

В экстрактах, полученных из клеток Y pseudotuberculosis, была определена активность нуклеозидкиназ, ответственных за фосфорилирование тимидина и уридина. Удельная активность тимидинкиназы составляла 52 пмоль/ 30 мин /мг белка, уровень активности уридинкиназы - 15 пмоль/ 30 мин /мг, был гораздо ниже, чем у тимидинкиназы. Ферменты фосфорилирования нуклеозидов, обнаруженные в белковом экстракте Y. pseudotuberculosis, были подвергнуты очистке с помощью фракционирования сульфатом аммония и последующей хроматографии через колонку с DEAE-toyopearl. Из рис. 5 видно, что после хроматографического разделения белкового экстракта во фракциях наблюдалось присутствие активности обеих нуклеозидкиназ.

20000

15000

х 2

с 3 х

10000

5000

20 30 40 номер фракций

Рис 5. Хроматография на DEAE-toyopearl ферментов фосфорилирования тимидина и уридина штамма Yersinia pseudotuberculosis. 1 - белок (АгвоХ 2 - активность тимидинкиназы, 3 - активность уридинкиназы.

В табл. 5 представлены данные по очистке тимидин- и уридинкиназы из клеток Y pseudotuberculosis. Как видно из таблицы, наиболее эффективной стадией в процессе выделения ферментов была ионообменная хроматография, при этом активности тимидин-, и уридинкиназы обнаруживались в одном и том же пике. Несмотря на то, что нуклеозидкиназы не разделились, они были очищены в 67-68 раз. Фракции белка, содержащие активности исследуемых ферментов, были объединены и подвергнуты дополнительной очистке путем фракционирования на колонке с "голубой сефарозой". Как и в результате ионообменной хроматографии на DEAE-toyopearl, активности нуклеозидкиназ после аффинной хроматографии также обнаруживались в одних и тех

же фракциях. Степень очистки составила 303,8 и 309,6 раз, а после диализа - 350 и 356,8 раза, соответственно для тимидинкиназы и уридинкиназы.

Разработанная схема выделения нуклеозидкиназ, включающая фракционирование сульфатом аммония, ионообменную и аффинную хроматографии, не позволила разделить активности тимидин- и уридинкиназы, хотя степень очистки ферментов составила около 350 раз. Активности обеих нуклеозидкиназ после хроматографии обнаруживались в одних и тех же фракциях, и соотношение удельных активностей ферментов, катализирующих фосфорилирование тимидина и уридина, оставалось практически постоянным на протяжении всех этапов очистки. Это позволило предположить, что обе активности принадлежат одному ферменту.

Таблица 5. Схема очистки тимидин- и уридинкиназы из клеток Y pseudotuberculosis

Стадия очистки Белок, мг Удельная активность, ед./мг белка Общая активность, ед. Степень очистки Выход, %

1. Экстракт 4200 52 15» 218400 63000* 1 100

2. Фракция 30-80 % насыщения сульфатом аммония 1550 130 37* 201500 57350* 2,50 2,47* 92,3 91,0*

3. Хроматография на ОЕАЕ-Юуореаг1 50 3510 1032* 175500 51600* 67,5 68,8* 80,3 81,9*

4. Хроматография на голубой сефарозе 5 15795 4644* 78975 23220* 303,8 309,6* 36,2 36,8*

5. Диализ 4,2 18,200 5,353* 76818 22482* 350,0 356,8* 35,2 35,7*

* - данные для уридинкиназы

За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего фосфорилирование 1 пмоль соответствующего нуклеозида за 30 мин инкубации при температуре 37°С.

Очищенный от АТР ферментный препарат был использован для характеристики его физико-химических свойств и субстратной специфичности. Исследование зависимости скорости реакции фосфорилирования тимидина и уридина, осуществляемой выделенной нуклеозидкиназой, от времени инкубации показало, что ферментный препарат катализирует фосфорилирование тимидина и уридина линейно в течение около 1,5 часов при 37°С. Выделенный фермент способен осуществлять фосфорилирование тимидина и уридина также при температуре 6-8°С, однако реакция в этих условиях протекает с низкой скоростью.

Максимальная скорость фосфорилирования тимидина и уридина, катализируемого нуклеозидкиназой, наблюдается при температуре около 45°С. При повышении температуры инкубации выше 50°С активность нуклеозидкиназы падает. Прединкубация выделенно1 о ферментного препарата в течение 5 часов при 37°С или 1 часа при 45°С не приводила к потере активности.

Нуклеозидкиназа У. pseudotuberculosis катализировала фосфорилирование тимидина и уридина в интервале рН 7,5-9,0 с максимумом активности при рН 8,0-8,5. Максимальная ферментативная активность наблюдалась в присутствии 0,5-1,0 мМ MgCl2 и 2 мМ АТР. Соли КС1 или NaCl ингибировали активность нуклеозидкиназы.

Определение свойств выделенной нуклеозидкиназы показало, что оптимальные условия для реакции фосфорилирования и тимидина, и уридина совпадали. Причем во всех случаях скорость фосфорилирования уридина нуклеозидкиназой была ниже, чем при использовании в качестве субстрата тимидина. Все это свидетельствовало в пользу того, что оба нуклеозида фосфорилируются одним и тем же ферментом с различной скоростью. Можно предположить, что выделенная нуклеозидкиназа является неспецифической по отношению к акцепторам фосфатных групп и способна переносить фосфат от АТР и на тимидин, и на уридин. Разница в скорости реакции фосфорилирования двух пиримидиновых нуклеозидов может бьггь обусловлена различиями в структуре этих соединений, как в углеводном компоненте, так и в нуклеиновом основании.

Исследование специфичности нуклеозидкиназы Y pseudotuberculosis с помощью меченых предшественников показало, что оптимальным субстратом для нее является тимидин, но выделенный фермент способен фосфорилировать также уридин и дезоксицитидин, но не использует в качестве акцептора фосфата тимидинмонофосфат.

Донором фосфатных групп в реакции фосфорилирования тимидина, катализируемой выделенным ферментом, является АТР, который частично может быть заменен GTP. Другие рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не поддерживают реакцию фосфорилирования нуклеозидов.

Исследование нуклеозидкиназы Y pseudotuberculosis показало, что первый этап фосфорилирования тимидина и уридина, являющегося ключевой ступенью для включения их в состав нуклеиновых кислот, катализируется одним ферментом. Различия в скорости фосфорилирования тимидина и уридина нуклеозидкиназой Y. pseudotuberculosis могут влиять на эффективность включения этих предшественников в ДНК и РЖ клеток бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что клетки исследованных бактерий способны включать экзогенные тимидин и уридин в состав нуклеиновых кислот. Эффективность и специфичность включения каждого из данных предшественников в ДНК или РНК индивидуальна для разных штаммов морских бактерий.

2. В экстрактах, полученных из клеток морских прокариот, обнаружены активности ферментов, катализирующих фосфорилирование тимидина, уридина, дезоксицитидина, гуанозина и аденозина.

3. Определен спектр нуклеозидкиназ, участвующих в фосфорилировании тимидина и уридина в клетках 10 штаммов морских бактерий, исследованы их свойства и субстратная специфичность.

4. Разработаны схемы выделения тимидинкиназы из штамма Pseudomonas sp. КММ 3694, уридинкиназы из штамма Pseudoalteromonas aurantia и нуклеозидкиназы из Yersinia pseudotuberculosis. Определены физико-химические и энзиматические свойства этих ферментов, а так же молекулярная масса и субъединичный состав ферментов фосфорилирования из Pseudomonas sp. КММ 3694 и Pseudoalteromonas aurantia.

5. Показано, что максимальная активность всех очищенных ферментов проявляется в щелочной области рН, для протекания реакции необходимо присутствие в среде ионов Mg2+ или Mn + и АТР.

6. Тимидинкиназа Pseudomonas sp. КММ 3694 использует в качестве акцептора фосфата тимидин и не способна катализировать фосфорилирование уридина, а

также тимидинмонофосфата. Уридинкиназа Pseudoalteromonas aurantia катализирует фосфорилирование уридина, но не тимидина и ингибируется конечным продуктом цепи фосфорилирования уридина - UTP. В качестве донора фосфата фермент предпочитает dGTP и способен также переносить на уридин фосфатную группу от GTP и АТР. Нуклеозидкиназа Yersinia pseudotuberculosis фосфорилирует тимидин, дезоксицитидин и уридин; донором фосфатных групп является АТР, который частично может замещаться GTP.

7. Определена молекулярная масса и субъединичный состав нуклеозидкиназ из Pseudomonas sp. КММ 3694 и Pseudoalteromonas aurantia.

Основные публикации по теме диссертации

1. Терентьева Н.А., Немцева Ю.А., Шевченко JI.C., Терентьев JT.JI., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Поиск высокоактивных продуцентов тимидин- и уридинкиназ среди морских микроорганизмов // Биотехнология. 2002. № 3. С. 3-12.

2. Немцева Ю.А. Биосинтез нуклеиновых кислот в клетках морских микроорганизмов и очистка ферментов фосфорилирования предшественников синтеза ДНК // Фундаментальные исследования морской биоты: биология, химия и биотехнология: Материалы конференции студентов, аспирантов и молодых ученых НОЦ ДВГУ "Морская биота": сб. тез. докл. - Владивосток. 2002. С. 102.

3. Немцева Ю.А., Терентьева Н.А., Терентьев Л.Л., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Включение экзогенных предшественников синтеза нуклеиновых кислот в клетки морских микроорганизмов // 3-ий Международный симпозиум "Химия и химическое образование": сб. науч. тр. - Владивосток. 2003. С. 61-62.

4. Немцева Ю.А. Определение скорости синтеза ДНК в клетках морских микроорганизмов с помощью экзогенных предшественников II VII Дальневосточная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии: сб. тез. докл. - Владивосток. 2003. С. 39.

5. Немцева Ю.А., Терентьева Н.А., Терентьев JI.JI., Шевченко Л.С., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Выделение и характеристика нуклеозидкиназ морских бактерий // Региональная научная конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии": сб. тез. докл. - Владивосток. 2004. С. 73.

6. Немцева Ю.А., Тимченко Н.Ф. Нуклеозидкиназа из Yersinia pseudotuberculosis // IV Научно-практическая конференция "Инфекционная патология в Приморском крае": сб. тез. докл. - Владивосток. 2004. С. 15-16.

7. Немцева Ю.А., Терентьева Н.А., Тимченко Н.Ф., Терентьев Л.Л., Рассказов В.А. Нуклеозидкиназа из Yersinia pseudotuberculosis // ЖМЭИ. 2005. № 2. С. 78-80.

Соискатель /bOt^&v Немцева Ю.А.

РНБ Русский фонд

2007-4 6712

Немцева Юлия Александровна

АВТОРЕФЕРАТ

ЗАО "Фартоп" г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Отпечатано 9 ноября 2005 г.

2 9 ДЕК 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Немцева, Юлия Александровна

Список принятых сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Общие представления о репликации ДНК.

2.2. Предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот.

2.2.1. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот.

2.2.1.1. Путь синтеза нуклеозидтрифосфатов de novo.

2.2; 1.2. Путь синтеза нуклеозидтрифосфатов salvage.

2.2.1.3. Взаимосвязь de novo и salvage путей биосинтеза предшественников нуклеиновых кислот.

2.3. Ферменты фосфорилирования нуклеозидов.

2.3.1. Нуклеозидкиназы.

2.3.2. Нуклеотидкиназы.

2.4. Ферменты фосфорилирования предшественников нуклеиновых кислот в клетках морских бактерий.

3. Материалы и методы.

4. Результаты исследования и их обсуждение.

4.1. Определение скорости роста клеток морских микроорганизмов в присутствии меченых нуклеозидов.

4.2. Определение активности нуклеозидкиназ в экстрактах морских микроорганизмов.

4.3. Анализ спектра нуклеозидкиназ морских бактерий с помощью ионообменной хроматографии.

4.4. Свойства нуклеозидкиназ.

4.5. Выделение нуклеозидкиназ клеток морских микроорганизмов.

4.5.1. Выделение тимидинкиназы из штамма Pseudomonas sp. КММ

3694.

4.5.2. Свойстватимидинкиназы штаммаPseudomonas sp. КММ

4.5.3. Выделение уридинкиназы из штамма Pscudoalteromonas aurantia

NCIMB

4.5.4. Свойства уридинкиназы штамма Pseudoalteromonas aurantia

NCIMB

4.6. Нуклеозидкиназы из клеток бактерии Yersinia pseudotuberculosis.

4.6.1. Выделение и изучение свойств тимидин- и уридинкиназ из экстракта бактерии Yersinia pseudotuberculosis.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование экзогенных предшественников в биосинтезе нуклеиновых кислот и ферменты фосфорилирования нуклеозидов в клетках морских бактерий"

В последнее время морские микроорганизмы, в частности бактерии, привлекают внимание исследователей, работающих в таких областях, как микробиология, биохимия и биотехнология. Это связано с особенностями метаболизма бактерий, обусловленными средой их обитания. Условия существования, абиотические и биотические, оказывают значительное влияние на жизнедеятельность морских микроорганизмов. Колебания температур вод Мирового Океана в весьма широком интервале в зависимости и от географической широты, и от глубин, определяют распространение мезофильных, психрофильных и психроактивных прокариот в море. В горячих глубоководных источниках океана, где жизнь других организмов сообщества зависит от прокариот-хемосинтетиков, а не от энергии Солнца (фотосинтеза), существуют и экстремально термофильные микроорганизмы. Большое влияние на жизнедеятельность микробов моря оказывает также гидростатическое давление, состав и содержание в воде различных растворенных солей.

Такие разнообразные, часто экстремальные условия обитания морских микроорганизмов дают основания предполагать наличие уникальных метаболических путей, обеспечивающих рост и размножение морских бактерий, а также возможность обнаружения в их клетках ферментов, отличающихся по своим свойствам от аналогичных ферментов наземных организмов.

Морская вода представляет собой естественную среду, в которой имеются все компоненты, необходимые для жизнедеятельности бактериальных клеток. Здесь находятся растворенные пептиды, аминокислоты, углеводы, различные компоненты нуклеиновых кислот и другие органические и неорганические соединения. Морские бактерии участвуют в кругообороте органических веществ Океана, и их клетки способны использовать имеющиеся в среде обитания предшественники в собственных метаболических процессах, а не создавать эти соединения из низкомолекулярных органических и неорганических веществ.

Основным показателем продуктивности бактериальных (и не только) клеток является биосинтез нуклеиновых кислот. Увеличение количества ДНК в экстрактах клеток свидетельствует об их делении, РНК - определяет метаболическую активность клетки.

ДНК и РНК синтезируются из пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые могут образовываться как из низкомолекулярных компонентов de novo, так и из готовых фрагментов (основания, нуклеозиды, остатки рибозы или дезоксирибозы) - salvage путь биосинтеза. Находящиеся в морской воде нуклеиновые кислоты и их компоненты являются для бактерий не только источником азота, углерода и фосфора, но и могут использоваться в качестве предшественников синтеза нуклеиновых кислот.

Молекулярный механизм утилизации морскими бактериями экзогенных предшественников практически не изучен. Широко применяемый метод определения биосинтеза ДНК с помощью радиоактивно меченного тимидина, а также РНК — с помощью меченного уридина, свидетельствует только о включении этих соединений в макромолекулы клетки, но не дает возможности определить, в какие именно биополимеры включается тот или иной предшественник. Чтобы включиться в состав нуклеиновых кислот, экзогенные нуклеозиды должны проникнуть внутрь клетки и фосфорилироваться клеточными ферментами до нуклеозидтрифосфатов, являющихся непосредственными субстратами для ДНК- и РНК-полимераз. Ключевую роль в процессе фосфорилирования предшественников синтеза нуклеиновых кислот играют нуклеозидкиназы. Хотя включение меченых нуклеозидов часто используется в качестве показателя продуктивности микробных сообществ, о наличии нуклеозидкиназ в клетках морских бактерий практически нет данных. Нет сведений ни о составе ферментов фосфорилирования нуклеозидов, ни об их свойствах и специфичности.

Целью работы является изучение процесса утилизации экзогенных предшественников синтеза нуклеиновых кислот клетками морских бактерий.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. Протестировать активности ферментов фосфорилирования нуклеозидов в экстрактах клеток морских бактерий.

В результате проведенных исследований было показано, что клетки исследованных морских бактерий способны включать экзогенные тимидин и уридин в молекулы нуклеиновых кислот, при этом метка каждого из этих предшественников может обнаруживаться как в ДНК, так и в РНК.

Впервые обнаружена множественность форм тимидин- и тимидилаткиназ среди представителей рода Pseudoalteromonas и уридинкиназы рода Bacillus sp. КММ 3573 и Pseudoalteromonas haloplanktis КММ 223. Показана способность некоторых тимидинкиназ катализировать дальнейшее фосфорилирование образующегося тимидинмонофосфата.

Показано, что морские бактерии могут быть новым перспективным источником ферментов, в частности, нуклеозид- и нуклеотидкиназ. Очищенные ферменты MOiyr быть с успехом использованы в биотехнологии и молекулярной биологии, а также при производстве меченых нуклеозидмоно-, -ди- и -трифосфатов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Немцева, Юлия Александровна

5. ВЫВОДЫ

Показано, что клетки исследованных бактерий способны включать экзогенные тимидин и уридин в состав нуклеиновых кислот. Эффективность и специфичность включения каждого из данных предшественников в ДНК или РНК индивидуальна для разных штаммов морских бактерий.

В экстрактах, полученных из клеток морских прокариот, обнаружены активности ферментов, катализирующих фосфорилирование тимидина, уридина, дезоксицитидина, гуанозина и аденозина.

Определен спектр нуклеозидкиназ, участвующих в фосфорилировании тимидина и уридина в клетках 10 штаммов морских бактерий, исследованы их свойства и субстратная специфичность.

Разработаны схемы выделения тимидинкиназы из штамма Pseudomonas sp. КММ 3694, уридинкиназы из штамма Pseudoalteromonas aurantia и нуклеозидкиназы из Yersinia pseudotuberculosis. Определены физико-химические и энзиматические свойства этих ферментов, а так же молекулярная масса и субъединичный состав ферментов фосфорилирования из Pseudomonas sp. КММ 3694 и Pseudoalteromonas aurantia.

Показано, что максимальная активность всех очищенных ферментов проявляется в щелочной области pH, для протекания реакции необходимо присутствие в среде ионов Mg2+ или Мп2+ и АТР.

Тимидинкиназа Pseudomonas sp. КММ 3694 использует в качестве акцептора фосфата тимидин и не способна катализировать фосфорилирование уридина, а также тимидинмонофосфата. Уридинкиназа Pseudoalteromonas aurantia катализирует фосфорилирование уридина, но не тимидина и ингибируется конечным продуктом цепи фосфорилирования уридина - UTP. В качестве донора фосфата фермент предпочитает dGTP и способен также переносить на уридин фосфатную группу от GTP и АТР.

Нуклеозидкиназа Yersinia pseudotuberculosis фосфорилирует тимидин, дезоксицитидин и уридин; донором фосфатных групп является АТР, который частично может замещаться GTP.

Определена молекулярная масса и субъединичный состав нуклеозидкиназ из Pseudomonas sp. КММ 3694 и Pseudoalteromonas aurantia.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Немцева, Юлия Александровна, Владивосток

1. Ahmed N.K., Baker D.R. Properties of uridine-cytidine kinase derived from L1210 leukemia cells // Cancer Res. 1980. Vol. 40, N 10. P. 3559-3563.

2. Akerley B J:, Rubin E.J., Novick V.L., Amaya K., Judson N., Mekalanos J.J. A genome-scale analysis for identification of genes required for growth or survival of Haemophilus influenzae II Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. Vol. 99. P. 966-971.

3. Anderson E.P. Nucleoside and nucleotide kinases. "The enzymes". Boyer P. D. Ed. V. IX. Part B. 3rd ed. Acad. Press. New York and London. 1973.

4. Anderson E.P. Uridine-cytidine kinase from a murine neoplasm // Methods Enzymol. 1978. Vol. 51. P. 314-321.

5. Andres C.M., Fox I.H. Purification and properties of human placental adenosine kinase // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254, N 22. P. 11388-11393.

6. Barker J., Lewis R.A. Deoxyguanosine kinase of neonatal mouse skin tissue // Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 658, N 1. P. 111-123.

7. Beck C. F., Ingracham J. L., Neuhard J., Thomassen E. Metabolism of pyrimidines and pyrimidine nucleosides by Salmonella typhimurium II J.Bacteriol. 1972. Vol. 110, N 1. P. 219-228.

8. Belfort M., Maley G.F., Maley F. Characterization of the Escherichia coli thyA gene and its amplified thymidylate synthetase product // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. Vol. 80. P. 1858-1861.

9. Bennett S.E., Chen C.Y., Mosbaugh D.W. Escherichia coli nucleoside diphosphate kinase does not act as a uracil-processing DNA repair nuclease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101, N 17. P. 6391-6396.

10. Black M.E., Hruby D.E. A single amino acid substitution abolishes feedback inhibition of vaccinia virus thymidine kinase // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 9743-9748.

11. Black M.E., Hruby D.E. Nucleotide sequence of the Escherichia coli thymidine kinase gene provides evidence for conservation of functional domains and quaternary structure //Mol. Microbiol; 1991. Vol. 5, N 2. P. 373-379.

12. Boehme R.E. Phosphorylation of the antiviral precursor 9-(l,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine monophosphate by guanylate kinase isozymes // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, N 20. P. 12346-12349.

13. Bohman C., Eriksson S. Deoxycytidine kinase from human leukemic spleen: preparation and characteristics of homogeneous enzyme //Biochem. 1988. Vol. 27, N 12. P. 4258-4265.

14. Botchan M. Coordinating DNA replication with cell division: current status of the licensing concept//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93, N 19. P. 999710000.

15. Boursaux-Eude C., Margarita D., Gilles A.M., Barzu O., Saint Girons I. Borrelia burdorferi uridine kinase: an enzyme of the pyrimidine salvage pathway for endogenous use of nucleotides // Microbiol. Lett. 1997. Vol. 151, N 2. P. 257-261.

16. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

17. Brady W.A., Kokoris M.S., Fitzgibbon M., Black M.E. Cloning, characterization, and modeling of mouse and human guanylate kinases // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271, N 28. P. 16734-16740.

18. Bronzert D.A., Monaco M.E., Pinkus L., Aitken S., Lippman M.E. Purification and properties of estrogen-responsive cytoplasmic thymidine kinase from human breast cancer // Cancer Res. 1981. Vol. 41, N 2. P. 604-610.

19. Buccino R.J., Roth J.S. Partial purification and properties of ATP:GMP phosphotransferase from rat liver // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 132, N 1. P. 49-61.

20. Bucurenci N., Serina L., Zaharia G., Landais S., Danchin A., Barzu O. Mutational analysis of UMP kinase from Escherichia coli II J. Bacteriol. 1998. Vol. 180, N 3. P. 473-477.

21. Carnrot C., Wehelie R., Eriksson S., Bolske G., Wang L. Molecular characterization of thymidine kinase from Ureaplasma urealyticum: nucleoside analogues as potent inhibitors of mycoplasma growth // Mol. Microbiol. 2003. Vol. 50, N.3.P. 771-780.

22. Carret C., Delbecq S., Labesse G., Carey B., Precigout E., Moubri K., Schetters T.P.M., Gorenflot A. Characterization and molecular cloning of an adenosine kinase from Babesia canis rossi II Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 265, N 3. P. 1015-1021.

23. Chakrabarty A.M. Nucleoside diphosphate kinase: role in bacterial growth, virulence, cell signaling and polysaccharide synthesis // Mol. Microbiol. 1998. VoL 28, N. 5; P. 875-882.

24. Chang C.H., Brockman R.W., Bennett L.L. Adenosine kinase from L1210 cells. Purification and some properties of the enzyme // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, N6. P. 2366-2371.

25. Chen M.C., Walker J., Prusoff W.H. Kinetic studies of Herpes simplex virus type 1-encoded thymidine and thymidylate kinase, a multifunctional enzyme // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 10747-10753.

26. Chen M.S., Prusoff W.H. Association of thymidylate kinase activity with pyrimidine deoxyribonucleoside kinase induced by herpes simplex virus // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253, N 5. P. 1325-1327.

27. Cheng N., Payne R.C., Traut T.W. Regulation of uridine kinase. Evidence for a regulatory site //J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, N 28. P. 13006-13012.

28. Chiesa C., Dal Pra A., Guarneri G. et al. Survey of Yersinia and related bacteria in shellfish// Water, Air and Soil Pollution. 1987. Vol. 34, N 3. pp. 241-244.

29. Chiesa C., Pacifico L., Cianfranco V. et al. Sources of 2883 strains of Yersinia enterocolitica and related species isolated in Italy: clinical, ecological and epidemiological features // Microecol. Ther. 1989. Vol. 18. P. 331-334.

30. Chraibi R., Wright M. Characterization of the thymidine kinase of Phisarum polycephalum //J. Biochem. 1983. Vol. 93, N 2. P. 323-330.

31. Craine J.E., Klee C.B. A deoxyadenylate kinase activity associated with polynucleotide phosphorylase from Micrococcus luteus II Nucl. Acid. Res. 1976. Vol. 3,N 11. P. 2923-2928.

32. Criss W.E., Pradhan T.K. Purification and characterization of adenylate kinase from rat liver // Methods Enzymol. 1978. Vol. 51: P. 459-467.

33. Datta A.K., Bhaumik D., Chatterjee R. Isolation and characterization of adenosine kinase from Leishmania donovani II J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262, N 12. P. 5515-5521.

34. Degreve B., Esnouf R., De Clercq E., Balzarini J. Selective abolishment of pyrimidine nucleoside kinase activity of Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase by mutation of alanine-167 to tyrosine // Mol. Pharmacol. 2000. Vol. 58, N 6. P. 1326-1332.

35. Deibel M.R., Reznik R.B., Ives D.H. Deoxynucleoside kinases from Lactobacilli. Separate interacting sites for deoxycytidine and deoxyadenosine // J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252, N 22. P. 8240-8244.

36. Durham J. P., Ives D. H. Deoxycytidine kinase. II. Purification and general properties of the calf thymus enzyme // J. Biol. Chem. 1970. Vol. 245, N 9. P. 22762284.

37. Ellims P.H., Van der Weyden M.B. Human liver thymidine kinase. Purification and some properties of the enzyme //J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, N 23. P. 1129011295.

38. Ellims P.H., Van der Weyden M.B. Kinetic mechanism and inhibition of human liver thymidine kinase // Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 660, N 2. P. 238-242.

39. Eriksson S., Munch-Petersen B., Johansson K., Eklund H. Structure and function of cellular deoxyribonucleoside kinases // CMLS, Cell. Moll. Life Sci. 2002. Vol. 59. P. 1327-1346.

40. Falkao D.P., Correa E.F., Falkao G.P. Yersinia spp. in the environment: epidemiology and virulence characteristics // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. Vol; 529. P. 341-343.

41. Fassy F., Krebs O., Lowinski M., Ferrari P., Winter J., Collard-Dutilleul V., Salahbey Hocini K. UMP kinase from Streptococcus pneumoniae: evidence for cooperative ATP binding and allosteric regulation // Biochem. J. 2004. Vol. 384. P. 619-627.

42. Fisher M.N., Newsholme E.A. Properties of rat heart adenosine kinase // Biochem. J. 1984. Vol. 221, N 2. P. 521-528.

43. Fuhram J.A., Azam F. Thymidine incorporation as a measure of heterotrophic bacterioplankton production in marine surface waters: evaluation and field results // Mar. Biol. 1982. Vol. 66. P. 109-120.

44. Fujimura R.K., Das S.K. Replicative DNA polymerases and mechanisms at a replication fork // Progr. Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 1980. Vol. 24. P. 87-107.

45. Fulchignoni-Lataud M.C., Tuilie M., Roux J.M. Uridine—cytidine kinase from fetal and adult rat liver. Purification and study of some properties // Eur. J. Biochem. 1976. Vol: 69, N 1. P. 217-222.

46. Gan T.E., Brumley J.L., Van Der Weyden M.B. Human thymidine kinase. Purification and properties of the cytosolic enzyme of placenta // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258, N 11. P. 7000-7004.

47. Gefter M.L. DNA replication // Annu. Rev. Biochem. 1975. Vol. 44. P. 45-78.

48. Gellert M. DNA topoisomerases // Annu. Rev. Biochem. 1981. Vol. 50. P. 879910.

49. Gentry D., Bengra C., Ikehara K., Cashel M. Guanylate kinase of Escherichia coli K-U //J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, N 19. P. 14316-14321.

50. Girons I.S., Gilles A.M., Margarita D., Michelson S., Monnot M., Fermandjian S., Danchin A., Barzu O. Structural and catalytic characteristics of Escherichia coli adenylate kinase // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262, N 2. P. 622-629.

51. Glaser P., Presecan E., Delepierre M., Surewicz W.K., Mantsch H.H., Barzu O., Gilles A.M. Zinc, a novel structural element found in the family of bacterial adenylate kinases // Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 12. P. 3038-3043.

52. Green F.J., Lewis R.A. Partial purification and characterization of deoxyguanosine kinase from pig skin // Biochem. J. 1979. Vol. 183, N 3. P. 547-553.

53. Grobner P. Thymidine kinase enzyme variants in Phisarum polycephalum. Kinetics and properties of the enzyme variants // J. Biochem. 1979. Vol. 86, N 5. P. 1607-1614;

54. Grobner P., Loidl P. Thymidine kinase. A novel affinity chromatography of the enzyme and its regulation by phosphorylation in Phisarum polycephalum // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 8012-8014.

55. Gyurasits E.B., Wake R.G. Bidirectional chromosome replication in Bacillus subtilis II J. Mol. Biol. 1973. Vol. 73. P. 55-63.

56. Hall S.W., Kuhn H. Purification and properties of guanylate kinase from bovine retinas and rod outer segments // Eur. J. Biochem. 1986. Vol. 161, N 3. P. 551-556.

57. Harlow K.W., Nygaard P., Hove-Jensen B. Cloning and characterization of the gsk gene encoding guanosine kinase of Escherichia coli II J. Bacterid. 1995. Vol. 177, N 8. P. 2236-2240.

58. Haugaard L.E., West T.P. Pyrimidine biosynthesis in Pseudomonas oleovorans IIJ. Appl. Microbiol. 2002. Vol. 92. P. 517-525.

59. Hawkins C.F., Bagnara A.S. Adenosine kinase from human erythrocytes: kinetic studies and characterization of adenosine binding sites // Biochemistry. . 1987. Vol: 26, N 7. P. 1982-1987.

60. Her M.O., Momparler R.L. Mammalian deoxynucleoside kinases. IV. Deoxythymidine kinase: purification, properties, and kinetic studies II J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246, N 20. P. 6152-6158.

61. Hochstadt J. Adenine phosphoribosyltranspherase from Escherichia coli II Methods Enzymol. 1978. Vol. 51. P. 558-567.

62. Hruby D.E. Inhibition of vaccinia virus thymidine kinase by the distal products of its own metabolic pathway // Virus Res. 1985. Vol. 2, N 2. P. 151-156.

63. Hsu C.H., Liou J.Y., Dutschman G.E., Cheng Y.C. Phosphorylation? of cytidine, deoxycytidine, and their analog monophosphates by human UMP/CMP kinase is differentially regulated by ATP and magnesium // Mol. Pharmacol. 2005. Vol. 67, N 3. P. 806-814.

64. Jeffrey W.H., Paul J.H. Thymidine uptake, thymidine incorporation, and thymidine kinase activity in marine bacterium isolates // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 5. P. 1367-1372.

65. Jenuth J.P., Mably E.R., Snyder F.F. Modelling of purine nucleoside metabolism during mouse embryonic development: relative routes of adenosine, deoxyadenosine, and deoxyguanosine metabolism // Biochem. Cell;Biol. 1996. Vol. 74, N 2. P. 219-225.

66. Jochimsen B., Nygaard P., Vestergaard T. Location on the chromosome of Escherichia coli of genes governing purine metabolism // Mol. Gen. Genet. 1975. Vol. 143. P. 85-91.

67. Jong A.Y.S., Campbell J.L. Characterization of Saccharomyces cerevisiae thymidylate kinase, the CDCS gene product // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, N 23. P. 14394-14398.

68. Karl D.M. Selected nucleic acid precursors in studies of aquatic microbial ecology// Appl. Envir. Microbiol. 1982. Vol. 44. P. 891-902.

69. Karl D.M. Simultaneous rates of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid synthesis for estimating growth and cell division of aquatic microbial communities // Appl. Envir. Microbiol. 1981. Vol. 427. P. 802-810.

70. Karlstrom O., Larsson A. Significance of ribonucleotide reduction in the biosynthesis of deoxyribonucleotides in Escherichia coli II Eur. J. Biochem. 1967. Vol.3. P. 164-170.

71. Kawasaki H., Shimaoka M., Usuda Y., Utagawa T. End-product regulation and kinetic mechanism of guanosine-inosine kinase from Escherichia coli II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. Vol. 64, N 5. P. 972-979.

72. Kessel D. Properties of deoxycytidine kinase partially purified from L1210 cells // J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243, N 18. P. 4739-4744.

73. Kielley R.K. Purification and properties of thymidine monophosphate kinase from mouse hepatoma // J. Biol. Chem. 1970. Vol. 245", N 16. P. 4204-4212.

74. Kim M.Y., Ikeda S., Ives D.H. Affinity purification of human deoxycytidine kinase: avoidance of structural and kinetic artifacts arising from limited proteolysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. Vol. 156, N 1. P. 92-98.

75. Kim M.Y., Ives D.H. Human deoxycytidine kinase: kinetic mechanism and end product regulation// Biochem. 1989. Vol. 28. P. 9043-9047.

76. Kirchman D., Ducklow H., Mitchel R. Estimates of bacterial growth from changes in uptake rates and biomass // Appl. Environ. Microbiol. 1982. Vol. 44, N 6. P. 1296-1307.

77. Kizer D., Holman L. Purification and properties of thymidine kinase from regenerating rat liver // Biochem. Biophys. Acta. 1974. Vol. 350. P. 193-200.

78. Knecht W., Petersen G.E., Sandrini M.P.B., Sondergaard L., Munch-Petersen B., Piskur J. Mosquito has a single multisubstrate deoxyribonucleoside kinase characterized by unique substrate specificity // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31, N 6. P. 1665-1672.

79. Kobayashi K., Ehrlich S.D., Albertini A., Amati G., Andersen K.K., Arnaud M., Asai K., Ashikaga S., Aymerich S., Bessieres P., et al. Essential Bacillus subtilis genes // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. Vol. 100. P. 4678-4683.

80. Kohno H., Kumagai H., Tochikura T. Purification and properties of pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from baker's yeast // Agric. Biol. Chem. 1983. Vol. 47. P. 19-24.

81. Koizumi K., Shimamoto Y., Azuma A., Wataya Y., Matsuda A., Sasaki T., Fukushima M. Cloning and expression of uridine/cytidine kinase cDNA from human fibrosarcoma cells // Int. J. Mol. Med. 2001. Vol. 8, N 3. P. 273-278.

82. Kornberg A. DNA Replication // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263, Iss. 1. P. 1-4.

83. Kornberg A. DNA Replication. San Francisco. "W. H. Freeman and Co." 1980.726P.

84. Kornberg A. Mechanisms of replication of Escherichia coli chromosome // Eur. J. Biochem. 1983. Vol. 137. P. 377-382.

85. Kornberg A. Supplement to DNA replication. San Francisco, W.H. Freeman and Co. 1982. P. 1-203.

86. Koshland D.E., Levitzki A. GTP synthetase and related enzymes. In P.D. Boyer (ed.) "The enzymes". Academic Press, Inc., New York. 1974. Vol. 10. P. 539559.

87. Kowal E.P., Markus G. Affinity chromatography of thymidine kinase from a rat colon adenocarcinoma // Prep. Biochem. 1976. Vol. 6, N 5. P. 369-385.

88. Krygier V., Momparler R.L. Mammalian deoxynucleoside kinases. II. Deoxyadenosine kinase: purification and properties // J. Biol. Chem. 1971a. Vol. 246, N9. pp. 2745-2751.

89. Krygier V., Momparler R.L. Mammalian deoxynucleoside kinases. III. Deoxyadenosine kinase: inhibition by nucleotides and kinetic studies // J. Biol. Chem. 1971b. Vol. 246, N 9. P. 2752-2757.

90. Krystal G., Scholefield P.G. The partial purification and properties of uridine kinase from Ehrlich ascites tumor cells // Can. J. Biochem. 1973. Vol. 51, N 4. P. 379-389.

91. Q., Zhang X., Almaula N., Mathews C.K., Inouye M. The gene for nucleoside diphosphate kinase functions as a mutator gene in Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1995. Vol. 254, N 3. P. 337-341.

92. Ma G.T., Hong Y.S., Ives D.H. Cloning and expression of the heterodimeric deoxyguanosine kinase/deoxyadenosine kinase of Lactobacillus acidophilus R-26 // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, N 12. P. 6595-6601.

93. Ma J.J:, Huang S.H., Jong A.Y. Purification and characterization of Saccharomyces cerevisiae uridine monophosphate kinase // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265, N 31. P. 19122-19127.

94. Ma N., Ikeda S., Guo S. Y., Fieno A., Park I., Grimme S., Ikeda T. Deoxycytidine kinase and deoxyguanosine kinase of Lactobacillus acidophilus R-26 are collinear products of a single gene //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 14385-14390.

95. Maness P., Orengo A. A pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from rat liver//Biochemistry. 1975. Vol. 14, N 7. P. 1484-1489.

96. Maness P., Orengo A. Activation of rat liver pyrimidine nucleoside monophosphate kinase // Biochim. Biophys. Acta. 1976. Vol. 429, N 1. P. 182-190.

97. Mathews C.K. "Genetic consequences of nucleotide pool imbalance." New-York; London. 1985. P. 47-66.

98. Mathews C.K., Sinha N. K. Are DNA precursors concentrated at replication sites? //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 302-306.

99. Matsuda A. Nucleoside kinases and new types of antitumour nucleosides // Gan To Kagaku Ryoho. 1997. Vol. 24, N 11. P. 1594-1599.

100. McNab R. Cloning and sequence analysis of thymidine kinase from the oral bacterium Streptococcus gordonii II FEMS Microbiol. Lett. 1996. Vol. 135, N 1. P. 103-110.

101. Meyskens F.L., Williams H.E. Adenosine metabolism in human erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1971. Vol. 240, N 2. P. 170-179.

102. Miller R.L., Adamczyk D.L., Miller W.H. Adenosine kinase from rabbit liver. I. Purification by affinity chromatography and properties // J. Biol. Chem. 1979a. Vol. 254, N7. P. 2339-2345.

103. Miller W.H., Miller R.L. Guanosine kinase from Trichomonas vaginalis II Mol. Biochem. Parasitol. 1991. Vol. 48. P. 39-46.

104. Molgaard H. Deoxyadenosine/deoxycytidine kinase from Bacillus subtilis. Purification, characterization, and physiological function // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, N17. P. 8216-8220.

105. Mollgaard H., Neuhard J. Biosynthesis of deoxythymidine triphosphate. In A. Munch-Petersen (ed.). Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganisms. Academic Press. Inc. (London) Ltd., London. 1983. P. 149-198.

106. Momparler R.L., Fischer G.A. Mammalian deoxynucleoside kinases I. Deoxycytidine kinase: purification, properties, and kinetic studies with cytosine arabinoside // J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243, N 16. P. 4298-4304.

107. Mori H., Iida A., Teshiba S., Fujio T. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product // J. Bacteriol. 1995. Vol. 177, N 17. P. 4921-4926.

108. Moriarty D.J.W. Measurement of bacterial growth rates in aquatic systems from rates of nucleic acid synthesis // Adv. Microb. Ecol. 1986. Vol. 9. P. 245-292.

109. Moriguchi M., Kohno H., Kamei M., Tochikura T. Purification and properties of guanylate kinase from baker's yeast // Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 662, N l.P. 165-167.

110. Munch-Petersen B., Knecht W., Lenz C., Sondergaard L., Piskur J. Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its G-terminal deletion mutants // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 9. P. 6673-6679.

111. Munch-Petersen B., Piskur J:, Sondergaard L. The single deoxynucleoside kinase in Drosophila melanogaster, Dm-dNK, is multifunctional and differs from the mammalian deoxynucleoside kinases // Adv. Exp. Med. Biol. 1998b. Vol. 431. P. 465-469.

112. Nave J-F., Neises B., Eschbach A. Study of analogues of thymidine-5'-monophosphate and thymidine as substrates or inhibitors of chick embryo liver thymidylate kinase // Nucleosides and nucleotides. 1996. Vol. 15, N 9. P. 1469-1479.

113. Neale G.A., Mitchell A., Finch L.R. Enzymes of pyrimidine deoxyribonucleotide metabolism in Mycoplasma mycoides subsp. mycoides II J. Bacterid. 1983.Vol. 156, N3. P. 1001-1005.

114. Nelson D.J., Carter C.E. Purification and characterization of thymidine 5'-monophosphate kinase from Escherichia coli B // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244, N 19. P. 5254-5262.

115. Neuhard J.,; Nygaard P. In Neidhardt F.C. (ed.). Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1996. Washington. Vol. 1. P. 445-473.

116. Neuhard J., Thomassen E. Altered deoxyribonucleotide pools in P2 eductants of Escherichia coli K-12 due to deletion of the dcd gene // J. Bacterid; 1976. Vol. 126, N 2. P. 999-1001.

117. Neyhard J. In A. Munch-Petersen (ed.), "Metabolizm of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms". Academic Press, London, Unated Kingdom. 1983. P. 95-148.

118. Noda M., Kunz B.C., Tsai S.C., Adamik R., Murtagh J.J., Chen H.C., Halpern J.L., Moss J. Isolation and immunological properties of adenosine kinase // Prep. Biochem. 1989. Vol: 19, N4. P. 351-361.

119. Oeschger M.P. Guanylate kinase from Escherichia coli B // Methods. Enzymol. 1978. Vol. 51. P. 473-482.

120. Okazaki R., Kornberg A. Deoxythymidine kinase of Escherichia coli. I. Purification and some properties of the enzyme // J. Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 269-274.

121. Orengo A. Feedback regulation in the ribopyrimidine "salvage" pathway // Exp. Cell Res. 1966. Vol. 41, Iss. 2. P. 338-349.

122. Orengo A. Regulation of enzymic activity by metabolites. I. Uridine-cytidine kinase of Novikoff ascites rat tumor// J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244, Iss. 8. P. 22042209.

123. Orengo A., Kobayashi S.H. Uridine-cytidine kinase from Novikoff ascites rat tumor and Bacillus stearothermophilus // Methods Enzymol. 1978. Vol. 51. P. 299307.

124. Orengo A., Saunders G.F. Regulation of a thermostable pyrimidine ribonucleoside kinase by cytidine triphosphate // Biochem. 1972. Vol. 11, N 10. P. 1761-1767.

125. Palella T.D., Andres C.M., Fox I.H. Human placental adenosine kinase // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, N 11. P. 5264-5269.

126. Pandey N.K. Transport of nucleic acid bases and nucleosides across the bacterial membrane // FEMS Microbiol. Letters. 1984. Vol. 21. P. 11-14.

127. Park I., Ives D.H. Properties of a highly purified mitochondrial deoxyguanosine kinase // Arch. Biochem. Biophys. 1988. Vol. 266, N 1. P. 51-60.

128. Payne M.R., Dancis J., Berman P.H., Balis M.E. Inosine kinase in leucocytes in Lesch-Nyhan patients // Exp. Cell Res. 1970. Vol. 59, N 3. P. 489-490.

129. Payne R.C., Cheng N., Traut T.W. Uridine kinase from Ehrlich ascites carcinoma. Purification and properties of homogeneous enzyme // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, N 18. P. 10242-10247.

130. Payne R.C., Traut T.W. Regulation of uridine kinase quaternary structure. Dissociation by the inhibitor CTP // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, N 21. P. 1248512488.

131. Perrier V., Surewicz W.K., Glaser P., Martineau L., Craescu C.T., Fabian H., Mantsch H.H., Barzu O., Gilles A.M. Zinc chelation and structural stability of adenylate kinase from Bacillus subtilis /I Biochem. 1994. Vol. 33, N 33. P. 99609967.

132. Petersen C. Inhibition of cellular growth by increased guanine nucleotide pools // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, N 9. P. 5348-5356.

133. Petit C.M., Koretke K.K. Characterization of Streptococcus pneumonia thymidylate kinase: steady-state kinetics of the forward reaction and isothermal titration calorimetry // Biochem. J. 2002. Vol. 363. P. 825-831.

134. Pollard P.C., Moriarty D.J.W. Validity of the tritiated thymidine method for estimating bacterial growth rates: measurement of isotope diluting during DNA synthesis // Appl. Envir. Microbiol. 1984. Vol. 48, N 6. P. 1076-1083.

135. Poulsen P., Jensen K.F., Valentin-Hansen P., Carlsson P., Lundberg L.D. Nucleotide sequence of the Escherichia colipyrE gene and of the DNA in front of the protein-coding region // Eur. J. Boichem. 1983. Vol. 135. P. 223-229.

136. Quirk P.G., Dunkley E.A. Jr., Lee P., Krulwich T.A. Identification of a putative Bacillus subtilis rho gene // J. Bacterid. 1993. Vol. 175, N 3. P. 647-654.

137. Robarts R.D., Wicks R.J., Sephton L.M. Spatial and temporal variations in bacterial macromolecule labeling with methyl- H. thymidine in a hypertrophic lake // Appl. Envir. Microbiol. 1986. Vol. 52, N 6. P. 1368-1373.

138. Rohde W., Lezius A.G. The purification of thymidine kinase from Escherichia coli by affinity chromatography // Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1971. Vol. 352, N 11. P. 1507-1516.

139. Ropp P.A., Traut T.W. Uridine kinase: altered enzyme with decreased affinities for uridine and CTP // Arch. Biochem. Biophys. 1998. Vol. 359. N 1. P. 6368.

140. Rossi M., Woodward D.O. Enzymes of deoxythymidine triphosphate biosynthesis in Neurospora crassa mitochondria // J. Bacteriol. 1975. Vol. 121. P. 640-647;

141. Rotllan P., Miras Portugal M.T. Adenosine kinase from bovine adrenal medulla // Eur. J. Biochem. 1985. Vol. 151, N 2. P. 365-371.

142. Ruffner B.W., Anderson E.P. Adenosine triphosphate: uridine monophosphate-cytidine monophosphate phosphotransferase from Tetrahymena pyriformis H J. Biol. Ghem. 1969. Vol. 244, N 21. P. 5994-6092.

143. Saito H., Tomioka H., Ohkido S. Further studies on thymidine kinase: distribution pattern of the enzyme in bacteria // J. Gen. Microbiol. 1985. Vol. 131. P. 3091-3098.

144. Schekman R., Weiner A., Kornberg A. Multienzyme systems of DNA replication // Science. 1974. Vol. 186, N 4168. P. 987-993.

145. Schirmer R.H., Thuma E. Sensitivity of adenylate kinase isozymes from normal and dystrophic human muscle to sulphhydrile reagents // Biochim. Biophys. Acta. 1972. Vol. 268, N 1. P. 92-97.

146. Schneider B., Sarfati R., Deville-Bonne D., Veron M. Role of nucleoside diphosphate kinase in the activation of anti-HIV nucleoside analogs // J. Bioenerg. Biomembr. 2000. Vol. 32, N 3. P. 317-324.

147. Scholtissek C. Nucleotide metabolism in tissue culture cells at low temperatures. 3. Studies in vitro // Biochim. Biophys. Acta. 1968. Vol. 155, N 1. P. 14-23.

148. Scott E.M., Wright R.C. Kinetics and equilibria of pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from human erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 571, N l.P. 45-54.

149. Seagrave J., Reyes P. Pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from rat bone marrow cells: a kinetic analysis of the reaction mechanism // Arch. Biochem. Biophys. 1987. Vol. 254. P. 518-525.

150. Servias P., Martinez J., Billen G., Vives-Rego J. Determining H.thymidine incorporation into bacterioplankton DNA: improvement of the method by DNase treatment // Appl. Environ. Microbiol. 1987. Vol. 53, N 8. P. 1977-1979.

151. Sherley J.L., Kelly T.J. Human cytosolic thymidine kinase // J. Biol. Chem.1988. Vol. 263, N 1. P. 375-382.

152. Shimono H., Sugino Y. Metabolism of deoxyribonucleotides. Purification and properties of deoxyguanosine monophosphokinase of calf thymus // Eur. J. Biochem. 1971. Vol. 19, N2. P. 256-263.

153. Shirae H., Yokozeki K. Purification and properties of purine nucleoside phosphorylase from Brevibacterium acetylicum ATCC 954 // Agric. Biol. Chem. 1991. Vol. 55, N 2. P. 493-499.

154. Speed R.R., Winkler H.H. Acquisition of thymidylate by the obligate intracytoplasmic bacterium Rickettsiaprowazekii // J. Bacteriol. 1991. Vol. 173, N 5. P. 1704-1710.

155. Stayton M.M., Rudolph F.B., Fromm H.J. Regulation, genetics, and properties of adenylosuccinate synthetase: a review // Curr. Top. Cell. Regul: 1983. Vol. 22. P. 104-141.

156. Stolworthy T.S., Black M.E. The mouse guanylate kinase double mutant E72Q/D103N is a functional adenylate kinase // Protein. Engineering. 2001. Vol. 14, N 11. P. 903-909.

157. Streeter D.G., Simon L.N., Robins R.K., Miller J.P. The phosphorylation of ribavirin by deoxyadenosine kinase from rat liver. Differentiation between adenosine and deoxyadenosine kinase // Biochem. 1974. Vol: 13, N 22. P. 4543-4549.

158. Strosselli S., Spadari S., Walker R.T., Basnak I., Focher F. Trichomonas vaginalis thymidine kinase: purification, characterization and search for inhibitors // Biochem. J. 1998. Vol. 334. P. 15-22.

159. Taylor A.T., Stafford M.A., Jones O.W. Properties of thymidine kinase partially purified from human fetal and adult tissue // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247, N 6. P. 1930-1935.

160. Tomasselli A.G., Noda L.H. Mitochondrial ATPrAMP phosphotransferase from beef heart: purification and properties // Eur. J. Biochem. 1980. Vol. 103, N 3. P. 481-491.

161. Tsuboi K.K., Chervenka G.H. Adenylate kinase of human erythrocyte. Isolation and properties of the predominant inherited form // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250, NT. P. 132-140.

162. Tsukamoto I., Taniguchi Y., Miyoshi M., Kojo S. Purification and characterization of thymidine kinase from regenerating rat liver // Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1079, N 3. P. 348-352.

163. Upton C., McFadden G. Identification and nucleotide sequence of the thymidine kinase gene of Shope fibroma virus // J. Virol. 1986. Vol. 60, N 3. P. 920927.

164. Usuda Y., Kawasaki H., Shimaoka M., Utagawa T. Characterization of guanosine kinase from Brevibacterium acetylicum ATCC 953 // Biochim. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1341, N 2. P. 200-206.

165. Usuda Y., Kawasaki H., Shimaoka M., Utagawa T. Molecular characterization of guanosine kinase gene from a facultative alkalophile, Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652 // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1442, N 2-3. P. 373-379.

166. Valentin-Hansen P. Uridine-cytidine kinase from Escherichia coli II Methods Enzymol. 1978. Vol. 51. P. 308-314.

167. Van der Ende A., Baker T.A., Ogawa T., Kornberg A. Initiation of enzymatic replication at the origin of th&Escherichiacoli chromosome: primase is the sole priming enzyme // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82, Iss. 12. P. 3954-3958.

168. Van Rompay A.R., Johansson M., Karlsson A. Substrate specificity and phosphorylation of antiviral and anticancer nucleoside analogues by human deoxyribonucleoside kinases and ribonucleoside kinases // Pharmacol. Ther. 2003. Vol. 100, N2. P. 119-139.

169. Van Rompay A.R., Norda A., Linden K., Johansson M., Karlsson A. Phosphorylation of uridine and cytidine nucleoside analogs by two human uridine-cytidine kinases // Mol. Pharmacol. 2001. Vol. 59, N 5. P. 1181-1186.

170. Van Rompay A.R., Johansson M., Karlsson A. Phosphorylation of deoxycytidine analog monophosphates by UMP-CMP kinase: molecular characterization of the human enzyme // Mol. Pharm. 1999. Vol. 56. P. 562-569.

171. Wang J.C. DNA Topoisomerases // Annu. Rev. Biochem. 1996. Vol. 65. P. 635-692.

172. Wang J.C. Moving one DNA double helix through another by a type II DNA topoisomerase: the story of a simple molecular machine // Q. Rev. Biophys. 1998. Vol. 31, N2. P. 107-144.

173. Wang L., Westberg J., Bolske G., Eriksson S. Novel deoxynucleoside-phosphorylating enzymes in mycoplasmas: evidence for efficient utilization of deoxynucleosides // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 42, N 4. P. 1065-1073.

174. Wang L.M., Kucera G.L., Capizzi R.L. Purification and characterization of deoxycytidine kinase from acute myeloid leukemia cell mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1202, N 2. P. 309-316.

175. Wiesmuller L., Noegel A.A., Barzu O., Gerisch G., Schleicher M. cDNA-derived sequence of UMP-CMP kinase from Dictyostelium discoideum and expression of the enzyme in Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 6339-6345.

176. Wild K., Bohner T., Folkers G., Schulz G.E. The structures of thymidine kinase ivom Herpes simplex virus type 1 in complex with substrates and a substrate analogue // Prot. Sei. 1997. Vol. 6. P. 2097-2106.

177. Wheeler P.R. Enzymes for purine synthesis and scavenging in pathogenic mycobacteria and their distribution in Mycobacterium leprae H i. Gen. Microbiol. 1987. Vol. 133. P. 3013-3018.

178. Wolfson J., Dressler D. Bacteriophage T7 DNA replication. An electron microscopic study of the growing point and the role of the T7 gene 4 protein in the formation of DNA fragments // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254, N 20. P. 10490-10495.

179. Wolfson J., Dressler D. Regions of single-stranded DNA in the growing points of replicating bacteriophage T7 chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1972. Vol. 69, N 9. P. 2682-2686.

180. World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms. 4 ed. 1993. WFCC WDCM

181. Xiao-Bing L.V., Hai-Zhen W.U., Jiang Y.E., Yi F., Hui-Zhan Z. Expression, purification, and characterization of recombinant Saccharomyces cerevisiae adenosine kinase // Acta Biochim. Biophys. Sin. 2003. Vol. 35, N 7. P. 666-670.

182. Yamada Y., Goto H., Ogasawara N. Adenosine kinase from human liver // Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 660, N l.P. 36-43.

183. Yamada Y., Goto H., Ogasawara N. Deoxyguanosine kinase from human placenta//Biochim. Biophys. Acta. 1982. Vol. 709, N 2. P. 265-272.

184. Yu L., Mack J., Hajduk P.J., Kakavas S.J., Saiki A.Y.C., Lerner C.G., Olejniczak E.T. Solution structure and function of an essential CMP kinase of Streptococcus pneumoniae /'! Prot. Science. 2003. Vol: 12. P. 2613-2621.

185. Дубинина И.Г., Шкурко B.F., Ворновицкая Г.И. Выделение и свойства уридинкиназы из клеток гепатомы Зайделя // Биохимия. 1981. Т. 46, № 10. С. 1905-1915.

186. Корнберг А. Синтез ДНК. М.: Мир. 1977. 360 С.

187. Краевский А.А., Куханова М.К. Репликация ДНК у эукариот // "Молекулярная биология" (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М. 1986. Т. 22. С. 5-132.

188. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Экология иерсиний и иерсиниозы // Окружающая среда и здоровье населения Владивостока. Владивосток: Дальнаука. 1998. С. 154-164.

189. Михайлов В.В., Терентьев Л. Л., Терентьева Н.А. Морские микроорганизмы и их ферменты. Владивосток: Дальнаука. 2004. 230 С.

190. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. 536 С.

191. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. Психрофильность патогенных бактерий. Новосибирск. Наука. 1991. 203 С.

192. Терентьев Л.Л., Терентьева Н.А., Рассказов В;А. Выделение и некоторые свойства тимидилаткиназы морского ежа // Биохимия. 1999. Т. 64, Вып. 1. С. 99-105.

193. Терентьева Н.А., Немцева Ю.А., Шевченко Л.С., Терентьев Л.Л., Михайлов В.В., Рассказов В.А. Поиск высокоактивных продуцентов тимидин-и уридинкиназ среди морских микроорганизмов // Биотехнология. 2002. № 3. С. 3-12.

194. Тимофеева А.А., Евсеева Т.И., Щербина Р.Д., Федоров Л.И. О природной очаговости и эпидемиологических особенностях псевдотуберкулеза на147 *

195. Сахалине и Курильских островах // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1974. № 12. С. 11-17.

196. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова JI.C., Сомова-Исачкова JI.M. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток: ОАО «Примполиграфкомбинат», 2004. 220 С.

Информация о работе

Немцева, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Использование экзогенных предшественников в биосинтезе нуклеиновых кислот и ферменты фосфорилирования нуклеозидов в клетках морских бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы