Использование ДНК-маркеров в селекционно-генетических исследованиях риса

Супрун, Иван Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Использование ДНК-маркеров в селекционно-генетических исследованиях риса
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Использование ДНК-маркеров в селекционно-генетических исследованиях риса"

Супрун Иван Иванович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ РИСА

Специальность 06 01 05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2005

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте риса в 2001-2004 гг.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Мухина Жанна Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Трошин Леонид Петрович

кандидат биологических наук Давоян Румик Оганесович

Ведущая организация:

Кубанский государственный университет

Защита состоится «25» января 2005 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 026.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте риса по адресу: 350921, г. Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского Научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан 23 декабря 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Гончарова Ю.К.

(

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выведение новых сортов сельскохозяйственных культур, в том числе и риса, основано на использовании природного или созданного человеком генетического разнообразия. Для обнаружения, оценки и охраны этого разнообразия, отбора растений, несущих хозяйственно ценные признаки, и отслеживания этих признаков в процессе селекции и в семеноводстве используют легко распознаваемые фенотипические проявления генов - маркеры.

Издавна применяемые в этих целях морфологические и биохимические маркерные признаки указывают на особенности формы, окраски или биохимического состава растения. Число их не так уж и велико, к тому же полигенная структура многих признаков строения и состава растений ограничивает возможности генетического картирования агрономически важных генов и контроля над переносом этих генов в новые формы растений [Хавкин Э.Е. 1997].

Развитие методов молекулярной биологии, в частности, таких как: рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР)- амплификация ДНК, сиквенирование ДНК (определение нуклеотидной последовательности) привело к появлению нового класса молекулярно-генетических маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям, входящих непосредственно в структуру агрономически важного гена или сцепленных с этим геном.

Возможности ДНК-маркеров во много раз превосходят потенциал изоферментов или запасных белков. Кроме того, проявление таких молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является тканеспецифичным и их можно обнаружить на любой стадии развития растений [Хавкин Э.Е. 1997].

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка эффективных методов оценки и отбора исходного материала для использования в селекционном процессе, основанных на полиморфизме ДНК-маркеров. В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИриса с использованием полиморфизма микросателлитных локусов ДНК в качестве маркерной системы.

2. На основании данных микросателлитного анализа сгруппировать сорта в соответствии со степенью генетического родства.

3. Изучить перспективность применения полиморфизма микросателлитных локусов для идентификации сортов.

4. Оценить возможность использования молекулярного полиморфизма Waxy-гена, детерминирующего содержание амилозы в зерновке как маркерной системы для ранжирования сортов риса по признаку «содержание амилозы в эндосперме зерновки».

5. В рамках программы по картированию локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу провести оценку уровня микросателлитного полиморфизма между отечественным сортом риса Белозерный и сортом Мороберекан, несущим локусы количественной устойчивости к указанному патогену.

Научная новизна исследований. В настоящей работе впервые: проведена идентификация сортов коллекции ВНИИриса на основе данных об аллельном разнообразии микросателлитных маркеров;

выполнена оценка генетического родства сортов риса отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров;

исследована корреляции между аллельными состояниями микросателлитного локуса первого интрона и сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена с признаком содержание амилозы в эндосперме у отечественных сортов риса;

при изучении полиморфизма микросателлитного локуса Waxy-гена впервые выявлен аллель с количеством СТ-повторов равным 21;

проведен анализ генетического полиморфизма между сортами Мороберекан и Белозерный на уровне ДНК с использованием микросателлитных маркеров и отобраны маркеры, необходимые для ведения маркерной селекции на устойчивость к пирикуляриозу.

Научно-практическая ценность работы. Информация о степени генетического родства сортов коллекции ВНИИриса, полученная по данным микросатенитного анализа, облегчит подбор родительских пар при гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве, избегая при этом скрещивания генетически близких сортов, что позволит повысить эффективность селекционного процесса.

Показана возможность использования полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена как эффективной маркерной системы для разделения отечественных сортов риса на группы по содержанию более 20% и менее 20% амилозы минуя технологическую оценку зерна. Выявленный аллель микросатенитного локуса первого интрона Waxy-гена с количеством СТ повторов 21 дополняет знания об его аллельном разнообразии.

Степень генетического полиморфизма между сортами Мороберекан и Белозерный, выявленная по данным микросателлитного анализа, говорит о возможности их использования в картировании локусов устойчивости к пирикуляриозу. Также отобраны микросателлитные маркеры, необходимые для выполнения указанного исследования, и ведения маркерной селекции по признаку устойчивость к пирикуляриозу

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на международной научно-практической конференции « Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г.); международной конференции « Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» (Turin, Italy, 15-17 September 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов « Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Анапа, 27-30 сентября 2004 г.); на методических советах Всероссийского НИИ риса 2001-2004 г.г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 112 страницах, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 171 наименование, в том числе 146 иностранных авторов.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились с 2001 г. по 2004 г. в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института риса и в лаборатории генетических ресурсов Национального института агробиологических наук г. Тсукуба, Япония в 2003 году.

Для проведения исследований по оценке генетического родства с использованием микросателлитного анализа были взяты сорта и сортообразцы риса из коллекции ВНИИриса и ВИР. В экспериментах по изучению молекулярного полиморфизма Waxy гена использовали сорта с различным содержанием амилозы. В качестве исходных форм для анализа полиморфизма микросателлитных локусов и отбора микросателлитных маркеров для картирования локусов устойчивости к пирикуляриозу был использован сорт Мороберекан, несущий локусы горизонтальной устойчивости, и сорт риса отечественной селекции - Белозерный.

Для выделения ДНК использовали бесхлорофилльные семидневные проростки, получаемые путем инкубации зерновок на увлажненной фильтровальной бумаге в темноте, при температуре 25-27С0.

Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод [Murray M.G., Thompson W.F. 1980].

В связи с пониженной всхожестью семян сортов Balilla и Balilla grana grosso, использованных в работе по оценке генетического разнообразия сортов риса, ДНК этих образцов была экстрагирована непосредственно из зерновок с использованием ацетата калия для очистки от белков [ Kang H.W. et al., 1998].

Концентрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрически по стандартной методике [Маниатис и др., 1984], а также по интенсивности окрашивания ДНК бромистым этидием в агарозном геле [Остерман Л.А. 1981].

Для анализа генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИриса были использованы 14 нейтральных микросателлитных(SSR) маркеров, отобранных в базе данных www.gramene.org.

В ходе оценки степени полиморфизма между сортами Белозерный и Мороберекан было использовано 468 SSR-маркеров, равномерно распределенных на генетической карте риса. При исследовании молекулярного полиморфизма Waxy гена использовали следующие праймерные пары: для синтеза участка интрона 1, содержащего микросателлитный локус; OLIGO 484- 5' CTTTGTCTATCTCAAGACAC 3' OLIGO 485- 5' TTGCAGATGTTCTTCCTGATG 3'

Для синтеза участка Waxy-гена, включающего сайт сплайсинга, и определения единичной замены нуклеотида в данной области.

ОЬЮО 484, W2R- 5' ТТТССЛОСССЛЛСЛССТТЛС 3',

С целью детекции agGtata<->agTtata полиморфизма области сайта сплайсинга интрона 1 использовали эндонуклеазу рестрикции Асс\

В ходе работы по отбору микросателлитных маркеров, полиморфных между сортами Белозерный и Мороберекан для всех маркеров были использованы одинаковые условия ПЦР, позволяющие получить максимальное количество продукта реакции. 9 минут при 94°С - начальная денатурация, след>ющи\ 35 циклов 30 секунд денатурация при 94°С, 1 минута отжиг праймеров при 55°С, 2 минуты синтез при 72°С; последний цикл синтеза 5 минут при 72°С.

ПЦР смесь включала 10 нг ДНК, 2,5 тМ ]^С12, 0,2 тМ дезокситуклеотидтрифосфатов (ёМТРБ), 50 тМ КС1, 10 тМ Tгis-HCI, рН 9,0, 0,1% Тритон Х-100, 0,23иМ каждого праймера, 0,25 единицы Тад-полимеразы, в общем объеме 5мкл

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 3% агарозном геле, на основе Трис-боратного буфера (ТБЕ) при напряжении 120У в течение 2,5 часов Визуализацию проводили в ультрафиолете после окрашивания гелей бромистым этидисм.

Определение степени генетического родства с применением микросателлитных маркеров экспериментально были подобраны оптимальные условия ПЦР, обеспечивающие высокий выход амплифицированного продукта наряду с минимальным количеством неспецифики: 5 минут при 94°С-начальная денатурация, след>ющи\ 30 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 30 секунд отжиг праймеров при №С, 30 секунд синтез при 72°С, последний цикл синтеза 3 минуты при 72°С. Где К=: 51°С для маркеров RM1, RM7, RM13, RM17, RM19, RM70, 54°С для маркеров RM11, RM18, RM20, RM168, 56°Сдля маркеров RM122, RM164; 59°С для маркеров RM148, RM167.

В состав ПЦР смеси входили 40 нг ДНК, 0,05мМ dNTPs, 0,2цМ каждого праймера. 1 единица Тад-полимеразы, 25 mM КС1, 60 тМ Tгis-HCI, рН 8,5, 0,1% Тритон Х-100, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, 1,5мМ MgCI2, в общем объеме реакционной смеси 25мкл.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8% акриламидный гель на основе ГБЕ Электрофорез проводили при напряжении 250У в течение 3 часов. Визуализацию проводили в ультрафиолете после окрашивания гелей бромистым огидием

При анализе молекулярного полиморфизма Waxy гена использовали условия ПЦР, оптимизированные непосредственно для праймерных пар OLIG0484 - OLIGO 485 и OLIGO 484 - W2R. 4 минуты при 94°С- начальная денатурация, следующих 35 циклов: 45 секунд денатурация при 94°С,30 секунд отжиг праймеров при 55°С, 1 минута синтез при 72°С: последний цикл синтеза 5 минут при 72°С.

ПЦР смесь включала 10 нг тотальной ДНК, 2,5 mM MgCI2, 0,2 my dNTPs, 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI, рН 9,0. 0,1% Тритон Х-100, 0,2цМ каждого праймера. 0,25единицы Taq-полимеразы. в общем объеме 5мкл.

Для идентификации аллелей микросатсллитного локуса проводили электрофоретическое разделение продуктов амплификации с праймерной парой OLIGO484 - OLIGO 485 в денатурирующем 8% полиакриламидном геле, на основе ТБЕ, содержащем 7М мочевины в качестве денатурирующего агента. Электрофорез вели при напряжении 2000V в течение 1,5 часа. Гель, окрашивали нитратом серебра, согласно инструкции, прилагаемой к наборам для окрашивания гелей фирмы Amersham Biosciences и фотографировали с помощью системы гель-документирования Bio-Print.

Для детекции единичной замены нуклеотидов в области сайта сплайсинга проводили рестриктную обработку продуктов амплификации с праймерами OLIGO484 и W2R рестриктазой Accl. Для этого 1 мкл продуктов ПЦР вносили в рестриктную смесь, содержащую 50 мМ ацетата калия, 20 мМ трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 1 единицу активности рестриктазы в объеме 5 мкл. Инкубацию проводили при 37С° в течение 5 часов.

Продукты рестрикции анализировали путем электрофореза в 2% агарозном геле на основе ТБЕ при напряжении 120 вольт, в течение 1,5 часа и визуализировали бромистым этидием.

Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1.

Статистическая обработка данных была выполнена в программе STATISTICA 6.0.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Анализ полиморфизма микросателлитных локусов между сортами Мороберекан и Белозерный в рамках исследований по картированию локусов устойчивости к пирикуляриозу

При выполнении QTL-анализа и маркерной селекции самым первым и одним из наиболее важных этапов является отбор маркеров, полиморфных между выбранными для исследования сортами, и определение степени полиморфизма между этими сортами, так как при выявлении низкого полиморфизма между родительскими генотипами, исключается возможность их использования для картирования количественных локусов.

Число полиморфных маркеров в работах такого рода наиболее часто составляет 100-150 или 30-50% от общего количества использованных при оценке полиморфизма [Yano M. and Sasaki Т., 1997].

При отборе учитывают следующие требования: маркеры должны быть по возможности равномерно распределены по геному, с наибольшим насыщением областей расположения локусов интереса. Это позволяет более эффективно контролировать внедрение требуемых участков генома в сорт реципиент. Также маркеры должны иметь ярко выраженную разницу в размере аллелей, что выражается в различии размеров продуктов ПЦР каждого конкретного маркера при электрофоретическом разделении, и хорошо амплифицироваться, для четкой идентификации родительских аллелей в ходе маркерной селекции.

В связи с этим данное исследование можно условно разделить на 2 этапа. На первом этапе оценили полиморфизм по максимально возможному количеству микросателлитных локусов между исследуемыми сортами, при этом старались максимально насытить области расположения локусов горизонтальной устойчивости к пирикуляриозу, картированные Wang G.L. et. al. в 1994 г. у сорта Мороберекан.

На втором этапе было проанализировано качество продуктов ПЦР и степень различия размеров аллелей, с учетом позиции маркеров на генетической карте риса.

Из 468 микросателлитных маркеров полиморфными оказались 177 маркеров, что составляет 37,8 процентов (табл.1).

Таблица 1. Распределение полиморфных маркеров на хромосомах риса

Хромосома Полиморфные маркеры Общее количество %

1 16 58 27,5

2 17 38 44

3 16 42 38

4 30 68 44

5 12 31 38,7

6 8 36 22

7 29 60 48

8 9 30 30

9 4 13 30

10 8 17 47

11 17 38 44

12 11 37 29

Суммарно 177 468 37,8

Из 177 полиморфных между сортами Белозерный и Мороберекан было отобрано 119 маркеров для дальнейшего использования в рТЬ-анализе, основываясь на качестве ПЦР-продукта, величине разницы размеров микросателлитной последовательности и их позиции на генетической карте.

Генетический полиморфизм на хромосомах 2,4, 7, 10 и 11 был выше, чем в других хромосомах: 44, 44, 48, 47 и 44% соответственно. Эти расхождения в степени полиморфизма каждой из хромосом могут быть объяснены различным уровнем сходства хромосом, который определяется различиями в происхождении сортов Мороберекан и Белозерный.

Маркеры, локализованные у областей рТЬ8, проявили более высокий уровень полиморфизма между родительскими сортами (50,6%) , чем в других областях генома (35,3%). Достоверность различий была определена при использовании модифицированного критерия Стьюдента для долей. Расчетное значение критерия оказалось равным 2,49 (1=2,49), и превышало стандартное (^=1,96), что говорит об отклонении ноль-гипотезы (Р<0,05), и о достоверности различий.

Наиболее высокий генетический полиморфизм у областей QTLs устойчивости к пирикуляриозу, выявленный микросателлитными маркерами, вероятнее всего объясняется разным уровнем устойчивости к патогену у исследуемых сортов.

На основе анализа полиморфизма между сортами Мороберекан и Белозерный с применением микросателлитных маркеров, можно судить о возможности их использования в качестве родительской пары в целях создания гибридной популяции для QTL-анализа локусов устойчивости к пирикуляриозу, который будет проведен на БЗ-популяции с применением 119 SSR маркеров, отобранных в данной работе.

3.2 Оценка возможности применения молекулярного полиморфизма Waxy-гена как маркерной системы в селекции риса по признаку содержание амилозы в зерновке.

В связи с тем, что содержание амилозы в эндосперме зерновки во многом обусловливает пищевые и технологические качества риса, данный признак находится в числе приоритетных и занимает одно из важных мест, как в мировой, так и в отечественной селекции риса.

Количество амилозы в эндосперме детерминируется Waxy геном, который расположен на шестой хромосоме, и кодирует синтазу гранулированного крахмала {granule-bound starch syntase=GBSS=Wx-protein).

Разработка маркерных систем на основе полиморфизма микросателлитного локуса первого интрона Waxy-гена и полиморфизма его 5' области сайта сплайсинга ведется в течение уже нескольких лет исследователями многих стран.

В ходе исследования у 10 сортов риса отечественной селекции с различным содержанием амилозы было выявлено два ранее известных аллеля микросателлитного локуса Waxy-гена с количеством СТ повторов-(СТ)п равным 18, 19 [Blight H.F J. et al., 1995; Ayres N. M et al., 1997; Bao J.S.et a!., 2002]. Кроме этого, впервые был обнаружен аллель с количеством СТ повторов в микросателлитной последовательности равным 21 у сорта КПСУ 0174 с содержанием амилозы 25% (табл.2).

Аллель с количеством СТ повторов 19 был выявлен у сортов Регул, Рапан, Серпантин, КПСУ 0276, Индус, ВНИИР 10102, КПСУ 02111, имеющих различное содержание амилозы в эндосперме зерновки (15,18,20%).

У сортов Виола и КПСУ 02107, которые резко отличаются по данному признаку: <2% и 25%, соответственно, в последовательности данного

микросателлитного локуса обнаружили (СТ)п=18. Но у сорта КПСУ 0174, содержащего также 25% амилозы, количество (СТ) повторов было равным 21.

Таблица 2. Полиморфизм микросателлитного локуса и сайта сплайсинга 'аху-гена у сортов риса с различным содержанием амилозы.

Сорт Содержание Количество G-T

амилозы(%) СТ повторов замена

1 КПСУ0276 15 19 Т

2 Регул 18-20 19 Т

3 Рапан 18-20 19 Т

4 Серпантин 20 19 Т

5 Виола <2 18 Т

6 Индус 18-20 19 Т

7 КПСУ0174 25 21 G

8 КПСУ02107 25 18 G

9 ВНИИР10102 18-20 19 Т

10 КПСУ02111 15 19 Т

В исследованиях Ayres N.M. et.al. (1997) микросателлитный аллель с количеством СТ повторов 18 был обнаружен у сортов с содержанием амилозы 14-19%. В работе по изучению сортов риса с содержанием амилозы 0-2% выявили аллели микросателлитного локуса с количеством СТ повторов равным 18 и 19 [Han Y.et al., 2003].

Но, как было отмечено выше, в результате исследования отечественных сортов риса такое число повторов было обнаружено у сортов с содержанием амилозы <2% и 25%.

По результатам исследования у семи сортов с числом СТ повторов 19 (КПСУ0276, Регул, Рапан, Серпантин, Индус, ВНИИР10102, КПСУ 02111) количество амилозы варьировало в пределах 15-20%. В ряде других работ этот микросателлитный аллель был выявлен у сортов с содержанием амилозы 01,5%, 15% [Ayres N.M. et.al., 1997; Han Y. et al, 2003].

Frances H. et al (1998) выявил у сортов с содержанием амилозы 15% (СТ)п=18, 17, в то время как у российских сортов риса, с аналогичными значениями по указанному признаку, количество СТ повторов было равным 19.

Отсутствие корреляции между числом СТ - повторов в микросателлитной последовательности первого интрона Waxy-гена и

содержанием амилозы у исследованных нами сортов, говорит о неперспективности использования полиморфизма данного микросателлитного локуса как маркерной системы для ранжирования сортов риса отечественной селекции по признаку содержание амилозы в эндосперме зерновки .

Более того, принимая во внимание данные исследований на образцах риса из других географических зон, можно сделать предположение о том, что микросателлитный локус первого интрона Waxy-гена не оказывает влияния на содержание амилозы, а данные полученные Ayres N.M. et al 1997 свидетельствуют лишь о корреляции между числом СТ — повторов и содержанием амилозы у сортов риса североамериканской селекции.

При проведении анализа 5' области сайта сплайсинга Waxy-гена у отечественных сортов с содержанием амилозы более чем 20% была выявлена последовательность agGtata, в то время как у сортов с содержанием амилозы ниже 20% - agTtata (табл.2).

Продукты ПЦР реакции с праймерами, фланкирующими область сайта сплайсинга были подвергнуты обработке рестриктазой Accl, и можно видеть, что характер электрофоретического разделения продуктов рестрикции (рис.1) у сортов КПСУ0174, КПСУ02107 с содержанием амилозы более 20% (№7 и №8) четко отличим от такового у остальных сортов, содержащих менее 20% амилозы.

1234 56 789 10

Рисунок 1. Электрофорез продуктов рестрикции 5'области сайта сплайсинга Waxy-гена рестриктазой Accl Примечание. 1-КПС10276,2-Регул, З-Рапан, 4-Серпантин, 5-Виола, б-Индус, 7-КПСУ0174,8-КПСУ02107,9-ВНИИР10102,10-КПСУ02111.

Различия в миграции продуктов рестрикции рестриктазой Accl обусловлены тем, что нуклеотидная последовательность agGtata входит в состав сайта рестрикции данной рестриктазы, и при ее изменении на agTtata, последовательность не подвергается расщеплению рестриктазой, что и

приводит к разнице в скорости миграции продуктов рестрикции при электрофорезе. Благодаря чему и представляется возможность различать сорта риса с заменой нуклеотида в данной области генома.

Для проверки достоверности взаимосвязи признака содержание амилозы с заменой нуклеотида G—>Т был использован коэффициент корреляции рангов Спирмена. Он оказался равен 0,72 при Р<0,05, что говорит о достоверности результата. Для выполнения расчетов был осуществлен перевод обозначений нуклеотидов в числовые значения: Т-1, G-2, таким образом признаку была придана количественная оценка.

Насколько известно, возможность четкой интерпретации результатов является одним из главных требований к молекулярным маркерам. При оценке отечественных сортов риса с различным содержанием амилозы, полиморфизм сайта сплайсинга показал себя как эффективная маркерная система для разделения сорпов на содержащие более 20% и менее 20%, что может быть востребовано в селекции на высокое содержание амилозы.

3.3 Анализ генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИриса с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров

При работе с генетическими ресурсами растений микросателлитные маркеры могут быть использованы в различных целях. Среди наиболее значимых можно выделить следующие: определение структуры коллекции и степени родства генотипов для наиболее эффективного подбора родительских пар при гибридизации, определение, идентификация и регистрация образцов коллекции, идентификация и регистрация источников и доноров ценных признаков, решение спорных вопросов авторства сортов и образцов растений [Конарев А.В. 1998].

Высокий уровень полиморфизма, выявляемый SSR-маркерами, определяет ценность этой маркерной системы позволяет говорить о возможности ее использования для оценки генетической изменчивости между сортами риса, и быстрой и достоверной идентификации сортов для определения гибридной чистоты семян и идентификации родительских аллелей.

Идентификация и паспортизация сортов выполняется на основании данных об аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого сорта.

В работах по изучению генетического разнообразия коллекций сортов риса зачастую используется относительно небольшой набор микросателлитов -порядка 15 маркеров [Luce С. et al 2000].

Наиболее вероятно, что это обусловлено высокой степенью их полиморфности.

В связи с этим для оценки степени генетического сходства среди избранных нами сортов коллекции ВНИИриса, и составления их ДНК-фингерпринта, было использовано 14 нейтральных, т.е. не сцепленных с каким либо геном, микросателлитных маркеров, отобранных исходя из принципа максимального полиморфизма, основываясь на информации из баз данных vwvw.gramene.org. и www.cornell.edu.org.

Из использованных в работе 14 маркеров наиболее высокий уровень полиморфизма по результатам анализа выборки из 39 сортов, показали маркеры RM 1, RM11, RM70, RM122, RM164,- 8, 7, 12, 8, 17 аллелей пэ каждому из маркируемых ло кусов, соответственно (табл.3).

Таблица 3. Аллельное разнообразие использованных в рг.боте микросателлитных маркеров

Маркер Тип Молекулярный Число

повтора вес (п.н.) выявленных аллелей

RVI1 (GA)n 89-103 8

RM7 (GA)n 176-182 4

RM11 (GA)n 121-133 7

RM13 (GA)n 131-161 4

RM17 (GA)n 174-180 4

RM18 (GA)n 159-165 4

RM19 (ATC)n 219-228 4

RM20 (ATT)n 216-222 .3

RM70 (ATT)n 140-188 12

RM122 (GAA)n 227-241 8

RM148 (GT)n 131-137 4

RM164 (GT)n 266-334 17

RM167 (GA)n 123-153 6

RM168 (T)n(GT)n 94-100 6

Примечание: информация о типе повтора, входящего в состав макросателлитной последовательности, доступна на сайте www.gramene.org.

Как видно из таблицы 3, маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от трех до семнадцати аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по маркерам ЯМ70 и ЯМ164.

Варьирование размеров аллелей данных микросателлитных локусов в широких пределах (ИМ70: 140-188 пар нуклеотидов; ЯМ164: 266-334 пар нуклеотидов) обусловливает высокий полиморфизм этих маркеров.

Из остальных маркеров можно условно выделить две основные группы исходя из уровня проявленного полиморфизма. К первой относятся следующие: ИМ 1, ИМ 11. ИМ 122, ИМ 167, ИМ 168. Количество аллелей, выявленных по ним, варьировало от 6 до 8 на один микросателлитный локус.

К группе маркеров, проявивших наиболее низкий уровень полиморфизма, принадлежат: ИМ7, ИМ13, ИМ17, ИМ18, ИМ19, ИМ20, ИМ148. По данным анализа 39 сортов из коллекции ВНИИриса, число аллелей на один локус было равным 4, и даже 3 (по маркеру ИМ20).

После идентификации аллелей и определения их размеров был проведен учет частоты встречаемости аллелей по каждому маркеру у исследованных сортов.

Нумерацию аллелей по каждому из маркеров проводили следующим образом: аллель с минимальным значением молекулярного ве;а принимали за нулевой и обозначали как 0, аллели с большим молекулярным весом нумеровали по разнице между ними и нулевым аллелем.

Такой способ нумерации аллелей широко применяется в исследованиях по изучению генетического разнообразия [Реу; Н. е! а1., 2001] , это позволяет более наглядно выражать разницу в размерах между аллелями каждого отдельно взятого микросателлитного маркера.

Кроме того, разница в размерах аллелей отображает генетическое сходство сортов, что объясняется путями эволюции микросателлитных последовательностей генома. Такая нумерация позволяет его учитывать при проведении статистической обработки данных.

По данным о частоте встречаемости аллелей представляется очевидным, что у большинства использованных в работе маркеров выявляются аллели, которые наиболее распространены у исследованных сортов (рис. 2, 3,4).

Рисунок 2. Частота аллелей микросателлитных маркеров КМ1, КМ7, ИМИ Примечание порядок аллелей маркеров слева направо КМ1-0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, ЯМ7-0, 2, 4, 6, ЯМ11-0, 2, 4, 6, 8,10, 12

Рисунок 3 Частота аллелей микросателлитных маркеров ИМ13, ИМ17, ИМ18, ИМ19, КМ20

Примечание порядок аллелей маркеров слева направо ЯМ13-0, 2, 26, 30, ЯМ 170, 2, 4, б ЯМ18-0, 2 4 6, ЯМ19-0, 3 6 9, ЯМ20-0, 3, б

Рисунок 4. Частота аллелей микросателлитных маркеров ЯМ148, ЯМ167,

ИМ168

Примечание порядок аллелеймаркеров слева направо-КИ148-0,2,4, 6; RM167-0,22,24,26,28,30, Ш168-0,2,3,4,5, б

Наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества сортов свидетельствует об относительной генетической их близости. Это вполне может являться следствием того, что различные группы сортов краснодарской селекции создавались на основе небольшого числа исходных популяций. Это и служит причиной ограниченного потенциала их генетической изменчивости.

Наряду с этим можно предположить, что аллели, наиболее распространенные у исследованных сортов, могут характеризовать общий морфотип растения риса, к получению которого стремились селекционеры в ходе выведения сортов, и вероятно, вполне оправдано при ведении отбора растений в ходе селекционного процесса учитывать наряду с комплексом морфофизиологических признаков и информацию об аллелях микросателлигных маркеров, использованных в данном исследовании.

По результатам микросателлитного анализа сортов были составлены их ДНК- паспорта, содержащие информацию о номере микросателлитного маркера и о его аллелях.

Среди всех изученных сортов не было обнаружено таковых с идентичным набором аллелей. Это свидетельствует о том, что микросателлитные маркеры обладают достаточным уровнем полиморфизма для использования их в сортовой идентификации. Помимо этого, полиморфизм микросателлитных маркеров может быть применим для выявления ложных гибридов на ранних этапах селекционного процесса.

Кроме того, при наличии ДНК-маркеров, сцепленных с генами интереса, возможна их идентификация в ходе селекционного процесса для отбора гибридов без фенотипической оценки, которая нередко бывает трудновыполнима.

На основании комплекса данных о частоте встречаемости аллелей у исследованных сортов и о размере аллелей, что отражено в их нумерации, была проведена оценка степени их генетического сходства. Для этой цели использовали кластерный анализ-метод основное назначение которого заключается в проведении классификации объектов.

Результаты кластеризации представлены на рисунке 5.

Анализ полученного в результате кластеризации иерархического дендрита позволяет выделить в выборке исследованных сортов две основные группы (кластера).

Рисунок 5. Кластерный анализ изученных сортов риса по данным микросателлитного анализа. К кластеру номер один отнесены сорта: Раздольный, Нарцисс, К-514, BaШla, Кендзо, Талисман, Краснодарский 3352, Курчанка, Юпитер, КПХ-1,

Виола, Славянец, Кубань 3, Лиман, Balilla grana grosso, Водолей, Вираж, Краснодарский 424, Фонтан, Спальник и сортообразец КП 157-02.

В состав второго кластера вошли сорта: Лидер, ВНИИР 8847, Хазар, Рапан, Серпантин, Аметист, ВНИИР 7887, Изумруд, Снежинка, Кулон, Лагуна, Дубовский 129, Стрелец, Спринт и сортообразцы КП 40-02, КП 9-01, КП 37-01, КП 27-02.

При рассмотрении генеалогии некоторых сортов, изученных в ходе данного исследования, становится очевидным, что их родительские формы отнесены в один с ними кластер. Прежде всего это касается рассмотренных выше сортов Славянец, Спальчик, К-514, Краснодарский 3352, Balilla, Balilla grano grosso, отнесенных к кластеру 1. Более того, все сорта генеалогии сортов Славянец и Спальчик (Балилла грана гроссо, Балилла, Краснодарский424, Краснодарский3352, К-514, Кендзо) отнесены с ними в один кластер, что также может свидетельствовать об объективности разделения на два кластера.

Следует также отметить сорта Лидер, Кулон, Рапан отнесенные к кластеру 2. У сортов Лидер и Рапан одна из родительских ферм общая - сорт Белозерный [Шиловский В.Н. и др., 2001]. Кроме того, у сорта Рапан вторая родительская форма - ВНИИР 8847 входит в этот кластер, а сорт Кулон, входящий в генеалогию сорта Лидер, отнесен в один с ним кластер.

Решение вопроса о достоверности межкластерных различий было выполнено в одном из многомерных статистических методов дискриминантном анализе. При разделении двух групп (кластеров) по условию анализа была получена только одна дискриминантная функция - наличие одной дискриминантной функции необходимо для достоверного разделения двух групп переменных (в данном случае двух кластеров). Ее анализ показал, что кластеры различаются статистически достоверно, о чем свидетельствует нулевое значение вероятности нуль- гипотезы.

В качестве подтверждения полученного результата рассмотрим распределение частот значений дискриминантной функции в каждой из групп (рис. 6).

Рисунок 6. Гистограмма распределения значений дискриминантнсй функции в

кластерах сортов

Из рисунка видно, что области распределения кластеров не перекрываются и одна из них (кластер 1) расположена в области отрицательных, другая (кластер 2) - в области положительных чисел. Эго также свидетельствует о достоверном разделении сортов на два кластера.

Проведенный в рамках данной работы анализ степени генетического родства между сортами коллекции ВНИИриса позволяет говорить об объективности данных, получаемых при использовании полиморфизма микросателлитных ДНК-маркеров

Информация о распределении сортов по признаку генетического родства может быть использована при подборе пар для гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в потомстве, что позволит повысить эффект ивность селекционного процесса.

ВЫВОДЫ

1. Уровень полиморфизма между сортами Мороберекан V Белозерный, выявленный в ходе исследования свидетельствует о возможности их использования в рТЬ-анализе локусов устойчивости к пирикуляриозу. Общий процент полиморфизма между ними равен 37,8%, что составляет 177 маркеров, из которых было отобрано 119 для использования в рТЬ- анализе и маркерной селекции по указанному признаку

2. Генетический полиморфизм на хромосомах 2, 4, 7, 10 и 11 был выше, чем в других хромосомах: 44, 44, 48, 47 и 44% соответственно. Эти расхождения в степени полиморфизма каждой из хромосом могут быть объяснены различным уровнем сходства хромосом, который определяется различиями в происхождении сортов Мороберекан и Белозерный.

3. Маркеры, локализованные в областях локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу, проявили достоверно более высокий уровень полиморфизма между родительскими сортами (50,6%), чем в других областях генома (35,3%). Наиболее высокий генетический полиморфизм в областях рТЬ устойчивости к пирикуляриозу, выявленный микросателлитными маркерами, вероятнее всего объясняется разным уровнем устойчивости у исследуемых сортов.

4. В ходе исследования у 10 сортов риса отечественной селекции с различным содержанием амилозы было выявлено три аллеля микросателлитного локуса 'аху-гена с количеством СТ повторов-(СТ)п равным 18, 19, 21. Аллель с количеством СТ повторов в микросателлитной последовательности равным 21 был обнаружен впервые.

5. Отсутствие корреляции между числом СТ - повторов в микросателлитной последовательности первого интрона ' аху-гена и содержанием амилозы у исследованных нами сортов, говорит о неперспективности использования полиморфизма данного микросателлитного локуса как маркерной системы для ранжирования сортов риса отечественной селекции по признаку содержание амилозы в эндосперме.

6. При проведении анализа 5' области сайта сплайсинга у отечественных сортов с содержанием амилозы более чем 20% была выявлена последовательность agGtata, в то время как у сортов с содержанием амилозы ниже 20% - agTtata. Достоверность взаимосвязи признака содержание амилозы с признаком G->T замена нуклеотида подтверждена проверкой по коэффициенту корреляции рангов Спирмена. Его значение оказалось равным 0,72 при Р<0,05, что говорит о достоверности результата.

7. Возможность четкой интерпретации результатов и достоверность полученных данных свидетельствуют о возможности использования полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона ' аху-гена как эффективной маркерной системы для разделения сортов на содержащие более 20% и менее 20% амилозы, что может быть востребовано в селекции высокоамилозных сортов.

8. У 14 микросателлитных маркеров, использованных в работе по изучению генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИ риса, был обнаружен различный уровень полиморфизма: от трех до семнадцати аллелей на один микросателлитный локус. Наиболее высокий уровень полиморфизма по результатам анализа показали маркеры ЯМ1, ИМИ, ЯМ70, ЯМ122, ЯМ164, - 8, 7,12,8,17 аллелей по каждому из маркируемых локусов соответственно.

9. На основании данных об аллельных комбинациях использованных в работе микросателлитных маркеров было выявлено, что каждый из исследованных сортов обладает уникальным, свойственным лишь ему набором аллелей. Это свидетельствует о том, что микросателлитные маркеры обладают достаточным уровнем полиморфизма для использования их в сортовой идентификации и в целях выявления ложных гибридов.

10. Анализ частоты встречаемости аллелей микросателлитных маркеров выявил наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества сортов, что свидетельствует об их относительной генетической близости.

11. По результатам кластерного анализа, проведенного на основании данных ДНК- маркирования было определено две основных группы сортов, сформированных по принципу наибольшего генетического сходства.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

1. При подборе пар для гибридизации проводить предварительную оценку генетического родства исходного селекционного материала с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров с целью получения наиболее широкого спектра изменчивости в гибридном потомстве.

2. Использовать полиморфизм микросателлитных локусов для идентификации ложных гибридов.

3. В селекции на повышенное содержание амилозы использовагь маркерную систему на основе полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона "аху-гена для разделения селекционного материала на группы по содержанию амилозы: <20% и >20% на самых ранних этапах развития растений. Это позволит сэкономить время и избежать потери семенного материала необходимого для технологической оценки зерна по данному признаку.

4. Использовать пару сортов Мороберекан и Белозерный для картирования локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу с применением микросателлитных ДНК-маркеров, отобранных в результате данного исследования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Мухина Ж.М., Ковалев B.C., Супрун И.И., Костылев П.И. Генотипирование российских сортов риса микросагеллигными маркерами // Рисоводство.- 2002.- № 2.- С. 32-35.

2. Супрун И.И. Возможность использования SDS-электрофореза в сортовой идентификации и оценке сортовой чистоты риса // Рисоводство. -2002,-№2,-С. 38-40.

3. Супрун И.И., Мухина Ж.М., Ильницкая Е.Т. Системы молекулярного ДНК-маркирозания и их использование в селекционно-генетических исследованиях риса // Рисоводство.- 2003.- № 3.- С. 25-30.

4. Супрун И.И., Мухина Ж.М., Харитонов Е.М. Идентификация количественных локусов полевой устойчивости риса к пирикуляриозу // Рисоводство.- 2004.- № 4.- С. 33-37.

5. Супрун И.И. Изучение молекулярного полиморфизма Waxy гена отечественных сортов риса с различным содержанием амитозы // Тезисы докладов всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов « Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах».- Анапа, 2004,- С.14-15.

6. Супрун И.И., Мухина Ж.М., Ильницкая Е.Т. Создание сорта риса с длительной полевой устойчивостью к пирикуляриозу // Материалы докладов международной научно-практической конференции « Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем».- Краснодар, 2004.- С. 149-151.

7. Супрун И.И., Мухина Ж.М., Харитонов Е.М. Селекция риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением молекулярного маркирования // Сборник научных трудов, посвященный 90-летию КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко.- Краснодар, 2004.- Т.З.- С.279-284.

8. Супрун И.И., Мухина Ж.М Анализ количественных локусов устойчивости к пирикуляриозу с использованием микросателлитных маркеров // Тезисы докладов всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов « Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах».- Анапа, 2004.- С. 15-17.

9. Khantonov E.M., Mukhina Zh. M., Ilnitskaya E.T., Suprun I.I. Marker assisted selection on rice blast resistance // Proceeding of the conference « Challenges and opportunities lor sustainable rice-based production systems».-Turin, 2004.-P.410-411.

Лицензия ИД 02334

14.07.2000

Подписано к печати 21. 12.04 Формат 60x80 / 16

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ. л. 1 Заказ 784

Тираж 100_

Отпечатано в типографии КубГАУ, 350044, Краснодар, Калинина, 13

16 СЕВ 2Г25

f i

с -

1901

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Супрун, Иван Иванович

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем

1.2 ДНК- технологии в молекулярном маркировании

1.3 Использование ДНК маркеров в селекции и генетике риса

1.3.1 Изучение биогенетического разнообразия риса

1.3.2 QTL- анализ, картирование генов и маркерная селекция риса

1.3.3 Изучение устойчивости к пирикуляриозу

1.3.4 Молекулярный полиморфизм Waxy-reHa

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1 Исходный материал

2.2 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК

2.3 Молекулярные маркеры, использованные в работе

2.4 Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации

2.5 Детекция единичной замены нуклеотида в области сайта сплайсинга с применением рестрикционного анализа

2.6 Анализ электрофореграмм

2.7 Статистическая обработка данных

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.2 Оценка возможности применения молекулярного полиморфизма Waxy- гена как маркерной системы в селекции риса по признаку содержание амилозы в зерновке

4 ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Использование ДНК-маркеров в селекционно-генетических исследованиях риса"

Актуальностьпроблемы. Выведение новых сортов сельскохозяйственных культур, в том числе и риса, основано на использовании природного или созданного человеком генетического разнообразия. Для обнаружения, оценки и охраны этого разнообразия, отбора растений, несущих хозяйственно ценные признаки, и отслеживания этих признаков в процессе селекции и в семеноводстве используют легко распознаваемые фенотипические проявления генов - маркеры.

Использование в качестве фенотипических маркеров белковых молекул (изоферменты, запасные белки) - продуктов индивидуальных генов - существенно расширило возможности картирования генов и их мониторинга в селекционном процессе и позволило создать новые методы идентификации и систематизации сортов и семенного контроля.

Развитие методов молекулярной биологии, в частности, таких как: рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР)- амплификация ДНК, сиквенирование ДНК (определение последовательности ДНК) привело к появлению нового класса молекулярно-генетических маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям, входящих непосредственно в структуру агрономически важного гена или сцепленных с этим геном.

Вот почему появление ДНК-маркеров радикально изменило методы оценки генетического разнообразия, паспортизации и классификации сортов, картирования и определения физической природы генов, интрогрессии новых генов и генетического мониторинга в селекции и генетике риса. Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка эффективных методов оценки и отбора исходного материала для использования в селекционном процессе, основанных на полиморфизме ДНК-маркеров. В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:

3. Изучить перспективность применения полиморфизма микросателлитных локусов для идентификации сортов.

4. Оценить возможность использования молекулярного полиморфизма Waxy-гена, детерминирующего содержание амилозы в зерновке и в пыльцевых зернах, как маркерной системы для ранжирования сортов риса по признаку «содержание амилозы в эндосперме зерновки».

6. Провести отбор маркеров, полиморфных между указанными сортами, для выполнения картирования локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу и ведения маркерной селекции по данному признаку. Научная новизна исследований. В настоящей работе впервые: проведена идентификация сортов коллекции ВНИИриса на основе данных об аллельном разнообразии микросателлитных маркеров; выполнена оценка генетического родства сортов риса отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров; исследована корреляции между аллельными состояниями микросателлитного локуса первого интрона и сайта сплайсинга первого интрона Waxy гена с признаком содержание амилозы в эндосперме у отечественных сортов риса; при изучении полиморфизма микросателлитного локуса Waxy-гена впервые выявлен аллель с количеством СТ-повторов равным 21; проведен анализ генетического полиморфизма между сортами Мороберекан и Белозерный на уровне ДНК с использованием микросателлитных маркеров и отобраны маркеры, необходимые для ведения маркерной селекции на устойчивость к пирикуляриозу.

Научно-практическая ценность работы. Информация о степени генетического родства сортов коллекции ВНИИриса, полученная по данным микросателлитного анализа, облегчит подбор родительских пар при гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве, избегая при этом скрещивания генетически близких сортов, что позволит повысить эффективность селекционного процесса.

Показана возможность использования полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена как эффективной маркерной системы для разделения отечественных сортов риса на группы по содержанию более 20% и менее 20% амилозы, минуя технологическую оценку зерна. Выявленный аллель микросателлитного локуса первого интрона Waxy-гена с количеством СТ повторов 21 дополняет знания об его аллельном разнообразии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международной научно-практической конференции « Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г.); Международной конференции « Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» (Turin, Italy, 15-17 September 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов « Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Анапа, 27-30 сентября 2004 г.); на методических советах Всероссийского НИИ риса 2001-2004 г.г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 112 страницах, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 171 наименование, в том числе 146 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Супрун, Иван Иванович

ВЫВОДЫ

1. Уровень полиморфизма между сортами Белозерный и Мороберекан, выявленный в ходе исследования свидетельствует о возможности их использования в QTL-анализе локусов устойчивости к пирикуляриозу. Общий процент полиморфизма между ними равен 37,8%, что составило 177 маркеров, из которых было отобрано 119 для использования в QTL-анализе и маркерной селекции по данному признаку.

3. Маркеры, локализованные в областях локусов количественной устойчивости к пирикуляриозу, проявили более высокий уровень полиморфизма между родительскими сортами (50,6%), чем в других областях генома (35,3%). Наиболее высокий генетический полиморфизм в областях QTL устойчивости к пирикуляриозу, выявленный микросателлитными маркерами, вероятнее всего объясняется разным уровнем устойчивости у исследуемых сортов.

4. В ходе исследования у 10 сортов риса отечественной селекции с различным содержанием амилозы было выявлено три аллеля микросателлитного локуса Wx гена с количеством СТ повторов-(СТ)п равным 18, 19, 21. Аллель с количеством СТ повторов в микросателлитной последовательности равным 21 был обнаружен впервые.

5. Отсутствие корреляции между числом СТ - повторов в микросателлитной последовательности первого интрона Waxy-гена и содержанием амилозы у исследованных нами сортов, говорит о неперспективности использования полиморфизма данного микросателлитного локуса как маркерной системы для ранжирования сортов риса отечественной селекции по признаку содержание амилозы в эндосперме.

6. При проведении анализа 5' области сайта сплайсинга у отечественных сортов с содержанием амилозы более чем 20% была выявлена последовательность agGtata, в то время как у сортов с содержанием амилозы ниже 20% - agTtata. Достоверность взаимосвязи признака содержание амилозы с признаком G—замена нуклеотида подтверждена проверкой по коэффициенту корреляции рангов Спирмена. Его значение оказалось равным 0,72 при Р<0,05, что говорит о достоверности результата.

7. Возможность четкой интерпретации результатов и достоверность полученных данных свидетельствуют о возможности использования полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена как эффективной маркерной системы для разделения сортов на содержащие более 20% и менее 20% амилозы, что может быть востребовано в селекции высокоамилозных сортов.

8. У 14 микросателлитных маркеров, использованных в работе по изучению генетического разнообразия сортов коллекции ВНИИ риса, был обнаружен различный уровень полиморфизма: от трех до семнадцати аллелей на один микросателлитный локус. Наиболее высокий уровень полиморфизма по результатам анализа показали маркеры RM1, RM11, RM70, RM122, RM164, - 8, 7, 12, 8, 17 аллелей по каждому из маркируемых локусов соответственно.

11. По результатам кластерного анализа, проведенного на основании комплекса данных о частоте встречаемости и о размере аллелей у исследованных сортов, было определено две основных группы сортов с наибольшей степенью генетического сходства.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

2. Использовать полиморфизм микросателлитных локусов для идентификации ложных гибридов.

3. В селекции на повышенное содержание амилозы использовать маркерную систему на основе полиморфизма сайта сплайсинга первого интрона Waxy-гена для разделения селекционного материала на группы по содержанию амилозы: <20% и >20% на самых ранних этапах развития растений. Это позволит сэкономить время и избежать потери семенного материала необходимого для технологической оценки зерна по данному признаку.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Супрун, Иван Иванович, Краснодар

1. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика.- 1999.- Т.- 35.- С.1538-1549.

2. Иванова Д.И. Иммунохимическое изучение водо солерастворимых белков зерновки риса в связи с вопросами эволюции и таксономии культурных видов рода Oryza L. Тр. по прикл. бот., ген. и сел.- 1979.- № 3.-С.135-144.

3. Иванова Д.И. Подвидовая дифференциация Oryza sativa L. по результатам иммунохимического анализа белков зерна. С.-х. биология.- 1980.- XV.- №6.-С.874-877.

4. Иванова Д.И. Полиморфизм спирторастворимого белка зерновки риса и перспективы его использование в оценке внутривидового разнообразия Oryza sativa L. // С.- х. биология.- 1983.- №4.- С.41-45.

5. Иванова Д.И. Идентификация геномов, субгеномов и подвидов риса по белкам зерновки. С.-х. биология.- 1986.- №7.- С.З- 9.

6. Иванова Д. И. Идентификация геномов, субгеномов и подвидов риса по водорастворимым белкам зерновки // Сельскохозяйственная биология.-1987.-№2.- С.27-34.

7. Клекка У.Р. Дискриминантный анализ // Факторный, дискриминантный и кластерный анализ. М.,1989. - С. 78-138.

8. Конарев А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // Сельскохозяйственная биология.-1998.- №5.- С.3-25.

9. Конарев В.Г. Белки как генетические маркеры растений.- М.: Колос, 1983.- 320с.

10. Конарев В.Г. Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений. Санкт-Петербург.: ВИР, 1998.- 370с.

11. Лакин Г.Ф. Биометрия.- М.: Мир, 1990.-352с.

12. Льюин Б. Гены.- М.: Мир, 1987.- 544с.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984.- 480с.14.0лдендерфер М. С., Блэшфилд С.К. Кластерный анализ // Факторный, дискриминантный и кластерный анализ. - М., 1989. — С. 139-210.

14. Остерман Л.А. 1981 Методы исследования нуклеиновых кислот.- М.: Наука, 1981.-288 с.

15. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.П. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgare L.) // Генетика.- 1997.- Т. 33.- С. 53-60.

16. Сиволап Ю.М., Чеботарь С.В., Топчиева Е.А., Корзун В.Н., Тоцкий В.Н. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма сортов Triiicum aestivum L. с помощью RAPD- и SSRP-анализа // Генетика.- 1999.- Т. 35.- С. 1665-1673.

17. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции.- М., 1985.- 245с.

18. Суворова Г.Н., Фунатсуки X., Терами Ф. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopyrum Mill., установленное RAPD-анализом // Генетика.- 1999.- Т. 35.- С. 1659-1664.

19. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельскохозяйственная биология.- 1997.- №5.- С.3-19.

20. Чан В-Т.В. Выделение нуклеиновых кислот из клинических образцов и клеточных культур // Молекулярная клиническая диагностика.- М.: Мир, 1999.- С. 303-328.

21. Чан В-Т.В. Гибридизация нуклеиновых кислот // Молекулярная клиническая диагностика.- М.: Мир, 1999.- С. 375-394.

22. Шиловский В.Н., Харитонов Е.М., Шеуджен А.Х. Селекция и сорта риса на Кубани.- Майкоп, 2001.- 34 с.

23. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика.- М.: Мир, 1999.-С. 395-427.

24. Янковский Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива // Соросовский образовательный журнал.- 1996.- № 2.- С.21-27.

25. Aggarwal R.K., Brar D.S., Nandi S., Huang N., Khush G.S. Phylogenetic relationships among Oryza species revealed by AFLP markers // Theor. Appl. Genetic.- 1999.- V. 96.- P. 602-611.

26. Ahn S.N., Bollich C.N., McClung A.M., Tanksley S.D. RFLP analysis of genomic regions associated with cooked-kernel elongation in rice // Theor. Appl. Genet.- 1991.- V. 87.- P. 141-145.

27. Ahn S.N., Kim Y.K., Han S.S., Choi H.C., Moon H.P., McCouch S.R. Molecular mapping of a gene for resistance to a Korean isolate of rice blast // Rice Genet. Newsl.- 1996.- V.13.- P. 74-76.

28. Akagi H., Yokozeki Y., Inagaki A., Fujimura T. Microsatellite DNA markers for rice chromosomes // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V. 93.- P. 1071-1077.

29. Akagi H., Yokozeki Y., Inagaki A., Fujimura T. Highly polymorphic microsatellites of rice consist of AT repeats, and classification of closely related cultivars with these microsatellite loci // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V. 94.-P.61-67.

30. Bao J.S., Corke H., Sun M. Microsatellites in starch-synthesizing genes in relation to starch physicochemical properties in waxy rice {Oryza sativa L.) // Theor. Appl. Genet.- 2002.- V.105.- P. 898-905.

31. Blair M.W., Panaud O., McCouch S.R. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice {Oryza sativa L.) // Theor. Appl. Genet.- 1999. V.98.- P. 780-792.

32. Blight H.F.J., Till R.I., Jones C.A. A microsatellite sequence closely linked to the Waxy gene of Oryza sativa II Euphytica.- 1995.- V.86.- P. 83-85.

33. Bryan G.T., Wu K.S., Farrall L., Jia Y., Hershley H.P., et al. tA single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta II The Plant Cell.- 2000.- V.12.- P. 2033-2045.

34. Castiglioni P., Pozzi C., Heun M., Terzi V., Muller K. J., Rohde W., Salamini F. An AFLP-Based Procedure for the Efficient Mapping of Mutations and DNA Probes in Barley // Genetics.- 1998.- V. 149.- P. 2039-2056.

35. Causse M.A., Fulton T.M., Cho Y.G., Ahn S.N., Chungwonse J., et al. Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population//Genetics.- 1994.- V.138.- P. 1251-1274.

36. Champoux M., Wang G., Sarkarung S., Mackill D.J., O'Toole J.C., Huang N., McCouch S.R. Locating genes associated with root morphology and drought avoidance in rice via linkage to molecular markers // Theor. Appl. Genet.- 1995.-V.90.- P. 969-981.

37. Chauhan R.S., Farman M.L., Zhang H.B., Leong S.A. Genetic and physical mapping of a rice blast resistance locus, Pi-C039(t), that corresponds to the avirulence gene AVR-C039, of Magnaporthe grisea II Mol. Genet. Genomics.-2002.- V.267.- P. 603-612.

38. Chen D.H., dela Vina M., Inukai Т., Mackill. D.J., Ronald P.C., Nelson R.J. Molecular mapping of the blast resistance gene, Pi44(t), in a line derived from a durably resistant rice cultivar // Theor. Appl. Genet.- 1999.- V.98.- P. 1046-1053.

39. Chen D.H., Nelson R.G., Wang G.L., Inukai Т., Mackill D.J., Ronald P.C. Characterization of blast resistance in the durably resistant rice cultivar Moroberekan // Advanced in rice blast research.- Kluwer Academic Publishers, 2000.- P. 17-27.

40. Chen M., Presting G., Barbazuk W.B. et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome // The Plant Cell.- 2002.- V. 14.- P. 537-545.

41. Chin E.C.L., Senior M.L., Shu H. et al. Maize simple repetitive DNA sequences: abundance and allele variation // Genome.- 1996.- V.39.- P. 866-873.

42. Cho Y.G., Eun M.Y., McCouch, Chae Y.A. The semidwarf gene, sd-1, of rice (Oryza sativa L.). II. Molecular mapping and marker-assisted selection // Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.89.- P. 54-59.

43. Conaway-Bormans C.A., Marchetti M.A., Johnson C.W., McClung A.M., Park W.D. Molecular markers linked to the blast resistance gene Pi-z, in rice for use in marker-assisted selection // Theor. Appl. Genet.- 2003.- V.107.- P. 1014-1020.

44. Dieffenbach C.W., Lowe T.M., Deksler G.S. General Concepts for PCR Primer Design // Nucleic Acids Res.- 1995.- V.18.- P. 999-1005.

45. Diwan N., Cregan P.B. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean // Theor. Appl. Genet. 1997.- V.95. - P. 723-733.

46. Dong Y., Tsuzuki E., Kamiunten H., Terao H., Lin D. Mapping of QTL for embryo size in rice // Crop science.- 2003.- V.43.- P. 1086-1071.

47. Dudley J.W. Molecular markers in plant improvement-manipulation of genes affecting quantitative traits // Crop science.- 1993.- V.33.- P. 660-668.

48. Feyt H., Dubois C., Clement G. Analysis of the diversity of rice genetic resources for use in Europe-determination of a core collection // Proceeding of Eurorice 2001 Symposium. Krasnodar.- 2001.- P. 52-68.

49. Frances H., Blight J., Larkin P.D., Roach P.S., Jones C.A., Fu H., et al. Use of alternate splice sites in granule-bound starch syntase mRNA from low-amylose rice varieties // Plant Molecular Biology.- 1998.- V.38.- P. 407-415.

50. Frisch M., Bohn M., Melchinger A.E. Minimum sample size and optimal positioning of flanking markers in marker-assisted backcrossing for transfer of a target gene // Crop science.- 1999.- V.39.- P. 967-975.

51. Fuentes J.L., Escobar F., Alvares A., Gallego G., Miriam C. Analysis of genetic diversity in Cuban rice varieties using izozyme, RAPD, and AFLP markers//Euphytica.- 1999.-V. 109.-P. 107-115.

52. Fuji K., Hayano-Saito Y., Saito K., Sugiura N., Hayashi N., et al. Identification of a RFLP marker tightly linked to the panicle blast resistance gene, Phi in rice // Breeding science.- 2000.- V.50.- P. 183-188.

53. Fuji K., Hayano-Saito Y., Sugiura N., Hayashi N., Saka N. et al. Gene analysis of panicle blast resistance in rice cultivars with rice stripe resistance // Breed. Res.-1999.- V.l.-P. 203-210.

54. Fukuoka S., Okuno K. QTL-analysis and mapping ofpi21, a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice // Theor. Appl. Genet.- 2001.-V. 103.- P. 185-190.

55. Han Y., Xu M., Liu X., Yan C., Schuyler S., et al. Genes coding for starch branching enzymes are major contributors to starch viscosity characteristics in waxy rice (Oryza sativa L.) // Plant Science.- 2003.- V. 166.- P. 357-364.

56. Harushima Y., Yano M., Shomura A., Sato M., Shimano Т., et al. A high-density rice genetic map with 2275 markers using a single F2 population // Genetics.- 1998.- V.148.- P. 479-494.

57. Hirano H.Y., Sano Y. Molecular characterization of the waxy locus of rice (Oryza sativa) // Plant and Cell Physiology.- 1991.- V.32.- P. 989-997.

58. Hittalmani S., Huang N., Courtois В., Venuprased N., et al. Identification of QTL for growth and yield-related traits in rice across nine locations of Asia // Theor. Appl. Genet.- 2003.- V.107.- P. 679-690.

59. Hittalmani S., Parco A., Mew T.V., Zeigler R.S., Huang N. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice // Theor. Appl. Genet.- 2000.- V.100.- P. 1121-1128.

60. Huang N., Angeles E.R., Domingo J., Magpantay G., et al. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: marker-assisted selection using RFLP and PCR// Theor. Appl. Genet.- 1997- V.95.- P. 313-320.

61. Huang N., Cortois В., Khush G.S., Lin H., Wang G., Wu P., Zhu K. Association of quantitative trait loci for plant height with major dwarfing genes in rice // Heredity.- 1996.- V. 77.- P. 130-137.

62. Imbe Т., Oba S., Yanoria M.J.T., Tsunematsu H. A new gene for blast resistance in rice cultivar IR24 // Rice Genet. Newsl.- 1997.- V.14.- P. 60-62.

63. Jaisval P., Ware D., Ni J., Chang K. et al. Gramene: development and integration of trait and gene ontologies for rice // Comparative and functional genomics.- 2002.- V.3.- P. 132-136.

64. Jansen R. C., Geerlings H., A. Oeveren J. V., Van Schaik R. C. A Comment on Codominant Scoring of AFLP Markers // Genetics.- 2001.- V.158.- P. 925-926.

65. Jena K.K., Moon H.P., Mackill D.J. Marker assisted selection- a new paradigm in plant breeding // Korean J. Breed.- 2003.- V.35.- P. 133-140.

66. Jensen L.B., Courtous В., Shen L., Li Z., et al. Locating genes controlling allelopathic effects against barnyardgrass in upland rice // Agron. Journ.- 2001.-V.93.- P. 21-26.

67. Jeon J.S., Chen D., Yi G.H., Wang G.L., Ronald P.C. Genetic and physical mapping of Pi5(t), a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast // Mol. Genet. Genomics.- 2003.- V.269.- P. 280-289.

68. Jia Y., Bryan G.T., Farrall L., Valent B. Natural variation at the Pi-ta rice blast resistance locus // Phytopathology.- 2003.- V.93.- P. 1452-1459.

69. Jiang J. and Wang S. Identification of a 118-kb DNA fragment containing the locus of blast resistance gene Pi-2(t) in rice // Mol. Genet. Genomics.- 2002.-V.268.- P. 249-252.

70. Kaji R. and Ogawa T. RFLP mapping of blast resistance gene Pik-m in rice // Int. Rice. Res. Notes.- 1996.- V.21.- P. 47.

71. Kang H.W., Cho Y.G., Yoon U.H., Eun M.Y. A rapid DNA extraction method for RFLP and PCR analysis from a single dry seed // Plant. Mol. Biol.- 1998.-V.16.-P. 90.

72. Khush G.S., Brar D.S., Hardy B. Rice genetics VI.- Los Banos. 2001.- 488 p.

73. Kurata N., Umehara Y., Tanoue H., Sasaki T. Physical mapping of the rice genome with YAC clones // Plant. Mol. Biol.- 1997.- V.35.- P. 101-113.

74. Lang N.T., Khush G.S., Huang N., Buu B. Fine mapping for blast resistance gene in rice (Oryza sativa L.) using bulked segregant analysis// Omonrice.- 2001.-V.I.- P. 1-8.

75. Launder E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J., Lincoln S.E., Newburg L. MAPMAKER: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage map of experimental and natural population // Genomics.-1987.-V.1.-P. 174-181.

76. Li Z.K. QTL-mapping in rice: a few critical consideration // Rice Genetics.-2001.- V.4.-P. 153-171.

77. Li Z.K., Luo L., Tabien R., Paterson A.H. A "defeated" resistance gene acts as a QTL against a virulent strain of Xantomonas oryzae // Mol. Gen. Genet.- 1999,-V.261.- P. 58-63.

78. Li Z.K., Pinson S.R.M., Stansel J.W., Park W.D. Identification of quantitative trait loci (QTL) for heading date and plant height in rice using RFLP markers // Theor. Appl. Genet.- 1995.- V.91- P. 374-381.

79. Lin H., Liang Z.-W., Sasaki Т., Yano M. Fine mapping and characterization of quantitative trait loci Hd4 Mid Hd5 controlling heading date in rice // Breeding Science.- 2003.- V.53.- P. 51-59.

80. Litt M., And Luty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am.J.Hum.Genet.- 1989.- V.44.- P. 388-396.

81. Liu G., Lu G., Zeng L., Wang G.L. Two broad-spectrum blast resistance genes, Pi9(t) and Pi2(t), are physically linked on rice chromosome 6 // Mol. Genet. Genomics.- 2002.- V.267.- P. 472-480.

82. Loriex M., Ndjiondjop M.N., Ghesquiere A. A first interspecific Oryza sativa* Oryza glaberrima microsatellite based genetic map // Theor. Appl. Genetic. 2000.- V.100.- P. 591-601.

83. Lu C., Shen L., Tan Z., Xu Y., He P., Chen Y., Zhu L. Comparative mapping of QTLs for agronomic traits of rice across environments using a doubled haploid population // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V.93.- P. 1211-1217.

84. Ma Z.Q., Roder M., Sorrells M.E. Frequencies and sequence characteristics of dinucleotide, trinucleotide, and tetra-nucleotide microsatellites in wheat // Genome.- 1996.- V.39.- P. 123-130.

85. Mackill D.J. and Ni J. Molecular mapping and marker-assisted selection for major-gene traits in rice // Rice genetic 4. Proceeding of the fourth international rice genetic symposium.- Los Banos .- 2001.- P. 137-151.

86. Manly K.F., Olson J.M. Overview of QTL mapping software and introduction to Map Manager QT // Mammalian Genome.- 1999.- V.10.- P. 327-334.

87. McCouch S.R., Chen X., Panaud O., Temnykh S., Xu Y., et al. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding // Plant Mol. Biol.- 1997.- V.35.- P. 89-99.

88. McCouch S.R., Doerge R.W. QTL-mapping in rice // Trends in Genetics.-1995.- V.ll.- P. 482-487.

89. McCouch S.R., Nelson R.G., Tohme J., Zeigler R.S. Mapping of blast resistance genes in rice // Rice blast disease.-1994.- V.l.- P. 167-186.

90. McCouch S.R., Teytelman L., Xu Y., Lobos K.B., Clare K., et al. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.) // DNA research.- 2002.- V.9.- P. 199-207.

91. Miyamoto M., Ando I., Rybka K., Kodama O., Kavasaki S. High resolution mapping of the indica-derived genes. I. Pi-b // Mol. Plant-Microbe Interact.- 1996.-V.9.- P. 6-13.

92. Mohan M., Nair S., Bhagwat A., Krishna T.G., Yano M., Bhatia C.R., Sasaki T. Genome mapping, molecular marker and marker-assisted selection in crop plants // Molecular Breeding.- 1997.- V.3.- P. 87-103.

93. Moncada P., Martinez C.P., Borrero J., Chatel M. et al. Quantitative trait loci for yield components in an Oryza sativa * Oryza rufipogon BC2F2 population evaluated in an upland environment // Theor. Appl. Genet.- 2001.- V.102.- P. 41-52.

94. Monna L., Kitazawa N., Yoshino R., Suzuki J. et al. Positional cloning of rice semidwarf gene, sd-1: rice "Green revolution gene" encodes a mutant enzyme involved in gibberellin synthesis // DNA research.- 2002.- V.9.- P. 11-17.

95. Monna L., Miyao A., Zhong H.S., Yano M. et al. Saturation mapping with subclones of YACs: DNA marker production targeting the rice blast disease resistance gene, Pi-b // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V.94.- P. 170-176.

96. Morgante M., Oliveri A.M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics // Plant J.- 1993.- V.3.- P. 175-182.

97. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research.- 1980.- V.10.- P. 4321-4325.

98. Naqvi N.I., Bonman J.M., Mackill. D.J., Nelson R.J., Chattoo B.B. Identification of RAPD markers linked to a major blast resistance gene in rice // Mol. Breed.- 1995.- V.I.- P. 341-348.

99. Okuno K. and Ebana K. Identification of QTL controlling allelopathic effects in rice: genetic approaches to biological control of weeds // JARQ.- 2003.- V.37.-P. 77-81.

100. Olufowote J.O., Xu Y., Chen X., Park W.D., Beachell H.M. Comparative evaluation of rice ( Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers // Genome.- 1997.- V.40.- P. 370-378.

101. Panaud O., Chen X., McCouch S.R. Frequency of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.) // Genome. 1995. V.38. P. 1170-1176.

102. Paran I. and Zamir D. Quantitative traits in plants: beyond the QTL // Trends in Genetics.- 2003.- V.19.- P. 303-306.

103. Paterson A.H. Molecular dissection of quantitative traits: progress and progress // Genome Research.- 1995.- V.5.- P. 321-333.

104. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M. A comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis // Mol. Breed.- 1996.- V.2.-P. 225-238.

105. Ray J. D., Yu L., McCouch S. R., Champoux M.C., Wang G. Mapping quantitative trait loci associated with root penetration ability in rice (Oryza sativa L.) // Theor. Appl. Genet. 1996.- V.92.- P. 627-636.

106. Redona E.D., Mackill D.J. Molecular mapping of quantitative trait loci in japonica rice // Genome.- 1996.- V.39.- P. 395-403.

107. Redona E.D., Mackill D.J. Mapping quantitative trait loci for seedling vigor in rice using RFLPs // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V.92.- P.395-402.

108. Redona E. D., Mackill D. J. Quantitative trait locus analysis for rice panicle and grain characteristics // Theor. Appl. Genet.- 1998.- V.96.- P. 957-963.

109. Renhua L., Jiang T.B., Xu C.G. Relationship between morphological and genetic differentiation in rice (Oryza sativa L.) // Euphytica. 2000.- V.l 14.- P. 1-8.

110. Resurrection A.P., Villareal C.P., Parco A., Second G., Juliano B.O. Classification of cultivated rices into indica and japonica types by the izozyme, RFLP, and two milled-rice methods // Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.89.- P. 14-18.

111. Ronald P.C., Albano В., Tabien R., Abenes L., Wu K.S. Genetic and physical analysis of the rice blight disease resistance locus, Xa-21 II Mol. Genet. Genomics.- 1992.-V.236.-P. 113-120.

112. Rybka K., Miyamoto M., Ando I., Saito A., Kawasaki S. High resolution mapping of the indica-derived rice blast resistance genes. 2. Pi-ta(2) and Pi-ta and consideration in their origin // Mol. Plant-Microbe Interaction.- 1997.- V.10.-P.517-524.

113. Saito K., Miura K., Nagano K., Hayano-Saito Y. et al. Identification of two closely linked quantitative trait loci for cold tolerance on chromosome 4 of rice and their association with anther length // Theor. Appl. Genet.- 2001.- V.103.- P. 862868.

114. Saji S., Umehara Y., Baltazar A.A., Yamane H., Tanoue H. A physical map with yeast artificial chromosome (YAC) clones covering 63% of the 12 rice chromosomes // Genome.- 2001.- V. 44. P. 32-37.

115. Sallaud C., Lorieux M., Roumen E., Tharreau D., Berruyer R. et al. Identification of five new blast resistance genes in the highly blast-resistance rice variety IR64 using a QTL mapping strategy // Theor. Appl. Genet.- 2003.- V.106.-P. 794-803.

116. Sano Y. Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm // Theor. Appl. Genet.- 1984.- V.68.- P. 467-473.

117. Sasaki T. The progress in rice genomics // Euphytica.- 2001.- V.l 18. P. 103111.

118. Sato Y.I., Nakamura I., Kuroda Y. Semi-sterile perennial wild rice (Oryza rufipogon) as the progenitor of japonica cultivar // Proceedings of international genetic resources workshop on the genus Oryza.-Tsukuba.- 2003.- P. 47-49.

119. Schlotterer С., Soller M. Polymorphism and locus-specific effects on polymorphism at microsatellite loci in natural Drosophila melanogaster populations// Genetics.- 1997.- V.146. P. 309-320.

120. Shen L., Cortous В., McNally K.L., Robin S., Li Z. Evaluation of near-isogenic lines of rice introgressed with QTLs for root depth through marker-aided selection// Theor. Appl. Genet.- 2001.- V. 103.- P. 75-83.

121. Suh J.P., Ahn S.N., Choi I.S., Cho Y.C. et al. Identification of QTL for cold tolerance at seedling stage in Korean weedy rice (Oryza sativa L.) // Korean J. Breed.- 2003.- V. 35.- P. 96-101.

122. Sun C.Q., Wang X.K., Yoshimura A., Doi K. Genetic differentiation for nuclear, mitochondrial and chloroplast genomes in common wild rice (Oryzarufipogon Griff.) and cultivated rice (Oryza sativaL.) // Theor. Appl. Genet.2000.- V.104.-P. 1335-1345.

123. Tanksley S.D. and Nelson J.C. Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable from unadapted germplasm into elite breeding lines // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V.92.- P. 191-203.

124. Thomas M.R., Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet.- 1993.- V.86.- P. 985-990.

125. Tsunoda Y., Jwa N.S., Akiyama K., Nakamura S., Motomura Т., et al. Cloning of the rice blast resistance gene Pi-B // Advanced in rice blast research.-2000.-V.1.- P. 9-16.

126. Umehara Y., Inagaki A., Tanoue H., Yasukochi Y., Nagamura Y. Construction and characterization of a rice YAC library for physical mapping // Molecular Breeding.- 1995.- V.I.- P. 79-89.

127. Wan J.L., Zhai H.Q., Wan J.M., Ikehashi H. Detection and analysis of QTLs for ferrous iron toxicity tolerance in rice, Oryza sativa L. // Euphytica.- 2003.- V. 131.- P. 201-206.

128. Wanchana S., Toojinda Т., Tragoonrung S., Vanavichit A. Duplicated coding sequence in the waxy allele of tropical glutinous rice (Oryza sativa L.) // Plant Science.- 2003.- V.165.- P. 1193-1199.

129. Wang D.L., Zhu J., Li Z.K., Paterson A.H. Mapping QTLs with epistatic effects and genotype* environment interaction by mixed linear model approaches // Theor. Appl. Genet.-1999.- V. 99.- P. 1255-1264.

130. Wang G.L., Mackill D.J., Bonman M., McCouch S.R., Champoux M.C., Nelson R. G. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistance rice cultivar // Genetics.- 1994.- V.136.- P. 14211434.

131. Wang Z., Taramino G., Yang D., Liu G. et al. Rice ESTs with disease-resistance gene- or defense-response gene-like sequences mapped to regionscontaining major resistance genes or QTLs // Mol. genet. Genomics.- 2001.-V.265.- P. 302-310.

132. Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. Survey of plant short tandem DNA repeats // Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.88.- P. 1-6.

133. Wang Z.X., Yano M., Yamanouchi U., Iwamoto M. et al. The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes // The Plant Journal.- 1999.- V.19.- P. 55-64.

134. Wang Z.Y., Wu Z.L., Xing Y.Y., Zheng F.G., Guo X.L. Nucleotide sequence of rice waxy gene // Nucleic acids research.- 1990.- V.l 8.- P. 5898.

135. Wang Z.Y., Zheng F.Q., Shen G.Z., Gao J.P., D Peter Snustad, et al. The amylose content in rice endosperm is related to the post-transcriptional regulation of the Waxy gene // The Plant Journal- 1995.- V.7.- P. 613-622.

136. Weber J.L. Human DNA polymorphism and methods of analysis // Curr. Opin. Biotechnol.- 1990.- V.l.- P. 166-171.

137. Wu J., Jiang J., Chen H., Wang S. Fine mapping of rice blast resistance gene Pi-2(t) II Acta agronomica sinica.- 2002.- V.28.- P. 243-254.

138. Wu K.S., Tanksley S.D. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice // Mol. Gen. Genet.- 1993.-V.241.- P. 225-235.

139. Wu P., Liao C.Y., Ни В., Yt K.K., Wes J., Ni J.J. Genetic analysis for aluminum tolerance in rice (Oryza sativa L.) via molecular markers // Rice Genet. Newsl.- 1999.- V. 16.- P. 48-51.

140. Xiao J., Li J., Yuan L., Tanksley S.D. Dominance is the major genetic basis of heterosis in rice as revealed by QTL analysis using molecular markers // Genetics. 1995.- V.l40.- P. 745-754.

141. Xiao J., Li J., Yuan L., McCouch S. R., Tanksley S. D. Genetic diversity and its relationship to hybrid performance and heterosis in rice as revealed by PCR-based markers // Theor. Appl. Genet.- 1996.- 92.- V.6. P. 637-643.

142. Xiao J., Li J., Yuan L., Tanksley S. D. Identification of QTLs affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross // Theor. Appl. Genet- 1996.- V.92.- P. 230-244.

143. Xu К. and Mackill DJ. A major locus for submergence tolerance mapped on rice chromosome 9 //Mol. Breed.- 1996.- V.2.- P. 219-224.

144. Yamamoto Т., Kuboki Y., Lin S.Y., Sasaki Т., Yano M. Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1, Hd-2 and Hd-3, controlling heading data of rice, as single Mendelian factors // Theor. Appl. Genet.- 1998.- V. 97.- P. 185-190.

145. Yan J., Zhu J., He C., Benmoussa M., Wu P. Molecular dissection of developmental behavior of plant height in rice ( Oryza sativa L.) // Genetics.-1998.- V.150.- P. 1257-1265.

146. Yan J., Zhu J., He C., Benmoussa M., Wu P. Molecular marker-assisted dissection of genotype-environment interaction for plant type traits in rice (Oryza sativa L.) // Crop science.- 1999.- V. 39.- P. 538-544.

147. Yang R.S., Saghai Maroof M.A., Xu C.G., Zhang Q., Biyashev R.M. Comparative analysis of microsatellite DNA polymorphism in landraces and cultivars of rice // Mol. Gen. Genet.- 1994.- V.245.- P. 187-194.

148. Yano M., Marushima Y., Nagamura Y., Kurata N., Minobe Y., Sasaki T. Identification of quantitative trait loci controlling heading date in rice using a high-density linkage map // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V. 95.- P. 1025-1032.

149. Yano M. and Sasaki T. Genetic and molecular dissection of quantitative traits in rice // Plant molecular biology.- 1997.- V.35.- P. 145-153.

150. Yoshimira S., Yoshimura A., Iwata N., McCouch S.R., Abenes M.L., Baraoidan M.R., Mew T.W. Tagging and combining bacterial blight resistance genes in rice using RAPD and RFLP markers // Mol. Breed.- 1996.- V.I.- P. 375387.

151. Yu Z.H., Mackill D.J., Bonman J.M., McCouch S.R., Guiderdoni E. Molecular mapping of genes for resistance to rice blast // Theor. Appl. Genet.-1996.- V. 93.- P. 859-863.

152. Yu Z.H., Mackill D.J., Bonmann J.M., Tanksley S.D. Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLP markers // Theor. Appl. Genet.- 1991.-V. 81.-P. 471-476.

153. Zeng Z.B. The precision mapping of quantitative trait loci // Genetics.- 1994.-V. 136.- P. 1457-1468.

154. Zhang G.Y., Guo Y., Chen S.L., Chen S.Y. RFLP tagging of a salt tolerance gene in rice // Plant Science.- 1995.- V.l 10.- P. 227-234.

155. Zhang J.S., Xie C., Li Z.Y., Chen S.Y. Expression of the plasma membrane H^-ATPase gene in response to salt stress in a rice salt-tolerance mutant and its original variety // Theor. Appl. Genet.- 1999.- V.84.- P. 1006-1011.

156. Zhang Q., Liu K.D., Yang G.P., Saghai Maroof M.A. Molekularmarker diversity and hybrid sterility in indica-japonica rice crosses // Theor. Appl. Genet.-1997.-V.95.-P. 112-118.

157. Zheng K.L., Zhuang J.Y., Lu J., Qian H.R., Lin H.X. Identification of DNA markers tightly linked to blast resistance genes in rice // Rice genetics III. Proceeding of the third international rice genetics symposium.- 1996.- P. 565-569.

158. Zhu J., Gale M.D., Quarre S. AFLP markers for the study of rice biodiversity // Theor. Appl. Genetic.- 1998.- V.96.- P. 602-611.

159. Zhu L.H., Chen Y., Xu Y.B., Xu J.C., Cai H.M., Ling Z.Z. Construction of molecular map of rice and gene mapping using a double haploid population of a cross between Indica and Japonica varieties // Rice Genet. Newsl.- 1993.- V.10.- P. 132-134.

160. Zhuang J.-Y., Lin H.-X, Lu J., Qian H.-R. et al. Analysis of QTL x environment interaction for yield components and plant height in rice // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V.95.- P. 799-808.

Информация о работе

Супрун, Иван Иванович
кандидата биологических наук
Краснодар, 2005
ВАК 06.01.05

Диссертация

Использование ДНК-маркеров в селекционно-генетических исследованиях риса - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы