Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Обоснование эффективности молекулярно-генетического подхода в изучении признаков риса, используемых в селекции и семеноводстве

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Обоснование эффективности молекулярно-генетического подхода в изучении признаков риса, используемых в селекции и семеноводстве"

ии500б270

Токмаков Сергей Вячеславович

ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОДХОДА В ИЗУЧЕНИИ ПРИЗНАКОВ РИСА, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВЕ

Специальность: 06.01.05. — селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 5 ДЕК ?011

Краснодар 2011

005006270

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт риса в 2007-2010 гг.

Научный руководитель:

Мухина Жанна Михайловна

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Гончаров Сергей Владимирович

доктор биологических наук, профессор

Щеглов Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур имени В. С. Пустовойта Россельхозакадемии

Защита состоится 19 января 2012 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.03 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, главный корпус, 1-й этаж, конференц-зал, тел/факс 8 (861) 221-57-93

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом - на сайтах http://vak.ed.gov.ru/ и http://www.kubsau.ru/

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Учёный секретарь диссертационного |7 7 / пЛ/ЛИ^0

совета, д. б. н., профессор ЦаценкоЛ. В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Роль ДНК-технологий в современных сельскохозяйственных науках трудно переоценить. Несомненно, в значительной мере эта роль касается селекции, изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов. Но кроме обозначенных вопросов с помощью ДНК-технологий можно решать и прикладные задачи, такие как определение подвидовой принадлежности и генетической близости различных сортообраз-цов. Даже агротехнические проблемы могут быть решаемы с помощью ДНК-технологий, которые посредством изучения фундаментальных вопросов могут повысить эффективность агротехнических приёмов.

В частности, ввиду высокой актуальности проблемы засоренности производственных посевов риса краснозерными формами для ее решения необходим комплексный научно-производственный подход, который предполагает глубокое знание генетических причин возникновения краснозерности. Особое значение здесь приобретает технология молекулярного маркирования.

Разработка методики идентификации гена окраски перикарпа риса Re позволит проводить скрининг генетической плазмы для выявления краснозёрных растений на любом этапе селекционно-семеноводческой программы вне зависимости от фазы онтогенеза растений.

Разделение растений риса на подвиды indica и japónica является, несомненно, важным, но не всегда однозначным вопросом для селекционеров. С поры о подвидовой принадлежности некоторых сортов риса ведутся давно. Этот вопрос усложняется наличием растений, относящихся к промежуточной группе. Распространенные методы идентификации подвидов риса indica и japónica весьма сложны, комплексны и результаты их не всегда однозначны, В ряде работ можно найти расхождение в результатах при дифференциации сортообраз-цов на подвид indica или japónica различными методами, связанными только с фенотипическим проявлением признака.

Информативные для подвидовой идентификации молекулярные маркеры могут позволить быстро и эффективно ранжировать родительские формы риса и гибридное потомство на подвиды indica или japónica.

Цель и задачи исследований.

Целью данного исследования являлась разработка методологических подходов использования молекулярно-генетических методов для идентификации краснозёрных форм и дифференциации генотипов риса на подвиды indica/japónica.

В проводимых исследованиях были поставлены следующие задачи.

1) Выявить полиморфизм гена красной окраски перикарпа риса Re и разработать праймерные пары, выявляющие аллельный полиморфизм при проведении полимеразной цепной реакции (ПНР).

2) Определить порог чувствительности созданных аллельспецифичных праймеров к гену Re при проведении ПЦР-анализа при различном соотношении ДНК образцов красно- и белозёрного риса в одной пробирке.

3) Провести изучение аллельного состояния гена Re с помощью разработанной маркерной системы у растений трёх сортов риса в питомнике испытания потомств первого года (первичные звенья семеноводства).

4) Провести попарное сравнение аллельного состояния микросателлит-ных локусов ДНК растений белозёрных сортов риса и их краснозёрных форм (КФ) и определить степень генетической близости изученных образцов.

5) Изучить генетическое разнообразие референсных сортообразцов подвидов indica и japónica коллекции ВНИИ риса, используя микросател-литный анализ и определить корреляцию между аллельным состоянием микросателлитных локусов ДНК и подвидовой принадлежностью изученных сортообразцов.

Научная новизна исследований.

— Разработан кодоминантный молекулярный маркер к гену красной окраски перикарпа риса Re и сопряжённая с ним методика упредительного выявления краснозёрной примеси в посевах риса.

— Впервые изучен феномен появления краснозёрных форм белозёрных сортов в семеноводстве и при производственном выращивании риса на основе молекулярно-генетического подхода. Молекулярными методами продемонстрировано, что переопыление белозёрных растений краснозёрными сорно-полевыми формами риса следует считать основной причиной возникновения краснозёрных форм.

— Впервые проведён поиск приоритетных для подвидовой идентификации риса аллелей 30 микросателлитных локусов ДНК среди образцов коллекции ВНИИ риса. Выявлены аллели, приоритетные для подвидов indica и japónica, соответственно.

Научно-практическая ценность работы.

— На основе созданного в рамках исследования ПЦР-маркера гена красной окраски перикарпа зерновки риса Re разработана упредительная методика выявления краснозёрной примеси в посевах первичных звеньев семеноводства риса до фенотипического проявления признака краснозёрно-сти, позволяющая элиминировать нежелательные генотипы из дальнейшего размножения на ранних стадиях онтогенеза растений.

— В ходе молекулярно-генетического анализа выявлена основная причина возникновения краснозёрных форм белозёрных сортов в производственных посевах риса - переопыление сорно-полевыми краснозёрными формами, а не мутации, смещающие рамку считывания гена окраски перикарпа, как предполагалось ранее. В этой связи агротехнические приёмы удаления с рисовых полей сорняков следует считать приоритетными в борьбе с сорно-полевыми формами риса.

— С помощью выявленных в ходе исследования приоритетных для подвидов indica и japónica аллелей микросателлитных локусов ДНК представляется возможным проводить ранжирование сортообразцов на подвиды indica и japónica в селекционном процессе, основываясь не только на данных морфотипа.

Положения, выносимые на защиту.

1) Молекулярный маркер для идентификации аллельного состояния гена красной окраски перикарпа риса Re.

2) Методика ранней диагностики краснозёрной примеси в посевах риса, основанная на применении созданного молекулярного маркера.

3) Обоснование причин возникновения краснозёрных форм белозёрных сортов риса на основе молекулярно-генетического подхода.

4) Микросателлитные молекулярные маркеры, информативные для идентификации indica/japónica сортообразцов растений рода Oryza.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования были доложены и одобрены на заседаниях методического совета ВНИИ риса в 2007 - 2010 гг., а также были представлены на международной научно-практической конференции «Селекция сортов риса, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, для стран умеренного климата и Центральной Азии» (Краснодар, 27-29 августа 2008 г.); XVII международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция. Охрана природы. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 13-21 сентября 2008 г.); IX молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2009 г.); V московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2009 г.); конкурсе молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу (Москва, 16-20 марта 2009 г.); 14 международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); 15 международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 г).

Публикации результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, рекомендаций селекционной практике и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включающих 17 таблиц и 31 рисунок. Список использованной литературы включает 171 источник, в том числе 151 - иностранных авторов.

Автор выражает большую благодарность за оказанную методическую помощь доценту кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета Т. В. Матвеевой, а также Д. И. Богомазу, ассистенту лаборатории генной и клеточной инженерии растений Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Содержание работы

1 Обзор литературы

На основе анализа актуальных литературных источников в главе приводится обзор основных типов молекулярных маркеров и маркерных систем. Обобщена информация о дифференциации растений риса на подвиды indica/japónica и освещена проблема появления краснозёрных форм риса.

2 Материал и методы

Исследования проводили с 2007 г. по 2010 г. в лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского института риса.

Апробацию созданного молекулярного маркера к гену Re красной окраски перикарпа риса проводили на контрастных по изучаемому признаку сортах риса из коллекции ВНИИ риса; а также на белозёрных сортах и их КФ любезно предоставленных заведующим кафедры генетики, селекции и семеноводства агрономического факультета КубГАУ профессором Г. JI. Зеленским. Эти же белозёрные сорта и их КФ были изучены на предмет генетического родства с использованием микросателлитных маркеров.

Также апробацию молекулярного маркера к гену Re проводили на девятнадцати краснозёрных линиях Oriza sativa Red, любезно предоставленных доцентом кафедры общей биологии и экологии экологического факультета Куб-ГАУ О. В. Зеленской.

Полевую апробацию созданного молекулярного маркера проводили на материале, взятом из питомника испытания потомств первого года (ПИП1) лаборатории семеноводства и семеноведения ВНИИ риса: 390 семей сорта Атлант, 98 семей сорта Ренар и 654 семьи сорта Флагман. Под семьёй понимается потомство одного растения; каждая такая семья состоит из 120 растений, выросших из семян, собранных с одной метёлки.

Полевой опыт проводили, группируя растения по 120 штук, что соответствует количеству растений в одной семье/рядке. Выделение ДНК, как и последующую амплификацию, осуществляли в группах из всех 120 растений. Таким образом, ДНК всех растений одной семьи/рядка была объединена в одной пробирке. Соответственно, наличие/отсутствие бэнда (бэнд - след фрагмента ДНК в агарозном или акриламидном геле, визуализируемый после электрофоретиче-ского разделения продуктов ПЦР) будет указывать на наличие/отсутствие крас-нозёрного растения в семье.

Изучение подвидов indica/japónica SSR маркерами проводили с использованием 40 референсных indica и japónica сортообразцов из коллекции ВНИИ риса.

Для выделения ДНК использовали бесхлорофилльные семидневные проростки, полученные путем инкубации на увлажненной фильтровальной бумаге в темноте при температуре 25-27 °С.

Для выделения ДНК при полевом эксперименте в одну пробирку отбирали по кусочку листа одинакового размера (0,5 см длиной) со всех растений в пределах семьи (рядка).

Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод (Murray и Thompson, 1980).

s

Концентрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрически по стандартной методике (Маниатис и др., 1984), а также по интенсивности окрашивания ДНК бромистым этидием в агарозном геле (Остерман, 1981).

Для разработки дизайна праймеров при создании внутригенного ДНК-маркера к гену Rc окраски перикарпа краснозёрного риса использовали нук-леотидные последовательности из базы данных www.ncbi.nih.gov. Затем было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритма «multiple alignment» в программе CLUSTALW (Hall, 1999).

На наличие димеров и петлей праймеры анализировали с использованием программы Vector NTI 10.3.0 (Invitrogen, 2006).

В работе по определению степени генетического родства белозёрных сортов и их краснозёрных форм, а также в работе по выявлению аллелей приоритета у растений риса подвидов indica и japonica использовали 30 микроса-теллитных маркеров (SSR), которые отобрали из базы данных www.gramene.org.

Амплификацию осуществляли наборами для проведения ПЦР (компания Сибэнзим, г. Новосибирск, Россия) в реакционном объеме 25 (iL. Параметры ПЦР смеси: в 25 цЬ смеси содержится 0,8 jig геномной ДНК, 1х ПЦР буфер (20 тМ Трис-НС!, рН 8,4, 50 mM КС1), 0,1 тМ каждого dNTP (дезоксинуклеотид-трифосфат), 1 ед. Taq-полимеразы (1,5 ед. Taq-полимеразы в опыте с разведениями ДНК), а также 0,23 цМ каждого праймера.

Амплификацию проводили при следующих условиях: 4 минуты при 94 °С, далее 30 циклов (35 циклов в опыте с разведениями ДНК при апробации маркера к гену окраски перикарпа Rc) (30 с - 94 "С, 30 с - Т °С, 30 с - 72 °С), далее 8 мин - 72 "С. Т °С - индивидуальная температура отжига каждой пары праймеров.

При апробации маркера к гену Rc температура отжига праймеров составляла 62 °С при использовании обеих праймерных пар и 58 °С при использовании одной праймерной пары в опыте с разведениями ДНК.

В опытах по апробации маркера к гену Кс для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 2% агарозный гель на основе ТБЕ. Электрофорез проходил при напряжении 120 V в течение 30 минут.

При микросателлитном анализе для электрофоретического разделения продуюгов ПНР использовали 8% полиакриламидный гель на основе ТБЕ. Электрофорез проходил при напряжении 220 V в течение 240 минут.

Визуализацию проводили в ультрафиолете после окрашивания гелей бромистым зтидием. Размер аллелей определяли путем сравнения со стандартным образцом. Идентификацию и определение размеров аллелей проводили с использованием программы Ое1Рго 32.

Статистическую обработку данных проводили в программе БТАШТССА

6.0.

3 Результаты исследований

3.1 Создание маркера к гену красной окраски перикарпа риса 11с

После выравнивания нуклеотидных последовательностей аллелей Яс (красный и коричневый перикарп), Яс-б (розовый перикарп) и гс (неокрашенный перикарп), была локализована функциональная делеция из 14 пар оснований (п. о.) аллеля гс белозёрного риса - АСвСвААААСГССО.

В соответствии со всеми необходимыми условия, были подобраны подходящие участки ДНК, на которые можно производить отжиг праймеров.

Затем были сконструированы две праймерные пары:

1) - ССААСТСОААСССОААААСТ;

2) Ш - ТТССААТСГТСОТТАСАОСС;

3) Р2 - АСААСАСШАСАСТСАААОС;

4) И2 - ОАААТСАССПХ!ЮАТОССАТСС.

На рисунке 1 показан принцип работы маркера к гену Яс. Два праймера являются аллельспецифичными, а два других - нет.

ю

422 л.о.

Red —СЕ

White —ГТ2

790" °

Рисунок 1 — Принцип работы аллельспецифичных кодоминантных праймеров

к гену Rc

Примечание — Аллели Rc/Rcs/Rc+ изображены на рисунке как один и обозначены «Red», а под обозначением «White» принят аллель гс; цифры, изображённые чёрным, показывают длину искомого фрагмента - пар оснований (п. о.), а цифры серым - расстояние or F2 до R2 на обоих аллелях; жирным пунктиром показана делеция в 14 п. о., тонким пунктиром - участки, идентичные между аллелями; стрелками - направление синтеза.

В первой паре праймеров - прямом (Forward) и обратном (Reverse), F1 и R1 соответственно, праймер F1 - специфичен аллелям Rc/Rcs/Rc+ коричневого/красного/розового риса, так как в данной точке посадки праймера эти три аллеля не проявляют полиморфизма между собой. Но F1 не может отжигаться на аллеле гс белозёрного риса, так как большая часть F1, а именно 11 пар оснований из 20 - ACGCGAAAAGT, попадает на зону делеции в 14 пар оснований. В тоже время, R1 может отжигаться как на ДНК краснозёрного, так и белозёрного риса, то есть праймер отжигается на участке, где полиморфизма между всеми четырьмя аллелями гена Rc не выявлено.

Во второй паре, F2 и R2, - F2 не является аллельспецифичным и может отжигаться на всех четырёх аллелях гена Rc - белозёрных и краснозёрных формах риса. R2 является специфичным аллелю гс белозёрного риса в полиморфном участке (делеция 14 пар оснований у гс аллели) между гс и Rc/Rcs/Rc+ аллелями, то есть R2 не отожжется на аллелях Rc/Rcs/Rc+.

Варианты прохождения ПЦР и ожидаемые длины продуктов реакции описаны в таблице 1.

и

Таблица 1 — Варианты прохождения ПЦР при различных комбинациях праймерных пар и ДНК образцов при идентификации аллельного состояния гена краснозёрности Лс

ДНК.краснозёрных м риса (гомозиготы по локусу Rc. Res или Rc -1 ДНК белозёрных форм 1 ДНК краснозёрного риса (гомозиготы по гетерозиготного рас-локусу гс) , тения (Ксгс) либо 1 смесь ДНК красно- я . *. " . о' , ^

г, л + 5 fc Амплифицируется участок доминантного аллеля гена Rc длиной 422 п. о.; праймер R2 участвовать в реакции не будет, т.к. отсутствует его сайт отжига, соответственно, количество копий участка F2-F1(cm. рисунок 1) будет мизерным Амплифицируется участок рецессивного аллеля гена гс длиной 790 п. о.; праймер Р1 участвовать в реакции не будет, т.к. отсутствует его сайт отжига, соответственно, количество копий участка Rl-R2 (см. рисунок 1) будет мизерным Амплифицируются участки и доминантного аллеля гена Rc (длина продукта 422 п. о.) и рецессивного (длина продукта 790 п. 0.)

F1R1 Амплифицируется участок доминантного атлеля гена Rc длиной 422 п. о. Амплификации не произойдёт, т.к. отсутствует сайт отжига праймера Р1 Амплифицирован будет только участок доминантного аллеля гена Яс длиной 422 п. 0.

1 Амплификации не произойдёт, т.к. отсутствует сайт отжига праймера R2 Амплифицируется участок рецессивного аллеля гена гс длиной 790 п. о. Амплифицируется участок рецессивного аллеля гена гс длиной 790 п. о.

Примечание - п. о. - пар оснований

Температура отжига праймеров была подобрана нами эмпирически и составила 62 °С.

Эффективность маркера была проверена на 9 образцах белозёрного риса и 27 краснозёрного. Результаты проверки 5 краснозёрных и 3 белозёрных сор-тообразцов риса представлены на рисунке 2. Из иллюстрации следует, что все изученные краснозёрные образцы риса являлись гомозиготами по гену Яс, а все изученные белозёрные сорта риса несли рецессивный аллель гена Яс.

МП/ 12. 3 4- 5 6 7 8 ИМ

" ... I 1.111МЁ1 '^№...11 |'..1 .1.11 ^ I "I-"""Л. ■

Ёк,

Рисунок 2 — Аллельные различия гена Яс у краснозёрных и белозерных сортообразцов коллекции ВНИИ риса

Примечание — 1 - Карат, 2 - Рубин, 4 - Павловский-Лес!, 6 - Спринт-Яес1, 8 - Привольный-Яеё (краснозёрные); 3 - Хазар, 5 - Павловский, 7 -Спринт (белозёрные); латинскими буквами «М\¥» обозначен маркер молекулярного веса; фрагмент, на который указывает стрелка, соответствует 800 п. о.

Затем решили определить порог чувствительности разрабатываемой методики для выявления минимальной примеси доминантного аллеля в пробе. С этой целью постановку ПНР проводили с различным соотношением ДНК образцов красно- и белозёрного риса в качестве матрицы в одной реакционной смеси.

Для экстракции ДНК брали строго по 0,15 г биомассы бесхлорофилльных семидневных проростков белозёрного сорта Павловский и краснозёрного Карат. Концентрация выделенной ДНК составила 800 ^/¡лЬ в обеих пробах. После этого ДНК сорта Карат разводили деионизированной водой в 50, 100, 200, 500 и 1000 раз. Затем неразбавленную ДНК сорта Павловский и разбавленную ДНК сорта Карат смешивали 1:1. В результате получалось соотношение ДНК краснозёрного риса к белозёрному 1:50 (2% краснозёрной примеси), 1:100 (1% краснозёрной примеси), 1:200 (0,5% краснозёрной примеси), 1:500 (0,2% краснозёрной примеси), 1:1000 (0,01% краснозёрной примеси).

При постановке ПЦР с разведениями ДНК в присутствии обеих пар праймеров, Р1 Ш и Р2 Я2, доминантный аллель гена Лс не идентифицировался. При постановке ПЦР только с парой праймеров П Ш, идентифицирующих до-

минантный аллель гена 11с, увеличив при этом количество циклов реакции до 35 и снизив температуру отжига праймеров до 58 °С, доминантный аллель гена Яс чётко визуализировался в разбавлениях вплоть до 200.

В результате полевого опыта, проведенного в питомнике испытания по-томств первого года (ПИП1) сортов Атлант, Ренар и Флагман, ни в одной из изученных семей не было обнаружено доминантного аллеля гена 11с.

Маркерная система может работать при использовании как обеих пар праймеров, так и при использовании каждой пары в отдельности. Критерием выбора праймеров являются задачи анализа.

Если необходимо провести анализ каких-то определённых растений целесообразно использовать обе пары праймеров. Это позволит определить аллель-ное состояние гена Яс.

Если необходимо провести скрининг большого количества образцов с целью выявить в группе белозёрных растений одно или несколько краснозёрных, например, в питомниках первичных звеньев семеноводства, где информация об аплельном состоянии изучаемого гена не будет важна, целесообразно использовать только праймерную пару Ш.

В условиях производственных посевов риса массовый ПЦР-анализ не представляется возможным и целесообразным. В тоже время, произвести отбор образцов с каждого растения в пределах отдельной делянки, если дело касается, например, питомника испытания потомств (первичные звенья семеноводства), вполне возможно. Соответственно, предлагаемая методика предполагает выделение ДНК из общей биомассы отобранных листьев (в онтогенезе растения -стадия второго-третьего настоящего листа) всей семьи с последующей постановкой ПЦР и электрофореза.

В случае обнаружения гена краснозёрности в исследуемой группе (семье) растений эта группа полностью элиминируется из питомника испытания потомств первого года (ПИП1). Если же необходимо точно идентифицировать краснозерное растение, проводится ПЦР-анализ каждого растения делянки.

3.2 Изучение генетической основы феномена краснозёрных форм белозёрных сортов риса на основе молекулярно-генетического подхода

Если причиной возникновения краснозёрных форм (КФ) является точко-вая мутация, то сорт и его КФ будут генетически идентичны, за исключением локуса, в котором произошла мутация.

Основываясь на результатах попарного сравнения аллельного состояния микросателлитных локусов ДНК сортов и их КФ, можно сделать вывод об их генетической близости: чем меньше идентичных аллелей - тем меньше генетическое родство.

В результате эксперимента получена информация о полиморфизме 27 исследованных микросателлитных локусов у десяти сортов риса и их КФ (всего 20 образцов).

Из использованных в работе микросателлитных маркеров, наиболее высокий уровень полиморфизма показали маркеры 11ш217, Кт266, Яш70 и Яш 164 — 8, 10, 12 и 13 аллелей по каждому из маркируемых локусов, соответственно.

На рисунке 3 показан полиморфизм локуса Ят70 у восьми пар сорт/КФ. Из приведённого рисунка видно, что в пределах всех пар сорт/КФ имеются ал-лельные различия - они максимальны в паре сорта Изумруд и его КФ, минимальны в парах сортов Павловский и Привольный с их КФ.

После идентификации аллелей и определения их размеров, была произведена нумерация аллелей по каждому из маркеров следующим образом: аллель с минимальным значением молекулярного веса принимали за нулевой и обозначали как «0», аллели с большим молекулярным весом нумеровали по разнице между ним и нулевым аллелем. Подобный способ нумерация широко применяется во многих исследованиях по изучению генетического разнообразия и позволяет наглядно отображать разницу в размерах аллелей (генетическое сходство/различие образцов) по каждому микросателлитному маркеру (Реу! е1 а!., 2001).

Рисунок 3 — Генетическое разнообразие, выявленное в локусе Яш70 у белозёрных сортов риса и их КФ

Примечание — «мв» - маркер молекулярного веса ДНК (отмечены бэнды 124,184 и 192 пары оснований); буквами: «б» - белозёрный сорт риса, «к» - его КФ; цифрами 1 -8 - электрофорегические позиции продуктов ПЦР различных сортов риса и их КФ: 1 - Изумруд; 2 - Краснодарский-86; 3 - Кубань-3; 4 - Лиман; 5 - Павловский; 6 - Привольный; 7 - Соната; 8 - Спринт.

Больше половины выявленных аллелей встречаются либо только у белозёрных сортов риса, либо только у их КФ. Так, например, из 12 аллелей, выявленных маркером Яш70, только два являются общими для белозёрных сортов и КФ.

Наличие одинаковых аллелей по многим маркерам для изученных белозёрных сортов может свидетельствовать, кроме того, об их относительной генетической близости, что является вполне типичным для сравнительно небольших генетических коллекций исходного селекционного материала.

В таблице 2 наглядно приведены результаты сравнения аллельного состояния микросателлитных локусов шести белозёрных сортов и их КФ.

Разнокачественность аллельных состояний в большинстве изученных микросателлитных локусов в парах сорт/КФ указывает на то, что изученные КФ не могли возникнуть в ходе точковой мутации. Скорее всего, происходит переопыление белозёрных сортов риса сорно-полевыми краснозёрными формами, которые обладают такими свойствами как осыпаемость и способность к

покою, наряду с генетическим разнообразием и неоднородностью. В дальнейшем у краснозёрного потомства происходит самоопыление, в результате чего оно становится схоже с районированными сортами и «выравнивается» с ними.

Таблица 2 — Аллельное разнообразие в 30 микросателлитных локусах 6 белозёрных сортов риса и их КФ

Маркер Бластоник Кубань-3 Павловский Спринт Виктория Изумруд

Б к Б к Б к Б К Б К Б к

Rm70 151 27 42 30 3 0 6 0 3 27 48 30

Rml64 4 0 20 62 16 64 22 42 16 18 20 4

Rm210 2 0 2 6 2 6 2 6 2 0 2 4

Rm217 0 2 4 22 4 18 4 4 4 0 0 22

Rmlt 4 6 8 8 12 0 2 6 0 10 2 8

Rml8 0 4 0 4 0 2 0 2 0 0 I 2 0

Rml9 0 3 : 0 0 0 9 0 0 0 6 0 6

Rml48 0 4 0 2 0 6 0 2 0 6 0 2

Rml68 0-V 0 0 4 0 2 2 3 0 5 2 3

Rm204 2 0 4 6 2 0 2 6 2 0 4 0

Rni206 0 0 0 4 8 8 4 оП 2 о 2 4 1

Rm247 б 2 10 10 10 2 0 Г 6 0 2 10 2

Rm266 4 2 2 2 10 18 22 20 8 4 8 2

Rm!7 2 4 0 4 2 4 2 4 4 2 4 4

Rml67 24 26 22 30 1 0 30 24 26 22 26 26 26

Rml 90 2 0 8 8 14 8 6 6 6 8 6 0

Rm224 0 2 0 8 0 0 16 16 2 8 0 8

Rm260 2 2 4 8 \ 0 2 4 8 2 8 2 2

Rml 4 0 12 12 6 6 2 0 6 0 4 4

Rml3 0 0 0 26 0 0 2 0 0 ' 26 0 2

Rml 22 12 12 4 4 2 2. 12 10 2 2 12 8 '

Rjri219 2 2 2 4 2 4 2 4 2 2 2 2

Rm7 2 2 2 0 2 2 2 2 2 0 2 4

Rm20 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 3

Rm2!8 0 0 0 4 6 6 4 4 0 0 0 6

Rm24 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0

Rml51 0 0 0 о 0 0 0 0 0 0 0 42

Примечания 1 Указаны номера аллелей 2 Буквами «Б» и «К» обозначены белозерный сорт и КФ соответственно 3 Серым цветом выделены номера аллелей, не проявившие полиморфизма в паре сорт/КФ

На основании комплекса данных о частоте встречаемости и размере аллелей у исследованных образцов, была проведена кластеризация методом Уорда (Ward. 1963). Результаты кластеризации представлены на рисунке 4.

Бластоник Изумруд Кубань-3 Соната Лиман Виктория Павловский Спринт Краснодарски й-86 Привольный Бластоник Red Виктория Red Изумруд Red Привольный Red Краснодарский-86 Red Спринт Red Павловский Red Соната Red Кубань-3 Red Лиман Red

О

6

Рисунок 4 — Кластерный анализ изученных белозёрных сортов риса и их КФ по данным микросателлитного маркерного анализа

Примечание — По оси ординат указаны названия образцов в порядке их генетического родства, а по оси абсцисс - «расстояние» между образцами, выраженное в условных единицах; Словом «Red» обозначены краснозёрные формы

При разрезании кластерного иерархического дендрита, приведённого на рисунке 4, по расстоянию 1,0 условных единиц выделились два кластера. Все белозёрные сорта вошли в один кластер, а все КФ - в другой. Таким образом, каждый отдельно взятый сорт генетически ближе с другими исследованными белозёрными сортами, нежели со «своими» КФ, которые, в свою очередь, намного больше генетически близки друг с другом, а не с сортами.

Исходя из этого, можно считать правомерным предположение о том, что в производственных посевах риса краснодарской зоны рисосеяния преобладает одна популяция или группа генетически близких популяций красиозёрных сор-но-полевых форм.

Расстояние объединения

3.3 Поиск молекулярных маркеров, информативных для под видовой идентификации растений Oryza sativa L.

Методами молекулярной биологии, в частности молекулярного маркирования, непосредственно связанного с ДНК, возможно выявление маркеров, специфичных для подвидов indica и japónica. Для этой цели нами была апробирована система маркирования микросателлитных локусов ДНК риса.

Все использованные в данном эксперименте маркеры, кроме одного (Rml51), проявили полиморфизм. Один маркер (3,3% от общего числа) проявил низкую степень полиморфизма, выявив всего два аллеля по локусу Rm20. Максимальный уровень полиморфизма был выявлен маркерами Rm70, Rm210 и Rm224 - 10 аллелей по каждому маркеру.

Аллельная миграция в локусе Rm247 представлена на рисунке 5.

Рисунок 5 — Аллельное разнообразие, выявленное в локусе Rm247 у 9 indica и 7 japónica сортообразцов риса

Примечание — «мв» - маркер молекулярного веса ДНК (отмечены бэнды 124 и 184 пары оснований); буквами: «и» - сортообразец indica, «я» - сортооб-разец japónica; цифрами 1-16 - электрофоретические позиции продуктов ПЦР различных indica/japónica сортообразцов риса

Все выявленные в локусе Rm247 аллели сортообразцов indica имели меньший молекулярный вес, по сравнению с аллелями сортообразцов japónica.

После определения размеров аллелей в соответствии с маркером молекулярного веса ДНК, была произведена нумерация аллелей по каждому из маркеров.

При проведении кластерного анализа, основанного на данных о частоте встречаемости аллелей, образцы чётко разделились на два кластера - в первый вошли все изученные indica сортообразцы, а во второй-japónicaсортообразцы.

Проявившие в данном исследовании полиморфизм маркеры можно разделить на три группы:

— выявившие одинаковые аллели у растений подвидов indíca/japonica;

— выявившие одинаковые аллели у растений подвидов indica/japónica, за исключением одного или двух аллелей;

— выявившие уникальные специфичные либо подвиду indica, либо подвиду japónica аллели.

12 маркеров, несущих indica/japónica специфичные аллели перечислены в таблице номер 3.

Таблица 3 — Аллели приоритета, выявленные в микросателлитных локусах ДНК растений риса подвида indica и japónica

Маркер Indica Japónica

Rm7 170*, 172,180,182 176,178

Rm9 128, 132,136 180,184,188,190

Rml3 143 129,131

Rml8 153,157 159,165

Rml9 222,225 219

Rm20 234 212

Rm25 146,148,154 120, 138,140,144

Rml48 133, 135, 137 131

Rml64 226,280,284 270,282,286,288

Rml68 100,101,102,103 94,96

Rm217 140,142,144,150,154 120, 122, 124

Rm247 131,135 153,155,165

Примечание - Размер аллелей указан в парах оснований

Большинство маркеров имели по несколько аллелей, специфичных для подвидов. По трём маркерам - Ят9, Кт18 и Ят247 - размер аллелей, специ-

фичных для растений подвида indica, был меньше веса аллелей растений подвида japónica. По маркерам Rm25, Rml68 и Rm217 размер аллелей, специфичных для растений подвида indica, был больше молекулярного веса аллелей, специфичных для japónica сортообразцов.

Таким образом, из всех изученных микросателлитных маркеров, для под-видовой идентификации сортообразцов риса максимально удобным с чётко интерпретируемым результатом является маркер Rm20, который имеет только по одному аллелю для каждого подвида с большой аллельной разницей. Также, к наиболее удобным маркерам можно отнести Rm9, Rml3, Rm217 и Rm247. Перечисленные маркеры имеют по несколько аллелей приоритета для каждого подвида, но большая аллельная разница позволяет чётко дифференцировать образцы по подвидовой принадлежности.

Выводы

1 Созданный для контроля чистоты от краснозёрной примеси питомников размножения в первичных звеньях семеноводства риса кодоминантный молекулярный маркер к гену красной окраски перикарпа риса Re позволяет чётко различать аллельные состояния гена Re - доминантное (краснозёрность) и рецессивное (белозёрность).

2 ПЦР с созданными праймерами к гену Re может эффективно проходить при различных соотношениях ДНК-матрицы краснозёрных и белозёрных форм риса в реакционной смеси и иметь чётко визуализируемые при электро-форетическом разделении продукты реакции при соотношении вплоть до 1:200 растений, соответственно.

3 Разработанная методика выявления краснозёрных растений риса в посевах, основанная на использовании созданного молекулярного маркера к гену Re, позволяет в упредительной форме на стадии второго-третьего настоящего листа обнаружить наличие доминантного аллеля гена Re. Предлагаемая методика способна выявить одно краснозёрное растение в группе до 200 растений

риса, что находится в интервале предельно допустимого по ГОСТу уровня засорения краснозёрной примесью для репродукционных семян.

4 Ни одного краснозёрного растения не было обнаружено при проведении скрининга 137040 растений из 1142 семей питомника испытания потомств первого года с использованием разработанной методики.

5 Краснозёрные формы (КФ), возникающие в производственных посевах белозёрного риса, по большинству изученных микросателлитных локусов сильно отличаются от белозёрных сортов. Таким образом, КФ не могли произойти в результате точковой мутации гена Re, а являются следствием переопыления сорно-полевыми краснозёрными формами риса.

6 Проводить ранжирование сортообразцов Oryza sativa L. на подвиды indica и japónica в селекционном процессе представляется возможным с помощью 12 выявленных специфичных микросателлитных локусов ДНК, которые позволяют дифференцировать растения используя только молекулярные методы.

Предложения для практической селекции

1 Использовать разработанную на основе созданного молекулярного маркера гена Re упредительную методику для контроля краснозёрной примеси в посевах питомников первичных звеньев семеноводства.

2 В связи с тем, что краснозёрные формы возделываемых в производственных условиях белозёрных сортов риса являются следствием переопыления сорно-полевыми формами, а не результатом мутационного процесса, совершенствовать агротехнические методы как главные в борьбе с засорённостью посевов краснозёрной примесью.

3 В селекционных программах использовать микросателлитные маркеры Rm20, Rm9, Rml3, Rm217 и Rm247 как информативные и наиболее удобные для оценки родительских форм и гибридного потомства на принадлежность к подвиду риса indica или japónica, избегая трудоёмких и не всегда однозначных физиологических методов.

Список работ, опубликованных по материалам исследований

Публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК

1 Токмаков, С. В. Разработка экспресс-методики идентификации гена Re

(красная окраска перикарпа) в исходном селлекционном материале риса / С. В. Токмаков // Труды КубГАУ. - Краснодар, 2009. - Вып. № 2 (17). - С. 167-169.

2 Токмаков, С. В. Изучение феномена возникновения «краснозерных фенокопий» белозерных сортов риса на основе молекулярно-генетического подхода / С. В. Токмаков, Е. В. Дубина, Ж. М. Мухина // Труды КубГАУ. -Краснодар, 2011. - Вып. № 2 (29). - С. 97-100.

3 Токмаков, С. В. Молекулярное маркирование в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу / С. В. Токмаков, Е. В. Дубина, Ж. М. Мухина // Труды КубГАУ. - Краснодар, 2011. - Вып. № 2 (29). - С. 132-134.

4 Токмаков, С. В. Создание внутригенных молекулярных маркеров риса для повышения эффективности селекционного и семеноводческого процессов / Ж. М. Мухина, С. В. Токмаков, Ю. А. Мягких, Е. В. Дубина// Научный журнал КубГАУ [Электронный ресурс]. - Краснодар : КубГАУ, 2011. - №67(03). -Шифр Информрегистра: 042110001240105. - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2011/03/pdf/19.pdf

5 Токмаков, С. В. Создание молекулярного маркера для оценки внутривидового полиморфизма по гену Re, обуславливающему красную окраску перикарпа риса Oryza saliva L. / С. В. Токмаков, Ж. М. Мухина, Д. И. Богомаз, Т. В. Матвеева // Экологическая генетика. - Санкт-Петербург, 2011. - Том IX. -Вып. №3,-С. 57-67.

Публикации в других изданиях

6 Токмаков, С. В. Молекулярно-генетический подход к созданию исходного материала в программах селекции риса / Ю. А. Мягких, Ж. М. Мухина, С. В. Токмаков // Селекция сортов риса, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, для стран умеренного климата и Центральной Азии: материалы международной научно-практической конференции (27-29 августа 2008 г.) / ВНИИриса - Краснодар, 2008. - С. 60-63.

7 Токмаков, С. В. Идентификация гена расоспецифической устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta / Ж. М. Мухина, Ю. А. Мягких, С. В. Токмаков // Нетрадиционное растениеводство. Селекция. Охрана природы. Эниология и здоровье: материалы XVII Международного симпозиума (13-21 сентября 2008 г.) / КМИНРЭЗ. - Алушта, 2008. - С. 472-473.

8 Токмаков, С. В. Создание кодоминантного молекулярного ПЦР-маркера для идентификации гена расоспецифической устойчивости к пирикуляриозу риса Pi- ta / Ж. M. Мухина, Ю. А. Мягких, Д. И. Богомаз, Т. В Матвеева, С. В. Токмаков // Рисоводство. - Краснодар, 2008. - №12. - С. 3-5.

9 Токмаков, С. В. Разработка метода идентификации гена Re красной окраски перикарпа риса (Oryza sativa L) для ранней диагностики краснозёрных форм в первичных звеньях семеноводства 1С. В. Токмаков, Ж. М. Мухина // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: материалы IX молодёжной научной конференции (8 апреля 2009 г.) / ВНИИ с.-х. биотехнологии. -Москва, 2009. - С. 37.

10 Токмаков, С. В. Создание внутригенных ДНК-маркеров и их использование в практической селекции риса / Ж. М. Мухина, И. И. Супрун, Е. Т. Ильницкая, С. А. Волкова, Ю. А. Мягких, Е. В. Дубина, С. В. Токмаков // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы V московского международного конгресса (16-20 марта 2009 г.) / Москва, 2009. - С. 261.

11 Токмаков, С. В. Применение методов молекулярного маркирования для создания исходного материала риса для селекции / Ю. А. Мягких, Ж. М. Мухина, С. В. Токмаков // Рисоводство. - Краснодар, 2009. - №14. - С. 17-19.

12 Токмаков, С. В. Создание внутригенного маркера к гену Re окраски перикарпа краснозёрного риса {Oryza sativa L.) / С. В. Токмаков, Ж. М. Мухина, Ю. А. Мягких, В. А. Янченко // Рисоводство. - Краснодар, 2009. - №15. - С. 3437.

Подписано в печать 29.11.2011 г. Бумага офсетная Печ. л. 1 Тираж 100 экз.

Формат 60x84 1/16 Офсетная печать Заказ №848

Отпечатано в типографии Куб ГАУ 350044,г. Краснодар, ул. Калинина, 13

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Токмаков, Сергей Вячеславович, Краснодар

61 12-3/382

Российская академия сельскохозяйственных наук Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт

риса

¿К*.

у'„

у"

На правах рукописи

Токмаков Сергей Вячеславович

ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОДХОДА В ИЗУЧЕНИИ ПРИЗНАКОВ РИСА, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВЕ

Специальность: 06.01.05. — селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

к. б. н. Ж. М. Мухина

Краснодар 2011

Содержание

Введение.......................................................................3

1 Обзор литературы...........................................................8

1.1 Молекулярные маркеры и основные маркерные системы................8

1.2 Общие сведения о культуре Oryza sativa L..................................15

1.2.1 Общие сведения о биологии..................................................16

1.2.2 Общие сведения о генетике..................................................17

1.2.3 Разделение на подвиды indica и japónica..................................19

1.2.3.1 Физиолого-морфологические методы подвидовой идентификации............................................................................................20

1.2.3.2 Молекулярно-генетические методы подвидовой идентификации.......................................................................................22

1.2.4 Феномен краснозёрности.....................................................39

1.2.4.1 Генетические основы признака окраска перикарпа

зерновки риса.........................................................................................40

1.2.4.2 Проблема диких и сорно-полевых форм риса............................44

1.2.4.3 Переопыление сорно-полевыми формами риса...........................52

2 Материал и методы.....................................................57

2.1 Материал исследований...........................................................57

2.2 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК................59

2.3 Нуклеотидные последовательности, использованные при разработке маркера к гену Re..................................................................................61

2.4 Молекулярные маркеры, использованные в работе..........................62

2.5 Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации.........................................................................64

2.6 Статистическая обработка данных...............................................66

3 Результаты и обсуждение.............................................68

3.1 Создание маркера к гену красной окраски перикарпа риса Re.........68

Определение порога чувствительности методики и полевой эксперимент.........................................................................................75

3.2 Изучение генетической основы феномена краснозёрных форм белозёрных сортов риса на основе молекулярно-генетического подхода...........83

3.3 Поиск молекулярных маркеров, информативных для подвидовой идентификации растений Oryza sativa L......................................................100

Выводы......................................................................118

Предложения для практической селекции...............................120

Список использованных источников..................................121

Введение

Актуальность проблемы.

Роль ДНК-технологий в современных сельскохозяйственных науках трудно переоценить. Несомненно, в значительной мере эта роль касается селекции, изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов. Но кроме обозначенных вопросов с помощью ДНК-технологий можно решать и такие прикладные задачи, как защита авторских прав селекционеров, защита продукции растениеводства от фальсификации и определение её качества и генетической чистоты.

Возможности ДНК-маркеров во много раз превосходят потенциал изо-ферментов или запасных белков. Кроме того, проявление таких молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является тканеспецифич-ным и их можно обнаружить на любой стадии развития растений [Хавкин, 1997].

Ввиду высокой актуальности проблемы засоренности производственных посевов риса краснозерными формами для ее решения необходим комплексный научно-производственный подход, который предполагает глубокое знание генетических причин возникновения краснозерности. Особое значение здесь приобретает технология молекулярного маркирования.

Краснозёрная примесь бывает представлена так называемыми краснозерными формами (КФ) районированных сортов. Габитусом они схожи с растениями возделываемых сортов по всем признакам, кроме окраски перикарпа.

Разработка методики идентификации гена окраски перикарпа риса Ыс, позволит проводить скрининг генетической плазмы для выявления краснозёрных растений на любом этапе селекционно-семеноводческой программы вне зависимости от фазы онтогенеза растений.

Использование микросателлитных маркеров позволяет выполнять широкий спектр задач для прикладной и фундаментальной науки. Помимо определения генетического родства и степени генетического разнообразия, с помощью

таких нейтральных, не сцепленных с каким либо признаком, маркеров можно отслеживать такие комплексные характеристики, как подвидовая принадлежность сортов риса - indica или japónica.

Распространенные методы идентификации подвидов весьма сложны, комплексны и результаты их не всегда однозначны. В ряде работ можно найти расхождение в результатах при дифференциации сортообразцов на подвид indica или japónica различными методами, связанными только с фенотипическим проявлением признака.

Наличие современной, удобной и точной методики подвидовой идентификации позволит упростить и ускорить селекцию риса на длиннозёрность.

Цель и задачи исследований.

Целью данного исследования являлась разработка методологических подходов использования молекулярно-генетических методов для идентификации краснозёрных форм и дифференциации генотипов риса на подвиды indica/japónica.

В проводимых исследованиях были поставлены следующие задачи.

1) Выявить полиморфизм гена красной окраски перикарпа риса Re и разработать праймерные пары, выявляющие аллельный полиморфизм при проведении полимеразной цепной реакции (ПНР).

2) Определить порог чувствительности созданных аллельспецифичных праймеров к гену Re при проведении ПЦР-анализа при различном соотношении ДНК образцов красно- и белозёрного риса в одной пробирке.

3) Провести изучение аллельного состояния гена Re с помощью разработанной маркерной системы у растений трёх сортов риса в питомнике испытания потомств первого года (первичные звенья семеноводства).

4) Произвести попарное сравнение аллельного состояния микросател-литных локусов ДНК растений белозёрных сортов риса и их краснозёрных форм (КФ) и определить степень генетической близости изученных образцов.

5) Изучить генетическое разнообразие референсных сортообразцов подвидов indica и japónica коллекции ВНИИ риса, используя микросател-

литный анализ и определить корреляцию между аллельным состоянием микросателлитных локусов ДНК и подвидовой принадлежностью изученных сортообразцов.

Научная новизна исследований.

— Разработан кодоминантный молекулярный маркер к гену красной окраски перикарпа риса Re и сопряжённая с ним методика упредительного выявления краснозёрной примеси в посевах риса.

— Впервые изучен феномен появления краснозёрных форм сортов в семеноводстве и при производственном выращивании риса на основе молекуляр-но-генетического подхода. Молекулярными методами продемонстрировано, что переопыление белозёрных растений краснозёрными сорно-полевыми формами риса следует считать основной причиной возникновения краснозёрных форм.

— Впервые проведён поиск приоритетных для подвидовой идентификации риса аллелей 30 микросателлитных локусов ДНК среди образцов коллекции ВНИИ риса. Выявлены аллели, приоритетные для подвидов indica и japónica, соответственно.

Научно-практическая ценность работы.

—- На основе созданного в рамках исследования ПЦР-маркера гена красной окраски перикарпа зерновки риса Re разработана упредительная методика выявления краснозёрной примеси в посевах первичных звеньев семеноводства риса до фенотипического проявления признака краснозёрно-сти, позволяющая элиминировать нежелательные генотипы из дальнейшего размножения на ранних стадиях онтогенеза растений.

— В ходе молекулярно-генетического анализа выявлена основная причина возникновения краснозёрных форм белозёрных сортов в производственных посевах риса - переопыление сорно-полевыми краснозёрными формами, а не мутации, смещающие рамку считывания гена окраски перикарпа, как предполагалось ранее. В этой связи агротехнические приёмы удаления с рисовых полей сорняков следует считать приоритетными в борьбе с сорно-

полевыми формами риса. Таким образом, для борьбы с краснозёрной примесью становится ясной приоритетность агротехнических приёмов для удаления с рисовых полей сорной растительности, включая сорно-полевые формы риса.

— С помощью выявленных в ходе исследования приоритетных для подвидов indica и japónica аллелей микросателлитных локусов ДНК представляется возможным проводить ранжирование сортообразцов на подвиды indica и japónica в селекционном процессе, основываясь не только на данных морфотипа.

Апробация работы.

Основные положения диссертационного исследования были доложены и одобрены на заседаниях методического совета ВНИИ риса в 2007 - 2010 гг., а также были представлены на:

— международной научно-практической конференции «Селекция сортов риса, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, для стран умеренного климата и Центральной Азии» (Краснодар, 27-29 августа 2008

г.);

— XVII международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция. Охрана природы. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 13-21 сентября 2008 г.);

— IX молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2009 г.);

— V московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2009 г);

— конкурсе молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу (Москва, 16-20 марта 2009 г.);

—14 международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г);

—15 международной пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 г).

Публикации результатов исследований.

По материалам исследований опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 в реферируемых журналах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, рекомендаций селекционной практике и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включающих 17 таблиц и 31 рисунок. Список использованной литературы включает 171 источник, в том числе 151 - иностранных авторов.

1 Обзор литературы

1.1 Молекулярные маркеры и основные маркерные системы

Многие исследователи относятся к молекулярным маркерам не просто как к новым признакам, позволяющим уточнить вопросы и проблемы, не решенные в рамках морфологического анализа, но буквально как к панацее. Такое увлечение молекулярными методами (молекулярными маркерами) во многих отношениях оправданно. Уже трудно представить дальнейшее развитие зоологии и ботаники без применения молекулярных методов. Успехи, как молекулярной филогенетики, так и филогеографии связаны не только со стремительным развитием ДНК-технологий (ПЦР, автоматическое секвенирование), но и с чёткой исследовательской программой, лёгкостью формализации получаемых данных и разработанными алгоритмами их анализа. Ещё одно неоспоримое преимущество молекулярных данных - сравнимость и воспроизводимость. Огромным достижением является создание международной базы данных, как по нуклеотидным, так и по аминокислотным последовательностям (http://www.ncbi.nim.gov/) [Абрамсон, 2009].

Генетические маркеры можно разделить на морфологические и молекулярные маркеры.

Морфологические маркеры. Первоначально в качестве генетических маркеров использовались морфологические (фенотипические) признаки. Например, с использованием маркеров этого типа в 1913 г. была построена первая генетическая карта (карта генома Drosophilla melanogaster). Однако количество информативных маркеров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды [Mohan et al., 1997].

Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генов (белковый или биохимический полиморфизм) и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК) [Сулимова, 2004].

Молекулярные маркеры можно разделить на белковые и ДНК-маркеры.

Белковые (биохимические) маркеры. Первыми молекулярными маркерами были маркеры, созданные на основе анализа белкового полиморфизма - так называемые биохимические маркеры. Помимо оценки уровня генетического полиморфизма видов, с их помощью были разработаны основные теоретические положения популяционной генетики [Алтухов, 1989].

К белковым маркерам относятся изоферментные системы и запасные

белки.

Биохимические методы исследования, особенно изоферментный анализ, предоставляют большие возможности для исследователей генетики риса. Идентифицируемые электрофоретически изоферменты часто используются для классификации видов и подвидов рода Огуга.

Одни из наиболее распространенных популяционно-генетических маркеров - эстеразы. Эстеразы - большая (не менее 20) группа ферментов, катализирующих расщепление сложноэфирных связей. По субстратам, которым они отдают предпочтения, их обычно разделяют на четыре типа: ацетилэстеразы, ари-лэстеразы, карбоксилэстеразы и холинэстеразы. Последние наиболее часто идентифицируется при традиционном электрофоретическом анализе различных организмов.

Преимущество белковых и ДНК-маркеров в том, что они расположены ближе других субстанций к носителю наследственной информации или сами являются ею [Созинов, 1985]. Но белковые маркеры имеют ряд существенных недостатков, связанных с тем, что анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрес-сирующихся генов.

Любая субстанция, претендующая на роль маркера, должна отвечать определенным требованиям. По мнению ряда исследователей, молекулярные маркеры должны обладать определенными свойствами и отвечать определенным требованиям: высокий уровень полиморфизма; кодоминантный характер наследования; оптимальный уровень встречаемости в геноме для решения конкрет-

ных задач; равномерное распределение в геноме по хромосомам; селективно нейтральное поведение; легкая оценка параметров маркера; возможность автоматизации оценки параметров маркера; высокая воспроизводимость оценки параметров маркера; возможность легкого обмена данными между лабораториями [Конарев, 1983; Созинов, 1985].

ДНК-маркеры. Нуклеотидные последовательности ДНК позволяют тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов и позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе и некодирующие.

ДНК-полиморфизм тестируют различными способами, включая прямое определение нуклеотидной последовательности интересующего исследователя участка (секвенирование) [Конарев, 1998].

ДНК-маркерные технологии условно можно разделить на две основные группы: с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и без таковой.

Молекулярное маркирование без применения ПЦР. Основной метод молекулярного маркирования без применения ПЦР - полиморфизм длин рестрикци-онных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) - стал возможным с открытием и выделением рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз). Суть данного метода заключается в том, что ДНК разрезается бактериальными рестриктазами в определённых специфических сайтах рестрикции [Льюин, 1987]. Затем продукты рестрикции разделяют в ага-розном геле, проводят блот-гибридизацию со специфическим меченым зондом и определяют длину рестриктных фрагментов на радиоавтографах [Чан, 1999].

ДНК-полиморфизм приведёт к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК и получению продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться [Алтухов и Салменкова, 2002].

Ещё одной методикой молекулярного маркирования без применения ПНР является ДНК-фингерпринт - "геномная дактилоскопия". Анализ проводится тем же способом, что и в случае ПДРФ, но в качестве специфического гибриди-

зационного зонда используются повторяющиеся последовательности - миниса-теллиты - многократно (тандемно) повторяющиеся последовательности из 9100 и более нуклеотидов.

Мощным толчком для создания новых типов ДНК-маркеров стало изобретение Кэри Мюллисом в 1983 г. метода амплификации in vitro определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полиме-разной реакции (ПЦР - полимеразная цепная реакци