Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование технологий ДНК-маркирования в селекционно-генетических исследованиях яблони

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Использование технологий ДНК-маркирования в селекционно-генетических исследованиях яблони"

На правах рукописи

УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ

Специальность: 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар -2015

005563738

005563738

Работа выполнена в Федеральном государственном научном бюджетном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства (ФГБНУ СКЗНИИСиВ) в 20082011 гг.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Супрун Иван Иванович Официальные оппоненты: Мухина Жанна Михайловна, доктор

биологических наук, заведующая лабораторией биотехнологии и молекулярной биологии ФГБНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт риса» Гучетль Сайда Заурбиевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунитета и молекулярного маркирования ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур имени B.C. Пустовойта»

Ведущая организация: ФГБНУ «Краснодарский научно-

исследовательский институт сельского хозяйства имени П.П. Лукьяненко»

Защита состоится «10» декабря 2015 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.03, созданного на базе ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13 (главный корпус, 1 этаж, к. 106), тел./факс (8-861) 221-57-93.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: г.Краснодар, ул. Калинина, 13 и на сайте http://www.kubsau.ru, с авторефератом - на сайтах: Высшей аттестационной комиссии -http://www.vak.ed.gov.ru и ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» — http://www.kubsau.ru.

Автореферат разослан «_»октября 2015 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

JI.B. Цаценко

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. Применение ДНК-технологий в селекции и генетике сельскохозяйственных культур позволяет значительно расширить область научных исследований: от изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов до защиты авторских прав селекционеров и продукции растениеводства от фальсификации, а также определение её качества и генетической чистоты.

Возможности ДНК-маркеров превосходят потенциал изоферментов и запасных белков. В связи с тем, что применение молекулярных маркеров не зависит от фенотипа растения, этапа вегетационного периода, и их использование позволяет напрямую характеризовать генотип, они приобретают все большую ценность при оценке степени генетического разнообразия, а также в исследованиях, направленных на идентификацию генов, участвующих в детерминации хозяйственно-ценных признаков. Особенно актуально использование ДНК-маркеров при идентификации генов устойчивости к заболеваниям, т. к. оно отменяет необходимость проведения фитопатологической оценки образцов.

Ввиду высокой вредоносности парши яблони, вызываемой грибным патогеном Venturia inaequalis (Cooke)G. Winter, актуально ускоренное создание сортов, иммунных к данному заболеванию. Решение этой задачи невозможно без глубоких знаний генетических основ устойчивости к парше. Особое значение здесь приобретает технология ДНК-маркирования, позволяющая проводить скрининг генетической плазмы яблони на наличие генов устойчивости на любом этапе селекционного процесса вне зависимости от фазы онтогенеза растений.

ДНК-маркеры могут быть использованы как для идентификации целевых генов, так и при изучении генетического разнообразия культурных растений. В этих целях могут быть эффективно использованы микросателлитные маркеры, что обусловлено их локусспецифичностью и значительной аллельной изменчивостью. Чаще всего микросателлитные маркеры используют для дифференцировки растений внутри вида, идентификации сортов, составлении генетических карт и в маркерной селекции, а также в работах по изучению генетического разнообразия и паспортизации сортов культурных растений.

Молекулярные ДНК-маркеры открывают большие перспективы для генетической паспортизации сортов яблони, детального картирования хромосом, изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне и идентификации генов хозяйственно-ценных признаков в селекционном материале.

Цель и задачи исследования. Цель исследований: совершенствование молекулярно-генетических методов оценки и отбора

исходного материала яблони в селекционном процессе и комплексное изучение генофонда яблони коллекции генетических ресурсов ФГБНУ СКЗНИИСиВ с применением ДНК-маркерного анализа.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить генетическое разнообразие сортов яблони коллекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием полиморфизма микросателлитных локусов ДНК в качестве маркерной системы.

2. На основании данных анализа микросателлитных локусов ДНК составить молекулярно-генетические паспорта сортов яблони отечественной селекции с оценкой уровня общего генетического полиморфизма и степени их генетического родства.

3. Провести скрининг селекционного материала яблони, предоставляемого центром селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием ДНК-маркерного анализа для выявления образцов, несущих гены устойчивости к парше V/ и Ут.

4. Разработать ДНК-маркер для гена устойчивости яблони к парше V/ с целью получения ПЦР-продукта, специфичного для его доминантного аллеля размером 100-150 пар нуклеотидов (п. н.).

5. Выполнить молекулярно-генетическую идентификацию аллелей 52, 55, 57, 5/0 гена самонесовместимости у отечественных сортов яблони с применением ДНК-маркерного анализа.

Научная новизна работы. Выполнена оценка генетического родства сортов яблони отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров. На основании данных, полученных по результатам анализа полиморфизма микросателлитных локусов, составлены ДНК-паспорта изученных сортов яблони.

Идентифицированы гены устойчивости к парше У/и Ут с применением ДНК-маркерных технологий в сортах и селекционных формах яблони ФГБНУ СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК.

Разработан молекулярный маркер к гену V/ на основании данных о его нуклеотидной последовательности, показана перспективность применения.

Впервые проведена молекулярно-генетическая идентификация аллелей 52, 55,57, Б10 гена самонесовместимости в отечественных районированных и перспективных сортах яблони.

На основании данных об аллельных комбинациях гена самонесовместимости определены группы совместимых и не совместимых При опылении сортов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные с применением микросателлитного анализа данные о степени генетического родства сортов яблони отечественной селекции позволяют повысить качество гибридизации, обеспечить максимальный спектр изменчивости в гибридном потомстве.

Показана перспективность использования ДНК-маркирования для идентификации генов устойчивости к парше V/ и Ут, а также аллелей гена самонесовместимости у сортов и форм яблони отечественной и мировой

селекции. Идентифицированы доминантные аллели генов устойчивости яблони к парше Vf и Vm у сортов и элитных форм яблони селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК. Усовершенствованный ДНК-маркер гена Vf позволяет расширить возможность применения мультиплексной ПЦР при идентификации данного гена устойчивости к парше в сочетании с другими генами хозяйственно-ценных признаков.

Информация об аллельном составе гена самонесовместимости позволит прогнозировать совместимость сортов при опылении, что даст возможность более эффективно формировать сортовые схемы садовых насаждений.

Методология и методы исследований. При планировании и проведении исследований в виде источников информации использовались научные статьи, доклады, книги производственной тематики, электронные ресурсы и другие материалы. При проведении исследований применялся системный подход. Теоретико-методологическую основу исследований составили методы планирования и проведения опытов, лабораторные исследования с применением системного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обоснование актуальности формирования ДНК-паспортов сортов яблони отечественной селекции с применением микросателлитного анализа.

2. Новые данные о степени генетического родства изученных сортов яблони.

3. Методические аспекты идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm. Выявление образцов, несущих доминантные аллели генов устойчивости к парше Vf и Vm.

4. Обоснование данных об аллельных комбинациях гена самонесовместимости у сортов яблони отечественной селекции и установление степени совместимости сортов согласно выявленному аллельному составу 5-гена.

5. Усовершенствование ДНК-маркера гена Vf устойчивости к парше, дополняющего методическую базу и позволяющего расширить область применения мультиплексной ПЦР в идентификации генов хозяйственно-ценных признаков яблони.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований доложены на ежегодных заседаниях Ученого совета ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии в 2009-2011 гг., III и IV Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2009-2010 гг.), Расширенном заседании Учёного совета по проблемам интенсивного садоводства посвященного 100-летию со дня рождения Гавриила Владимировича Трусевича (Краснодар, 2010 г.).

Публикации результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 17 печатных работ, в том числе (8) из них в изданиях из Перечня, рекомендованного ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включающих 12 таблиц и 26 рисунков. Состоит из введения, трех глав, выводов, рекомендаций для практической селекции и двух приложений. Список использованной литературы включает 202 источника, в том числе 127 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы. На основании анализа литературных источников раскрыт вопрос современного состояния изученности генплазмы яблони отечественной и иностранной селекции. Обоснована необходимость использования ДНК-технологий в современных сельскохозяйственных дисциплинах с целью изучения генетического разнообразия, главных генов хозяйственно-ценных признаков и улучшения качества продукции.

2. Условия, объекты и методы исследований.

Исследования проводились с 2008 г. по 2011 г. в секторе генетических и статистических исследований Северокавказского зонального научно-исследовательского института садоводства и виноградарства Россельхозакадемии с использованием следующего оборудования: ДНК-амплификатор Терцик, Eppendorf Mastercycler gradient, микроцентрифуги Eppendorf Minispin, микродозаторов автоматических, термостат для микропробирок Термит, камеры для горизонтального электрофореза SE-2 и SE-3 и вертикального — VE-3 фирмы Хеликон (Москва), трансиллюминатор Vilber Lourmat, реактивов и расходных материалов для ПЦР и электрофореза, автоматический генетический анализатор/секвенатор ABI Prism 3130.

Объекты исследований: отечественные сорта и элитные формы яблони коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК (в рамках совместных проектов РФФИ) предоставленные селекционерами Е.В. Ульяновской, E.H. Седовым, С.Н. Артюх и И.Л. Ефимовой, а также зарубежные сорта яблони: Прима, Фуджи, Голден Делишес, Айдаред, Глостер, Мекинтош. В качестве сорта-стандарта, несущего ген Vf использовали сорт Прима американской селекции, что связано с наличием в международной научной литературе информации об аллельных состояниях изучаемых микросателлитных локусов у данного сорта. При проведении анализа образцов яблони на предмет наличия доминантной аллели гена Vm в качестве стандарта наличия гена использовали сорт Орловский пионер, селекции ВНИИСПК (г. Орел). Стандартами при анализе полиморфизма локуса ■У-гена послужили сорта иностранной селекции с известным из литературных данных аллельным набором 5-локуса: Голден Делишес - S2, S3; Айдаред - S7; Мекинтош - S10.

В ходе работы изучали полиморфизм микросателлитных маркеров CH01fö3b, CHOlhOl, CHOlhlO, СН02с06, CH02d08, СН04е05, СН05ГС6, CH01f02, CH02cll, Hi02c07, СН02с09, CH03d07. В качестве ДНК-маркера гена Vm использовали микросателлитный локус Hi07h02; для гена Vf -

внутригенный маркер - VfC. Для изучения полиморфизма локуса S-гена сортов яблони применяли маркеры OWB 122, 123; FTC 177, 226, 143, 144, 12, 228.

Методы исследований. В работе применяли ЦТАБ-метод и сорбентный метод экстракции ДНК. Экстракцию проводили согласно методике J.J. Doyle et al. (1987 г.), а также в модификации, включающей дополнительную очистку проб. Использовали модифицированную методику ЦТАБ за счет введения в состав лизирующего буфера дополнительного компонента - поливинилпирролидона в концентрации 1%, позволяющую экстрагировать ДНК с чистотой, достаточной для проведения ПЦР при использовании листьев, гербаризованных на разных этапах вегетации, и при использовании свежей ткани листовой пластинки.

ПЦР проводили по стандартным и оригинальным методикам. Амплификацию осуществляли с использованием наборов для проведения ПЦР, ООО «Сибэнзим» (кат. № К-002), г. Новосибирск, Россия. Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР, полученных с ДНК-маркером гена Vf, использовали 8% полиакриламидный гель, а также 2% агарозный гель на основе 0,5-кратного Трис-боратного буфера (0,045 М Трис, 0,045 М Борной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН=8,2); гена Vm - 8% полиакриламидный гель. Анализ размеров продуктов амплификации с ДНК-маркерами аллелей 5-ген а вели в 2% агарозном геле. Использовали камеры для горизонтального электрофореза SE-2 и SE-3 и вертикального электрофореза VE-3 фирмы ООО Хеликон, г. Москва. После проведения электрофореза гелевые пластины помещали на 10-20 минут в раствор бромистого этидия (5 мкг/см3), и фотографировали в УФ-спектре. Размер аллелей определяли путем сравнения со стандартным образцом -pBR322/BsuR I (Хеликон, Россия). Фрагментный анализ SSR-маркеров проводили на автоматическом генетическом анализаторе-секвенаторе ABI Prism 3131. Результаты фрагментного анализа обрабатывали в программе Gene Mapper 4.1. При оценке результатов микросателлитного анализа матрица генетических дистанций была построена с использованием коэффициентов (индексов) подобия по М. Nei et al. (1979). Кластерный анализ выполнен методом UPGMA с использованием FreeTree Application 0.9.1.50 (ZDAT v.o.s.). Графическое построение дендрограммы проведено в программе TreeView (Win32) 1.6.6. Фактическая (Но) и ожидаемая (Не) гетерозиготность рассчитаны в соответствии с L.E. Martinez et al. (2006) с использованием программы GenAlEx 6.3.

3. Экспериментальная часть

3.1 Апробация методов экстракции ДНК

В связи с высоким содержанием загрязнителей (полисахариды и полифенольные соединения) в тканях яблони на начальном этапе работы была выполнена апробация различных методов экстракции ДНК, в

частности сорбентного и ЦТАБ-метода, с целью поиска оптимального, требующего минимальных временных и финансовых затрат.

В работе были апробированы ЦТАБ-метод. варианты ЦТАБ-метода по J.J. Doyle et al. (1987 г.) и MG. Murray (1980 г.) в качестве базовых. ЦТАБ-метод основан на использовании цетилтриметиламмоний бромида в качестве основного детергента, входящего в состав лизируюшего буфера. Применялся экстрагирующий буфер следующего состава: 2% ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид); 1,4 М хлористого натрия (NaCl); 0,1 М Трис-гидрохлорид (Трис-HCl); 20мМ ЭДТА (этилендиаминотетрааиетат). В качестве модификации внесли дополнительные этапы очистки проб ДНК. Дтя этого, после этапа вторичной депротеинизации (базовый метод), проводили преципитацию проб в буфере преципитации (1% ЦТАБ, 50мМ Трис-HCl, ЮмМ ЭДТА). После преципитации ДНК осадок растворяли в 500 мкл солевого буфера (1 М NaCl, ЮмМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА) и вносили 1 см3 этилового спирта (96%) для осаждения ДНК при -20°С. В состав экстрагирующего буфера вводили полизинилпирролидон (PVP) 1% для очистки проб от полифенольных соединений. Данные операции позволили существенно повысить чистоту проб за счет освобождения от полисахаридных и белковых фракций.

В таблице 1 отображена эффективность экстракции ДНК из растительной ткани яблони на различных этапах вегетации с использованием перечисленных методов.

Таблица 1 - Эффективность методов экстракции ДНК на различных этапах вегетации яблони___

Тип ткани яблони ■ Метод экстракции

ЦТАБ „^ г- „ 1 ЦТАБ+Р\'Р+2 ЦТАБ+2 доп. этапа | ^ ,„.... доп. этапа ОЧИСТКИ проо ДНК 1 ттиъг у ! очистки проо ДНК Diat.

Кора „ -

Почки - - - - J

Молодой лист ч- + + :

Лист +/- -f -t- -

Старый +/- + -

Примечания: 1. PVP - поливинилпирролидон 2. Diat. - сорбентный метод экстракции - набор «Diatom mini prep 200» :

Модификация ЦТАБ-метода с поливинилпирролидоном (1 %) в экстрагирующем буфере и двумя этапами очистки/переосаждения показала

эффективность экстракции ДНК из листовой пластины яблони на поздних стадиях вегетационного периода. Это позволило получить пробы ДНК, пригодные для проведения ПЦР из листьев, гербаризованных на поздних этапах вегетации (за 1-2 недели до начала листопада и во время него), хотя в данном случае концентрация ДНК в получаемых препаратах была существенно ниже. Как видно из таблицы 1, с применением усовершенствованного метода экстракции удалось получить пробы ДНК со степенью чистоты, достаточной для проведения ПЦР, следовательно, данная модификация метода ЦТАБ была признана эффективной и универсальной и использовалась в работе.

3.2 Идентификация генов У/к Ут у отечественных сортов и селекционных форм яблони.

После апробации ДНК-маркеров к генам V/ и Ут и оптимизации экспериментальных параметров выполнили молекулярно-генетическую идентификацию данных генов у сортов и элитных селекционных форм яблони. Оптимальными показателями температуры отжига праймеров: маркеров генов У/ и Ут определили 56°С и 58°С соответственно; концентрация дезоксинуклеотидтрифосфатов в ПЦР-смеси - 0,1 мкМ; концентрация для праймеров - 0,3 мкМ.

Использование для ДНК-маркерного анализа оптимального метода экстракции ДНК и параметров ПЦР, позволивших получать максимальный синтез целевых участков, дало возможность четко идентифицировать аллели £;7-гена устойчивости ряда сортов и элитных форм яблони к парше (рисунок 1).

123456789 МВ

Рисунок 1 - Электрофоретический анализ ПЦР продуктов ДНК маркера гена У/у некоторых сортов и элитных форм яблони, где 1-3 - элитные формы яблони: 1 - 12/2-21-4, 2 - 12/2-20-1, 3 - 12/1-21-68; 4-9 - сорта яблони: 4 -Василиса, 5 - Первинка, 6 - Солнышко, 7 - Рассвет, 8 - Орловский пионер, 9 - Прима (стандарт У/+), МВ - маркер молекулярного веса ДНК

Как видно из рисунка 1, специфический ПЦР-фрагмент (уровень отмечен стрелкой), подтверждающий наличие гена V/, обнаружен у 2 элитных форм яблони: 12/2-21-4, 12/1-21-68 и сортов Василиса, Солнышко, Рассвет.

В ходе исследования был выполнен массовый скрининг селекционного материала яблони, обладающего комплексом ценных агробиологических признаков. В таблице 2 показаны результаты идентификации гена V/у сортов и элитных форм яблони отечественной селекции.

Таблица 2 - Сорта и элитные формы яблони селекции СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК с идентифицированным геном V/ иммунитета к

парше

Сорт и элитная форма яблони Родительская форма с геном Vf

Василиса, Екатеринодарское, Кармен, Любава, Ноктюрн, Тайна, Юнона, 12/1-21-33, 12/1-21-80, 12/2-20-20, 12/2-20-27, 12/2-21-2, 12/3-20-15, 12/3-20-16, 12/3-20-17, 28-41-44, 28-42-32, 44-24-49-Ю, 44-27-52-СЗ, 44-27-60-С, 44-27-74-В, 44-27-75-3, 44-29-9-С, К-90 Прима

Зефир, Красный Янтарь, Рассвет, 28-36-43, 28-38-52, 44-24-36-Ю, 44-24-38-С, 44-24-39-Ю, 44-29-30-3, 44-29-39-В, 44-29-61-СЗ Редфри

Солнышко, Юбилей Москвы, 12/1-21-62, 12/1-21-68, 12/2-20-38, 12/2-21-10 М. floribunda Sieb. 821

12/1-21-13, 12/1-21-16, 12/1-21-26, 12/1-21-43, 12/1-21-48, 12/2-20-50, 12/2-20-53, 12/2-21-4, 12/2-21-33, 12/2-21-70, 12/3-20-31, 12/3-21-6, 12/3-21-9, 12/3-21-28, 12/3-21-32 Балегард 0247 Е

12/2-20-1 Ред спур

29-5-44 Форма 2034

Для ряда из указанных сортов и селекционных форм яблони ранее было проведено фитопатологическое тестирование на искусственном инфекционном фоне во ВНИИСПК г. Орел, в ходе которого была выявлена их высокая степень устойчивости к патогену, что свидетельствует о наличии у них искомого гена V/. Полученные результаты молекулярно-генетического анализа по идентификации гена V/ подтверждают данные фитопатологической оценки, сведения о происхождении изученных сортов и форм яблони.

При проведении анализа образцов яблони на предмет наличия доминантной аллели гена Ут в качестве стандарта наличия гена использовали сорт Орловский пионер селекции ВНИИСПК (г. Орел). При постановке ПЦР и дальнейшем проведении электрофоретического анализа у данного сорта выявлялся ПЦР продукт размером порядка 230 п. н. - отмечен стрелкой (рисунок 2), что соответствует литературным данным о размере ПЦР продукта в случае наличия доминантной аллели гена.

МВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Рисунок 2 - Электрофоретический анализ ПЦР продуктов ДНК маркера гена Ут у сортов и элитных селекционных форм яблони, где МВ -- маркер молекулярной массы ДНК; 1 - сорт-стандарт Орловский пионер; 2 -31-34-40: 3 - Юбилей Москвы; 4 - Ноктюрн: 5 - Фея; 6 - 29-7-101; 7-31-31-128; 8-44-29-9-С; 9-27-2-276; 10-27-2-222; 11-27-2-218; 1244-29-30-3; 13 - 44-25-71-СЗ; 14 - 44-27-29-В; 15 - 44-27-32-СЗ

В ходе выполнения ДНК-маркерного анализа ряда сортов и форм яблони селекции ВНИИСПК ген Ут был идентифицирован у сорта Первинка и следующих элитных форм: 31-34-40, 31-31-128, 27-2-276, 27-2-222, 29-7-101, 27-2-218. Результаты работы позволяют говорить об информативности использования выбранного ДНК-маркера для идентификации гена Ут.

3.3. Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена У/ иммунитета яблони к парше

При использовании известного на сегодняшний день ДНК-маркера VjC к гену Vf, созданного на основе данных о его нуклеотидной последовательности, наряду с аллель-специфичным фрагментом размером 286 п. н., синтезируется два неспецифических фрагмента размером 484 и 646 п. н. у образцов, как с доминантным, так и с рецессивным аллелем гена Vf. Несмотря на то. что наличие указанных неспецифических фрагментов не препятствует достоверной идентификации доминантного аллеля, это может снижать эффективность одновременной идентификации данного гена в сочетании с генами других хозяйственно-ценных признаков при проведении мультиплексной ПЦР.

С целью расширения спектра использования данного маркера гена Vf для мультиплексной ПЦР идентификации с другими генами устойчивости к парше и мучнистой росе выполнили исследование по созданию ДНК-маркера, позволяющему получать единичный ПЦР продукт для доминантного аллеля при отсутствии такового для рецессивного аллеля.

После выравнивания нуклеотидных последовательностей аллелей Vfal (.HcrVfl), Vfa2 (HcrVfl) и VfaA (.HcrVfi) (номера в базе данных NCBI AJ297739, AJ297740 и AJ297741) в программе ClustalW, провели их сравнение с учетом того, что Vfa4 является доминантным аллелем гена устойчивости яблони к парше У/ и определили полиморфный участок для создания нового ДНК-маркера. Нуклеотидная последовательность

созданного дополнительного обратного праймера ДНК-маркера {■'/"-гена: 5' ТСАСТТТАТТССАТСТО 3'.

В ходе экспериментальной проверки выявили синтез продукта, специфичного для доминантного аллеля. ПЦР размером около 140 п. н., однако помимо этого синтезировался продукт размером около 510 п. н„ который не препятствует идентификации доминантного аллеля (рисунок 3).

Рисунок 3 - Электрофоретический анализ ПЦР продуктов нового ДНК маркера гена V/(сочетание праймеров Р+ЯО, где МВ - маркер молекулярной массы ДНК, 1 - сорт-стандарт Прима; 2-5, 8, 9 - образцы, несущие доминантный аллель гена; 6, 7 - образцы с рецессивным аллелем

Согласно рисунку 3, продукт размером около 510 п. н. не препятствует достоверной идентификации искомого гена. В связи с тем. что целевой фрагмент, как и неспецифический (510 п. н.) не перекрывают по размеру фрагменты амплификации маркеров генов устойчивости яблони к мучнистой росе Р1-1, Р1-2. Р1-м', рекомендуется выполнить апробацию мультиплексных комбинаций данного маркера в сочетании с маркерами генов устойчивости яблони к мучнистой росе.

3.4 Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости в сортах яблони

Для изучения аллельного полиморфизма гена самонесовместимости яблони целевыми были выбраны аллели, наиболее распространенные в мировом генофонде яблони в соответствии с литературными данными: Б2. БЗ, 57, Б10, и исследовано 33 сорта яблони отечественной селекции. В выборку для исследования вошли перспективные и введенные в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Северо-Кавказском регионе сорта яблони селекции СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК.

На начальном этапе работы для ДНК-маркеров к изучаемым аллелям гена самонесовместимости подобрали унифицированные температурно-временные параметры полимеразной цепной реакции, одинаковые для всех аллелей: 5 минут при 94°С - начальная денатурация; следующие 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 40 секунд отжиг праймеров при 60°С, 30

секунд синтез при 72°С. Последний цикл синтеза 5 минут при 72°С. Оптимальными концентрациями дезоксинуклеотидтрифосфатов и праймеров определены 0,1 мкМ и 0,3 мкМ соответственно.

На рисунке 4 продемонстрирован пример электрофоретического разделения продуктов ПЦР с ДНК-маркером к аллелю 570.

МВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 МБ 10 1112 1314 15 16 1718

Рисунок 4 - Электрофореграмма ДНК-идентификации гллеля 5/0 (209 п.н.), где МВ-маркер молекулярного веса ДНК («шаг» маркера 100 п.н.);

1,10- сорт Мекинтош (стандарт 570+); 2 - 9; 11 - 18 сорта российской селекции: 2 - Красный янтарь, 3 - Золотое летнее, 4 - Кармен, 5 - Талида, 6 -Родничок, 7 - Тайна. 8 - Талисман, 9 - Зефир, 11 - Екатеринодарское, 12 -Юбилей Москвы, 13 - Ноктюрн, 14- Фея, 15 - Дин Арт, 16 - Рассвет, 17-Зимнее утро, 18 - Юбилей Москвы

Из результатов исследований видно (рисунок 4), что у сортов яблони отечественной селекции: Золотое летнее, Талида, Родничок, Талисман, Екатеринодарское, Юбилей Москвы присутствуют ПЦР-фрагменты одного размера с соответствующим сортом-стандартом иностранной селекции.

По результатам молекулярно-генетического анализа отечественных сортов и элитных форм яблони были идентифицированы целевые аллели гена самонесовместимости, представленные в таблице 3. На каждый генотип перечисленных сортов яблони приходится от одного до трех (у триплоидного сорта Союз) различных аллелей гена самонесовместимости.

Согласно таблице 3, наиболее распространенным оказался аллель 5/0, обнаруженный у 15 сортов: Аленушкино, Афродита, Василиса, Екатеринодарское, Золотое летнее, Имрус, Казачка кубанская, Корей, Любава, Маяк станичный, Родничок. Славянин, Союз, Талида и Юбиляр. Аллели 52, 55,57 выявлены у 10, 9 и 10 генотипов соответственно.

Таблица 3 - Идентифицированные аллели 5-гена в отечественных сортах яблони

Сорт яблони Идентифицированные аллели 5-гена

52 1 55 57 ; Б10

1. Але ну ш кино - ! - ! +

2. Афродита - - ; 4-

3. Болотовское + +

4. Василиса - - ! +

5. Дин Арт - - + !

6. Екатеринодарское - - ! +

7. Зефир - - 4- !.

8. Зимнее утро - - + !

9. Золотое летнее - + 1 +

10.Илфус - .4- | +

11 .Казачка-кубанская - + - +

12.Кармен + - -

13.Корей 1 - +

14.Красный янтарь + ! +

15.Кубанское багряное + -

16.Любава - - +

17.Маяк станичный ! + +

18.Ноктюрн + 1 - 1 - -

19.Орловское полесье 1 - | + -

20.Персиковое + 1 -

21.Рассвет 4- - +

22.Родничок - - - + |

23.Свежесть - + - -

24.Славянин - - _ +

25.Солнышко - + +

26. Союз -1- - 4- +

27. Старт - - +

28.Строевское + + -

29.Тайна + -

ЗО.Талида + - - +

31.Фея - - -

32.Юбилей Москвы - - + !

33.Юбиляр - ! - 1 +

Для ряда сортов, таких как Болотовское (52 55), Золотое летнее (55 5/0), Имрус (55 5/0), Казачка кубанская (55 5/0), Красный янтарь (52 57), Маяк станичный (55 5/0), Рассвет (52 57), Солнышко (55 57), Строевское (52 55), Талида (52 5/0), а также триплоидного сорта Союз (32 57Б10), аллельный состав 5-гена был установлен полностью.

При анализе имеющейся информации о происхождении изученных отечественных сортов яблони стало видно, что наиболее распространенными родительскими формами являются американские сорта яблони Голден Делишес, Прима и Айдаред, несущие соответственно 52 S3, S2 SI0 и S3 S7-аллели гена самонесовместимости. Соответственно, указанные аллели широко представлены в таких сортах яблони как: Аленушкино (5/0). Афродита (570), Болотовское (52 S3), Василиса (5/0), Екатеринодарское (5/0), Золотое летнее (S3 5/0), Имрус (S3 5/0), Казачка кубанская (S3 5/0), Корей (5/0). Кубанское багряное (55), Любава (5/0), Маяк станичный (S3 S10), Ноктюрн (52), Персиковое (52). Родничок (52), Свежесть (S3), Славянин (5/0), Строевское (52 S3), Тайна (52), Талида (52 5/(7). Также у многих изученных сортов яблони обнаружен 57-аллель гена самонесовместимости: Дин Арт (57), Зефир (57), Красный янтарь (52 57), Орловское полесье (57), Зимнее утро (57), Рассвет (52 57). Солнышко (S3 57), Союз (52 57 5/0), Старт (57), Юбилей Москвы (57). Таким образом, данные об аллельном составе 5-гена у изученных сортов яблони соответствуют имеющимся сведениям об их происхождении, подтверждая достоверность молекулярно-генетических методов.

Информация об аллельном составе гена самокесовместимости v изученных сортов яблони может быть использована для подбора оптимальных комбинаций при гибридизации с целью ускорения селекционного процесса и получения максимального числа гибридных сеянцев. Наряду с этим, знание аллелытого состава 5-гена может позволить прогнозировать эффективность перекрестного опыления сортов и форм с различными комбинациями аллелей гена, что немаловажно в случае разработки сортовых схем садовых насаждений у плодовых культур, в том числе и яблони.

Для повышения эффективности перекрестного опыления сортов яблони важно использовать в качестве родительской пары сорта, несущие различные комбинации аллелей гена самонесовместимости. На основании данных о наличии изученных аллелей были определены совместимые и несовместимые при опылении пары Труппы сортов.

3.5 Исследование полиморфизма микросателлнтных локусов сортов яблони отечественной селекции

В связи с высокой степенью полиморфизма был использован набор из 12 микросателлнтных маркеров, являющийся достаточным для оценки уровня полиморфизма в исследуемой выборке генотипов яблони. В результате выполнения фрагментного анализа на автоматическом генетическом анализаторе/секвенаторе ABI Prism 3130 были получены четкие, воспроизводимые результаты с точностью до одного нуклеотида. Такая информация является наиболее точной для составления ДНК-паспортов генотипов (сортов, клонов, селекционных форм).

Все сорта яблони обладали уникальным аллельным набором, позволяющим идентифицировать каждый из них в изученной выборке. Из использованных в работе 12 маркеров наиболее высокий уровень полиморфизма по результатам анализа 31 сорта яблони показал маркер СН02с11 - 10 аллелей (таблица 4).

Таблица 4 - Полиморфизм использованных в работе микросателлитных маркеров______________

Диапазон размеров Количество

Маркер амплифицированных выявленных Но Не

фрагментов, п. н. аллелей

СНОШЗЬ 141-182 5 0.71 ттг

СНОНЮ! 118-137 6 0,74 0.75

СН01Ы0 94-120 7 0,54 1 0,60

■; СН02с0б 204-256 9 0.89 0,82

СН02сЮ8 215-258 9 0.80 0,77

: СН04е05 178-230 9 0,56 0,79

СН05ГО6 171-189 7 0.87 0.72

СН01ГО2 173-210 8 0.83 0,76

■ СН02с11 219-241 10 0.80 0,75

НЮ2с07 104-166 9 0,8т1 0.78

СН02с09 235-259 7 0.77 0,77

СН03<107 188-228 7 0.67 0,77

Примечания:

1. Но - наблюдаемая гетерозиготность; 2. Не - ожидаемая гетерозиготность I

Согласно таблице 4. маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от пяти до десяти аллелей на один микросателлитный локус. К группе маркеров, проявивших наиболее низкий уровень полиморфизма, принадлежат: СНОШЗЬ и СН01Ь01. По данным анализа 31 сорта яблони отечественной селекции число аллелей на один локус было равным 5 и б соответственно. К группе маркеров со средним уровнем полиморфизма относятся: СН01Ы0, СН05ГО6, СН0Ш2, СН02с09, СНОЗсШ. ЗБЯ-маркеры: СН02с06, СН02сЮ8, СН04е05 и НЮ2с07 показали высокий уровень полиморфизма - девять аллелей на локус. Суммарно, по 12 изученным локусам было выявлено 93 аллеля. Величина ожидаемой гетерозиготности варьировала в диапазоне от 0,602 (СН01Ы0) до 0.827 (СН02с0б). Фактическая (наблюдаемая) гетерозиготность была определена в пределах от 0,548 (СНОГпЮ) до 0,897 (СН02с06, НЮ2с07). При этом для локусов СН02с06, СН02сЮ8, СН04е05, СН05й)б, СН0Ш2, СН02с11, НЮ2с07 и СН02с09 фактическая гетерозиготность превышает ожидаемую, также указывая на высокий уровень генетического полиморфизма данных локусов внутри изученной группы сортов.

По результатам проведенного фрагментного анализа все сорта яблони обладали уникальным аллельным набором, позволяющим идентифицировать

их среди сортов изученной выборки. У ряда сортов по некоторым микросателлнтным маркером не были обнаружены амплифнцированные фрагменты, что соответствует нуль-аллелю. Это такие сорта как: Персиковое, Нимфа по локусам СН02с06, CH03d07 и НЮ2с07; Фортуна. Зимнее утро. Зори Кубани. Свежесть по локусам C'H02do8. СН04е05. НЮ2с07 и CH03d07 соответственно.

Частота встречаемости выявленных у исследованных образцов яблони аллелей по каждому микросателлитному маркеру в абсолютных величинах показана на приведенных ниже гистограммах (рисунок 5 - 8), полученных с помощью программы GenAlEx 6.3. Рисунки приведены в интерфейсе данной программы, где по оси ординат (Frequency) значение 100 % равнозначно значению 1,0.

Д!!з|з Frequency

„ 0,800 ,----

с 0.600 +

§ 0.400 +

jf 0.200 -I

it. о, coo .' ,

ÜJLLL

ллл

141'143162;1?4.1»2:115'120 '22 124 ' 12S 137 94 ; 59 . 100 104■ 112 СН01ЮЗЭ СИС-^01 CHOIh'O

Рисунок 5 - Частота аллелей мнкросателлитных маркеров СНОШЗЬ. СН01Ь01, СН01Ы0, выявленная при изучении отечественных сортов яблони

Согласно рисунку 5, из восьми представленных маркеров самым полиморфным являлся СНОГпЮ. Интересно отметить, что по данному маркеру наибольшее число амплифишгрованных фрагментов имело молекулярный вес 100 п. н. (60 °Ь>.

А1!з!е Frequency

Тй „ П 1н - п I п п _ _ 0.1! 0 . . ц . i.ll_____II ii - - n Iii

т о (N, CN, ' о -г: СЧ ' сы сч • сы : '-g 1Л ; О . — , ОЭ i £> j О < ^ : СО «D'Cn;»- (D О r^-i о;о'т- ко - •>- '■ СЧ -r-v 1 ~v| C-J • fM • 1 СЧ

Locus

Рисунок б - Частота аллелей мнкросателлитных маркеров СНОЗсОб, CH02d08, СН04е05, выявленная при изучении отечественных сортов яблони

Маркеры, показанные на рисунке 6 проявили одинаковый уровень полиморфизма - 9 выявленных аллелей на локус, причем наиболее

распространенными оказались аллели с молекулярным весом от 178 до 258 п. н.

Alie!» Frequency

Рисунок 7 - Частота аллелей микросателлитных маркеров CH0SÎ06, CH01fD2, CH02cl 1, выявленная при изучении отечественных сортов яблони

Как видно из рисунка 7, максимальный уровень полиморфизма обнаружен у маркера СН02с11 - 11 аллелей с молекулярным весом в основном от 231 до 237 п. н. (73 %). У маркеров CH051D6 и СН0Ш2 были амплифииированные фрагменты с одинаковым молекулярным весом -185 п. н. (29 %).

Allele Frequency

, о «с-

0.30С О 201 -' 0.100 -

0.000 -

Î! п. J i f .0 i _.а.„. п Г J „ п 1 ■DFOC1 п.Г

: ' со : О , О УЗ i CN со ' О . <£ : CN ' Т : Ю J СО iniT-i^.S'T- N.ailO.OlCM ч- i СО , о ; СО п 1 *г ' «Г ' 1Л . ■ Ц' ! СС 1 СТ> ! Т' О i О • см . CN • СЧ : Оч • СМ • CN 1 ON ' C-J ! ; : СЧ : CN ■ CN ' Сч

Hi Ci с 07

СН02С09 Locus

Рисунок 8 — Частота аллелей микросателлитных маркеров НЮ2с07, СН02с09. СН03<307, выявленная при изучении отечественных сортов яблони.

Приведённая на рисунке 8 гистограмма иллюстрирует, что маркеры показали средний уровень полиморфизма, СН02с09 и Сн03с107 - семь аллелей, НЮ2с07 - восемь аллелей.

На основании комплекса данных о частоте встречаемости аллелей и о размере а.мплифицированных последовательностей для каждого аллеля, а также уровня гетерозиготности была проведена оценка степени генетического сходства изученных сортов яблони методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (иРвМА) (рисунок 9).

Результаты кластеризации в целом отражают генетическую разнородность и происхождение сортов из изученной выборки. Это

выражается в одновременном присутствии как явно выделяющихся кластеров и наличии кластеров, включающих всего два генотипа или выделение отдельных генотипов в отдельную ветвь кластера (сорт Свежесть), так и кластеров второго порядка со сложной структурой, которые состоят из последовательно включаемых в кластер отдельных генотипов - кластер, включающий сорта Талида, Персиковое, Маяк станичный, Ноктюрн, Любава, Василиса, Кармен, Болотовское и Юнона (рисунок 9).

4J

-с

Svezhest

Nímfa

Та lid а

Persikovoe

Mayak stanichly

Noktum

Lyubava

Vasiltsa

Kuban

Karmen

Bolotovskoe

Yunona

KVZarevo

Zolotaya korona

Din Art

AportACC

Zorl Kubanl

Talisman

Amulet

Krasnly yantar

Fortuna

Rassvet

Solnishko

Stroevskoe

Yublley Moskvi

Afrodita

Start

Kubanskoe rumíanos Zofotoe letnee tmrus

Zimnee utro

Рисунок 9 - Дендрограмма генетического сходства изученных сортов яблони, построенная по методу иРСМА

Как видно из рисунка 9, затруднительным представляется определение несколько крупных кластеров, объединяющих все изученные генотипы. Очевидной причиной этого могут являться такие факторы как; присутствие нескольких небольших групп сортов (по 5-6 сортов), имеющих общие родительские формы (как одну из родительских форм, так и обе, в ряде случаев); разное генетическое происхождение родительских форм сортов из изученной выборки; наличие ряда сортов (КВ Зарево, Имрус, Зимнее утро,

Свежесть), имеющих в качестве родительских форм уникальные сорта, не повторяющиеся в генеалогии ни у одного из остальных сортов изученной выборки; родительские формы некоторых из изученных сортов имеют в своем происхождении сорта, являющиеся прямыми родителями других сортов из изученной выборки.

Сорта с одной родословной в большинстве своем объединены в общие кластеры. К примеру, в один кластер были объединены сорта Талисман, Амулет, Красный янтарь, Рассвет, которые происходят из гибридной комбинации Редфри х Папировка тетраплоидная. Это свидетельствует об объективной оценке и эффективности использования микросателлитных маркеров в этих целях. Возможность различать генетически близкие сорта, полученные в результате гибридизации одной родительской пары, также подтверждает перспективность использования микросателлитов в идентификации сортов, в том числе и с одинаковым происхождением.

В связи с вышесказанным, рекомендуем учитывать результаты кластеризации при планировании селекционной работы. Для получения наибольшей изменчивости в гибридных популяциях не следует использовать при гибридизации в качестве родительских пар сорта, вошедшие в один кластер. Наряду с этим, данные микросателлитного генотипирования могут быть использованы в дальнейшем для подтверждения генеалогии сортов и гибридов при возникновении спорных вопросов в случае, если одна или обе их родительские формы входят в перечень изученных нами сортов яблони.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполнения исследований на основе применения методов ДНК-маркерного анализа выявлены селекционно-ценные формы и сорта яблони, обладающие устойчивостью к парше, установлен уровень генетического разнообразия внутри группы современных сортов яблони отечественной селекции и определен уровень их совместимости при опылении.

1. Разработан модифицированный метод экстракции ДНК. позволяющий получать пробы ДНК с необходимой чистотой для проведения ПЦР на любом этапе вегетационного развития листьев, в том числе из листьев, гербаризованных на поздних этапах вегетации, что повышает универсальность применения ДНК-маркерного анализа.

2. По результатам скрининга, направленного на молекулярно-генетическую идентификацию генов устойчивости Гот и Vf в селекционных формах к сортах яблони выявлено наличие гена Vf у 12 сортов и 46 элитных форм яблони селекции СКЗНИИСиВ. Ген I'm идентифицирован у сорта яблони Первинка и следующих ценных селекционных форм: 31-34-40, 31-31-12S, 27-2-276, 27-2-222, 29-7-101, 27-2-21S.

3. Создан ДНК-маркер на основании данных о нуклеотидной последовательности гена Vf. который может быть использован при одновременной идентификации гена устойчивости яблони к парше I/и других генов хозяйственно-ценных признаков яблони.

2 i

4. Выполнена молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости S2, S3, S7, SJ0 у 33 отечественных сортов яблони.

5. В результате анализа полиморфизма 12 микросателлитных маркеров выборке из 31 сорта яблони отечественной селекции выявлено, что наибольшим уровнем полиморфизма обладает маркер СН02с11 - 10 аллелей, а минимальным - CHOlíüSb и CHOlhOl- 5 и б аллелей, соответственно.

6. На основании данных SSR-анализа для всех изученных генотипов яблони получены уникальные ДНК-фингерпринты, позволяющие идентифицировать их среди сортов изученной выборки.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

1. Использовать ДНК-маркерный анализ в селекционных программах на устойчивость к парше для идентификации генов Vf и Vm. Элитные формы яблони с идентифицированным» генами Vf и Vm являются ценным селекционным материалом для создания устойчивых к парше сортов.

2. Учитывать данные о присутствии/отсутствии аллелей гена самонесовместимости при подборе родительских пар для получения максимального количества гибридного потомства с возможностью формирования сортовых схем садовых насаждений согласно информации об аллельных комбинациях .S-гена у изученных сортов яблони.

3. Использовать изученные SSR-маркеры при дальнейшем исследовании генетического разнообразия отечественного генофонда яблони и при идентификации достоверности данных о происхождении селекционных образцов. ДНК-фингерпринты изученных сортов яблони могут быть использованы для решения спорных вопросов о сортовой принадлежности посадочного материала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Супрун, И.И. Цитолого-генетическое изучение особенностей опыления иммунных и высокоустойчивых к парше сортов яблони / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Arpo XXI. - 2010. - № 1-3. -С. 27-28.-0,1 п. л. (авт. 0,05).

2. Супрун, И.П. Комплексный подход к созданию устойчивых к парше сортов яблони с использованием молекулярно-генетических методов . И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, E.H. Седов. Г.А. Седышева // Arpo XXI. - 2010. - № 4-6. - С. 12-14. - 0,2 п. л. (авт. 0,02).

3. Супрун, И.И. Использование методов ДНК-маркирования для идентификации аллелей гена самонесовместимости яблони / И.И. Супрун. Е.В. Ульяновская. Я.В. Ушакова ,'/ Труды Кубанского государственного университета. -2010. - №1 (22). - С. 57-59. -0,1 п. л. (авт. 0,04).

4. Супрун, И.И. Методологические аспекты использования ДНК-маркирования в селекции яблони на устойчивость к парше / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Труды Кубанского государственного университета. - 2010. -№1(22). - С. 86-88. - 0,1 п. л. (авт. 0,02).

5. Супрун, И.И. Скрининг селекционного материала яблони на наличие гена устойчивости к парше Vf с применением методов молекулярного маркирования / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, Е.Н. Седов, Г.А. Седышева, З.М. Серова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2011. - № 3 (30). - Т. 1. - С. 84-86.-0,2 п. л. (авт. 0,03).

6. Супрун, И.И. Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости у сортов яблони отечественной селекции / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, Е.Т. Ильницкая // Доклады РАСХН. - 2011. - № 5. - С. 15-18.-0,15 п. л. (авт. 0,03).

7. Супрун, И.И. Генотипирование сортов яблони российской селекции с использованием микросателлитных маркеров / Супрун И.И., Токмаков С.В., Малюченко О.П., Ушакова Я.В., Бабаков А.В. // Известия ТСХА. - 2011. - вып. 6. - С. 162-166. - 0,15 п. л. (авт. 0,02).

8. Супрун, И.И. Изучение генетического разнообразия современных сортов яблони (Malus х domestica Borkh.) отечественной селекции с использованием микросателлитных локусов / И.И. Супрун, Я.В. Ушакова, С.В. Токмаков, Ч.Э. Дюрель, К. Денанс, Е.В. Ульяновская // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - № 1. - Т. 50. - С. 37-45. - 0,1 п. л. (авт. 0,04).

Публикации в других изданиях:

9. Ушакова, Я.В. Идентификация сортов яблони отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных локусов / Я.В. Ушакова // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: Материалы III всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Краснодар: КубГАУ, 2009. - С. 706-707. - 0,1 п. л. (авт. 0,1).

10. Супрун, И.И. Изучение самонесовместимости яблони с использованием молекулярно-генетических и цитологических методов / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Вклад фундаментальных научных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края: материалы научно-практической конференции грантодержателей РФФИ и администрации Краснодарского края. -Краснодар. - 2009. - С. 44-45. - 0,1 п. л. (авт. 0,04).

11.' Супрун, И.И. Использование методов молекулярного ДНК-маркирования в целях идентификации генов устойчивости к парше / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова, Е.Н. Седов, З.М. Серова // Вклад фундаментальных научных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края: материалы научно-практической конференции грантодержателей РФФИ и администрации Краснодарского края. - Краснодар. - 2009. - С. 102-103. - 0,2 п. л. (авт. 0,02).

12. Ушакова, Я.В. Изучение аллельного полиморфизма гена самонесовместимости в сортах яблони российской селекции / Я.В. Ушакова // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: Материалы IV всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. -Краснодар: КубГАУ, 2010. - С. 233 - 234. - 0,1 п. л. (авт. 0,1).

13. Супрун, И.И. Использование ДНК-маркирования в селекции яблони / И.И. Супрун, Я.В. Ушакова // Международная научно-практическая конференция, посвященная 155-летию со дня рождения И.В. Мичурина. XXII Мичуринские чтения «Развитие научного наследия И.В. Мичурина по генетике и селекции плодовых культур». - Мичуринск. - 2010 - С 289-293.-0,2 п. л. (авт. 0,1).

14. Супрун, И.И. Селекционно-генетическое изучение российской генплазмы яблони с применением молекулярного ДНК-маркирования / И.И Супру н, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // 19-й Международный симпозиум «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниология. Экология и здоровье». - Алушта, Украина. - 2010. - С. 337-340. - 0 1 п л (авт. 0,04).

15. Супрун, И.И. Перспективы использования ДНК-маркерной технологии для повышения эффективности селекции яблони / И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова // Высокоточные технологии производства! хранения и переработки плодовой и ягодной продукции: материалы научно-практической конференции. - Краснодар: СКЗНИИСиВ. - 2010. - С 38-43 -0,1 п. л. (авт. 0,03).

16. Ушакова, Я.В. Использование технологии ДНК-маркирования в селекционно-генетических исследованиях яблони / Я.В. Ушакова // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: Материалы V всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Краснодар- КубГАУ 2011.-С. 235-237.-0,1 п. л. (авт. 0,1).

17. Ушакова, Я.В. Изучение генетического полиморфизма яблони с применением микросателлитного ДНК-маркирования / Я.В. Ушакова, И.И. Супрун // Вклад ВОГиС в решение проблем инновационного развития России: материалы научно-практической конференции Кубанского отделения ВОГиС. - Краснодар: КубГАУ, 2011. - С. 175-176. - 0,1 п. л. (авт. 0,05).

18. Ульяновская, Е.В. Комплексный подход к отбору ценных генотипов яблони, устойчивых к стрессовым факторам среды / Е.В. Ульяновская, И.И. Супрун, C.B. Токмаков, Я.В. Ушакова. - Плодоводство и виноградарство Юга России [Электронный ресурс]. - Краснодар-СКЗНИИСиВ. - 2014. - № 25 (1). С. 11-26. - Режим доступа: http: // www.iournal.kubansad.ru / pdf /14/01/02.pdf

Подписано к печати.07.10,2015 г. Бумага офсетная Печ. л. 1 Тираж 100 экз.

Формат 60x84 1б Офсетная печать Заказ №53 2

Отпечатано в типографии Кубанского ГАУ 350044, Краснодар, ул. Калинина, 13.