Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка генетического разнообразия сортов и форм яблони с использованием ДНК-маркеров

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оценка генетического разнообразия сортов и форм яблони с использованием ДНК-маркеров"

На правах рукописи

ШАМШИН Иван Николаевич

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ И ФОРМ ЯБЛОНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ

Специальности:

03.02.07-Генетика 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 НО Я 2014

Санкт-Петербург - 2014

005554186

005554186

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина

Научные руководители: доктор биологических наук

Кудрявцев Александр Михайлович зам. директора Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

академик, доктор сельскохозяйственных наук Савельев Николай Иванович директор Всероссийского НИИ генетики и селекции плодовых растений им. Н.И. Мичурина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Матвеева Татьяна Валерьевна доцент кафедры генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного Университета

кандидат биологических наук Бурляева Марина Олеговна старший научный сотрудник отдела ГР зернобобовых культур Всероссийского НИИ растениеводства имени Н.И. Вавилова

Федеральное государственное бюджетное научное Ведущая организация: учреждение Всероссийский научно-

исследовательский институт селекции плодовых культур

Защита диссертации состоится 10 декабря 2014 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.041.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44; факс (812) 571-87-28; email: v.gavrilova@vir.nw.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова и на сайте: http://vir.nw.ru

Автореферат размещен на сайтах ВАК и ВИР «10» октября 2014 г и разослан «,<*» сиября 2014 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук.

Алексеевна Гаврилова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Яблоня является одной из важнейших плодовых культур. В России ее насаждения занимают более 70% всех площадей садов. Разнообразие климатических условий нашей страны требует создания большого сортимента сортов устойчивых к различным типам стрессоров и обладающих высокими товарно-потребительскими качествами. Это, в свою очередь, ставит определенные задачи перед селекционерами по созданию новых высокоадаптивных сортов яблони.

В связи с необходимостью интенсификации селекционного процесса целесообразно использование генетических методов, основанных на анализе ДНК. Применение молекулярных маркеров позволяет значительно ускорить идентификацию исходного материала и проводить анализ результатов скрещивания в достаточно короткий период времени. Таким образом, облегчается подбор родительских пар для скрещивания, поиск родительского материала в гибридных формах и анализ интрогрессии полезных признаков от исходных форм потомкам. Маркирование сортового материала яблони облегчит контроль над его однородностью при закладке маточных насаждений, сортовой прочистке садов и при реализации посадочного материала.

Анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фено-типическое проявление, может дать устойчивые характеристики растения, нейтральные по отношению к среде обитания и практически пригодные для идентификации генотипов, регистрации сортов и маркирования хозяйственно-ценных генов и признаков.

Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение генетического полиморфизма сортов и форм яблони из коллекции ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина на основе анализа микросателлитных последовательностей генома и целевых аллелей генов устойчивости к парше, а также генов, контролирующих продолжительную сохранность плодов.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Изучить генетическое разнообразие сортов и гибридных форм яблони, используя анализ простых микросателлитных повторов ДНК.

2. Выявить распространение в коллекции яблони гена устойчивости к парше V/по данным ДНК-маркирования.

3. Оценить разнообразие сортов и гибридных форм яблони по аллелям генов, вовлеченных в контроль биосинтеза этилена (Мс1-ЛСБI и Мс1-АС01).

4. Оценить разнообразие сортов и гибридных форм яблони по аллелям генов, вовлеченных в контроль синтеза экспансина.

Научная новизна:

- на основании анализа ДНК сортов яблони из коллекции ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина выявлены закономерности распределения генов, контролирующих продолжительную сохранность плодов у сортов и форм яблони.

- идентифицированы уникальные генотипы, несущие редкие аллели по микросателлитным локусам.

- на основании изучения простых микросателлитных последовательностей генома созданы генетические паспорта анализируемых сортов и форм яблони.

- показана высокая степень полиморфизма сортов селекции И.В. Мичурина.

- с использованием генетических маркеров и секвенирования в коллекции сортов ВНИИГиСПР идентифицированы генотипы, обладающие моногенной устойчивостью к парше, контролируемую геном V/.

Практическая значимость исследований.

Идентифицированы источники гена контролирующего моногенную устойчивость к парше у яблони.

Выявлены генотипы, несущие целевые аллели генов продолжительной сохранности плодов. В частности выделены сорта, содержащие аллели генов Мс1-АС01 и \id-ACSl, обуславливающие сниженный уровень синтеза этилена в плодах. Идентифицированы генотипы, несущие комбинации аллелей гена Мс1-Ехр7 ответственные за продолжительную сохранность твердости плода. Использование таких сортов в селекционной работе в качестве родительских пар дает возможность создания сортов с длительной лежкостью.

Установлено, что анализ микросателлитных последовательностей генома у сортов и форм яблони предоставляет селекционеру дополнительную информацию о генетическом сходстве и различии селекционного материала, что позволит более обоснованно подбирать пары для скрещивания. В связи с выявленным высоким уровнем полиморфизма микросател-

литных локусов установлена возможность использования данного метода для оценки гибридного фонда и паспортизации сортов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на Международной научно-практической конференции «Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС» г. Санкт-Петербург (11-13октября 2012 г.), Международной научно-практической конференции, посвященной 155-летию со дня рождения И. В. Мичурина XXII «Мичуринские чтения» (26-28 октября, 2010) г. Мичуринск, Международной научно-практическая конференция «Современные сорта и технологии для интенсивных садов» г. Орел ГНУ ВНИИСПК (15-18 июля 2013 г.). Результаты исследований позволили принять участие в межгосударственной целевой программе ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» (государственный контракт№ 16.М04.11.00).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 6 в рецензируемых ВАК изданиях, 1 методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций для селекции, списка литературы (141 наименование, в том числе 93 зарубежных автора), двух приложений, содержит 14 таблиц и 12 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2 ОБЪЕКТЫ, МЕТОДИКА II УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологическими объектами исследования послужили сорта и гибридные формы яблони из коллекции ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина. Всего проанализировано 72 генотипа. Экстрагирование ДНК было проведено по протоколу предложенному Эдвардсом (Edwards et. al., 1991) в модификации Форте (Форте, 2004) с применением очистки от полифенольных соединений хлоридом лития. Так же использовали методику Д. Пучоа (Puchooa, 2004) адаптированную для работы с растительным материалом с высоким содержанием фенольных соединений.

Для идентификации гена Vf использовали ПЦР с праймером VfiC (Afunian et al., 2004). Идентификацию генов, вовлеченных в биосинтез этилена, проводили, используя праймеры Md-ACOl и Md-ACSl(Costa, 2005).

5

Ген, вовлеченный в синтез экспансина в плодах яблони, идентифицировали с помощью праймера MD-Exp7 (Costa, 2008). Анализ генетического полиморфизма сортов и гибридных форм яблони проводили с использованием 15 микросателлитных праймеров (Gianfranceschi, 1998). Все используемые в работе праймеры были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия, Москва). Амплификацию проводили в приборе GeneAmp 9700 производства фирмы «Applied Biosystems» или ДТ-96 фирмы «ДНК-технология».

Разделение продуктов амплификации с праймерами VfC, Md-ACQl и Md-ACSl проводили путем электрофореза в 2% агарозном геле.

Разделение продуктов амплификации с микросателлитными праймерами проводили путем электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в камере для вертикального электрофореза Sequi-gen GT system (BIO-RAD). Проявляли гель, используя метод окрашивания нитратом серебра (Benbouza et al., 2006). Для определения длины амплифицированных фрагментов использовали маркер молекулярной массы ЮЬр DNA ladder (Invitrogen) (0,05 г/л).

Статистический анализ данных микросателлитного анализа был проведен с использованием программы Past 4.8. В статистический анализ были включены только четкие, воспроизводимые фрагменты.

Показатель генетического разнообразия рассчитывали по Нею:

Н- 1-Y.p,, где H - коэффициент полиморфизма, р-частота аллелей (Nei, 1973).

Расчет генетических расстояний (GD) проводили с использованием коэффициента различий Дайсона. В качестве дистанционного метода построения филогенетических деревьев использовался UPGMA анализ (метод попарного внутригруппового невзвешенного среднего - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean).

Секвенирование было проведено с помощью автоматического секвенатоа Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в Институте Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Обработка результатов секвенирования проведена с использованием программы MEGA5.0 и Chromas 4.0.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Оценка генетического разнообразия яблони с использованием анализа мнкросателлитов

Выбранные микросателлитные локусы характеризовались высоким уровнем информативности. Число аллелей на локус варьировало от 10 (для локуса СН02с02Ь) до 20 (для локуса CH03d07), что дает возможность выявлять межсортовой полиморфизм.

Всего было выявлено 217 SSR-фрагментов размером от 76 до 250 п.н. Значительная часть выявляемых аллелей относится к редким, то есть встречались только один раз среди анализируемых генотипов. Например, в локусе CH02g04 из 18 детектируемых аллелей 6 (размером 178, 185, 186, 189, 191 и 194 п.н.) можно отнести к редким, так как они обнаружены только у одного из анализируемых генотипов, тогда как аллель длинной 199 п.н. встречается у 19 образцов.

Всего выделено 36 сортообразцов для которых идентифицированы специфичные аллели. Наибольшее количество уникальных аллелей (по три аллеля) отмечены у сортовой формы Кавказское самоплодное и сорта Пепин шафранный. Из 36 выделенных образцов, для которых идентифицированы уникальные аллели, присутствуют только 5 сортов зарубежной селекции.

На основании анализа SSR-спектров были рассчитаны генетические расстояния между образцами. При этом проводится вычисление коэффициента сходства Дайсона между парами образцов. Было установлено, что у исследованных образцов значения коэффициентов сходства варьируют в пределах от 0 (между сортами Гала и Полинка) и 0,7 (между сортами Аркад летний и Аркад зимний). При этом коэффициент сходства был высоким у сортов имеющих общую родословную (Аркад летний и Аркад зимний, Успенское и Прима).

На основании данных о генетическом полиморфизме сортов и форм яблони была построена дендрограмма, отражающая сходство изучаемых генотипов (рис. 1).

Полинка Лавиа

Мирон сахарный Мекинтош Коричное полосатое Шафран-китайка Malus се rast fe ra Векьяминовское Благовест Малюха Останкино Васюган Тилеимон 11-6-2 3-19 10-16 х-з 10-18 Фуджн Фридом Греннн Смит Годлен делишес Золотая китайка Таежное

Пепин шафранный

Аркад зимний

Аркад летний

Свежесть

Бребурн

Гала

Найдзеиы

Спартак

Жигулевское

Дочь коричного

Рождественское

Бессемянка мичуринская

Флагман

Большак

Антоновка обыкновенная Дорунак

Бельфлер-китайка

Мичуринец

Хувитуш

Северная зорька

Антоновка шестисотграммовая

Malus robusta

Кулон-китайка

Осеннее полосатое

Бельфлер-рекорд

Комсомолец

Яхонтовое

Трувор

Мантет

Шаропай

Феникс алтайский

Украинское

Зимнее полосатое

Крас нознаменное

Болотовекое

Кандиль орловский

Успенское

Прима

Сябрина

Парад изка

Кавказское самоплодное Malus sargentii Malus baccaia 54-118

Malus pumita Malus ringo Ессул Еомака

Из дендрограммы видно, что четкое разделения на кластеры у коллекционных образцов отсутствует, что подтверждает и низкое значение индекса бутстреп. Вероятно, это связано с большим разнообразием коллекционных образцов, поскольку в анализируемой коллекции собраны разнообразные сорта яблони селекции различных регионов нашей страны и зарубежных стран, созданные в различное время.

Велика доля сортов полученных от свободного опыления и сортов народной селекции. В происхождение значительной части исследуемых образцов принимали участие дикие виды рода Malus. Такие скрещивания характерны, в частности, для сортов селекции И.В. Мичурина.

Межвидовая гибридизация, лежащая в основе сортов, созданных И.В. Мичуриным, делает эту коллекцию генетически уникальной, о чем косвенно свидетельствует большое количество редких (и уникальных) SSR аллелей, выявленных в этой группе сортов.

Уникальность мичуринских сортов в целом подтверждается и оценкой их генетического сходства с зарубежными сортами, которое проводили используя метод главных координат на основе анализа 15 микросателлитных локусов (рис. 2).

Анализ распределения образцов в плоте показывает, что эти две группы не имеют четкого разграничения (как и все коллекционные образцы в целом). Однако хорошо видно, что большинство мичуринских сортов располагаются в левой нижней половине плота, а зарубежные сорта - в правой верхней.. Исключение составляет сорт Бребурн, который по состоянию микросателлитных локусов оказался очень похож на сорт Дочь коричного. Анализ родословной не позволяет выявить родство этих сортов, так, как происхождение сорта Бребурн неизвестно, а сорт Дочь коричного получен от скрещивания сорта народной селекции Коричное полосатое и дикорастущего вида яблони Malus prumifolia. Возможно, такое сходство оказалось случайным, возможно есть какое-то рациональное объяснение, но для его получения требуются дополнительные анализы.

Таким образом, анализ нашей коллекции показал, что разнообразие яблони по микросателлитным локусам высоко и эти маркеры вполне могут быть использованы для генетической паспортизации сортов. Другим положительным моментом применения данных маркеров является то, что с их помощью возможно искать в коллекции уникальные генотипы, несущие редкие аллели по микросателлитным локусам и, соответственно, с высокой степенью вероятности и редкие аллели по локусам сцепленных генов.

*

ч о»

Северная зсрьх$

Саеаное Бельфлер-рекорд • К

*

Автшовха «Золота^китайка шестисотграыыовая *Хуиятуш

Шафргн-ыгга&а

•?Лавна

Грана Сшгг

Яхонтовое

• Тилейыов Фуцш

•фретоы

Годен деяншес

• Краснознаменное

Бсдьфяер-китайк^

•Шарппай

"*Труьар"

Лачь коричного Бребурн

Парадазка ышуршеря . Мантгг

•Вювьшак

•Гала • Приыа

»^есемшц-ц м^нурява

он

Сооп]пз«е 1

Рис. 2 Расположение сортов селекции И.В. Мичурина и зарубежных сортов в главных координатах на основе

анализа 15 микросателлитных локусов генома ф - сорта селекции И.В. Мичурина

- зарубежные сорта

Такие генотипы могут оказаться перспективными в селекции. Данные маркеры позволяют оценить генетическое разнообразие коллекции в целом и даже в, некоторой степени, выявить различия в пулах генофондов имеющих разное происхождение. Однако они не очень удобны при изучении родословных яблони, поскольку общая структура полученного филогенетического древа оказывается достаточно «рыхлой» и с определенной степенью достоверности можно говорить только о родственных связях некоторых пар сортов.

3.1.1 Использование микросателлитных маркеров для генетической паспортизации сортов яблони

Анализ микросателлитных локусов позволил получить индивидуальные профили их аллелльных состояний. Каждый сорт имеет свой уникальный профиль, на основании которого может быть составлен генетический паспорт.

Для создания генетических паспортов сортов и форм яблони необходимо отобрать локусы, которые показывают высокую эффективность в выявлении внутривидового полиморфизма и идентификации генотипов.

На основании анализа 15 микросателлитных локусов определен диагностический набор наиболее информативных, позволяющих идентифицировать генотипы взятые для анализа. Минимальным количеством для определения сортовой специфичности является 11 праймерных пар: СН(Ш12, СН03сЮ7, СН02с02Ь, СНОШЗЬ, СН03сЮ8, СН05§08, СН02в04, СН04е07, СНОЗсШ, СН(Ш01, СН03а04. Установлено, что данного количество праймеров достаточно для однозначной идентификации любого сорта в коллекции.

Для создания генетических паспортов на основе 88Я-анализа целесообразно результаты амплификации с выбранными парами праймеров записать в виде таблицы, в которую заносят название сорта, название микросателлита и размер амплифицируемого фрагмента. Целесообразно, также, в паспорте указывать происхождение сорта, оригинатора и год внесения в госреестр, что позволяет получить полную информацию о сорте. В качестве примера приведен образец паспорта разработанного для сорта яблони Антоновка обыкновенная.

Генетический паспорт сорта яблони Антоновка обыкновенная

Оригинатор ГНУ Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства

Год внесения в Госреестр 1947

Происхождение Сорт народной селекции

Сорт Микросателлит Аллель (размер, п.н.)

Антоновка обыкновенная CH03dl2 c9 (108)

CH03d07 рб (217)

CH02c02b d2 (109)

CH01f03b al (140)

CH03d08 a7( 123); k7 (147)

CH05g08 xl3( 178); ¡13 (192)

CH02g04 m3 (198)

CH04c07 тя/0(138);ЫО(98)

CH03dll (120)

CH03d01 c5 (114)

CH03a04 m4 (112); f4 (98)

3.2 Распространение гена устойчивости к парше (У/) у сортов и форм яблони на основании данных ДНК-маркирования

Для выявления распространения гена в анализируемой коллекции сортов и форм яблони применяли STS-маркер V/C разработанный Afunian M.R. (Afunian et al., 2004).

При проведении реакции с праймерами VfCl и VfC2 амплифициру-ются три фрагмента, которые соответствуют участкам генов Vfal, Vfa2 и Vfa4 Эти гены гомологичны генам HcrVfl, HcrVfi, и HcrV/4, выявленных у сорта Флорина (Afunian et al., 2004). Большинство исследований показывают, что непосредственно геном Vf, ответственным за моногенную устойчивость к заболеванию паршой, является ген Vfa4 (Vinatzer et al.,1998; Xu&Korban, 2002; Afunian et al., 2004).

Фрагменты генов Vfal, Vfa2 присутствуют у всех исследуемых образцов. Данные гены экспрессируются только в молодых листьях. Во взрослом состоянии в листьях экспрессируется лишь ген Vfa4 (Afunian et al., 2004). Наличие фрагмента гена Vfa4 идентифицировано у 13 из 72 анализируемых генотипов. Такими сортами являются: Благовест, Веньяминов-ское, Кандиль орловский, Былина, Успенское, Болотовское, Прима, Рождественское, Флагман, Надзейны, Сябрина, Фридом и сортовая форма 3-19.

3.2.1 Секвенирование фрагментов генов Vf

Для обоснования достоверности проведенных исследований по идентификации гена Vf в анализируемых коллекционных образцах сортов и форм яблони амплифицированные фрагменты были секвенированы.

Для проведения сиквенса были взяты фрагменты иммунного к парше сорта яблони Успенское. Секвенированные последовательности были выровнены и приведены на рисунке 3. Приведен поиск аналогичных последовательностей в базе данных NCBI. Секвенированный фрагмент Vfa4 совпадает на 99% с последовательностью гена HcrVß Malus ßoribunda расположенной в генбанке под номером AJ297741. Это подтверждает, что амплифицируемый у части образцов фрагмент размером 286 п.н. является участком гена Vf.

Md-Vfl ATATCACATATTTGÄGG&AAATTGAnTGTCAGAT...................... 35

Md-Vf2 ATATCACATCTTTGAGGGAAAT7GA777GTCA7CCAATTATA7TAGTCTTÜ4TCCG4 57

Md-Vf3 ATATCACATCTTTGAGGGWTTWTTTSTCATTCA^rrCTATTAGTCTTGATCCGA 57

->

VfClF

Md-Vfl .........-.......-.......-.....-.....-.......-..........-

Md-Vf2 TTCCCAAATGGCTGCTTTA4CCAAAA4ü4TC?TTGCATT6AG7CTAGAATCCAATGA 114 Md-Vf3 TTCCCAAATTGn6G7T7ACCCAAAAAA7CCGTT6AATTGAGTCTASAATCC4ATCA 114

Hd-Vfl .........................................................

Md-Vf2 ACTTACAGS4CAACTTCCAAGCATCATTCAGAA7AT&ACTGÜTCTTAAAGTTCTTGA 171 Md-Vf3 ACTTACAGGACAACTTCCAAGAAGTATTCAGAATATGACTGGTCTTACAACTCrTAA 171

V,d-Vfl .........................................................

Md-Vf2 TCTCGGATGGWCSACTTCAATTCTACCÄTACCTGAATGGTTGTATÄGCTTGAACAA 228 Md-VfJ TCTCGGGGGGAACüAATTCAATTCrACCATACCTGAATSGTTGTATAGCTTGAACAA 228

Hd-Vfl .........................................................

Md -Vf 2 TCTCSAGTCTTTÄ£TTC7TTCTTACAATGCCT7GCGTGGTGAAATATCGAGTTCCAT 285 Md-Vf3 TC7CGAGTCCTTACTTCTTTTTGGCAATGCCTT«GTGGTGAAA7ATCGAG7TCCAT 2ß5

Md-vfl .............................................-...........

Hd-Vf2 TGGAAACATGACATCCCTTGTCAATCTTCACTTGGATGGTAATCAGrTGGAAGGGAA 342 Kd-Vf 3 TGÜAAACCTTAAAAGTTTAAGGCACTTTGA7CTTTCAA6TAAT7CA----------- 331

Md-Vfl .....-.................................................AA 37

Md-Vf2 AATCCCAAATTCCTTGGGACATCTTTGTAAGTTGAAAGTTCTTGATCTGTCAAASAA 399

331

Hd-Vfl CAATTTCACGGTTCAAAGACCA7CCGAAATCTTTGAAAGT7TGTCCAGATGTGGTCC 95

MÖ-Vf2 CCAmCACGGTTCGAAÜ^CCArCCGAAATCTTCGaAAGTTTGTCCAAATGTGGTCC 456

Hd-Vf3 ........................-................................................................331

Md-Vfl AGATGGAA7AAAG7CATTGTCG7TÜAGGAA7AC7AATGTATCAGGTCCC4TTCCAAT 152

Nd -Vf 2 AüAT6GAATAAAGTCAT7GrCATTGAGGTATAC7AATATATCACG7CCCA7TCCAAT 513

№J-Vf3 .....................................ATATCAGGTCCCATTCCAAT 3S1

Md-Vfl G7CACTAGGAAATATGTCAÄGCT7AGAAAAAT7GGACA7ATC7GTA%A7CAGTTTA 209

Md-Vf2 GTCACTAGGAAATCTGTCAAGC77AGAAAAATTGÜACATATCTGGAAATCATTTTA 579

Md-Vf3 CTCACTAGGAAATCTATCAAGCTTAGAAAAATTGTACATATCTGÄAÄATCATTTTA 403

Hd-Vfl A7GGAACTTTCACAÜAAGTTA7TGG7CAACTCAAAATGCTAACGA 254

«d-Vf2 ATGCAACTTTCACAGA4GTTATTGGrCAACTCAflAATGCTAACGA 615

Md-Vf3 ATGGAACTTTCACA&AAG77AT7GG7CAACTCAAAATGCTAACGA 463 <-

VfC2R

Рисунок 3 Выравнивание нуклеотидных последовательностей амплифицируемых фрагментов: \ld-Vfl - У/а4, Мс1-УО - У/а1, Мс1-УВ - У/а2 Стрелками обозначены места отжига праймеров.

3.3 Идентификация аллелей генов влияющих на длительность хранения плодов в коллекции сортов и форм яблони

3.3.1 Идентификация аллелей генов, вовлеченных в биосинтез этилена в плодах у сортов и форм яблони

Товарные качества плодов обуславливает их внешний вид, который зависит от сроков сохранности. Знание о наличии генетических компонентов, ответственных за лежкость, значительно повысит эффективность получения новых конкурентоспособных сортов. Ключевыми факторами сохранности плода является уровень биосинтеза этилена, который проходит в два этапа при участии ферментов АСС-синтазы и АСС-оксидазы (Yanmin Zhu & Bruce Н.Barritt, 2008).

Для анализа аллельного состояния генов Md-ACSl и Md-ACOl в ген-плазме сортов и форм яблони была проведена амплификация геномной ДНК с праймерами Md-ACS 1 и Md-ACO 1.

При анализе коллекционных образцов яблони по локусу Md-ACSl были идентифицированы три аллельных варианта. В исследуемых сортах и формах выделены гетерозиготные образцы, а также гомозиготные по первому и по второму аллелю. Всего в исследуемых образцах выявлено 16 гетерозиготных сортов по данному локусу, 2 сорта гомозиготных по аллелю 2 и 56 сортов гомозиготных по аллелю 1.

Анализ аллельного полиморфизма по гену Md-ACOl выявил, что у большинства сортов и форм яблони в исследуемой коллекции присутствуют обе аллельные формы данного гена.

В анализируемой коллекции аллель Md-ACS 1-2 чаще встречается в сортах зарубежной селекции. Так, из 72 растений данный аллель идентифицирован у 6 сортов российской селекции и 8 сортов селекции зарубежных стран. При этом два из них (Гала, Фуджи) являются гомозиготными формами по данному аллелю.

Анализ аллельного разнообразия гена Md-ACSl позволил выявить закономерность распределения аллельных форм гена у сортов и форм яблони. Интересным является факт отсутствия аллеля 1 в стародавних сортах отечественной селекции, сортах народной селекции и диких видах яблони. Аллельная форма 2 данного гена появляется у сортов селекции зарубежных стран и современных российских сортов, в родословной которых присутствуют зарубежные сорта.

Изучение происхождения сортов зарубежной селекции, анализируемых в работе, показало, что родительскими формами большинства из них являются сорт Голден делишес. Это позволяет предположить, что дефектный аллель Md-ACSl-2, обуславливающая сниженный уровень биосинтеза этилена в плодах яблони, впервые появилась в результате селекционной работы в зарубежных сортах или в результате мутации у одного из диких видов яблони.

Для гена Md-ACOl наиболее распространена комбинация аллелей Md-ACOl-1 и Md-ACOl-2. Однако среди изучаемых генотипов выявлены гомозиготные формы по аллелю Md-ACOl-2. Такими сортами являются сорта Флагман и Рождественское. Наибольший интерес представляют сорта и формы яблони, несущие аллель Md-ACOl-1, ответственный за сниженный уровень синтеза продукта данного гена. В анализируемой коллекции данный аллель в гомозиготном состоянии идентифицирован у диких видов яблони - Malus baccata, Malus pumila и Malus ringo. Среди сортов аллель Md-ACOl-loтмечен у сорта зарубежной селекции Фуджи.

В сортах отечественной селекции сочетание аллелей, ответственных за наиболее низкий уровень синтеза этилена в плодах не отмечено. Поэтому целесообразным является проведение селекционной работы по созданию сортов яблони, сочетающих в своем генотипе аллели Md-ACOl-1 и Md-ACSl-2 И способных сохранять свои товарные качества продолжительный период времени. Результаты проведенного анализа позволили идентифицировать носителей данных аллельных форм генов, которые возможно использовать в скрещиваниях при создании сортов с длительным сроком хранения. Так носителями аллеля 2 гена Md-ACSl в гомозиготном состоянии являются сорта западной селекции

Гала и Фуджи. Идентифицированы также гомозиготы по аллелю 1 гена Md-ACOl, которыми являются дикие виды яблони (Malus baccata, Malus pumila и Malus ringo).

3.3.2 Лллельное разнообразие генов, вовлеченных в биосинтез экспансинау сортов и форм яблони

Одним из важных компонентов длительной лежкости плода является его способность длительное время сохранять высокую плотность мякоти. Смягчение фруктов - процесс, происходящий из-за деполимеризации различных классов полисахаридов. Экспансии - белок, участвующий в нарушение нековалентных связей между матрицей гемицеллюлозы и целлюло-

зы микрофибрилл. Для гена, вовлеченного в биосинтез экспансина у яблони, был работай микросателлитный маркер, который позволяет идентифицировать аллель состояния гена MD-Exp7.

Аллелльное разнообразие гена MD-Exp7опекавши с использованием микр теллитного праймера MD-Exp7SSR. В результате проведенной амплификации выяв 3 аллельных формы гена: MD-Exp7-1, MD-Exp7-2 и MD-Exp7-3.

Анализируемые сорта яблони содержат различные комбинации аллелей MD-Exp7.

Культурные сорта яблони разделяют на три группы в зависимости от сочет аллельных форм гена MD-Exp7 (Costa et. al., 2008). Для каждой из этих групп хара рен различный уровень биосинтеза экспансина. В анализируемой коллекции сорт форм яблони комбинация MD-Exp7-llMD-Exp7-2, обуславливающая наиболее низ уровень биосинтеза экспансинавыявлена у 19 генотипов.

Ко второй группе сортов со средним уровнем синтеза этилена принадлежат та с комбинацией аллелей MD-Exp7-2lMD-Exp7-2. В анализируемой коллекции и тифицировано 24 генотипа гомозиготных по второму аллелю.

В третью группу в которую входят сорта и формы яблони с повышенным ур синтеза экспансина объединены генотипы для которых характерно сочетание алл MD-Exp7-21MD-Exp7-3. Всего таких образцов выявлено восемь.

Анализ полученных результатов показал, что аллель 1 гена MD-Exp7, обус ливающую сниженный уровень синтеза белка экспансина, характерен для диких bi яблони, а также сортов, родительскими формами которых являлись дикие виды, ключение составляют сорта Васюган и Останкино не имеющие среди родителей Д1 видов. Аллель 3, данного гена, идентифицирован у сортов зарубежной селекции и тов отечественной селекции: Аркад летний желтый, Аркад зимний и Яхонтовое, я невого подвоя 54-118 и гибридной формы 3-19. У сортов отечественной селекщ родословной присутствует дикий вид яблони - Яблоня Недзвецкого. Это позво. предположить, что данный вид является генисточником аллели 3.

Выделены генотипы, сочетающие все три аллельных формы гена. Такими сортами являются стародавние сорта Аркад летний желтый, Аркад зимний и Яхонтовое.

Сравнение сроков созревания, по литературным данным (Седов, 2005, Савельев, 1999), и комбинации аллелей показало, что для сортов с комбинацией МО-Ехр7-ИКЮ-Ехр7-2, ответственной за сниженный уровень синтеза экспансина, характерны сорта с осенним и зимним сроками созревания. Исключение составляют летние сорта Золотая китайка и Мирон сахарный, плоды которых обладают малым сроком хранения и быстро теряют твердость. Данные сорта требуют дальнейшего изучения генотипа и филогении.

На основании полученных ранее результатов рассмотрено соотношение аллельных форм генов вовлеченных в биосинтез этилена и гена ответственного за синтез экспансина. Анализ показывает, что соотношение аллельных форм Мс1-АС81-2 и Мс1-АСО!-1 генов синтеза этилена и аллелей МО-Ехр7-УМВ-Ехр7-2 гена, контролирующего биосинтез экспансина, отмечены у сортов Хувитус и Грэнни Смит. Такое сочетание аллелей говорит о сниженном уровне синтеза продуктов данных генов, что обуславливает продолжительные сроки хранения плодов данных сортов яблони.

4 Применение методов маркер-опосредованной селекции для получения новых генотипов яблони

Оценка коллекции сортов и форм яблони ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина с использованием молекулярных маркеров позволила выявить ее уникальность и идентифицировать генисточники ценных хозяйственных признаков. В результате проделанной работы выявлены аспекты, которые затруднено оценить с использованием традиционных методов селекции. Применение методов маркер-опосредованой селекции открывает новые возможности отбора уникальных генотипов и значительно экономит время. При этом возможна оценка комплекса признаков, а также гомо- и гете-розиготности организма по селектируемому гену.

Появление новых методов в биологии и, в частности в молекулярной биологии, требует переосмысления подхода к каноническим принципам селекционной работы. Целесообразно применение оценки новых генотипов на уровне ДНК. Поэтому на практике оценка гибридных форм должна проходить по измененным схемам. Так принцип маркер-опосредованой селекции для отбора ценных генотипов по комплексу признаков яблони можно разделить на несколько этапов.

1. Подбор перспективных родительских форм для скрещивания.

2. Проведение скрещивания.

3. Отбор гибридных семян.

4. Высадка семян в закрытом грунте (возможно даже зимой в первый год анализа).

5. Проращивание семян до стадии 2-3 листьев.

6. Экстрагирование ДНК из гибридных сеянцев.

7. Проведение ПЦР-анализа для идентификации маркеров генов хозяйственно-значимых признаков.

8. Отбор ценных генотипов.

9. Высадка сеянцев в открытый грунт для дальнейшего изучения.

Все стадии проведения анализа могут занимать 1-2 года, начиная со

сбора семян и заканчивая получением результатов. При этом отбор генотипов позволяет идентифицировать признаки, которые затруднительно определить по фенотипу или до его проявления необходимо ждать до состояния взрослого растения.

Принцип маркерного подхода к селекции очень удобен при анализе больших генетических коллекций. Здесь есть возможность оценки разнообразия по селектируемым генам и выявления доноров с комплексом важных признаков. Так, проведя анализ сортов и форм яблони из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина установлено, что исследуемые генотипы содержат большое количество уникальных микросателлитных локусов генома, что делает ее высокополиморфной и представляет интерес для селекционной работы. Выделены генисточники таких признаков как сниженный уровень биосинтеза этилена и экспансина в плодах, моногенная устойчивость к парше. Результаты такого анализа могут быть основой при выборе родительских форм для скрещиваний.

5 Экономическая эффективность использования методов ДНК-технологии

В нашей работе коллекция сортов яблони была проанализирована на распространение в ней генов, ответственных за продолжительную сохранность плода. Использование данного метода целесообразно для анализа гибридного потомства, полученного от скрещивания сортов с генами контролирующих лежкость.

Использование методов маркер-опосредованной селекции для оценки гибридного потомства позволяет сократить финансовые расходы и время отбора в сравнении с традиционными методами селекции.

Для сравнения двух методов анализа был произведен расчет экономической эффективности. При этом была взята стандартная методика проведения ПЦР-анапиза, использованная при выполнении работы. В качестве традиционного метода отбора гибридных форм яблони по степени сохранности плодов выбран ускоренный метод получения урожая путем прививки в крону однолетних побегов. Временные затраты рассчитывались от момента посева семян в почву.

Таким образом, сравнительная оценка методов отбора гибридных форм по степени лежкости плодов показала, что использование методов молекулярного анализа является экономически выгодным. Уровень рентабельности при этом достигает 431,4%.

Выводы

1. Анализ микросателлитных локусов у образцов сортов и форм яблони из коллекции ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина показал высокую полиморфность и сортоспецифичность данного типа маркеров. С их помощью идентифицирован 31 генотип отечественной селекции, в которых присутствуют уникальные аллели по микросателлитгым локусам.

2. На основе анализа 11 микросателлитных локусов генома (CH03dl2, CH03d07, CH02c02b, СНОНОЗЬ, CH03d08, CH05g08, CH02g04, CH04e07, CH03dl 1, CH03d01,'CH03a04) возможно идентифицировать различия между двумя сортами. Этого достаточно для создания генетических паспортов сортов и форм яблони.

3. Идентифицированы сорта несущие ген Vf, ответственный за моногенную устойчивость к заболеванию паршой: Благовест, Веньяминов-ское, Былина, Успенское, Болотовское, Прима, Рождественское, Флагман, Надзейны, Сябрина, Фридом и сортовой форме 3-19.

4. Установлено, что аллель Md-ACSl-2, обуславливающий сниженный уровень биосинтеза этилена в плодах, распространен у зарубежных сортов и производных от них сортов отечественной селекции. У дикорастущих видов яблони - Malus baccata, Malus pumila и Malus ringo идентифицирован аллель Md-ACOl-1, ответственный за продолжительную сохранность плодов.

5. По результатам ДНК-типирования выделены генотипы, являющиеся генисточниками гена MD-Exp7, контролирующего уровень биосинтеза экспансина, белка ответственного за степень плотностиплодов - сорта Пепин шафранный, Аркад зимний, Дорунак, Антоновка обыкновенная, Шаропай, Хувитус, Украинское, Мирон сахарный, Мекинтош, Коричное полосатое, Таежное, Северная зорька, Бельфлер-рекорд, Яхонтовое, Осеннее полосатое, Васюган, Останкино и вид Malus sargenta. Для данных сортов характерна комбинация двух аллельных вариантов гена MD-Exp7\ MD-Exp7-1/ MD-Exp7-2.

6. Расчет экономической эффективности показал высокий уровень рентабельности (431,4%) использования молекулярно-генетического анализа гибридного потомства в сравнении с традиционными методами при селекции на признак продолжительности хранения плодов.

Практические рекомендации для селекции

1. На основании генетического типирования и анализа нуклеотидной последовательности гена устойчивости к парше рекомендовать для селекции в качестве исходных форм для создания сортов с моногенной устойчивостью к парше сорта Благовест, Веньяминовское, Былина, Успенское, Бо-лотовское, Прима, Рождественское, Флагман, Надзейны, Сябрина, Фридом и сортовую форму 3-19.

2. Для селекции рекомендовать в качестве доноров генов продолжительной сохранности плодов источники гена Md-ACOl виды - Malus baccata, Malus pumila и Malus ringo.

3. Рекомендовать для планирования схем скрещивания при проведения селекционной работы в качестве генисточников гена длительной леж-кости плодов я б л о н и (ген CS7 ) сорта Гала и Фуджи.

4. Рекомендовать при планировании схем гибридизации для создания сортов с низкой степенью размягчения плодов генисточники гена биосинтеза экспансина(MD-ExpT) сорта Пепин шафранный, Аркад зимний, Дорунак, Антоновка обыкновенная, Шаропай, Хувитус, Украинское, Мирон сахарный, Мекинтош, Коричное полосатое, Таежное, Северная зорька, Бельфлер-рекорд, Яхонтовое, Осеннее полосатое, Васюган, Останкино и вид Malus sargentii.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Шамшин И.Н., Савельев Н.И., Кудрявцев A.M. Применение молекулярных маркеров для идентификации генотипов яблони с геном устойчивости к парше / И.Н. Шамшин, Н.И. Савельев, A.M. Кудрявцев // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. работ - 2011. - Т. 26. - С. 126129.

2. Шамшин И.Н., Кудрявцев A.M., Савельева И.Н. Скрининг колон-новидных генотипов яблони методом молекулярно-генетического анализа / И.Н. Шамшин, A.M. Кудрявцев, И.Н. Савельева // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета-2011.-№2 Ч. 1 - С. 55-58

3. Савельев Н.И., Юшков А.Н., Шамшин И.Н. Применение метода молекулярных маркеров для изучения генетического разнообразия плодовых культур / Н.И. Савельев, А.Н. Юшков, И.Н. Шамшин // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета - 2011. - №2 Ч. 1 -С. 8-12.

4. Шамшин И.Н. Оценка разнообразия по аллелям генов, вовлеченных в контроль биосинтеза этилена у яблони, с помощью молекулярных маркеров / И.Н. Шамшин // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета-2011,-№2 Ч. 1 -С. 76-81.

5. Шамшин И.Н., Савельев Н.И., Кудрявцев A.M. Аллельное разнообразие гена MD-EXP 7 у сортов яблони и груши маркеров / И.Н. Шамшин, Н.И. Савельев, A.M. Кудрявцев // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета - 2012. - №4 Ч. 1 - С. 23-26.

6. Шамшин И.Н. Создание генетических паспортов сортов яблони на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов генома / И.Н. Шамшин // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета - 2013. - №6. - С. 27-31.

Публикации в других изданиях

I. Шамшин И.Н., Кудрявцев A.M., Савельев Н.И. Анализ генетического полиморфизма генома яблони с использованием микросателлитных последовательностей ДНК / И.Н. Шамшин, A.M. Кудрявцев, Н.И. Савельев // Научные труды ГНУ СКЗНИИСиВ. Методологическое обеспечение селекции садовых культур и винограда на современном этапе (Материалы научно-практического форума «Роль экологизации и биологизации в по-

вышении эффективности производства плодовых культур, винограда и продуктов их переработки»), - Краснодар: ГНУ СКЗНИИСиВ, 2013. -Том 1,-с. 39-42.

2. Шамшин И.Н., Савельев Н.И., Кудрявцев А.М.Применение ДНК-технологий для анализа генетической коллекции яблони / И.Н. Шамшин, Н.И. Савельев, A.M. Кудрявцев // Современные сорта и технологии для интенсивных садов: материалы между нар. научн. - практ. конф., поев. 275-летию А.Т. Болотова (15-18 июля 2013 г., Орел). - Орел: ВНИИСПК, 2013.-е. 272-275.

Методические рекомендации Шамшин И.Н., Кудрявцев A.M., Савельев Н.И.Создание генетических паспортов сортов яблони на основе анализа полиморфизма микроса-теллитных локусов генома: методика / И.Н. Шамшин, A.M. Кудрявцев, Н.И. Савельев. - Мичуринск, 2013. - 44 с.

Отпечатано в издательско-полиграфическом центре ФГБОУ ВПО МичГАУ Подписано в печать 23.10.2014 г. Формат 60x84'/|6, Бумага офсетная № 1. Усл.печ.л. 1,2 Тираж 120 экз. Ризограф Заказ № 17892

Издательско-полиграфический центр Мичуринского государственного аграрного университета 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная, 101, тел. +7 (47545) 9-44-45