Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Искусственные ДНК-содержащие супрамолекулярные комплексы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Искусственные ДНК-содержащие супрамолекулярные комплексы"

На правах рукописи

□034555

П03М0Г0ВА ГАЛИНА ЕВГЕНЬЕВНА

ИСКУССТВЕННЫЕ ДНК-СОДЕРЖАЩИЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ

03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2008

о 5 ДЕК 2008

003455514

Работа выполнена в центре "Биоинженерия" Российской академии наук и в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины "Росздрава"

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор

Елизавета Сергеевна Громова

Доктор химических наук, чл.-корр. РАН

Александр Габибович Габибов

Доктор химических наук, профессор

Юрий Михайлович Евдокимов

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН

-/7

Защита состоится 25 декабря 2008 г. в ' на заседании диссертационного

совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан 24 ноября 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, кандидат химических наук

Крицын

Общая харастеристика работы

Актуальность работы. Одно из основополагающих природных свойств полинуклеотидов состоит в их способности ассоциироваться с различными биополимерами и низкомолекулярными соединениями с образованием супрамолекулярных комплексов. Надмолекулярные ассоциаты полинуклеотидов -естественная форма их существования. Конструирование искусственных комплексов ДНК и структурно-функциональное исследование таких модельных систем -продуктивный прием, как для изучения природных процессов, так и для создания новых подходов к решению широкого спектра актуальных прикладных задач. В настоящей работе рассмотрены три группы супрамолекулярных ассоциатов ДНК. I. Наиболее близкие природным аналогам нуклеопротеиновые транспортные комплексы для направленной доставки чужеродных олиго-/полинуклеотидов в целевые клетки живого организма. 2. Комплексы, моделирующие свойства живой системы [живая клетка - фиксированная на внешней мембране ДНК -комплементарная нуклеотидная последовательность]. 3. Ассоциаты ДНК и нуклеопротеиновые ансамбли с наночастицами металла (никеля).

Необходимость применения специальных транспортных систем для доставки чужеродного генетического материала в клетки-мишени остается существенным препятствием на пути развития генотерапии. Наибольшая избирательность в отношении целевых клеток показана для белковых переносчиков чужеродного генетического материала, использующих естественные механизмы клеточного обмена. В настоящее время, несмотря на обнадеживающие лабораторные результаты, известные белковые векторы в силу различных причин не удовлетворяют требованиям клинического применения. Поэтому актуальна разработка новых подходов к созданию белков-транспортеров ДНК, способных к самопроизвольной сборке с различными терапевтически значимыми молекулами олиго- и полинуклеотидов с образованием стабильных в биологических жидкостях функциональных надмолекулярных комплексов. Для этой цели необходимо изучение закономерностей образования и структурно-функциональных свойств таких нуклеопротеиновых ассоциатов. Полученные результаты могут стать основой для разработки новых универсальных и технологически доступных неиммуногенных белковых векторов, необходимых для создания различных лекарственных средств для генотерапевтического лечения заболеваний различной этиологии.

Многие адгезивные манипуляции с живыми клетками основаны на бинарных лиганд-рецепторных взаимодействиях. Для направленной мультиаффинной

иммобилизации клеток на твердом носителе недавно было предложено снабдить поверхность клеток фрагментами ДНК. Для этого проводили ковалентную конденсацию активированных олигонуклеотидов с олигосахаридами клеточной мембраны, модифицированными азидо-группами (Chandra, 2006), что и придавало клеткам искусственное сродство к комплементарным последовательностям ДНК. Реализация этой привлекательной и перспективной идеи осложнена и ограничена необходимостью использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью (трое суток) процедуры ДНК-модификации клеток. Создание нового способа быстрой, эффективной и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с плазматической мембраной чрезвычайно актуально для развития новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов, разработки новых биосенсорных систем.

Одно из направлений в нанотехнологии состоит в получении новых материалов с использованием фрагментов ДНК, ковапентно связанных с наноразмерным носителем, например, частицами золота (Crocker, 2008). Наночастицы никеля, в сравнении с ранее описанными платформами, обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилированные белки (Becerril, 2006, Лазарев, 2007). Поэтому создание биосенсоров и диагностических систем на основе подобных биополимерных структур представляет значительный интерес. Однако, закономерности процессов сборки ассоциатов наночастиц никеля с олигонуклеотидами и белками до сих пор не изучены. Непосредственная же металлизация ДНК путем восстановления катионов никеля приводит к изменению конформации и потере природных свойств полинуклеотида (Becerril, 2005, 2006). Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.

В настоящей работе большое внимание уделено исследованию, разработке и оптимизации методов синтеза фрагментов ДНК, в том числе содержащих модификации сахаро-фосфатного остова и различные заместители, способов получения рекомбинантных белков, а также подходов к формированию и анализу структуры комплексов полинуклеотидов.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состоит в конструировании искусственных ДНК-содержащих супрамолекулярных комплексов, изучении на этих моделях закономерностей их сборки и структурно-функциональных свойств и

применении найденных подходов для решения важных прикладных медико-биологических и нанобиотехнологических задач, таких как:

— конструирование новых белков-векторов, самоассоциирующихся с олигонуклеотидами и их аналогами, а также с плазмидной ДНК для избирательной доставки чужеродного генетического материала в целевые клетки;

— создание нового способа быстрой, эффективной и безопасной для жизнеспособности клеток фиксации ДНК на внешней мембране клетки для расширения возможностей адгезивных манипуляций с живыми клетками;

— получение функциональных ассоциатов олигонуклеотидов, белков и нуклеопротеиновых комплексов на основе наночастиц никеля;

— разработка и оптимизация методов получения ДНК и белковых компонентов комплексов, а также способов формирования и анализа структурной организации супрамолекулярных ассоциатов полинуклеотидов.

Научная новизна и практическая значимость. Получены ковалентные белок-

белковые и ДНК-белковые конъюгаты с применением природных (алъфа-

фетопротеина и эпидермального фактора роста человека, ЭФРч) и новых

рекомбинантных белков. Показано, что синтезированные соединения и комплексы

способны избирательно интернализоваться целевыми клетками по рецептор-

опосредованному механизму и обеспечивать доставку нуклеиновой компоненты к

внутриклеточным мишеням. В качестве основы для конструирования переносчика

биотинилированных молекул получен слитый функциональный белок - стрептавидин-

дифтерийный токсин. На основании полученного экспериментального материала

сформулирован новый подход к созданию транспортных белков для доставки

чужеродной ДНК в клетки-мишени, в соответствии с которым получен ряд новых

полипептидов, в том числе белок РвЕк, состоящий из адресующего ЭФРч домена и

олигокатионной ДНК-связывающей последовательности. На примере взаимодействия

плазмидной ДНК и различных олигонуклеотидов с РвЕк изучены процессы

формирования и свойства образующихся комплексов. Исследовано влияние

конформации ДНК на строение и свойства ассоциатов с РвЕк и влияние

комплексообразования на структуру самой ДНК. Определены стерические и

термодинамические параметры связывания белка с олигонуклеотидами. Показана

выраженная корреляция между структурой комплексов и их биологическими

свойствами. Обнаружено, что РвЕк не только способствует более интенсивной

интернализации ДНК клетками-мишенями, но и защищает ее от деградации

нуклеазами. Показано, что РвЕк в результате существенно увеличивает

3

противоопухолевый эффект известных антисмысловых олигонуклеотидов, создавая реальную перспективу разработки широкого спектра адресованных генотерапевтических средств. Найденные подходы и закономерности носят системный характер и необходимы для конструирования новых переносчиков ДНК, избирательных в отношении различных типов клеток.

Предложен новый способ иммобилизации фрагментов ДНК на внешней поверхности клеток для генерации искусственного сродства клеток к комплементарным олигонуклеотидным последовательностям. Показано, что жирнокислотные производные олигонуклеотидов при внесении в культуральную среду нековалентно и эффективно удерживаются на внешней мембране клеток, не изменяя их жизнеспособности. Иммобилизованные олигонуклеотиды сохраняют природную способность к гибридизационным взаимодействиям. Найденный метод ДНК-маркирования клеток перспективен для создания биосенсоров, разработки новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов.

В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмерными основами. Показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами однонитевых ДНК с образованием стабильных комплексов. На примере рекомбинантных гистидинилированных белков исследовано образование протеин-никелевых ассоциатов. Впервые показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не деградированы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства, что создает основу для их использования, например, в системах селекции аффинных к белкам аптамеров. Полученные результаты вносят вклад в создание новых биополимер-никелевых наноструктур - исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной наноэлектроники, биологии и медицины.

Оптимизированные методы и технологические приемы получения олигонуклеотидов, их структурных аналогов и производных, а также способы очистки и анализа фрагментов ДНК широко используются в лабораторной практике. С их применением получены новые штаммы-продуценты белков (атриального натрийуретического фактора, кальцитонина, гормона роста, эпидермального фактора роста, цитохромов и др.), трансгенные вирусы (на основе Х-вируса картофеля) и растения (арабидопсис, табак и картофель), разработаны диагностикумы различных

инфекционных заболеваний. С помощью синтезированных олигонукпеотидов проведена одна из первых отечественных работ по геномному секвенированию (геном Х-вируса картофеля), а также конформационные исследования ДНК - параллельных дуплексов, триплексов, квадруплексов. В настоящей работе предложен новый методический прием, позволяющий осуществлять одновременный автоматический синтез олигонуклеотидов, содержащих различное число тиофосфорильных межнуклеотидных связей. Этот метод важен для поиска новых олигонуклеотидных лекарственных средств и развития ДНК-диагностики. Описана малоизученная реакция превращения полигалогензамещенных флоуронов в соответствующие акридины действием водного аммиака, являющаяся побочной при получении флуоресцентно меченых олигонуклеотидов. Использование зондов, синтезированных и выделенных с учетом этого процесса, позволило увеличить чувствительность ряда диагностикумов на 15-20%.

Разработанные методы и технологические приемы внедрены в производство диагностических наборов для определения широкого ряда патогенов, используются в производстве ДНК-синтезаторов серии ASM-800 и конструировании нового 96-канального синтезатора ASM-1000 (ООО "Биоссет", Россия, Новосибирск).

Вклад автора. Работа носит выраженный междисциплинарный характер. Основной вклад автора состоит в теоретическом обосновании гипотез, постановке задач, детальном планировании проведения экспериментов и анализе их результатов. Кроме того, непосредственно автором выполнено подавляющее число синтетических, хроматографических и аналитических работ.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации автором опубликовано более 65 печатных работ, в том числе 2 патента, главы в научных сборниках, статьи, 33 из них в рецензируемых отечественных и международных журналах из списка ВАК.

Материалы, включенные в диссертацию, докладывались более чем на 40 всероссийских и международных симпозиумах и конференциях, в том числе на Int. Conf. "Fundamental & Applied Problems in Phytovirology", 14 Conversation: Biomolecular Stereodynamics. Albany. US, Int. Conf. "RNA as Therapeutic and Genomics Target" IV Russian-French Symp. "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology", 11 Conversation: Biomolecular Stereodynamics, Int. Conf. "Molecular Biology on the verge of the XXI Century: genome structure. Functional Analysis", 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry и др.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, материалы и методы исследования, выводы, список литературы и приложения, содержащего 4 акта о внедрении части результатов работы в производство. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 63 рисунка. Список литературы содержит 286 ссылок.

Основное содержание работы

1. ДНК-компонента комплексов. При проведении многофакторных исследований очень важны точно выбранные модельные соединения и биологические системы, позволяющие достоверно регистрировать эффекты и объективно их интерпретировать. Так, фосфодиэфирные олигонуклеотиды быстро расщепляются в биологических жидкостях, и, например, наблюдая за флуоресцентной меткой, нельзя однозначно утверждать, что она еще входит в состав молекул олигомеров и делать выводы об их транслокации. Устойчивые к биодеградации тиофосфорильные олигонуклеотиды, сохраняя гибридизационные свойства своих природных аналогов, могут иметь иную стерическую организацию и иные закономерности и параметры сборки комплексов. Исходя из этих соображений, в работе проводились параллельные исследования модифицированных и немодифицированных олигомеров. Только анализ совокупности экспериментов позволял сделать достаточно корректные и обоснованные выводы. Поэтому в настоящей работе рассмотрены некоторые особенности получения полностью и частично тиофосфорильных олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих флуоресцентные метки.

1.1. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации заданной локализации. Среди модификаций сахаро-фосфатного остова, повышающих устойчивость олигонуклеотидов к биодеградации, наиболее подробно изучены особенности применения и метаболизм тиофосфорильных олигонуклеотидов, показана их перспективность использования в качестве антисмысловых последовательностей. В то же время известно, что тиофосфорильные олигонуклеотиды обладают системной токсичностью. В ряде случаев плодотворным оказалось введение лишь нескольких концевых замен в состав фосфодиэфирного олигомера (Лактионов 1999, Herbert 2002). Использование частично модифицированных олигомеров дает ряд преимуществ в генодиагностике и быстрой амплификации плазмидной ДНК (Di Giusto 2003). Особенно важно изучение влияния тиофосфорильных замен на конформацию олигонуклеотидов-аптамеров, биологическая активность которых зачастую непосредственно обусловлена их

пространственной организацией. Проведение скрининговых и сравнительных исследований требует синтеза широкого набора частично модифицированных олигонуклеотидов, однако технологические приемы их параллельного автоматического синтеза не разработаны. Преимущества предложенных в настоящей работе подходов состоят в простоте совмещения или чередования фосфодиэфирного и тиофосфорильного циклов автоматических синтезаторов при использовании стандартных растворов и реактивов.

Автоматический синтез олигонуклеотидов осуществляли в традиционном реакционном цикле амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов. В -случае тиофосфорильных звеньев стадию окисления проводили до кепирования, чтобы снизить вероятность образования фосфодиэфирных примесей. Для превращения промежуточных фосфоротриэфиров в 0,0,0-триэфиры тиофосфорной кислоты использовали стандартный раствор ЗН-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксида в ацетонитриле.

Одновременная сборка полностью модифицированных олигонуклеотидов или последовательностей, сочетающих один фосфодиэфирный и один 3'- или 5'-концевой тиофосфорильный блоки, не вызывает технических или программных затруднений. Чередование фосфотриэфирных и тиофосфотриэфирных межнуклеотидных связей в заданной последовательности, различной для синтезируемых параллельно олигомеров, требует иной организации реакционных циклов. При введении в состав олигомеров нескольких тиофосфорильных блоков (независимо от протяженности этих участков) рационально использовать чередование двух методов, состоящих из стандартной комбинации подпрограмм для З'-фосфодиэфирных звеньев и отличающиеся порядком стадий кепирования и окисления, а также, соответственно, составом и линией подачи окислителя, - для З'-тиофосфорильных. Введение большего числа модифицированных блоков также возможно в условиях параллельного синтеза, но требует более глубоких изменений протокола синтеза. Для каждого нуклеотидного звена создается по 2 отдельные программы, причем блоки кепирования и окисления прописываются в подпрограмме конденсации. Выходы стандартно деблокированных и очищенных олигомеров не отличались от выходов фосфодиэфирных олигомеров и не зависели от режима их сборки.

Проблема получения высокоочищенных частично тиомодифицированных олигонуклеотидов состоит еще и в том, что не представляется возможным проконтролировать полноту прохождения реакции сульфурирования в ходе синтеза, и очистка целевых соединений от фосфодиэфирных примесей не всегда эффективна.

Надежным методом для подтверждения состава частично модифицированных олигомеров стала МАЬБ1 ТОР МБ (лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия с участием матрицы). Для получения достоверных спектров тиоаналогов ДНК была проведена оптимизация ряда

-----------. параметров масс-спектрометрии

п;

ООО;

«i 20Q*

> 600¡

Л 1

1-

и üooi

0

X 600-;

0

S

о 200.

«1 н 600 ¡

X

ч

ÜlKH

N = 1

; 4741

¡ N = 2 J4759 t

i it . P561011!

JN = 2 1 4762 í

-....... ¿*Vi-------- LII:

N = 4 |4791 i

* P4 ¡

4-400 4500 4600 4700 4500 4900 £>000 M/Z

Рис. 1. Масс-спектры тиофосфорильных аналогов LI, Lll, Р4 и Р561011 олигонуклеотида

ATR15 d(GGTTGGTGTGGTTGG).

Число атомов серы (N) в молекуле рассчитано с точностью до целых по формуле: N= [Мнайд- Мрассч]/16 (1), где Мнайд -молекулярная масса, найденная масс-спектрометрически; Мрасс, - расчетная молекулярная масса соответствующего фосфодиэфирного олигомера, в данном случае масса ATR15 = 4726 Да; 16 - разница в атомных весах серы и кислорода.

(подготовка матрицы, условия нанесения образца и др.). Характерные примеры спектров, полученные в найденных условиях, приведены на рис. 1. Результаты расчетов по формуле (1) с высокой точностью подтверждают состав

синтезированных последовательностей.

На примере синтеза ряда тиоаналогов олигонуклеотидов продемонстрирована эффективность найденных решений, которые делают доступными частично

модифицированные олигонуклеотиды, что позволит

широко применять их как молекулярно-биологические исследовательские инструменты и компоненты диагностикумов, а также для поиска новых эффективных олигонуклеотидных лекарственных средств.

1.2. Конформационные исследования олигонуклеотидов. Биологическая значимость структурного полиморфизма ДНК в последние годы находит все большее подтверждение. Богатая гуаниновыми повторами ДНК, например, способна образовывать стабильные четырехцепочечные структуры, G-квадруплексы, структура которых стабилизируется водородными связями в G-квартетах и стэкинг-контактами между ними. Показано, что подобные структуры существуют m vivo в ядре клетки (Paeschke 2005, Simonsson 2001). Изменение структурной организации ДНК, как например, в промоторе гена С-тус, может привести к развитию канцерогенеза (Siddiqui-Jain 2002). Кроме того, биологическая активность некоторых

олигонуклеотидов непосредственно связана с их конформацией (Smirnov 2000, Lee 2004). Представляется важным изучить влияние комплексообразования на исходную конформацию ДНК и структуру самого комплекса. Для того, чтобы выбрать модельные олигонуклеотиды, необходимо было провести структурные физико-химические исследования. Один из продуктивных подходов к установлению вторичной структуры олигомеров состоит в изучении изменения параметров флуоресценции интеркаляторов (в настоящей работе - этидий бромида, EtBr) в составе комплексов с ДНК (Борисова 1998). Метод поляризованной флуоресценции EtBr был использован для определения молярности структур, образованных из олигонуклеотида d(TTAGGG)4 (названного ТМО), его частичных и полного тиоаналогов (TMOS2, TMOS4 и TMS), фосфодиэфирных олигомеров d(TTAGGG)3, d(GT)12 и d(AC)12. Исследования проводились совместно с ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН. Поляризация флуоресценции молекул EtBr (PEt), адсорбированного на фрагменте ДНК, связана с гидродинамическим объемом макромолекулы (V) и ее временем вращательной релаксации (р) уравнением Перрена-Вебера: р =Зт(1/Р0 -1/3)/(1/Р - 1/Р„) = 3r| V/kT, (2), справедливым для модели эллипсоида с малой асимметрией, где т - длительность флуоресценции EtBr в комплексе с олигонуклеотидом; Р - измеряемая поляризация, Р0 = 0,42 предельная величина степени поляризации флуоресценции EtBr в бесконечно вязкой среде (Т/г| —> 0), г| - вязкость растворителя; Т - абсолютная температура, к - постоянная Больцмана, V - гидродинамический объем макромолекулы. Рассчитанные времена вращательной релаксации олигонуклеотидов находятся в соответствии с их молекулярными массами и количеством нуклеотидов в одной цепи, что свидетельствует о сворачивании этих молекул в мономолекулярные образования (табл. 1).

Конформацию олигонуклеотидов изучали по спектрам кругового дихроизма (КД). На рис. 2 представлены спектры КД олигонуклеотидов, зарегистрированные в широком интервале изменения температуры раствора. При 0 и 15 °С спектры ТМО TMOS2 и TMOS4 (рис. 2а, 2d), содержат положительную полосу с максимумом около 295 нм и отрицательную - около 265 нм, что соответствует спектру антипараллельного G-квадруплекса. Спектр d(TTAGGG)3 при 0 °С содержит две положительные полосы с максимумами около 295 и 265 нм (рис. 2Ь), что свидетельствует о сворачивании олигонуклеотида в шпилечную структуру,

Таблица 1. Времена вращательной релаксации (р) и масса олигонуклеотидов

Олигонуклеотид Р (нсек) М (Да) Олигонуклеотид Р (нсек) М (Да)

ТМО: (мономер -24 н.о) (димер ~ 48 н о) 25+3 7900 TMS (24 и.о.) 24 ±3 7900

d(GT)i2(24 но) 26 ±3 7900

40+5 13000 Декадуплекс (20 и.о.) 21+3 6600

d (TTAGGG)j(18 но) 21± 3 5900

характерную для денатурированной нити тиофосфорильной ДНК, у которой практически отсутствуют стэкинг-контакты между основаниями. Видно (рис. 2с), что повышение температуры раствора слабо влияет на спектр КД TMS и сильно на d(TTAGGG)3 и ТМО.

На рис. За приведены кривые термического

плавления G-квадруплекса, построенные с

использованием изменений в спектре КД, наблюдаемых при повышении

температуры раствора. Изменение амплитуды КД-спектра при длине волны 274 нм отражает плавление квадруплексной структуры, так как в этом диапазоне не происходит заметного

наложения от КД-спектра шпилечных структур,

образующихся при

15°с

Рис. 2. Спектры КД: ТМО (а), d(TTAGGG)3 (b), TMS (с), их изменения при повышении температуры раствора и (d) сравнение спектров КД (15 С ) олигомеров ТМО и его тиоаналогов, содержащих по 2 - TMOS2 - или по 4 - TMOS4 -тиомодификации в петлях квадруплекса.

плавлении квадруплекса, что имеет место в области 295 нм. С использованием кривой

плавления (рис. За, [-О-]) при Х=274 нм были рассчитаны термодинамические

параметры G-квадруплекса, которые свидетельствуют об образовании стабильного

мономолекулярного антипараллельного G-квадруплекса ТМО. На рис. За, (-А-)

приведена кривая плавления шпильки d(TTAGGG)3, построенная с использованием

изменений в спектре КД, наблюдаемых в длине волны Х=295 нм. Для сравнения

приведены кривые термического УФ-плавления олигонуклеотидов, регистрируемые по изменению поглощения при Х=260 нм: ТМО, TMS, d(TTAGGG)3, d(GT)u и d(AC)|2 (рис. ЗЬ). Кривая для ТМО (-•-) также характеризуется высокой температурой

плавления Тш= 56±5 °С. Кривая УФ-плавления d(TTAGGG)3 (рис. ЗЬ -А-) характеризуется более низкой Тш= 36±5°С, чем у G-квадруплекса, что свидетельствует о меньшей стабильности вторичной структуры этого образца. Кривые плавления d(GT),2 , d(AC)12 и TMS (рис. ЗЬ -+- , -Х- , -■-) доказывают отсутствие стабильной вторичной структуры у этих образцов. На основании полученных данных о времени релаксации р, анализа спектров КД и кривых термического плавления исследуемых олигонуклеотидов можно утверждать, что ТМО образует термостабильный антипараллельный внутримолекулярный G-квадруплекс, d(TTAGGG)3 - шпильку, a TMS, d(GT)12 и d(AC)|2 находятся в виде неупорядоченных нитей. Для дальнейших исследований важно отметить, что введение флуоресцентной метки, 5'-(6)FAM, в состав олигонуклеотидов TMS и ТМО не внесло заметных изменений в их термодинамические и структурные параметры.

Охарактеризованные шпилечные, нитевые и квадруплексные олигомеры были использованы как модельные соединения в исследованиях структурной организации нуклеопротеиновых комплексов.

Для выяснения влияния на биологическую активность олигонуклеотидов их связывания с белковыми векторами в работе использовались хорошо изученные антисмысловые олигомеры к генам С-тус, Bcl-ll и др. (Dias 2002, Manoharan 2002, Kurreck 2003, Wang 2004), действие которых вызывает апоптоз опухолевых клеток.

1,10

О 20 40 60 Температура "С

20 40 60 Температура. "Г

Рис. 3. Кривые термического плавления олигонуклеотидов: (а) - построены по изменениям спектров КД: ТМО (-•-), 295 нм, ТМО (-О-), 274 нм; d(TTAGGG)3 (-А-), 295 нм и TMS (-■-) в 279 нм; (Ь) -нормированные кривые УФ-плавления олигонуклеотидов, 260 нм: ТМО (-•-), d(TTAGGG)3 (-А-), TMS (-■-), d(GT)12 (-+-) и d(AC)12 (-Х-).

В качестве плазмидной ДНК для получения нуклеопротеиновых ассоциатов использовались стандартные коммерческие плазмиды (Clontech, США), содержащие под ядерным промотором ген репортерного флуоресцирующего белка (GFP).

Другая область применения синтетических олигомеров - химико-ферментативный синтез генетических конструкций для получения трансгенных организмов, в том числе продуцентов рекомбинантных белков, которые также использовались в настоящей работе для получения нуклеопротеиновых ассоциатов. Основные подходы в этой области хорошо известны и не требуют подробных описаний. Многие из найденных методических разработок и приемов получения олигонуклеотидов вошли в рутинную лабораторную практику. С применением оптимизированных методов синтеза олигомеров получены новые штаммы-продуценты белков, трансгенные вирусы, растения. Разработки в области олигонуклеотидного синтеза уже внедрены в производство медицинских диагностических наборов, используются в производстве и конструировании новых ДНК-синтезаторов (соответствующие акты о внедрении приведены в разделе "Приложение" диссертации).

1.3. Флуоресцентномеченные олигонуклеотиды. Флуоресцентномеченные олигонуклеотиды широко применяются в современных исследованиях. В настоящей работе флуоресцентные производные олигонуклеотидов позволили визуализировать процессы интернализации клетками искусственных нуклеопротеиновых комплексов, их внутриклеточную локализацию и др. Совершенствование надежных методов получения высокоочищенных меченых олигонуклеотидов особенно актуально в связи с созданием комплексных диагностических наборов, позволяющих одновременно анализировать содержание в пробе нескольких ДНК-мишеней (Probert 2004, Ram 2005). Особенности хроматографического поведения модифицированных олигонуклеотидов, затрудняющие их очистку, обусловлены рядом причин, одна из которых связана с их склонностью к внутри- и межмолекулярной агрегации. Соотношение конформационых форм олигомера зависит от температурного режима хроматографии и зачастую различно для разбавленных и концентрированных растворов. Поэтому профили аналитических и препаративных хроматограмм могут содержать разные пики, а условия хроматографии, найденные в аналитическом варианте, оказываются неэффективными для препаративной очистки. При оптимизации ВЭЖХ методов очистки олигонуклеотидов фракции анализировали с помощью MALDI MS, UV-спектрофотометрии, электрофоретического анализа в ПААГ и сравнивали эффективность их работы в соответствующих условиях ПЦР в реальном времени. В большинстве случаев найденные режимы оказались удачными

для обращено-фазовых С1б и С18 колонок. В то же время, для некоторых олигомеров, в особенности тиофосфорильных G-богатых, нам не удалось подобрать приемлемые условия ВЭЖХ-очистки только изменением температуры, состава буферных растворов и градиентов элюции. В этих случаях эффективным оказалось использование колонок с фазой С4.

Другая проблема при получении высокоочищенных флуоресцентномеченных олигонуклеотидов состоит в том, что некоторые метки при деблокировании могут подвергаться структурной деградации. В результате в реакционной смеси синтеза накапливаются олигонуклеотиды, совпадающие по последовательности с целевым зондом, но имеющие иные флуоресцентные свойства, что может искажать результаты исследований. Ранее, например, был показан процесс трансформации метки, созданной на основе флуоресцеинизотиоцианата (Dubey 1998), в составе которой фрагмент тиомочевины частично превращается в остаток мочевины или гуанидина.

В нашей практике нестабильные результаты ПЦР-анализов наиболее часто встречались при применении гексахлорфлуоресцеинсодержащих олигомеров (НЕХ-олигонуклеотидов). При хроматографическом анализе оказалось, что во всех случаях постаммонолизные смеси содержали примесь, которая совпадала по электрофоретической подвижности в ПААГ с целевым соединением, практически не отличалась от него по данным масс-спектрометрии, но имела и иной длинноволновый максимум в УФ-спектре и другие флуоресцентные свойства. ВЭЖХ-профиль постаммонолизной смеси синтеза декамера 5'-НЕХ-Тю, несклонного к самоассоциации, также содержал два мажорных пика, "А"- НЕХ-Тщ и "Б"- НЕХ-Т,0 (рис. 4). Только второе вещество обладало характерными для НЕХ-производных спектральными характеристиками. Соотношение "Б"/"А" зависело от условий аммонолиза, причем повторный аммонолиз очищенного "Б"-НЕХ-Тю приводил к накоплению "A"- HEX-Ti0, содержание которого росло при увеличении длительности и/или температуры обработки. MS-анализ модельного НЕХ-изопропилфосфата (ХИПФ), аммонолиз которого также приводил к накоплению двух продуктов ("А"-ХИПФ - "Б"- ХИПФ), показал, что спектр "Б"- ХИПФ (рис. 5) полностью соответствовал теоретическому мультиплету (IsoPro 3J, а в спектре "А"- ХИПФ наблюдался регулярный сдвиг всех сигналов на -1 Да. Полученные данные, а также ЯМР-спектры (не приведены) модельных соединений, позволяют предположить, что водный аммиак в мягких условиях (при 20-60°С) взаимодействует с флоуроновой группировкой и превращает ее в соответствующий замещенный акридин (рис. 5). Обнаруженный процесс не противоречит химии гетероциклов (Эпьдерфипьд, 1954),

но ранее он был описан для реакции флоуронов с аммиаком при 180" в течение нескольких суток.

3 о. ■s-.хипф

а у* ^ vi

Рис. 5. Масс-спектры и схема превращения НЕХ-изопропилфосфата ("Б"-ХИПФ) в акридиновое производное "А"-ХИПФ (показан более стабильный таутомер).

Рис. 4. ВЭЖХ-профили

постаммонолизных смесей НЕХ-Т10. Указаны температурный режим и продолжительность аммонолиза, УФ-(а) и флуоресцентные спектры эмиссии 480 нм (Ь) олигонуклеотидов "А"-

НЕХ-Тю и "Б"-НЕХ-Т,0.

В результате, показано, что при получении любого НЕХ-содержащего

олигонуклеотида при аммонолизе образуется побочный продукт, производное тетрахлордиоксиакридина, примесь которого для получения достоверных результатов дальнейших исследований необходимо тщательно отделять.

2. Нуклеопротеиновые комплексы для доставки чужеродной ДНК в клетки-мишени. Настойчивый поиск способов доставки в клетки чужеродного генетического материала связан со спецификой его применения в терапевтических целях. Уникальные адресующие свойства показаны для белковых переносчиков ДНК, методы конструирования которых подробно проанализированы в литературном обзоре настоящей диссертации. Интерес к белковым векторам особенно возрос в связи с открытием новых перспективных свойств олигонуклеотидов (антисенсы, аптамеры, ДНК/РНК гибриды, э^Ю^А и др.). Настоящая работа развивает подход к созданию самоорганизующихся белковонуклеиновых молекулярных ансамблей, способных избирательно интернализоваться клетками-мишенями и обеспечивать взаимодействие нуклеиновой компоненты с внутриклеточными мишенями.

Избирательность в отношении целевых клеток таких комплексов обеспечивается взаимодействием белковой компоненты с тканеспецифическими поверхностными рецепторами или рецепторами патогенеза клеток-мишеней, а интернализация -рецептор-опосредованным эндоцитозом. Прежде, чем определить требования к

XalOd

R-U(C'HOH) 2-► R<CHO) 2-

ГЬЛ-ЭФР

II

RHC'N-ЭФР III

белкам-переносчикам ДНК и разработать их структуру, были получены и исследованы различные рецептор-опосредованные доставщики чужеродной ДНК в клетки, отличающиеся как составом доменов, так и способами их соединения.

2.1. Ковалентные нуклеопротеиновые конъюгаты. Один из известных подходов

к избирательной доставке в клетки фрагментов полинуклеотидов состоит в создании их химических конъюгатов с белками-лигандами поверхностных рецепторов целевых клеток (Manoharan. 2002. Rajur 1997). Для конденсации с производными антисмысловых олигонуклеотидов в настоящей работе использовались альфа-фетопротеин человека (АФП) и рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека (ЭФРч), рецепторы которых наиболее характерны для опухолевых клеток (Carpenter 1979, Ogiso 2002, Ницветов 2005). ЭФРч как вектор обладает рядом

известных привлекательных сторон, кроме того, удаленность N-конца молекулы от рецептор-связывающего участка (Hommel 1992) облегчает получение модифицированных производных, потенциально сохраняющих аффинные свойства ЭФРч.

Биотехнологическую наработку препаратов рекомбинантного рЭФРч (по данным ВЭЖХ 9396%) осуществляли, используя полученный нами продуцент - S. cerevisiae ВКМ CR-349D.

По физико-химическим и

иммунологическим характеристикам

полученный препарат рЭФРч соответствует его природному аналогу. Метод конденсации

3 !'

U___

Я =5'-ААТССТСССССАСТТСАССС = б'-ААСОТГСАСХКЮСАТ

Рис. 6. Схема синтеза и ВЭЖХ-анализ реакции получения конъюгата ЭФРч с

олигонуклеотидом Я(СНО)2, Я = 5'-ААТССТСССССАОТТСАССС -Диасорб С16Т, 4x250 мм, УФ-детектор (—), >.=260 нм, флуоресцентный детектор (—), Ха[=220 нм, Аст=380 нм.

предусматривал синтез антисмысловых олигонуклеотидов, снабженных З'-концевым

/ Л У БЮТ '

АФП }—ик, _

^АФП^-: IV

АФП )—N

VI

та ЕМСБ

Олигонукпеотнд УШ

Олигонукпеотнд

¿1

,он о

АФП Нк

VI

Днтаотреигол

Т?

(афп

Олигонукяеотвд н I

X

XI Конъюгат

? Олнгонуклеотад

Рис. 7. Схема синтеза конъюгатов АФП с аминоалкильными производными олигонуклеотидов.

З'-концевым уридиновым звеном (I на рис. 6), i/ис-диольная группировка которого направленно расщеплялась периодатом натрия. Небольшой избыток (10%) обессоленных диальдегид-производных (II) взаимодействовал без дополнительного катализа и конденсирующих реагентов с ЭФРч с образованием конъюгатов III. Ход реакции контролировали методом ВЭЖХ (рис. 6), выходы конъюгатов составляли 7891% на исходный белок. Состав конъюгатов (белок-олигонуклеотид, 1:1) определяли по соотношению поглощений при 260 и 280 им, данным MALDI TOF масс-спектрометрии и анализу состава кислотных гидролизатов полученных соединений. Можно предположить, что конденсация проходила преимущественно по N-концевой аминогруппе белка за счет образования амидиновой группировки, что не должно было нарушить рецептор-связывающие свойств ЭФРч в составе конъюгата. Важно отметить, что ЭФРч (Serva), рекомбинантный рЭФРч и конъюгаты ЭФРч-олигомер вызывали одинаковую индукцию стимуляции пролиферации клеток (данные по включению [3Н]-тимидина в ДНК синхронизированных мышиных фибробластов линии ЗТЗ). В экспериментах с целевыми клетками линии КВ и рецептородефицитными контрольными - линии К562 (совместно с НИБОХ СО РАН) было показано, что конъюгаты ЭФРч-антисмысловой олигомер в 5-20 раз снижали относительное содержание мРНК-мишени, причем только в целевых клетках.

АФП (IV), выделенный по известному методу (Wagner 1970) из ретроплацентарной сыворотки рожениц, после модификации (соединения VI и X) конденсировали с активированными производными олигонуклеотвдов IX в соответствии со схемой, приведенной на рис. 7. Содержание олигонуклеотида в конъюгатах XI определяли по соотношению сигналов в УФ-спектре при 260 и 280 нм.

2.2. Получение белковых векторов химической конденсацией доменов.

Полилизиновый конъюгат природного АФП, который был синтезирован в настоящей работе, по принципам конструирования аналогичен искусственным полипептидам ЭФРч-полилизин, трансферин-полилизин, асиалогликопротеин-полилизин и др. Представлялось интересным непосредственно, в условиях параллельных экспериментов, сравнить два типа доставки антисенс-олигомеров с помощью одного и того же адресующего домена (АФП): в виде комплексов [АФП-полилизин - олигонуклеотид] и ковалентных конъюгатов АФП-олигонуклеотид.

С полилизином (М.в. 29,3 КДа) АФП сшивали с помощью бифункционального реагента SPDP (V). Конъюгат АФП-полилизин выделяли на колонке Superdex 200 HR ионообменной хроматографией. При электрофорезе в восстанавливающих условиях фракций, содержащих конъюгат, появлялась полоса, соответствующая по

молекулярному весу АФП.

Исследование накопления клетками конъюгата и комплекса АФП с флуоресцентно-меченными олигонуклеотидами проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Показано, что как комплекс, так и конъюгат активно захватываются опухолевыми клетками SKOV3 и MCF-7, причем интенсивность эндоцитоза конъюгата значительно (в 5-6 раз) выше, чем комплекса. Вероятно, химическое присоединение молекул полилизина к АФП может влиять на доступность рецептор-связывающего участка АФП.

Флуоресцентная микроскопия клеток MCF-7, инкубированных в присутствии и конъюгата АФП-олигомер-FAM (FAM -флуоресцентная метка), и комплекса АФП-полилизин-олигомер-FAM показала, что уже через 1 час флуоресценция наблюдалась в перинуклеарной зоне клетки, в областях эндоплапзматического ретикулума и комплекса Гольджи (рис. 8).

2.3. Рекомбинантные белковые векторы-переносчики полинуклеотидов.

Наиболее перспективный, гибкий и доступный способ получения новых белков сегодня - это химико-ферментативный синтез гена, получение штамма-продуцента и биотехнологическая наработка рекомбинантного полипептида.

Среди рецептор-опосредованных белковых доставщиков в клетки различных веществ, в том числе чужеродной ДНК и цитостатиков, заметное место занимают рекомбинантные мультидоменные белки, созданные на основе токсинов (Liao 1995, Uherek 1998, Spano 2008, Rhie 2008, Epaulard 2008 и др.).

Оригинальность белковой конструкции, полученной в настоящей работе (совместно с ГНЦ Прикладной микробиологии), состоит в том, что в качестве связывающего домена белок содержит остаток стрептавидина, который обеспечивает его избирательное взаимодействие с биотинилированными молекулами, в том числе ДНК. Гибридный полипептид дифтерийный токсин-стрептавидин (72366 Да) состоит из 511 аминокислотных остатков дифтерийного токсина и зрелой формы стрептавидина. Его ген содержит 2016 п.н., которые кодируют 672 аминокислотных остатка: 511 N-концевых аминокислот дифтерийного токсина, один остаток, образовавшийся в результате слияния генов (глицин), метионин, введенный в ген

Рис. 8. Распределение

флуоресценции в клетках МСР-7 после 24 часа инкубации с ковалентным конъюгатом 5'-РАМ-ААСОГГОАООООСАТ-АФП. А)-флуоресцентная микроскопия, Б) -те же клетки в фазовом контрасте.

стрептавидина в результате ПЦР, и 159 С-концевых остатков зрелого стрептавидина. Индукция промотора фага Т7 в клетках полученного штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)p LysS приводила к синтезу гибридного белка размером около 72 кДа, что соответствует значению вычисленной молекулярной массы слитого белка (72366 Да). Гибридный белок обладает ферментативной активностью дифтерийного токсина и сохраняет способность стрептавидина связывать биотин, подобно стрептавидину в составе других гибридных белков (Karp 1996). Иммуноблот слитого белка, перенесенного на нитроцеллюлозный фильтр из ПААГ, обладал биотин-связывающей активностью и антигенными свойствами дифтерийного токсина. Далее планировалось заменять каталитическую субьединицу токсина остатками адресующих белков-лигандов и получил, рекомбинантные векторы, способные переносить в целевые клетки биотиншшрованные молекулы.

Однако анализ экспериментальных и литературных данных показал, что, несмотря на убедительные результаты по селективной доставке чужеродного генетического материала с помощью различных белковых векторов и адресованных конъюгатов ДНК in vitro, их клиническое использование сталкивается с рядом проблем. Низкая растворимость и неприемлемые геометрические размеры ДНК-векторных ассоциатов, а также общая цитотоксичность поликатионов остаются основными причинами, тормозящими практическое применение полиплексных векторов. Кроме того, химическое соединение доменов может приводить к искажению аффинных свойств адресующего лиганда, как, например, описано выше для вектора АФП-полилизин.

Использование рекомбинантных мультидоменных конструкций решает проблему наработки гомогенных по составу препаратов белка, но их использование ограничено иммуногенностью чужеродных белков и их ассоциатов. Последнее замечание стало решающим аргументом для отказа от продолжения работ по созданию аналогичных конструкций на основе полученного белка дифтерийный токсин-стрептавидин.

Из анализа приведенных данных можно предположить, что определяющими для реализации функциональных задач являются свойства ассоциатов, а не их компонентов. Следовательно, при разработке структуры транспортных белков необходимо, в первую очередь, прогнозировать свойства их нуклеотидных комплексов и взаимодействия этих ансамблей с биополимерами, которые также ассоциированы с внутриклеточными молекулярными структурами. В основе настоящего подхода лежит представление о том, что транспортный белок должен самопроизвольно ассоциироваться с генетическим материалом с образованием стабильного в физиологических условиях, низкоиммуногенного комплекса,

избирательного в отношении клеток-мишеней. При разработке структуры векторов были соблюдены следующие важные требования. 1). Максимально упростить конструкцию белка за счет многофункциональности его двух доменов. 2). Использовать минимальные по размерам и максимально охарактеризованные участки доменов. 3). Внести минимальные изменения в природные последовательности. 4). Предусмотреть возможность внутриклеточного расщепления комплекса с образованием нетоксичных метаболитов. 5). Обеспечить универсальность белка по отношению к природе и длине генетического материала. 6). Предусмотреть как технологическую доступность получения, так и удобство использования белка-вектора.

2.3.1. Белковый вектор PGEk. При конструировании на основании изложенных принципов рекомбинантных белков-векторов для доставки олигонуклеотидов в активно пролиферирующие клетки в качестве рецептор-связывающего домена был выбран ЭФРч. ДНК-связывающий домен представлен последовательностью, содержащей классический мотив того сигнала ядерной локализации (NLS), который способен сохранять кариофильность в составе комплексов с ДНК (Collas 1997, Uherek 2000). Эксперименты с ковалентными конъюгатами ЭФРч показали, что N-концевая модификация этого белка не препятствует лиганд-рецепторным взаимодействиям (см. выше), что послужило основанием для выбора структуры вектора, названного PGEk. PGEk состоит из 64 аминокислотных остатков, 11 из которых соответствует мотиву NLS (подчеркнут), слитых с последовательностью ЭФРч: KKKKRKVEDPYNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQY

RDLKWWELR.

Для получения белка PGEk был создан экспрессионный вектор, несущий ген слитого белка модифицированный тиоредоксин (Тгх) - ЭФРч. Введение с помощью метода ПЦР точечных мутаций в ген тиоредоксина (Glu30His и Gln62His) позволило

выделять слитый белок металлохелат аффинной хроматографией, а введение

Тгх-Lint PGEk

PGEkc - v

Рис. 10. Анализ стадий получения белков ЭФРч и РОЕк (трицин-ПААГ,15%). 1 - очищенный РйЕк; 2, 5 белки после гидролиза ЕКЬ - гибрид тиоредоксин-Ьтк-РОЕк (2) и тиоредоксин-Ыпк-ЭФРч (5); 3. - тиоредоксин-1лпк-РОЕк; 4 -очищенный ЭФРч.

С-линкера (Link = (Asp)4-Lys) - гидролизовать полипептид энтерокиназой.

Экспрессионный вектор Trx-Link-PGEk получали введением в состав плазмиды фрагмента, кодирующего участок связывания генетического материала (NLS- мотив), используя синтетические олигонуклеотиды. Продуцент слитого белка Trx-Link-PGEk (В-8389 ВКПМ) получали трансформацией этой плазмидой клеток штамма Е. coli BL21(DE3)pLysS.

Слитые белки выделяли из дезинтегрированных клеток штамма-продуцента хроматографией, затем обессоленный полипептид обрабатывали энтерокиназой EKmax ("Invitrogen"). PGEk из гидролизата очищали ситовой и ионообменной хроматографией. Электрофоретический контроль стадий получения PGEk и ЭФРч приведены на рис. 10. Чистота препаратов PGEk (7622 Да) по данным обращено-фазовой ВЭЖХ составляла не менее 97%. Аналогично был получен белок PGEkR, укороченный на 5 С-концевых аминокислотных остатков гомолог PGEk.

PGEk-опосредоеанная доставка чужеродной ДНК в целевые клетки. Для того чтобы изучить транспортные свойства белков PGEk и PGEkR, в первую очередь были проведены их испытания in vitro. Цитологические работы (совместно с НИБОХ СО РАН и Московским НИИ медицинской экологии) проводились на линиях клеток, для которых показана суперэкспрессия ЭФРч-рецепторов: HeLa, MCF-7, А431, KB, В-клеточная лимфома Naraalva и SCOV3. В качестве отрицательного контроля

использовали дефицитные по EGF-рецепторам клетки линии К562. Как положительный контроль рассматривали

результаты доставки тех же генетических конструкций в клетки липофекцией. Уже первые исследования транспортных свойств белка PGEk

свидетельствовали о его эффективности. Как видно по данным в табл. 2, присутствие белка в 3-5 раз увеличивало интенсивность флуоресценции

Таблица 2. Влияние вектора PGEk на доставку тиофосфорильного 5' -FAM-олигону клеотида F2009 в клетки линии А431 и К562.

Линия клеток О X V s я Ю О ч Соотношен. M\M Ср интенс. флуоресц., У Е Флуоресц. клеток, % Относит, флуоресц к F2009

0 3,83 0,60

F2009 17,2 97,10

А431 PGEkF2009 3:1 47,1 99,80 3,2

PGEk F2009 5:1 64,4 99,90 4,5

PGEk.F2009 10:1 73,6 100,00 5,2

0 5,07 0,25

К562 F2009 54,4 96,80

PGEk:F2009 ¡0 1 47,9 95,70 0,87

целевых клеток А431 в сравнении с клетками, инкубированными только с FAM-олигомером. Для контрольных клеток присутствие PGEk приводило к относительному снижению этого

показателя на 10-20%. Таким образом, использование PGEk для доставки олигонуклеотидов уменьшало вероятность их попадания в нецелевые клетки. Присутствие PGEk не только способствовало избирательному поглощению олигонуклеотидов, но и усиливало их исходные противоопухолевые свойства. Так, в отношении клеток линии В показатель выживаемости - 1С50 - при действии тиофосфорильных антисмысловых олигомеров ASI (к гену С-тус) и 2009 (к гену Ьс12) составлял ~ 2000 нМ, а в комплексе с белком - 630 нМ (однократное добавление) и 90 нМ (двукратное добавление) соответственно.

Сравнение митогенной активности PGEk и его смесей с олигонуклеотидами ТМО, TMS и плазмидной ДНК (pEGFP N1) с активностью ЭФРч не выявило разницы между белками. Активность PGEk в составе ассоциатов с олигонуклеотидами, видимо, зависела от содержания PGEk в комплексе и пропорционально снижалась в интервале величины молярных избытков белка 1-5 для ТМО, 1-3 для TMS и 1-25 для плазмиды. Полученные зависимости подтверждают специфичность связывания комплексов с рецептором ЭФРч и позволяют предположить, что из всего комплекса с рецептором связывается только один остаток ЭФРч.

Результаты исследования

уровня эндоцитоза целевыми клетками после 1 часа инкубации со свободными FTMO и FTMS и с их смесями с PGEk (рис. 11) свидетельствуют о том, что присутствие даже 1 молекулы белка значительно (в 3-10 раз) повышало флуоресценцию клеток. Увеличение избытка белка не приводило к росту эффективности транспорта олигомеров.

Через 24 часа картина для FTMS не изменилась (рис.12Ж-12К), а в случае ТМО флуоресценция сохранялась только в клетках, обработанных олигомером с 4-5 кратным избытком PGEk (рис. 12Г,

Ш ТМО. TMS

га 1/1

От 2/1 Шзп Ш4П

■М

Sis

_

PGEk/TMO PGEk/TMS

Рис. 11. Накопление РТМО, РТМ5 и их комплексов с РйЕк клетками вКОУЗ за 1 ч инкубации при 37°С. Данные проточной цитометрии.

12Д), т.е. накопление клетками SKOV3 флуоресцентномеченных олигонуклеотидов после более продолжительной, 24-часовой инкубации, уже существенно зависело и от содержания PGEk в комплексах и от природы олигонуклеотида. Видимо, образование

комплекса с 4-5 молекулами белка защитило фосфодиэфирный ТМО от деградации. На микрофотографиях видно, что доставка в составе комплексов с PGEk не препятствовала внутриклеточному трафику

олигонуклеотидов в ядро (рис. 13).

Известно, что ТМО и TMS ингибируют активность теломеразы (Sun 1997, Wang 2004). TMS в микромолярных концентрациях обладает неизбирательной цитотоксичностью, а для ТМО цитотоксическая активность не обнаружена. В настоящей работе показано, что инкубация клеток линии HeLa (2x104 рецепторов/клетку, Berkers 1991) с комплексом PGEk/TMS в течение 5 суток приводила к их гибели в 10 раз эффективнее, чем от свободного TMS. Для клеток линии MCF-7 (3x103 рецепторов/клетку Kroning 1995) значение IC50 для комплекса PGEk/TMS было в 2 раза выше (около 500 нМ). Примечательно, что практически таким же антипролиферативным действием обладал комплекс PGEk/TMO (5:1). Этот факт впервые создает реальную перспективу эффективного генотерапевтического применения

нетоксичных фосфодиэфирных фрагментов ДНК.

Влияние вектора PGEk на доставку плазмиды в опухолевые клетки.

Эффективность доставки плазмиды липофекцией, судя по экспрессии репортерного белка GFP, оказалась одинаковой для клеток всех рассмотренных

Рис. 12. Флуоресценция ЕТМО и РТМБ в клетках ЭКОУЗ после 24 ч инкубации со свободными олигонуклеотидами и в составе комплексов с РйЕк. А-Д -БТМО, Е-К - ПМХ. А, Е - ЕТМО и ЕТМ8, Б, Ж - соотношение РОЕк/олигонуклеотид 1/1; В, 3 - 2/1, Г, И-4/1, Д, К-5/1.

Рис. 13. Распределение

флуоресценции в клетках SKOV3, 24 ч инкубации с комплексом PGEk/FTMS. слева -зеленая FTMS, справа - голубая флуоресценция Hoechst 33342 (ядра клеток).

культур (табл. 3).

Присутствие РвЕк приводило к флуоресценции только целевых клеток (НеЬа и А431, см. табл. 3 и рис. 14), причем в узком интервале соотношений. Характерно, что максимум эффективности, хотя и различался по амплитуде, но совпадал по молярным

избыткам белка (РвЕк/ДИК,

Контроль: клетки А431 + плазмида рЕОЕР-Ш

Клетки А431+плазмида рЕОРР-Ш: РвЕк, 1:25

-25/1), что соответствует и

составу комплекса с

минимальной удельной

митогенной активностью.

Дальнейшее увеличение

избытка белка подавляло

,, эндоцитоз комплекса, вероятно, Рис. 14. Влияние вектора РОЕк на доставку

репортерной плазмиды рЕОРР-Ш в опухолевые вследствие конкурентного

клетки линии А431. связывания свободных молекул

РвЕк с рецепторами ЭФРч.

Таблица 3. Влияние РвЕк на доставку репортерной плазмиды в опухолевые клетки.

Добавлено Соотношение Флуоресцирующих, клеток, %

(ДНК = плазмида Культура клеток

рЕОРРШ) М/М НеЬа А431 К562

ДНК/липофектин 85-90 85-95 85-90

ДНК 0 0 0

ДНК:РОЕк 1:1 0 0 0

ДНЮРвЕк 1:8 20-30 25-35 0

ДНК:РОЕк 1:16 20-30 40-45 0

ДНК.РСЕк 1:25 40-46 50-56 0

ДНК:РОЕк 1:32 20-30 40-45 0

ДНК:РОЕк 1:64-5000 0 0 0

2.3.2. Сборка и структурная организация комплексов РОЕк -ДНК.

Для изучения структурной организации РвЕк-ДИК комплексов использовались флуоресцентные методы в сочетании с методами кругового дихроизма и УФ-плавления, позволяющие получать данные в условиях максимально приближенных к физиологическим (совместно с ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН). Влияние различных конформаций олигонуклеотидов на ассоциацию с молекулами РвЕк и состав комплексов исследовалось с применением охарактеризованных выше модельных олигомеров. Подвижность молекул РйЕк в комплексе с ДНК оценивали по

изменению времени вращательной релаксации (р) свободных молекул ДНК и РвЕк-ДНК комплексов.

Сравнение экспериментальной (1 на рис.15) и теоретической (2 на рис. 15) зависимостей позволяет сделать вывод о том, что жестко с белком связаны ~ 10-13

аминокислот РйЕк (-соответствующие

1

У

/

И I ^ Л

т.

ЫЬЗ-домену), а ЭФРч домен способен вращаться относительно молекулы ДНК. Полученные данные о динамике РйЕк в составе комплекса с ДНК важны для понимания механизмов переноса комплексов через мембрану клетки и взаимодействия ассоциатов РвЕк с ЭФРч-рецепторами.

Изучение комплексов РСЕк-ДНК с

Рис. 15. Относительное увеличение помощью собственной УФ-

времени релаксации РОЕк-ДНК флуоресценции белка, обусловленного комплекса в зависимости от количества

• с? /с

адсорбированных на ДНК молекул белка (г). 1 рассчитана теоретически

остатками триптофана (/чх=284 нм, =341 нм), позволило выявить разницу в

для жестко связанного белка на ДНК , 2 зависимостях изменений интенсивности - экспериментальные данные.

(Г) и поляризации (Р) УФ-флуоресценции РвЕк при титровании белком олигомеров, имеющих форму нити, шпильки или квадруплекса и построить соответствующие изотермы адсорбции (рис. 16).

Как видно на рис. 16, адсорбция молекул РйЕк на всех олигонуклеотидах в интервале 2 < г < 3 хорошо описывается с помощью некооперативного механизма

С (Г N -С \

связывания, для которого справедливо уравнение: 1 2 >, где

КШ1 - константа ассоциации, С2 и С; - концентрация связанных и свободных молекул РвЕк. Ст.< - молярная концентрация олигонуклеотида, выраженная в цепях, N - максимальное число мест связывания молекул белка на олигонуклеотиде. При кооперативном механизме связывания молекул РвЕк использовали уравнение Хилла: С3

=

СГ (С.

та N С2) ^ гд£ ы _ коэффициент кооперативности Хилла. Пересечение начального наклона кривой с осью абсцисс (рис. 16) позволяет определить количество сильных мест связывания (Л^ = 3). Численное значение тангенса угла наклона кривой равно константе ассоциации (К|). Константы связывания сильного типа комплекса К|

для всех олигонуклеотидов оказались близкими = 107 М"1. Константа связывания PGEk на G-квадруплексе, К:= (2.0±0.4)107 М"1, оказалась самой высокой по сравнению с другими олигонуклеотидами (табл. 4) с коэффициентом кооперативности Хилла ш = 4. Последующая сорбция молекул PGEk на ТМО и TMS происходит по кооперативному механизму с более низкими величинами констант ассоциации.

Рис. 16. Изотермы адсорбции молекул PGEk на олигонуклеотидах. (а) - ТМО (-•-) и TMS (-■-); (b) - d(TTAGGG)3 (-А-); (с) - d(GT)12 (-+-) и d(AC),2 (-Х-). , г - количество связанных молекул белка, приходящихся на олигонуклеотид; Cj - концентрация свободного белка в растворе, выраженная в мкМ. Измерения сделаны в PBS-буфере при 30 °С.

Таблица 4. Параметры связывания PGEk на олигонуклеотидах в PBS-буфере при 3 и 37 °С.

Г -AG, ^•ass? Г

Олигонуклеотиды 106 М'1 кДж моль" 106МЛ

з'с з'с 37 °С 37 "С

G-квадруплекс, ТМО 20 + 4 <3 39 ±7 70 ± 10 <3

3.0 ±0.2 3 > г < 6 34 ±2 4.0 ± 1.5 3 > г < 6

Шпилька, 18 ± 5 <3 38 ±8

d(TTAGGG)3 1.9 ±0.3 3 > г < 5 33 ±5

Нить, 17 ± 4 <3 38 + 8 30 ±5 <2

TMS 1.5 ± 0.4 3 > г < 6 32 + 8 0.8 ±0.2 2 > г

Нить, 8.0 ±3 <3 36+12

d(GT)u 1.7 ±0.3 3 > г < 5 33 + 5

Нить, 10 ± 3 <3 37 ±11

d(AC),2 1.7 ± 0.3 3 > г < 5 33 + 5

:ы> :*о 2¡u> зоа ло ->:o

Дакка uo.iHbi, нм

Рис. 17. Спектры КД: комплексов PGEk: ТМО. Соотношение PGEk/ДНК увеличивали: 1- 0; 2 -1,7; 3 - 2,6; 4 - 3,4; 5 - 5,1(а); для комплексов PGEk: TMS. РОЕк/ДНК= О(-), 2,3(--)(Ь).

Наблюдаемое сильное кооперативное связывание молекул PGEk на G-квадруплексе и его отсутствие на других олигонуклеотидах

объясняется существенным

различием в конформациях исследуемых образцов. На основании анализа спектров КД (рис. 17) было установлено, что в составе ассоциатов с PGEk молекулы ТМО свернуты в антипараллельный G-квадруплекс. Молекулы TMS, d(GT)]2 и d(AC)i2 не имеют выраженной вторичной структуры и находятся в виде неупорядоченных нитей. Молекулы d(TTAGGG)3 сохраняют конформацию шпильки (не приведены). В то же время по

мере добавления белка наблюдается падение амплитуды спектра около 290295 нм и смещение максимума к 300 нм. КД спектры белка в этой области не вносят изменения в интенсивность сигналов.

Линейная зависимость падения амплитуды около 290 нм от количества связанных молекул PGEk (PGEkR) г (рис. 18) позволяет предположить, что адсорбция каждой молекулы вызывает некоторое изменение его конформации, частичное раскручивание

четырехцепочечной спирали. Однако, даже при максимальном насыщении комплекса PGEk /ТМО, 5/1 сохраняется

Рис. 18. Изменение амплитуды спектра КД (290 нм) для молекул ТМО при увеличении числа адсорбированных молекул РйЕк (РОЕкЛ), приходящихся на олигонуклеотид (г).

исходная конформация олигомера.

Суммируя экспериментальные данные, можно достаточно аргументировано описать процессы формирования и структурно-функцональные свойства нуклеопротеиновых супрамолекулярных ансамблей ДНК с рассматриваемыми белками. Так, самопроизвольная ассоциация белков РвЕк или РвЕкЯ с олигонуклеотидами различного состава и длины, а также с их тиофосфорильными аналогами в физиологических условиях происходит быстро (даже при 3 °С ~ за 2 мин), не требуя никаких дополнительных манипуляций.

Достаточно присоединения 1 молекулы белка, чтобы обеспечить избирательную интернализацию олигонуклеотидов клетками-мишенями (см. табл. 2, рис. 11, 12).

При увеличении избытка белка происходит достройка ассоциатов до насыщения (средняя константа диссоциации Кд = 10"7 М), причем их состав определяется не только длиной (1 белок /~ 6-7 звеньев денатурированной олигонуклеотидной цепи), но в большой степени и конформацией ДНК. Так, 24-мер в виде нити способен связать 3 молекулы, а 24-мерный в-квадруплекс - 5-6 молекул белка (см. рис. 16а).

Из результатов исследований, проведенных на примерах олигонуклеотидов в виде денатурированной нити, шпильки и квадруплекса следует, что основные параметры исходной стерической организации олигонуклеотида сохраняются и в составе ассоциатов (рис. 17).

Механизм образования комплексов для олигомеров в виде нити и дуплекса носит некооперативный характер, в случае квадруплекса ТМО первые 2-3 молекулы белка также связываются некооперативно, а следующие 2-3 молекулы присоединяются по кооперативному механизму, слегка раскручивая жесткую исходную структуру олигонуклеотид (табл. 4, рис. 18).

Интернализация транспортных комплексов происходит по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза, что и обеспечивает избирательность доставки ДНК в клетки-мишени (табл. 2, 3).

В составе ассоциатов наблюдается гибкое связывание ЭФРч-домена, что позволяет его А-петле, несущей рецептор-связывающий фрагмент, легко подстраиваться под структуру ЭФРч-рецепторов (рис. 15).

Все рассмотренные нуклеопротеиновые комплексы являются одним модифицированным ЭФРч-лигандом (данные о пропорциональном снижении пролиферативной активности комплексов см. на стр 21). Другими словами, во взаимодействии с целевым ЭФРч-рецептором участвует только один остаток ЭФРч из всего ассоциата, вне зависимости от его состава. Этот факт, а также некооперативное присоединение первых молекул белка к ДНК (табл. 4), создает основу для

28

конструирования адресованных комплексов ДНК, содержащих наряду с молекулами векторов дополнительные молекулы, придающие супрамолекулярным ассоциатам новые свойства.

Присутствие белков-векторов снижает вероятность попадания чужеродной ДНК в нецелевые клетки (табл. 2).

Комплексообразование с белками РвЕк или РОЕкК усиливает или даже генерирует биологическое действие ДНК-компоненты, причем только в отношении целевых клеток (см. стр. 22-23).

Полученные данные позволяют предположить, что ассоциаты ДНК с РйЕк или РйЕкЯ способны к МЬ8-опосредованной ядерной транслокации (рис. 13).

Если рассматривать ассоциаты ДНК-РОЕк как Х-ЭФРч лиганды, сохраняющие связь с рецептором в эндосоме, то можно предположить, что ДНК способна оказаться в ядре либо при растворении ядерной оболочки во время митоза, либо в результате развития одного из трех не исключающих друг друга процессов.

1). Высвободиться в цитозоле и пассивно диффундировать в ядро, минуя ядерный поровый комплекс. Это вполне возможно для тиофосфорильных олигонуклеотидов, но противоречит данным об активности биодеградируемых фосфодиэфиров.

2). Попасть в ядро в составе комплекса [ДНК-белок-рецептор]. Этот вариант кажется маловероятным, поскольку противоречит данным об успешной доставке антисмысловых олигомеров к внеядерным РНК-мишеням.

3). Более вероятным представляется высвобождение в цитоплазме не ДНК, а ее комплекса с РвЕк. Это объясняет и защиту от нуклеаз, поскольку все фосфаты остаются экранированными, и активный МЬЗ-обусловленный транспорт в ядро, и возможность перехвата ДНК-составляющей комплекса аффинной молекулярной мишенью еще в эндоплазматическом ретикулуме.

Полученные белки РОЕк или РвЕкВ. перспективны для создания высокоэффективных адресованных генотерапетичских средств и их применения, поскольку каждый из них характеризуется следующими необходимыми свойствами.

> Универсальность по отношению к длине, составу и конформации ДНК.

> Избирательность и эффективность доставки генетического материала.

> Увеличение активности олигонуклеотидов и ДНК.

У Защита ДНК от деградации.

> Технологическая доступность и удобство в использовании.

Найденные в результате реализации нового подхода к конструированию белков-переносчиков ДНК в целевые клетки закономерности имеют системный характер и необходимы для понимания молекулярных механизмов действия природных и искусственных нуклеопротеиновых комплексов и конструирования новых переносчиков ДНК.

3. Искусственные ДНК-ассоциаты с живыми клетками. Интересная и перспективная задача по разработке направленных методов создания ассоциатов, содержащих живые клетки, может быть решена на основе использования свойств полинуклеотидов, предварительно зафиксированных на внешней мембране клеток. Ключевую роль при создании таких модифицированных ДНК-меченых клеток играет способ фиксации ДНК. В настоящей работе предложен новый метода иммобилизации олигонуклеотидов на внешней мембране живой клетки за счет гидрофобных взаимодействий их амфифильных конъюгатов, способных самопроизвольно ассоциироваться с липидным бислоем плазматической мембраны.

Основные отличия и преимущества настоящего метода от описанного ранее способа ковалентной конденсации модифицированных остатков полисахаридов клетки с активированными производными фосфитов олигомеров (Chandra 2006) состоят в том, что эффективная иммобилизация практически не требует ни временных затрат, ни специальных абиогенных обработок клеток.

Выбор структуры конъюгатов основывался на анализе опыта получения подобных производных для генотерапевтических целей и встраивания их в липосомы и обусловлен следующими основными факторами: необходимость обеспечить минимальное влияние на жизнедеятельность клетки и чужеродной ДНК, и гидрофобной части конъюгата; растворимость модифицированных олигонуклеотидов

Рис. 19. Схема получения ациламиноалкильных производных олигонуклеотидов. в культуратьной среде; доступность зафиксированной ДНК к гибридизации. Отметим,

О

Z-олигонуклеотид -CHrCH(CH2OH)-(CH2)4-NH2-3' + YOI;

+ Z- олигонуклеотид -CH2-CH(CH2OH)-(CH2)4-NHY

Z = н

= флуоресцентная метка

Y = стеароил =пальмитоил

что быстрая биодеградация олигонуклеотидов, препятствующая их терапевтическому применению, в случае ДНК-маркирования не столь критична. Достаточное для манипуляций время жизни комплекса "клетка-олигонуклеотид" может составлять десятки минут, во всяком случае, быть менее или соизмеримо со временем цикла клеточного деления. В результате была выбрана простая структура жирнокислотных производных фосфодиэфирных олигонуклеотидов, которые синтезировали конденсацией аминоалкилолигомеров (в том числе флуоресцентномеченных) с активированными производными стеариновой или пальмитиновой кислот (рис. 19).

Флуоресцентная микроскопия показала, что полученные FAM-меченые жирнокислотные производные

FTlRNSt* FT18N

олигонуклеотидов с примерно одинаковой эффективностью

фиксируются на клетках (рис. 20 А). Олигонуклеотиды без жирнокислотных остатков

фиксируются на незначительном количестве клеток (рис. 20В), причем - мертвых, как было подтверждено экспериментами с окрашиванием клеток пропидий иодидом (рис. 20G и 20Н). Одновременное окрашивание клеток действием клеточного маркера CellTrace Far Red DDAO-SE (CTFR), ковалентно метящим клеточные белки, показало, что флуоресцирующие объекты - не агрегаты, которые могут быть образованы дифильными

молекулами олигонуклеотидов, а именно клетки, и что эти молекулы располагаются в клеточной мембране (рис. 20С, 20D). Последний факт подтверждается и распределением FAM-флуоресценции меченых олигонуклеотидов и CTFR по профилям живой и мертвой клеток (рис. 20Е и 20F соответственно).

Рис. 20. Флуоресцентная микроскопия клеток Jurkat, меченных

олигонуклеотидами FT18NSte и FT18N.

Проточная цитометрия показала, что флуоресценция клеток линейно зависела от концентрации жирнокислотных производных меченых олигонуклеотидов в интервале 0.05-0,2 мкМ.

Олигонуклеотидный дуплекс, состоящий из жирнокислотного конъюгата и комплементарного ему меченного олигонукпеотида, также эффективно фиксируется на поверхности клеток.

После закрепления на клетках жирнокислотных производных олигонуклеотидов они

остаются доступными для образования дуплексов.

Например, как показано на рис. 21 А, вся клеточная популяция, предварительно инкубированная с T18NSte, приобрела сильный

флуоресцентный сигнал после обработки ее FAM-олигонуклеотидом FA25, комплементарным к T18NSte. При этом интенсивность сигнала в гораздо большей степени зависела от концентрации предварительно связанного T18NSte, чем от концентрации FA25 (рис. 21В).

Флуоресцентная микроскопия подтвердила, что только предварительно обработанные T18NSte клетки флуоресцируют после добавления FA25 (рис. 21С - 21Е). Сходные результаты были получены и для олигонуклеотидов T18NPal и T25NSte.

При инкубировании тех же клеток с некомплементарными к T18NSte FAM-олигомерами флуоресценция не наблюдалась. Олигонуклеотиды, содержащие

жирнокислотные остатки, одинаково хорошо фиксировались на внешней мембране

1 s А '«"И TSte: 0, 0.4, 1.6 шМ Л Ч >0 ■ . А >■ 11 ) ! u W • /|| !•• I 1 Ii » I n \ £ / h \ 6 J -X ........ s в Г..... / / / /

0.4 1.2 2.0 TlïSte (цМ)

Интенс. флуо{УВсц., у.е.

ISiilSifiil ' * Шж^ЩШЩк'й! гШ

T18Ste: 1.6 мкМ T18Ste: 0 мкМ T18Ste: 0 мкМ

Рис. 21. Гибридизация разных количеств

олигонуклеотида T18NSte, фиксированного на

клетках Jurkat, с комплементарным олигонуклеотидом FA25.

Рис. 22. Флуоресцентная микрофотография макрофагов линии J774. обработанных олигонуклеотидом FT18NSte.

различных клеток как растущих в

100 300 ¡00 700 Концетридах фосфат о-сапе» ого Буфера, ыМ (рН 7,4)

90 # 70 ^ 50 30

3 4 5 6 7 рН (0,1 М ФСБ)

2Ш 600 1000 1400 1800 Концентрация имидазопа, мМ

Рис. 23. Влияние на эффективность ассоциации олигонуклеотидов с

наночастицами никеля: а) ионной силы растворов олигонуклеотида 5'-РАМ-

СССТТСТСАСТТАСОСТТАО в фосфатно-солевом буфере; Ь) рН растворов олигомера 5'-СССТТСТСАОТТАООСТТАО; с) концентрации имидазола в растворах того же олигомера. С1 - суммарная концентрация связанного и свободного олигонуклеотида, С2 -концентрация ДНК-№

комплексов.

суспензионной культуре, так и прикрепленных к поверхности. На рис. 22 приведена флуоресцентная микрофотография макрофагов линии 1774, инкубированных с РТ1ШЭ1е. В этом случае были подтверждены закономерности, найденные для клеток линии 1игка1 по следующим показателям: цитотоксичность, распределение меченых производными олигонуклеотидов по профилям живых и мертвых клеток, зависимость нагрузки олигонуклеотидов на клетку от их концентрации. Очевидно, есть все основания утверждать, что данный метод фиксации олигонуклеотидов можно успешно применять для широкого круга клеток.

Таким образом, было установлено, что ациламиноалкильные производные

олигодезоксирибонуклеотидов при внесении в клеточную культуру, помещенную в фосфатно-солевой буфер или в бессывороточную среду, способны самопроизвольно нековалентно фиксироваться на внешней поверхности живых клеток, не изменяя жизнеспособности последних в стандартных условиях культивирования, а также способны в связанном состоянии гибридизоваться с комплементарными фрагментами ДНК, которые могут быть присоединены к другим клеткам, везикулам, молекулам, поверхностям.

4. Ассоциаты наночастиц никеля с олигонуклеотндами и белками. Одно из направлений в нанотехнологии состоит в получении новых материалов с использованием фрагментов ДНК, ковалентно связанных с

наноразмерным носителем, например, частицами золота (Crocker 2008). В сравнении с ранее описанными платформами, наночастицы никеля обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилированные белки (Becerril 2006, Лазарев 2007). Поэтому создание на их основе функциональных биополимерных структур для использования в биосенсорах и различных диагностических системах представляет значительный интерес. Однако, закономерности процессов сборки ассоциатов наночастиц никеля с олигонуклеотидами и белками до сих пор не изучены. Так, например, известно, что непосредственная металлизация ДНК путем восстановления катионов никеля приводит к потере конформации и природных свойств полинуклеотида (Becerril 2005,2006). Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.

В работе показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами однонитевых ДНК фосфодиэфирной и тиофосфорильной природы с образованием стабильных комплексов. Анализ изотерм адсорбции различных олигонуклеотидов свидетельствует о зависимости параметров связывания олигомеров от их длины, нуклеотидного состава, природы межнуклеотидных связей (данные приведены в диссертации).

401

500 1000 1500 Ni, икг

2000

200 400 600 ТЗО-Ni, икг

800

Рис. 24. Изотермы адсорбции наночастицами никеля (20 °С) гистидинилированных белков йРР и 30. С1 — суммарная концентрация связанного и свободного белка, С2 концентрация связанного белка.

Рис. 25. Изотермы адсорбции (20 °С) ассоциатами Т30-№ комплементарного (с)Азо) и некомплементарного (с1С30) олигомеров. С1 - суммарная концентрация связанного и свободного олигонуклеотида, С2 - концентрация ДНК-№ комплексов.

С целью оптимизации условий образования Ni-биополимерных ассоциатов было

рассмотрено также влияние на эффективность адсорбции олигомсров ионной силы (см. рис. 23а) и рН (см. рис. 23Ь) растворов, а также концентрации имидазола, блокирующего образование координационных связей (см. рис. 23с). На примере двух рекомбинантных гистидинилированных белков исследовано образование протеин-никелевых комплексов.

Получены изотермы адсорбции белков наночастицами никеля (рис. 24). Методом МАЬШ ТОР масс-спектрометрии показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не деградированы.

В экспериментах по гибридизации №-олигонуклеотидных комплексов показано, что №-связанные олигомеры способны избирательно удерживать комплементарные последовательности. Так, комплекс №-Т30 заметно лучше удерживал комплементарный олигомер ёАзо в сравнении с олигомером (1С30 (рис. 25).

На примере белка ОБР показано, что выделенный из состава комплекса с N1 белок не изменял своих исходных флуоресцентных свойств. Более того, оказалось, что в составе комплекса вРР сохранил способность избирательно удерживать аптамерные олигонуклеотиды А§Гр1 и А§Рр2 с образованием №-нуклеопротеиновых комплексов. Причем, как видно из рис. 26А, эффективность связывания аптамеров (А§рр1 и Agfp2) и случайной последовательности существенно различались. Следует отметить, что обнаруженное преимущество А§Рр1 в сравнении с Agfp2 коррелирует и с литературными данными (БШпИх 2003).

Рис. 26. А. Изотермы адсорбции (20 оС) ассоциатов СРР-№ с вРР-аптамерами Agfpl, \gip2 и с1С30 . В - изотермы адсорбции аптамеров за вычетом поправки на неспецифическое связывание. С1 - суммарная концентрация связанного и свободного олигонуклеотида. С2 - кониентоания ЛНК-№ комплексов

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в составе ассоциатов биополимеры могут частично или полностью сохранять функциональные свойства.

Приведенные новые данные подтверждают перспективность использования биополимер-никелевых наноструктур в качестве исследовательских и диагностических инструментов в молекулярной наноэлектронике, биологии и медицине.

Выводы

1. Сформулирован новый подход к созданию транспортных белков для доставки чужеродной ДНК в клетки-мишени, в соответствии с которым получен ряд новых полипептидов, в том числе белок РвЕк, состоящий из адресующего ЭФРч домена и олигокатионной ДНК-связывающей последовательности, мотива сигнала ядерной локализации.

2. Синтезированы новые белок-белковые и ДНК-белковые конъюгаты с применением природных и рекомбинантных белков, способные избирательно интернализоваться целевыми клетками по рецептор-опосредованному механизму и обеспечивать доставку нуклеиновой компоненты к внутриклеточным мишеням. Для конструирования такого рода транспортных систем получен ряд рекомбинантных белков, в том числе эпидермальный фактор роста человека, а также слитый белок стрептавидин-дифтерийный токсин для транспорта биотинилированных объектов.

3. Изучены механизмы образования и структурно-функциональные свойства комплексов РБЕк и его гомолога РОЕкЯ с фрагментами ДНК, предложены гипотетические механизмы транслокации нуклеопротеиновых ассоциатов и их взаимодействий с внутриклеточными мишенями. Найденные подходы и закономерности имеют системный характер и являются важными для конструирования новых переносчиков ДНК, селективных к различным типам клеток.

4. Для создания супрамолекулярных ассоциатов ДНК с живыми клетками предложен новый способ фиксации олигонуклеотидов на внешней поверхности клеток, использующий синтетические жирнокислотные производные олигонуклеотидов. Показано, что при внесении таких конъюгатов в культуральную среду ДНК эффективно удерживается на внешней мембране клеток, не изменяя их

жизнеспособности и сохраняя свои гибридизационные свойства. Получены комплексы клетка-олигомер-комплементарный олигонуклеотид. Найденный метод ДНК-маркирования клеток перспективен для создания биосенсоров, разработки новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов.

5. В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмерными основами. Найдены условия получения комплексов ДНК-№, протеин-№ и нуклеопротеин-№, в составе которых молекулы биополимеров не деградированы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства. Полученные результаты вносят вклад в создание новых биополимер-никелевых наноструктур.

6. Для создания различных ДНК-содержащих комплексов и их многофакторного структурно-функционального анализа разработаны и оптимизированы способы получения олигонуклеотидов и контроля их качества, в том числе метод параллельной сборки локально тиофосфорилированных олигомеров; рассмотрены особенности синтеза и очистки олигомеров, несущих флуоресцентные метки, а также проведены конформационные исследования ДНК. С их применением разработан ряд диагностикумов патогенов, получены новые штаммы-продуценты белков (атриального натрийуретического фактора, кальцитонина, гормона роста, эпидермального фактора роста, цитохромов и др.), трансгенные вирусы (на основе X-вируса картофеля) и растения (арабидопсис, табак и картофель). Разработанные методы и технологические приемы внедрены в производство диагностических наборов для определения широкого круга наследственных и различных инфекционных заболеваний, используются в производстве отечественных синтезаторов.

Список основных статен по теме

1. Позмогова Г.Е., Чернов Б.К., Голова Ю.Б., Баев A.A. Твердофазный синтез олигодезоксирибонуклеотидов с применением фосфамидитных динуклеотидных блоков. // Доклады АН СССР. 1986. Т. 291. №5. С. 1131-1134.

2. Чернов Б.К., Голова Ю.Б., Позмогова Г.Е. Быстрое удаление р-нитрофенилэтильной защитной группы с О6 -положения гуанидинового основания. // Биоорганическая химия. 1987. Т. 13. №8. С. 1136-1138.

3. Жвирблис Г.С., Горбулев В.Г., Рубцов П.М., Чернов Б.К., Голова Ю.Б., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г., Баев A.A. Генетическая инженерия пептидных гормонов. Клонирование к-ДНК гормона роста свиньи и конструирование гена для экспрессии гормона в бактериях. // Молекулярная биология. 1988. Т. 22. №1. С. 145150.

4. Краев A.C., Морозов С.Ю., Лукашева Л.И., Розанов М.Н., Чернов Б.К., Позмогова Г.Е., Симонова M.JL, Голова Ю.Б., Белжеларская С.Н., Скрябин К.Г., Атабеков И.Г. Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. // Доклады АН СССР. 1988. Т. 300. №3. С. 711-717.

5. Ирисбаев Б.К., Краев A.C., Абдукаримов A.A., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. Клонирование родоспецифического ДНК-зонда из гриба Fusarium oxysporum. // Молекулярная биология. 1991. Т. 25. С. 1667-1669.

6. Кочкина В.М., Морозов И.А., Франк Е.Г., Карпычев И.В., Рудик O.A., Чернов Б.К., Позмогова Г.Е., Венкстерн Т.В., Баев A.A. К вопросу о существовании в скелетных мышцах кролика ветвящего фермента рибонуклеопротеидной природы и соответствующего рибозима. //Молекулярная биология. 1991. Т. 25. С. 1546-1564.

7. Вызова М.В., Краев A.C., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. Молекулярная характеристика фрагментов генов семейства халконсинтетазы двух видов хлопчатника с помощью метода полимеразной цепной реакции. // Молекулярная биология. 1992. Т. 26. №4. С. 193-200.

8. Вызова М.В., Краев A.C., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. Идентификация с помощью ревертазной полимеразной цепной реакции генов халконсинтетазы специфически экспрессирующихся в тканях лепестков двух видов хлопчатника Gossypium hirsutum 108F и Gossypium herbaceum. // Молекулярная биология. 1992. Т. 26. №4. С. 940-944.

9. Рысков А.П., Куприянова Н.С., Капанадзе Б.И., Нечволодов К.К., Позмогова Г.Е., Просняк М.И., Янковский Н.К. Оценка частоты встречаемости некоторых мини- и макросателлитных последовательностей в ДНК хромосомы 13 человека. // Генетика. 1993. Т. 29. №10. С. 1750-1754.

10. Schulga A.A., Levichkin I.V., Kurkbanov F.T., Okorokov A.L., Pozmogova G.E., Kirpichnikov M.P. An approach to construction of hybrid polypeptide molecules-homologue recombination method. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. №18. P. 3808-3810.

11. Акимчева C.A., Рябченко Н.Ф., Миронов B.H., Голышин П.Н., Позмогова Г.Е., Троицкая E.H., Абдукаримов А., А., Скрябин К.Г. Молекулярно-генетический анализ коллекции среднеазиатских штаммов В. thuringiensis. // Биотехнология. 1994. Т. 34. №4. С. 21-24.

12. Гулина И.В., Шульга O.A., Миронов В.Н., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Позмогова Т.Е., Яковлева Г.А., Скрябин К.Г. Экспрессия частично модифицированного гена d-эндотоксина из В. thuringiensis var tenebrionis в трансгенных растениях картофеля. // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. №5. С. 1166-1175.

13. Николаидис М.Н., Парсаданян А.Ш., Позмогова Г.Е., Эльдаров М.А., Ананьева Н.М., Майсурян H.A., Галоян A.A. Синтез и секреция в Е. coli предсердного натрийуретического фактора человека в виде С-концевого гибрида с белком A St. aureus. // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. №5. С. 1098-1105.

14. Bagyan I.L., Revenkova E.V., Pozmogova G.E., Kraev A.S., Skryabin K.G. 5'-Regulatory region of Agrobacterium tumefaciens T-DNA gene 6b directs organ-specific, wound-inducible and auxin-inducible expression in transgenic tobacco. // Plant Mol Biol. 1995. V. 29. №6. P. 1299-1304.

15. Щенникова A.B., Краев A.C., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. Клонирование ДНК-зондов для обнаружения и идентификации патогенных грибов. // Молекулярная биология. 1996. Т. 30. №6. С. 1268-1273.

16. Шемякин И.Г., Анисимова В.А., Копылов П.Х., Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Манзенюк О.Ю., Лось Т.А., Щербаков Г.Я. Конструирование и экспрессия в клетках Е. coli гибридного белка дифтерийный токсин-стрептавидин. // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. №5. С. 790-794.

17. Миронов В.Н., Краев A.C., Чернов Б.К., Позмогова Г.Е., Ульянов A.B., Голова Ю.Б., Симонова М.Л., Гордеев В.К., Скрябин К.Г. Гены биосинтеза рибофлавина Bacillus Subtilis - полная первичная структура и модель организации. // Доклады АН СССР. 1998. Т. 305. №2. С. 482-488.

18. Позмогова Г.Е., Кнорре Д.Г. Белковые и пептидные конструкции для доставки в клетку олигонуклеотидов и ДНК. // Вопросы медицинской химии. 1998. Т. 44. №4. С. 331-347.

19. Семенова С.К., Хрисанфова Г.Г., Асатрян A.M., Мовсесян С.О., Позмогова Г.Е., Рысков А.П. Генетическая изменчивость Trichinella spiralis Oven, 1835 и Trichmella pseudospiralis Garkavi,1972, выявляемая методом полимеразной цепной реакции со

случайными праймерами. // Генетика. 1998. Т. 34. №4. С. 528-524.

20. Борисова О.Ф., Щелкина А.К., Харитонов В.А., Позмогова Г.Е., Лившиц М.А., Флорентьев B.JI. Четырехцепочечные комплексы, образованные из 3'd(GT)5pO(CH2CH2)3p-d(GT)5-3' олигонуклеотидов. // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. №3. С. 503-511.

21. Shchyolkina А.К., Borisova O.F., Livshits М.А., Pozmogova G.E., Chernov B.K., Klement R., Jovin T.M. Parallel-stranded DNA with mixed AT/GC composition: role of trans G.C base pairs in sequence dependent helical stability. // Biochemistry. 2000. V. 39. №33. P. 10034-10044.

22. Игнатов A.H., Кугинуки Я., Супрунова Т.П., Позмогова Г.Е., Сеитова A.M., Дорохов Д.Б., Хираи М. RAPD-маркеры, сцепленные с локусом устойчивости к расе 4 возбудителя сосудистого бактериоза anthomonas campestris pv. campestris (Pamm.) Dow., у Brassica rapa L. IIГенетика. 2000. Т. 36. №3. С. 357-360.

23. Борисова О.Ф., Щелкина А.К., Ильичева И.А., Позмогова Г.Е. Конформационный полиморфизм и растяжимость квадруплексов ДНК, образованных из d(GT)n повторов. // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. С. 860-867.

24. Игнатов А.Н., Монахос Г.Ф., Джалилов Ф.С., Позмогова Г.Е. Ген авирулентности Xanthomonas campestris pv. campestris. гомологичный локусу avrBs2, узнается при расово-специфичной реакции двумя генами устойчивости растений рода Brassica. П Генетика. 2002. Т. 38. №12. С. 1656-1663.

25. Besschetnova I.A., Pozmogova G.E., Shchyolkina А.К., Borisova O.F. The effect of the secondary and tertiary structure of d(TTAGGG)n telomeric oligonucleotides on their binding with a novel recombinant protein PGEk - deliver of DNA in cells. // J. Biomol Struct. Dyn. 2005. V. 22. P. 859-860.

26. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H. Адресованные белок-нуклеиновые комплексы для генотерапии. I. Конструирование нового белкового рекомбинантного переносчика. // Новые лекарственные препараты. 2005. №11. С. 66-71.

27. Позмогова Г.Е., Посыпанова Г.А. Адресованные белок-нуклеиновые комплексы для генотерапии. II. Доставка чужеродной ДНК в клетки-мишени с помощью нового рекомбинантного белка PGEk. // Новые лекарственные препараты. 2005. №11. С. 7280.

28. Посыпанова Г.А., Киреева Н.Н., Макаров В.А., Фатгахова Г.В., Попова О.Н., Позмогова Г.Е., Северин С.Е., Северин Е.С. Использование альфа-фетопротеина для адресной доставки антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки: сравнение двух конструкций. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2005. №3. С. 15-20.

29. Бессчетнова И.А., Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Щелкина А.К. Комплексы теломерных олигонуклеотидов d(TTAGGG)4 с новым рекомбинантным белковым вектором PGEk - переносчиком нуклеиновых кислот в пролиферирующие клетки. // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. №3. С. 489-496.

30. Zaitseva М.А., Kaluzhny D.N., Shchyolkina А.К., Borisova O.F., Pozmogova G.E. The influence of different local thiophosphoryl internucleotide bonds on the d(GGTGGTTGTGGTGGT) conformation. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. V. 24. P. 830831.

31. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H. Принципы создания белковых переносчиков ДНК. Новые производные эпидермального фактора роста человека для генотерапии. // Бюлл эксперим биол и мед. 2007. Прилож. 2. С. 87-93.

32. Лукьянова Т.А., Зайцева М.А., Карпов В.А., Позмогова Г.Е. Синтез и масс-спектрометрия олигонуклеотидов, несущих тиофосфорильные модификации заданной локализации. // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. №1. С. 83-88.

33. Позмогова Г. Е., Чувилин А. Н., Смирнов И. П., Зайцева М. А., Татаринова О. Н., Говорун В.М. Получение и свойства ассоциатов наночастиц никеля с ss-ДНК и белками. // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №5-6. С. 148-154.

34. Посыпанова Г.А., Чувилин А.Н., Киреева Н.Н., Северин Е.С., Позмогова Т.Е. Влияние стехиометрии комплексов теломерных олигонуклеотидов с белковым вектором PGEk на их антипролиферативную активность и интернализацию клетками-мишенями. // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. №2. С. 1-9.

35. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Веремеев К.Ю., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Петрунин Д.Д., Позмогова Г.Е. Влияние способов очистки олигодезоксирибонуклеотидных зондов на эффективность генодиагностики методом PCR в режиме реального времени. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2008. Т. 145. №3. С. 275-280.

36. Timofeeva М., Felgenhauer P., Sedraan J., Shostak N., Kupriyanova N., Pozmogova G., Lind A., Bayev A.A. Loach (Misgurnus fossilis) oocyte 5S rRNA gene: heterogeneity of the primary structure and location of transcription stimulatory signal in their upstream spacer. //Nucleic structure and function. Eds: J.R. Harris, l.B. Zbarsky. 1990. P. 143-147.

37. Bagyan I.L., Kraev A.S., Pozmogova G.E., Skryabin K.G. The 5'-untranslated leaders of BSMV RNAgamma and PVX coat protein mRNA as translational enhancers in tobacco protoplasts. // Genom Structure and Function C. Ed: Nicolini C., Kluvver Academic Publishers, Netherlands. 1997. P. 319-323.

38. Eldarov M.A., Sidorovich V.E., Pozmogova G.E., Skryabin K.G. Targeted expression of mammalian cytochromes P45002B4 and P450SCC in yeast Saccharomyces cerevisiae. //

Biohpysics of Electron Transfer and Molecular Bioelectronics ELBA Forum Series, Ed: Nicolini C.,Plenum Publishing Corporation NY, London. 1998. V. 3. P. 91-102.

39. Эльдаров M.A., Позмогова Г.Е., Кагиянц C.M., Луценко C.B., Северин Е.С., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Штамм дрожжей S. cerevisiae ВКМ CR-349D -продуцент эпидермального фактора роста человека. // Патент РФ №21505001. 1999.

40. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Посыпанова Г.А., Шульга A.A., Эльдаров М.А., Ермолюк Я.С., Северин Е.С., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Пептидный вектор, способ его получения, нуклеотидная последовательность, рекомбинантная плазмидная ДНК и штамм Escherichia coli В-8389 ВКПМ для его получения, способ генетической модификации клеток млекопитающих и человека. // Патент РФ № 2248983. 2005.

Список тезисов по теме

41. Позмогова Г.Е., Розанов М.Н., Симонова M.JI., Априкян П.Г. Геном протексвирусов: секвенирование Х-вируса картофеля и предсказание функций продуктов вирусных генов. // Тез. IV Межд. конф. по генетике. 1989. Варна. НРБ. С.73-77.

42. Позмогова Г.Е. Блочный синтез олигодезоксирибонуклеотидов на твердой фазе в неавтоматическом режиме с использованием фосфатных и фосфамидитных димерных блоков. Синтез генов пептидных гормонов. //Тез. IV Межд. конф. по генетике. 1989. Варна. НРБ. С.27-31.

43. Позмогова Г.Е., Чернов Б.К., Голова Ю.Б., Гнучев Н.В. Применение ион-парной ВЭЖХ для разделения сложных смесей синтетических олигодезоксирибонуклеотидов. // Тез. VI Всес. Симп. по межфазной жидкостной хроматографии 1989. Алма-Ата. С. 82.

44. Скрябин К.Г., Рябченко Н.Ф., Миронов В.Н., Шульга O.A., Пугин М.М., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Позмогова Г.Е. Принципы получения устойчивых растений. II Тез. 1 Всес. симп." Новые методы биотехнологии растений", Пущино. 1991. С. 10.

45. Краев A.C., Шульга O.A., Пугин М.М., Ревенкова Е.В., Карпычев И.В., Эльдаров М.А., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. Проблемы оптимизации экспрессии трансгенов. // Тез. I Всесоюзн. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино. 1991. С. 93.

46. Головко А.Э., Акимчева С.А., Голышин П.Н., Рябченко Н.Ф., Степанов А.И., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. Поиск и молекулярно-генетический анализ новых энтомопатогенных штаммов Bacillus thuringiensis./ÍTe3. докл. V Конф. "Новые направления биотехнологии". Пущино. 1992. С. 17.

47. Skryabin K.G., Bagyaii I.L., Gulina I.V., Kraev A.S., Padegimas L.S., Pooggin M.M., Revenkova E.V., Schennikova A.V., Shulga O.A., Sokolova M.A., Pozmogova G.E. Production of transgenic plants resistant to viruses, insects and herbicides: optimization of heterologous gene expression. // Conf. Pap. Of 10-th Anniversary Otto Warburg Symp. "Molecular Biology & Plant breeding: Theoretical, practical & legal aspects". March 1994. P. 87.

48. Suprunova T.P., Bocharnicova N.I., Pozmogova G.E., Dorokhov D.B. RAPD-analysis of interspecific hybrids Licopersicon Esculentum mill, and Sulanum Peimellii cor. obtained by means of pollination with exogenous DNA. // Abst. Of The 7-th Intern. Pollination Symp., Lethbridge, Canada.1996. P.l 12.

49. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H. Конструирование транспортных комплексов: белковый вектор - интеркалятор - ДНК для использования в генотерапии. // Тез. VIII Конф. "Новые направления биотехнологии". Москва. 1998. С. 64.

50. Сидорович В.Е., Бобровникова Е.В., Эльдаров М.А., Соколов Н.Н., Позмогова Г.Е., Арчаков А.И., Скрябин К.Г. Экспрессия цитохромов Р45011А1 и Р45002В4 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. // Тез. VIII Конф. "Новые направления биотехнологии". Москва. 1998. С. 66.

51. Щелкина А.К., Борисова О.Ф., Лившиц М.А., Чернов Б.К., Позмогова Т.Е., Джовин Т.М., Чуриков Н.А Структура и динамика нуклеиновых кислот и их комплексов. Новая двойная спираль ДНК с AT и GC трансуотсон-криковскими парами. // Тез. II Съезд биофизиков России. Москва. 1999. Т.1. С. 184-185.

52. Борисова О.Ф., Щелкина А.К., Харитонов В.А., Мамаева O.K., Лысов Ю.П., Позмогова Г.Е., Тимофеев Э.Н., Лившиц М.А., Флорентьев В.Л. Структура и динамика четырехцепочечных комплексов, образованных из d(GT)n повторов. // Тез. II Съезд биофизиков России. Москва. 1999. Т.1. С. 98.

53. Pozmogova G.E., Chuvilin A.N., Posypanova G.A. Oligodeoxyribonucleotide-recombinant human epidermal growth factor (rEGFh) conjugates. // Abstr. Int. Conf. "Trends in nucleic acid chemistry" Moscow. 2000. P. 13.

54. Pozmogova G.E., Chuvilin A.N., Posypanova G.A., Shulga A.A., Ermolyuk Ya.S., Kireeva N.N., Kirpichnikov M.P., Skryabin K.G. New EGF-based peptide vectors for antisense oligonucleotides and plasmid DNA target delivery into actively proliferating cells. //Abstr. Int. Conf. "RNA as Terapeutic and Genomics Target". Novosibirsk. 2001. P. 83.

55. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H., Посыпанова Г.A. , Шульга А.А., Ермолюк Я.С., Киреева Н.Н., Глухов А.И., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Новый пептидный вектор EGF-NLS для доставки антисенс- олигонуклеотидов и плазмидной ДНК в опухолевые клетки. //Тез. "Биотехнология -2001". Пущино. 2001. С. 215.

56. Chernolovskaya E., Pimanova Т., Chuvilin A., Pozmogova G., Vlassov V. Target delivery of antisence oligonucleotide into EGF-receptor expressing cells. // Abstr. Int. Conf. "RNA as Terapeutic and Genomics Target". Novosibirsk. 2001. P. 75.

57. Позмогова Г.Е., Бессчетнова И.А., Щелкина A.K., Борисова О.Ф. Роль квадруплексной структуры d(TTAGGG)4 теломерной ДНК в связывании с пептидным вектором PGEk -переносчиком олигонуклеотидов в ядра клеток.// Тез. III Съезда биофизиков России. Воронеж. 2004. Т. 1. С. 134-135.

58. Позмогова Г.Е. Адресованные белок-нуклеиновые комплексы для генотерапии. //Тез. XII Росс. Нац. Конгр. «Человек и лекарство». Москва. 2005. С. 293.

59. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Посыпанова Г.А., Бессчетнова И.А, Борисова О.Ф. Структура и свойства адресованных комплексов рекомбинантного белка PGEk с теломерным олигонуклеотидом d(TTAGGG)4 и его фосфотиоатным аналогом.//Тез. Межд. конф., посвященной 80-летию со дня рождения академика Д.Г. Кнорре. Новосибирск. 2006. С. 203.

60. Зайцева М.А., Калюжный Д.И., Лукьянова Т.А., Щелкина А.К., Борисова О.Ф., Позмогова Г. Е. Структурные исследования локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов d(GGTGGTTGTGGTGGT), аналогов антитромбинового аптамера. XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва. 2007. Т. 4. С. 535.

61. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Позмогова Г.Е. Специфика обращено-фазовой ВЭЖХ олигодезоксирибонуклеотидных зондов для Real-Time PCR генодиагностики. // Тез. III Межд. конф. "Фундаментальные науки - медицине". 2007. Новосибирск. С.143.

62. Pozmogova G.E., Chuvilin A.N. Artificial nucleoprotein complexes for gene therapy. Constructing and structural-functional investigations // Abstr. IV Russian-French Symp "Supramlecular Systems in Chemistry and Biology". Moscow. 2007. V. 5. P. 36.

63. Позмогова Г.Е., Татаринова O.H., Смирнов И.П. Формирование нуклеопротеиновых ассоциатов на основе наночастиц никеля. // Сб. трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 2008. С. 206.

64. Чувилин А.Н., Серебрякова М.В., Позмогова Г.Е. Деградация флуоресцентных меток на основе галогенированных ксантенов в условиях аммонолиза. // Сб. трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 2008. С. 205.

65. Smirnov I.P., Pozmogova G.E., Govorun V.M. DNA isolation and desalting directly on MALDI plate for MS analysis. // Proceedings of the 56-th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. Colorado USA. 2008 ASMS CD 2008, TPB 040.

Подписано в печать 10.11.08. Объем 2,75 печ.л. 2 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. 123104, Москва, Тверской б-р, 7/2 Тип. ЦНИИ ЭИСУ

Содержание диссертации, доктора химических наук, Позмогова, Галина Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Супрамолекулярные конструкции для направленного транспорта в клетки-мишени фрагментов полинуклеотидов (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

1.1. Почему нужны невирусные системы доставки.

1.2. Интернализация олигонуклеотидов.

1.3. Что подразумевается под направленным транспортом чужеродной ДНК.

1.4. Физические методы доставки ДНК.

1.5. Химические методы доставки ДНК.

1.6. Биохимические методы доставки ДНК.

1.6.1. Поиск специфических лигандов.

1.6.2. Низкомолекулярные органические лиганды.

1.6.3. Асиалогликопротеины.

1.6.4. Белковые и пептидные лиганды.

1.6.4.1. Пептиды.

1.6.4.2. Природные и рекомбинантные белки.

1.6.4.3. ДНК-связывающие домены.

1.6.4.4. Эндосомолитические домены.

1.6.4.5. Ядерный импорт.

1.7. Основные принципы архитектуры нуклеопротеиновых транспортных комплексов.

2. Искусственные ДНК-содержащие супрамолекулярные комплексы (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

2.1. ДНК-компонента комплексов.

2.1.1. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации заданной локализации.

2.1.2. Конформационные исследования олигонуклеотидов.

2.1.3. Флуоресцентномеченные олигонуклеотиды.

2.1.3.1. Некоторые особенности хроматографического поведения модифицированных олигонуклеотидов.

2.1.3.2. Трансформация гексахлорфлуоренилового остатка в составе олигонуклеотидов в условиях аммонолиза.

2.2. Нуклеопротеиновые комплексы для доставки чужеродной ДНК в клетки-мишени

2.2.1. Ковалентные нуклеопротеиновые конъюгаты.

2.2.1.1. Ковалентные конъюгаты ЭФРч с антисмысловыми олигонуклеотидами.

2.2.1.1.1. Получение белка рЭФРч.

2.2.1.1.2. Синтез ЭФРч-олигонуклеотидных конъюгатов.

Сравнение митогенной активности белка ЭФР, рекомбинантного ЭФРч и конъюгатов ЭФР-AACGTTGAGGGGCAT и ЭФР

AATCCTCCCCCAGTTCACCC.

Влияние конъюгата ЭФР- AACGTTGAGGGGCAT на подавление экспрессии гена-мишени С-тус.

2.2.1.2. Синтез конъюгатов АФП-олигомер.:.

2.2.2. Белковые векторы-переносчики ДНК.

2.2.2.1. Получение белковых векторов химической конденсацией доменов

2.2.2.1.1. Синтез конъюгата АФП-полилизин.

Получение комплекса АФП-полилизин-олигонуклеотид.

Исследование уровня эндоцитоза олигонуклеотидов опухолевыми клетками в составе конъюгата с АФП и комплекса с полипептидом

АФП-полилизин.

Анализ распределения конъюгата АФП с флуоресцентномеченным антисмысловым олигонуклеотидом в опухолевых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии.

Сравнение уровня эндоцитоза конъюгата АФП-FASl и комплекса АФП-полилизин-FAS 1.

2.2.2.2. Рекомбинантные белковые векторы-переносчики полинуклеотидов

2.2.2.2.1. Рекомбинантный белок дифтерийный токсин-стрептавидин.

Основные требования к структуре белковых векторов.

2.2.2.2.2. Структура белкового рекомбинантного переносчика ДНК,

PGEk.

2.2.2.2.3. Получение белка PGEk.

2.2.2.2.4. Структурная организация и свойства супрамолекулярных PGEk

ДНК и PGEkR-ДНК комплексов.

PGEk-опосредованная доставка чужеродной ДНК в целевые клетки.

Влияние PGEk на доставку олигонуклеотидов.

Увеличение активности антисмысловых олигонуклеотидов в присутствии PGEk.

Сравнение митогенной активности белков ЭФРч, PGEk и комплексов

PGEk с олигонуклеотидами.

Исследование интернализации олигонуклеотидов ТМО и TMS в составе комплексов с PGEk с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

Внутриклеточная локализация олигонуклеотидов.

Исследование цитотоксичности комплексов PGEk с ТМО и TMS in vitro\Q2 Влияние вектора PGEk на доставку репортерной плазмиды pEGFP N1 в опухолевые клетки.

Структурная организация комплексов PGEk с олигонуклеотиами.

Изучение динамики молекул PGEk в комплексе с олигонуклеотидами разной структуры.

Изучение комплексов PGEk-ДНК с помощью собственной УФфлуоресценции белка.

Изотермы адсорбции молекул PGEk на олигонуклеотидах ТМО и TMS 112 Изучение структуры биологически активных комплексов PGEk-ДНК

Влияние молекул PGEk на вторичную структуру олигонуклеотидов.

Получение и свойства белка-вектора PGEkR.

2.3. Искусственные ДНК-ассоциаты с живыми клетками.

2.3.1. Выбор структуры амфифильных производных олигонуклеотидов.

2.3.2. Синтез олигонуклеотидных производных жирных кислот.

2.3.3. Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток.

2.3.4. Гибридизационные свойства ДНК-модифицированных клеток.

2.4. Супрамолекулярные комплексы наночастиц никеля с олигонуклеотидами и белками.

2.4.1. ДНК-ассоциаты наночастиц никеля.

2.4.2. Ассоциаты наночастиц никеля с белками.

2.4.3. Взаимодействие Ni-GFP с GFP-связывающими ДНК-аптамерами

Agfp 1 и Agfp2.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Искусственные ДНК-содержащие супрамолекулярные комплексы"

Подобно тому, как существует область молекулярной химии, основанной на ковалентных связях, существует и область супрамолекулярной химии — химии молекулярных ансамблей и межмолекулярных связей" Лауреат Нобелевской премии по химии за 1987 Ж.-М. Лен [1].

Одно из основополагающих природных свойств полинуклеотидов состоит в их способности ассоциироваться с различными биополимерами и низкомолекулярными соединениями с образованием функциональных супрамолекулярных комплексов. Надмолекулярные ассоциаты полинуклеотидов - естественная форма их существования.

Супрамолекулярная (надмолекулярная) химия (Supramolecular chemistry) -междисциплинарная область науки, включающая химические, физические и биологические аспекты рассмотрения более сложных, чем молекулы, химических систем, связанных в единое целое посредством межмолекулярных (нековалентных) взаимодействий [1].

Объекты супрамолекулярной химии - супрамолекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т.е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке. Одной из фундаментальных проблем современной химии является направленное конструирование таких систем, создание из молекулярных «строительных блоков» высокоупорядоченных супрамолекулярных соединений с заданной структурой и свойствами [1,2].

Создание искусственных комплексов ДНК и структурно-функциональное исследование таких модельных систем - продуктивный прием, как для изучения естественных природных процессов, так и для создания новых подходов к решению широкого спектра актуальных прикладных задач. В настоящей работе рассмотрены три группы супрамолекулярных ассоциатов ДНК.

1. Наиболее близкие природным аналогам нуклеопротеиновые транспортные комплексы для направленной доставки чужеродных олиго-/полинуклеотидов в целевые клетки живого организма.

2. Комплексы, моделирующие свойства живой системы [живая клетка -фиксированная на внешней мембране ДНК - комплементарная нуклеотидная последовательность].

3. Искусственные ассоциаты ДНК и нуклеопротеиновые ансамбли на основе наночастиц металла (никеля).

Необходимость применения специальных транспортных систем для доставки чужеродного генетического материала в клетки-мишени остается существенным препятствием на пути развития генотерапии. Наибольшая избирательность в отношении целевых клеток показана для белковых переносчиков чужеродного генетического материала, использующих естественные механизмы клеточного обмена. В настоящее время, несмотря на обнадеживающие лабораторные результаты, известные белковые векторы в силу различных причин не удовлетворяют требованиям клинического применения. Поэтому особенно актуальна разработка новых подходов к созданию белков-транспортеров ДНК, способных к самопроизвольной сборке с различными терапевтически значимыми молекулами олиго- и полинуклеотидов с образованием стабильных в биологических жидкостях функциональных надмолекулярных комплексов. Для этой цели необходимо изучение закономерностей образования и структурно-функциональных свойств таких нуклеопротеиновых ассоциатов.

Полученные результаты могут стать основой для разработки новых универсальных и технологически доступных неиммуногенных белковых векторов, необходимых при создании лекарственных средств для генотерапии заболеваний различной этиологии.

Многие адгезивные манипуляции с живыми клетками основаны на бинарных лиганд-рецепторных взаимодействиях. Для направленной иммобилизации клеток на твердом носителе недавно было предложено снабдить поверхность клеток фрагментами ДНК. Для этого проводили ковалентную конденсацию активированных олигонуклеотидов с олигосахаридами клеточной мембраны, модифицированными азидо-группами [3], что и придавало клеткам искусственное сродство к комплементарным последовательностям ДНК. Реализация этой привлекательной и перспективной идеи осложнена и ограничена необходимостью использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью (трое суток) процедуры ДНК-модификации клеток. Создание нового способа быстрой, эффективной и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с плазматической мембраной чрезвычайно актуально для развития новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов, разработки новых биосенсорных систем.

Одно из направлений в нанотехнологии состоит в получении новых материалов с использованием фрагментов ДНК, ковалентно связанных с наноразмерным носителем, например, частицами золота [4]. В сравнении с ранее описанными платформами наночастицы никеля обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилированные белки [5, 6]. Поэтому создание на их основе функциональных биополимерных структур биосенсоров и диагностических систем представляет значительный интерес. Однако, закономерности процессов сборки ассоциатов наночастиц никеля с олигонуклеотидами и белками до сих пор не изучены. Непосредственная же металлизация ДНК путем восстановления катионов никеля приводит к изменению конформации и потере природных свойств полинуклеотида [7, 5]. Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.

В настоящей работе большое внимание уделено исследованию, разработке и оптимизации методов синтеза фрагментов ДНК, в том числе содержащих модификации сахаро-фосфатного остова и различные заместители, способов получения рекомбинантных белков, а также подходов к формированию и анализу структуры комплексов полинуклеотидов.

Цель настоящей работы состоит в конструировании искусственных ДНК-содержащих супрамолекулярных комплексов, изучении на этих моделях закономерностей их сборки и структурно-функциональных свойств и применении найденных подходов для решения важных прикладных медико-биологических и нанобиотехнологических задач, таких как: конструирование новых белков-векторов, самоассоциирующихся с олигонуклеотидами и их аналогами, а также с плазмидной ДНК для избирательной доставки чужеродного генетического материала в целевые клетки; создание нового способа быстрой, эффективной и безопасной для жизнеспособности клеток фиксации ДНК на внешней мембране клетки для расширения возможностей адгезивных манипуляций с живыми клетками; получение функциональных ассоциатов олигонуклеотидов, белков и нуклеопротеиновых комплексов на основе наночастиц никеля; разработка и оптимизация методов получения ДНК и белковых компонентов комплексов, а также способов формирования и анализа структурной организации супрамолекулярных ассоциатов полинуклеотидов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Позмогова, Галина Евгеньевна

4. ВЫВОДЫ

1. Сформулирован новый подход к созданию транспортных белков для доставки чужеродной ДНК в клетки-мишени, в соответствии с которым получен ряд новых полипептидов, в том числе белок PGEk, состоящий из адресующего ЭФРч домена и олигокатионной ДНК-связывающей последовательности, мотива сигнала ядерной локализации.

2. Синтезированы новые белок-белковые и ДНК-белковые конъюгаты с применением природных и рекомбинантных белков, способные избирательно интернализоваться целевыми клетками по рецептор-опосредованному механизму и обеспечивать доставку нуклеиновой компоненты к внутриклеточным мишеням. Для конструирования такого рода транспортных систем получен ряд рекомбинантных белков, в том числе эпидермальный фактор роста человека, а также слитый белок стрептавидин-дифтерийный токсин для транспорта биотинилированных объектов.

3. Изучены механизмы образования и структурно-функциональные свойства комплексов PGEk и его гомолога PGEkR с фрагментами ДНК, предложены гипотетические механизмы транслокации нуклеопротеиновых ассоциатов и их взаимодействий с внутриклеточными мишенями. Найденные подходы и закономерности имеют системный характер и являются важными для конструирования новых переносчиков ДНК, селективных к различным типам клеток.

4. Для создания супрамолекулярных ассоциатов ДНК с живыми клетками предложен новый способ фиксации олигонуклеотидов на внешней поверхности клеток, использующий синтетические жирнокислотные производные олигонуклеотидов. Показано, что при внесении таких конъюгатов в культуральную среду ДНК эффективно удерживается на внешней мембране клеток, не изменяя их жизнеспособности и сохраняя свои гибридизационные свойства. Получены комплексы клетка-олигомер-комплементарный олигонуклеотид. Найденный метод ДНК-маркирования клеток перспективен для создания биосенсоров, разработки новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов.

5. В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмерными основами. Найдены условия получения комплексов ДНК-Ni, протеин-Ni и нуклеопротеин-Ni, в составе которых молекулы биополимеров не деградированы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства. Полученные результаты вносят вклад в создание новых биополимер-никелевых наноструктур.

6. Для создания различных ДНК-содержащих комплексов и их многофакторного структурно-функционального анализа разработаны и оптимизированы способы получения олигонуклеотидов и контроля их качества, в том числе метод параллельной сборки локально тиофосфорилированных олигомеров; рассмотрены особенности синтеза и очистки олигомеров, несущих флуоресцентные метки, а также проведены конформационные исследования ДНК. С их применением разработан ряд диагностикумов патогенов, получены новые штаммы-продуценты белков (атриального натрийуретического фактора, кальцитонина, гормона роста, эпидермального фактора роста, цитохромов и др.), трансгенные вирусы (на основе Х-вируса картофеля) и растения (арабидопсис, табак и картофель). Разработанные методы и технологические приемы внедрены в производство диагностических наборов для определения широкого круга наследственных и различных инфекционных заболеваний, используются в производстве отечественных синтезаторов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Позмогова, Галина Евгеньевна, Москва

1. Пожарский А.Ф. Супрамолекулярная химия. Часть 1. Молекулярное распознавание. // Соросовский образовательный журнал. 1997. Т. №9. С. 32-39.

2. Chandra R.A., Douglas E.S., Mathies R.A., Bertozzi C.R., Francis M.B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. // Angew Chem Int Ed Engl. 2006. V. 45. №6. P. 896-901.

3. Crocker J.C. Nanomaterials: golden handshake. //Nature. 2008. V. 451. №7178. P. 528-529.

4. Becerril H.A., Ludtke P., Willardson B.M., Woolley A.T. DNA-templated nickel nanostructures and protein assemblies. // Langmuir. 2006. V. 22. №24. P. 1014010144.

5. Becerril Н.А., Stoltenberg R.M., Wheeler D.R., Davis R.C., Harb J.N., Woolley A.T. DNA-templated three-branched nanostructures for nanoelectronic devices. // J Am Chem Soc. 2005. V. 127. №9. P. 2828-2829.

6. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Cotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991. V. 88. №19. P. 8850-8854.

7. Hart I.R. Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy. // Semin Oncol. 1996. V. 23. №1. P. 154-158.

8. Mann M.J., Morishita R., Gibbons G.H., von der Leyen H.E., Dzau V.J. DNA transfer into vascular smooth muscle using fusigenic Sendai virus (HVJ)-liposomes.

9. Mol Cell Biochem. 1997. V. 172. №1-2. P. 3-12.

10. Navarro J., Oudrhiri N., Fabrega S., Lehn P. Gene delivery systems: Bridging the gap between recombinant viruses and artificial vectors. // Adv Drug Deliv Rev. 1998. V. 30. №1-3. P. 5-11.

11. Diebold S.S., Lehrmann H., Kursa M., Wagner E., Cotten M., Zenke M. Efficient gene delivery into human dendritic cells by adenovirus polyethylenimine and mannose polyethylenimine transfection. // Hum Gene Ther. 1999. V. 10. №5. P. 775786.

12. Palu G., Bonaguro R., Marcello A. In pursuit of new developments for gene therapy of human diseases. // J Biotechnol. 1999. V. 68. №1. P. 1-13.

13. Takakura Y., Nishikawa M., Yamashita F., Hashida M. Development of gene drug delivery systems based on pharmacokinetic studies. // Eur J Pharm Sci. 2001. V. 13. №1. P. 71-76.

14. Nicklin S.A., White S.J., Watkins S.J., Hawkins R.E., Baker A.H. Selectivetargeting of gene transfer to vascular endothelial cells by use of peptides isolated by phage display. // Circulation. 2000. V. 102. №2. P. 231-237.

15. Gottschalk U., Chan S. Somatic gene therapy. Present situation and future perspective. // Arzneimittelforschung. 1998. V. 48. №11. P. 1111-1120.

16. Han S., Mahato R.I., Sung Y.K., Kim S.W. Development of biomaterials for gene therapy. // Mol Ther. 2000. V. 2. №4. P. 302-317.

17. Rusconi S., Ceppi M. Vectors for Gene Delivery. // Gene therapy of Rheumatoid Arthritis. 2000. V. P. 1-23.

18. DeMayo F.J., Tsai S.Y. Targeted gene regulation and gene ablation. // Trends Endocrinol Metab. 2001. V. 12. №8. P. 348-353.

19. Nichol C., Kim E.E. Molecular imaging and gene therapy. // J Nucl Med. 2001. V. 42. №9. P. 1368-1374.

20. Duchler M., Pengg M., Schuller S., Pfneisl F., Bugingo C., Brem G., Wagner E., Schellander K., Muller M. Somatic gene transfer into the lactating ovine mammary gland. // J Gene Med. 2002. V. 4. №3. P. 282-291.

21. Kircheis R., Wightman L., Kursa M., Ostermann E., Wagner E. Tumor-targeted gene delivery: an attractive strategy to use highly active effector molecules in cancer treatment. // Gene Ther. 2002. V. 9. №11. P. 731-735.

22. Wells D.J., Ferrer A., Wells K.E. Immunological hurdles in the path to gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. // Expert Rev Mol Med. 2002. V. 2002. P. 1-23.

23. Uherek C., Wels W. DNA-carrier proteins for targeted gene delivery. // Adv Drug Deliv Rev. 2000. V. 44. №2-3. P. 153-166.

24. Kircheis R., Blessing Т., Brunner S., Wightman L., Wagner E. Tumor targeting with surface-shielded ligand—polycation DNA complexes. // J Control Release. 2001. V. 72. №1-3. P. 165-170.

25. Pouton C.W., Seymour L.W. Key issues in non-viral gene delivery. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. №1-3. P. 187-203.

26. Parker A.L., Newman C., Briggs S., Seymour L., Sheridan P.J. Nonviral gene delivery: techniques and implications for molecular medicine. // Expert Rev Mol Med. 2003. V. 2003. P. 1-15.

27. Luo D., Han E., Belcheva N., Saltzman W.M. A self-assembled, modular DNA delivery system mediated by silica nanoparticles. // J Control Release. 2004. V. 95. №2. P. 333-341.

28. Gao X., Kim K.S., Liu D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. // Aaps J. 2007. V. 9. №1. P. E92-104.

29. Huang R.Q., Qu Y.H., Ke W.L., Zhu J.H., Pei Y.Y., Jiang C. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. // Faseb J. 2007. V. 21. №4. P. 1117-1125.

30. Li D., Yu H., Huang H., Shen F., Wu X., Li J., Wang J., Cao X., Wang Q., Tang G. FGF Receptor-mediated Gene Delivery using Ligands Coupled to Polyethylenimine. // J Biomater Appl. 2007. V. P.

31. Liu F., Conwell C.C., Yuan X., Shollenberger L.M., Huang L. Novel nonviral vectors target cellular signaling pathways: regulated gene expression and reduced toxicity. // J Pharmacol Exp Ther. 2007. V. 321. №2. P. 777-783.

32. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V., Vlassov V.V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. №17. P. 6454-6458.

33. Karpova G.G., Knorre D.G., Ryte A.S., Stephanovich L.E. Selective alkylation of poly(A) tracts of RNA inside the cell with the derivative of ethyl ester of oligothymidilate bearing 2-chloroethylamino group. // FEBS Lett. 1980. V. 122. №1. P. 21-24.

34. Кнорре Д.Г., Власов В.В. Клеточные мембраны как барьер при биологических применениях антисмысловых олигонуклеотидов, их производных и аналогов. // Биоорг химия. 1992. Т. 18. №10-11. С. 1330-1340.

35. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. 1991. V. 254. №5037. P. 1497-1500.

36. Dean D.A. Peptide nucleic acids: versatile tools for gene therapy strategies. // Adv Drug Deliv Rev. 2000. V. 44. №2-3. P. 81-95.

37. Dias N., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Mol Cancer Ther. 2002. V. 1. №5. P. 347-355.

38. Herbert B.S., Pongracz K., Shay J.W., Gryaznov S.M. Oligonucleotide N3'~>P5' phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors. // Oncogene. 2002. V. 21. №4. P. 638-642.

39. Лактионов П.П., Брыксин A.B., Рыкова Е.Ю., Амирханов Н.В., Власов В.В. Исследование фармокинетики и стабильности в крови in vivo фосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов. // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45. №3. С. 170-177.

40. Dean F.B., Nelson J.R., Giesler T.L., Lasken R.S. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. II Genome Res. 2001. V. 11. №6. P. 1095-1099.

41. Di Giusto D., King G.C. Single base extension (SBE) with proofreading polymerases and phosphorothioate primers: improved fidelity in single-substrate assays. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. №3. P. e7.

42. Smirnov I., Shafer R.H. Effect of loop sequence and size on DNA aptamer stability. // Biochemistry. 2000. V. 39. №6. P. 1462-1468.

43. Meyers L.A., Lee J.F., Cowperthwaite M., Ellington A.D. The robustness of naturally and artificially selected nucleic acid secondary structures. // J Mol Evol. 2004. V. 58. №6. P. 681-691.

44. Биченков E.E., Будкер В.Г., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Лохов С.Г.,

45. Савченко Е.В., Теплова Н.М. Взаимодействие модифицированного холестерином полинуклеотида с фосфатидилхолиновыми липосомами. // Биолмембраны. 1988. Т. 5. №7. с. 735-741.

46. Zarytova V.F., Ivanova Е.М., Chasovskikh M.N. Synthesis of steroid-containing oligonucleotides and their alkylating derivatives. // Bioorg Khim. 1990. V. 16. №5. P. 610-616.

47. Manunta M., Nichols B.J., Tan P.H., Sagoo P., Harper J., George A.J. Gene delivery by dendrimers operates via different pathways in different cells, but is enhanced by the presence of caveolin. // J Immunol Methods. 2006. V. 314. №1-2. P. 134-146.

48. Mishra R.K., Moreau C., Ramazeilles C., Moreau S., Bonnet J., Toulme J.J. Improved leishmanicidal effect of phosphorotioate antisense oligonucleotides by LDL-mediated delivery. // Biochim Biophys Acta. 1995. V. 1264. №2. P. 229-237.

49. Richardson P.D., Kren B.T., Steer C.J. Gene repair in the new age of gene therapy. // Hepatology. 2002. V. 35. №3. P. 512-518.

50. Dykxhoorn D.M., Novina C.D., Sharp P.A. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. V. 4. №6. P. 457-467.

51. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. №11. P. 2717-2724.

52. Heggestad A.D., Notterpek L., Fletcher B.S. Transposon-based RNAi delivery system for generating knockdown cell lines. // Biochem Biophys Res Commun. 2004. V. 316. №3. P. 643-650.

53. Huang F., Khvorova A., Marshall W., Sorkin A. Analysis of clathrin-mediated endocytosis of epidermal growth factor receptor by RNA interference. // J Biol Chem. 2004. V. 279. №16. P. 16657-16661.

54. Sakamoto K.M. Knocking down human disease: potential uses of RNA interference in research and gene therapy. // Pediatr Res. 2004. V. 55. №6. P. 912913.

55. Liu Z., Winters M., Holodniy M., Dai H. siRNA delivery into human T cells and primary cells with carbon-nanotube transporters. // Angew Chem Int Ed Engl. 2007. V. 46. №12. P. 2023-2027.

56. Rakhmilevich A.L., Janssen K., Turner J., Culp J., Yang N.S. Cytokine gene therapy of cancer using gene gun technology: superior antitumor activity of interleukin-12. // Hum Gene Ther. 1997. V. 8. №11. P. 1303-1311.

57. Wolff J.A. Naked DNA transport and expression in mammalian cells. // Neuromuscul Disord. 1997. V. 7. №5. P. 314-318.

58. Beardsley T. Working under pressure. // Sci Am. 2000. V. 282. №3. P. 34.

59. Wells J.M., Li L.H., Sen A., Jahreis G.P., Hui S.W. Electroporation-enhanced gene delivery in mammary tumors. // Gene Ther. 2000. V. 7. №7. P. 541-547.

60. Sundararajan R. Nanoelectroporation: a first look. // Methods Mol Biol. 2008. V. 423. P. 109-128.

61. Tyagi R.K., Sharma P.K., Vyas S.P., Mehta A. Various carrier systems-mediated genetic vaccination strategies against malaria. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. №4. P. 499-520.

62. Li W., Szoka F.C., Jr. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. // Pharm Res. 2007. V. 24. №3. P. 438-449.

63. Zhang Z., Sha X., Shen A., Wang Y., Sun Z., Gu Z., Fang X. Polycation nanostructured lipid carrier, a novel nonviral vector constructed with triolein for efficient gene delivery. // Biochem Biophys Res Commun. 2008. V. 370. №3. P. 478482.

64. Radler J.O., Koltover I., Jamieson A., Salditt Т., Safinya C.R. Structure and1.terfacial Aspects of Self-Assembled Cationic Lipid-DNA Gene Carrier Complexes. // Langmuir. 1998. V. №14. P. 4272-4283.

65. Ma H., Diamond S.L. Nonviral gene therapy and its delivery systems. // Curr Pharm Biotechnol. 2001. V. 2. №1. P. 1-17.

66. Abbasi M., Uludag H., Incani V., Hsu C.Y., Jeffery A. Further investigation of lipid-substituted poly(L-Lysine) polymers for transfection of human skin fibroblasts. // Biomacromolecules. 2008. V. 9. №6. P. 1618-1630.

67. Templeton N.S., Lasic D.D., Frederik P.M., Strey H.H., Roberts D.D., Pavlakis G.N. Novel DNA:liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. //Nature Biotechnol. 1997. V. 15. №3. P. 647-652.

68. Богданенко E.B:, Свиридов Ю.В., Московцев A.A., Жданов Р.И. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии. // Вопр Мед Химии. 2000. Т. 46. №3. С. 57-79.

69. Кривцов Г.Г., Жданов Р.И. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углевод-содержащих векторов. // Вопр Мед Химии. 2000. Т. 46. №3. С. 80-93.

70. Newell-Price J., King P., Clark A. The CpG Island Promoter of the Human Proopiomelanocortin Gene Is Methylated in Nonexpressing Normal Tissue and Tumors and Represses Expression // Molecular Endocrinology. 2001. V. 15. №2. P. 338-348.

71. Fielding A.K., Chapel-Fernandes S., Chadwick M.P., Bullough F.J., Cosset F.L., Russell S J. A hyperfusogenic gibbon ape leukemia envelope glycoprotein: targeting of a cytotoxic gene by ligand display. // Hum Gene Ther. 2000. V. 11. №6. P. 817826.

72. Csaszar A., Abel T. Receptor polymorphisms and diseases. // Eur J Pharmacol. 2001. V. 414. №1. P. 9-22.

73. Reiss M. TGF-beta and cancer. // Microbes Infect. 1999. V. 1. №15. P. 13271347.

74. Nakagawa K., Ishizaki T. Therapeutic relevance of pharmacogenetic factors in cardiovascular medicine. // Pharmacol Ther. 2000. V. 86. №1. P. 1-28.

75. Li Z., Zhao R., Wu X., Sun Y., Yao M., Li J., Xu Y., Gu J. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. // Faseb J. 2005. V. 19. №14. P. 1978-1985.

76. Booth P.J., Templer R.H., Meijberg W., Allen S.J., Curran A.R., Lorch M. In vitro studies of membrane protein folding. // Crit Rev Biochem Mol Biol. 2001. V. 36. №6. P. 501-603.

77. Chen C.H., Chernis G.A., Hoang V.Q., Landgraf R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100. №16. P. 9226-9231.

78. Rajendran M., Ellington A.D. In vitro selection of molecular beacons. //Nucleic

79. Acids Res. 2003. V. 31. №19. P. 5700-5713.

80. Lee J.F., Hesselberth J.R., Meyers L.A., Ellington A.D. Aptamer database. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. D95-100.

81. Hofland H.E., Masson C., Iginla S., Osetinsky I., Reddy J.A., Leamon C.P., Scherman D., Bessodes M., Wils P. Folate-targeted gene transfer in vivo. // Mol Ther. 2002. V. 5. №6. P. 739-744.

82. Wagner E., Cotten M., Foisner R., Birnstiel M.L. Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of poly cations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991. V. 88. №10. P. 4255-4259.

83. Mahato R.I., Takemura S., Akamatsu K., Nishikawa M., Takakura Y., Hashida M. Physicochemical and disposition characteristics of antisense oligonucleotides complexed with glycosylated poly(L-lysine). // Biochem Pharmacol. 1997. V. 53. №6. P. 887-895.

84. Choi Y.H., Liu F., Choi J.S., Kim S.W., Park J.S. Characterization of a targeted gene carrier, lactose-polyethylene glycol-grafted poly-L-lysine and its complex with plasmid DNA. // Hum Gene Ther. 1999. V. 10. №16. P. 2657-2665.

85. Puis R., Minchin R. Gene transfer and expression of a non-viral polycation-based vector in CD4+ cells. // Gene Ther. 1999. V. 6. №10. P. 1774-1778.

86. Reddy J.A., Dean D., Kennedy M.D., Low P.S. Optimization of folate-conjugated liposomal vectors for folate receptor-mediated gene therapy. // J Pharm Sci. 1999. V. 88. №11. P. 1112-1118.

87. Nishikawa M., Takemura S., Yamashita F., Takakura Y., Meijer D.K., Hashida M., Swart P.J. Pharmacokinetics and in vivo gene transfer of plasmid DNA complexed with mannosylated poly(L-lysine) in mice. // J Drug Target. 2000. V. 8. №1. P. 29-38.

88. Kim S.H., Jeong J.H., Мок H., Lee S.H., Kim S.W., Park T.G. Folate Receptor Targeted Delivery of Polyelectrolyte Complex Micelles Prepared from ODN-PEG-Folate Conjugate and Cationic Lipids. // Biotechnol Prog. 2007. V. 23. №1. P. 232237.

89. Benns J.M., Kim S.W. Tailoring new gene delivery designs for specific targets. // J Drug Target. 2000. V. 8. №1. P. 1-12.

90. Wu C.H., Sapozhnikov E., Wu G.Y. Evaluation of multicomponent non-viral vectors for liver directed gene delivery. // J Drug Target. 2002. V. 10. №2. P. 105111.

91. Gharwan H., Wightman L., Kircheis R., Wagner E., Zatloukal K. Nonviral gene transfer into fetal mouse livers (a comparison between the cationic polymer PEI and naked DNA). // Gene Ther. 2003. V. 10. №9. P. 810-817.

92. Basu S., Wickstrom E. Synthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake. // Bioconjug Chem. 1997. V. 8. №4. P. 481-488.

93. Rajur S.B., Roth C.M., Morgan J.R., Yarmush M.L. Covalent protein-oligonucleotide conjugates for efficient delivery of antisense molecules. // Bioconjug Chem. 1997. V. 8. №6. P. 935-940.

94. Mahat R.I., Monera O.D., Smith L.C., Rolland A. Peptide-based gene delivery. // Curr Opin Mol Ther. 1999. V. 1. №2. P. 226-243.

95. Стеценко Д.А., Арзуманов A.A., Коршун B.A., Гейт М.Д. Пептид-олигонуклеотидные конъюгаты как антисмысловые агенты нового поколения. // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. №6. С. 998-1006.

96. Manoharan М. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. №2. P. 103-128.

97. Зубин E.M., Романова E.A., Орецкая T.C. Современные методы синтеза олигонуклеотидопептидов. // Успехи химии. 2002. Т. 71. №3. С. 273-301.

98. Турутин Д.В., Зацепин Т.С., Тимченко М.А., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С. Ковалентное присоединение фактора транскрипции NF-kB к ДНК-лиганду, содержащему 2'-альдегидную группу. // Молекулярная биология. 2002. Т. 36. №5. С. 877-879.

99. Martin М.Е., Rice K.G. Peptide-guided gene delivery. // Aaps J. 2007. V. 9. №1. P. 18-29.

100. Tang M.X., Szoka F.C. The influence of polymer structure on the interactions of cationic polymers with DNA and morphology of the resulting complexes. // Gene Ther. 1997. V. 4. №8. P. 823-832.

101. Wadhwa M.S., Collard W.T., Adami R.C., McKenzie D.L., Rice K.G. Peptide-mediated gene delivery: influence of peptide structure on gene expression. // Bioconjug Chem. 1997. V. 8. №1. P. 81-88.

102. McKenzie D.L., Kwok K.Y., Rice K.G. A potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents. // J Biol Chem. 2000. V. 275. №14. P. 99709977.

103. El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. // J Control Release. 2004. V. 94. №1. P. 1-14.

104. Tiera M.J., Winnik F.O., Fernandes J.C. Synthetic and natural polycations for gene therapy: state of the art and new perspectives. // Curr Gene Ther. 2006. V. 6. №1. P. 59-71.

105. Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J., Mims M.P., Leland F.E., Woo S.L., Smith L.C. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. // Gene Ther. 1996. V. 3. №5. P. 448-457.

106. Plank C., Tang M.X., Wolfe A.R., Szoka F.C., Jr. Branched cationic peptides for gene delivery: role of type and number of cationic residues in formation and in vitro activity of DNA polyplexes. // Hum Gene Ther. 1999. V. 10. №2. P. 319-332.

107. Adami R.C., Collard W.T., Gupta S.A., Kwok K.Y., Bonadio J., Rice K.G. Stability of peptide-condensed plasmid DNA formulations. // J Pharm Sci. 1998. V. 87. №6. P. 678-683.

108. McKenzie D.L., Collard W.T., Rice K.G. Comparative gene transfer efficiency of low molecular weight polylysine DNA-condensing peptides. // J Pept Res. 1999. V. 54. №4. P. 311-318.

109. McKenzie D.L., Smiley E., Kwok K.Y., Rice K.G. Low molecular weight disulfide cross-linking peptides as nonviral gene delivery carriers. // Bioconjug Chem. 2000. V. 11. №6. P. 901-909.

110. Midoux P., Kichler A., Boutin V., Maurizot J.C., Monsigny M. Membrane permeabilization and efficient gene transfer by a peptide containing several histidines. // Bioconjug Chem. 1998. V. 9. №2. P. 260-267.

111. Pichon C., Goncalves C., Midoux P. Histidine-rich peptides and polymers for nucleic acids delivery. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 53. №1. P. 75-94.

112. Midoux P., LeCam E., Coulaud D., Delain E., Pichon C. Histidine containing peptides and polypeptides as nucleic acid vectors. // Somat Cell Mol Genet. 2002. V. 27. №1-6. P. 27-47.

113. Plank C., Oberhauser В., Mechtler K., Koch C., Wagner E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. // J Biol Chem. 1994. V. 269. №17. P. 12918-12924.

114. Ogris M., Carlisle R.C., Bettinger Т., Seymour L.W. Melittin enables efficient vesicular escape and enhanced nuclear access of nonviral gene delivery vectors. // J Biol Chem. 2001. V. 276. №50. P. 47550-47555.

115. Boeckle S., Wagner E., Ogris M. C- versus N-terminally linked melittin-polyethylenimine conjugates: the site of linkage strongly influences activity of DNA polyplexes. // J Gene Med. 2005. V. 7. №10. P. 1335-1347.

116. Boeckle S., Fahrmeir J., Roedl W., Ogris M., Wagner E. Melittin analogs with high lytic activity at endosomal pH enhance transfection with purified targeted PEI polyplexes. // J Control Release. 2006. V. 112. №2. P. 240-248.

117. Chen C.P., Kim J:S., Steenblock E., Liu D., Rice K.G. Gene transfer with poly-melittin peptides. // Bioconjug Chem. 2006. V. 17. №4. P. 1057-1062.

118. Ruben S., Perkins A., Purcell R., Joung K., Sia R., Burghoff R„ Haseltine W.A., Rosen C.A. Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus tat protein. // J Virol. 1989. V. 63. №1. P. 1-8.

119. Fawell S., Seery J., Daikh Y., Moore C., Chen L.L., Pepinsky В., Barsoum J. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. J J Proc Natl Acad Sci U S A. 1994. V. 91. №2. P. 664-668.

120. Vives E., Brodin P., Lebleu B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. // J Biol Chem. 1997. V. 272. №25. P. 16010-16017.

121. Rudolph C., Plank C., Lausier J., Schillinger U., Muller R.H., Rosenecker J. Oligomers of the arginine-rich motif of the HIV-1 TAT protein are capable of transferring plasmid DNA into cells. // J Biol Chem. 2003. V. 278. №13. P. 1141111418.

122. Vives E. Cellular uptake correction of utake. of the Tat peptide: an endocytosis mechanism following ionic interactions. // J Mol Recognit. 2003. V. 16. №5. P. 265271.

123. Brooks H., Lebleu В., Vives E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. // Adv Drug Deliv Rev. 2005. V. 57. №4. P. 559-577.

124. Derossi D., Chassaing G., Prochiantz A. Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery. // Trends Cell Biol. 1998. V. 8. №2. P. 84-87.

125. Deshayes S., Morris M.C., Divita G., Heitz F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62. №16. P. 1839-1849.

126. Pooga M., Hallbrink M., Zorko M., Langel U. Cell penetration by transportan. // Faseb J. 1998. V. 12. №1. P. 67-77.

127. Pooga M., Kut C., Kihlmark M., Hallbrink M., Fernaeus S., Raid R., Land Т., Hallberg E., Bartfai Т., Langel U. Cellular translocation of proteins by transportan. // Faseb J. 2001. V. 15. №8. P. 1451-1453.

128. Parente R.A., Nir S., Szoka F.C., Jr. Mechanism of leakage of phospholipidvesicle contents induced by the peptide GALA, // Biochemistry. 1990. V. 29. №37. P. 8720-8728.

129. Wyman T.B., Nicol F., Zelphati O., Scaria P.V., Plank C., Szoka F.C., Jr. Design, synthesis, and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers. // Biochemistry. 1997. V. 36. №10. P. 3008-3017.

130. Rittner K., Benavente A., Bompard-Sorlet A., Heitz F., Divita G., Brasseur R., Jacobs E. New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo. // Mol Ther. 2002. V. 5. №2. P. 104-114.

131. Kim J., Chen C.P., Rice K.G. The proteasome metabolizes peptide-mediated nonviral gene delivery systems. // Gene Ther. 2005. V. 12. №21. P. 1581-1590.

132. Gharakhanian E., Takahashi J., Kasamatsu H. The carboxyl 35 amino acids of SV40 Vp3 are essential for its nuclear accumulation. // Virology. 1987. V. 157. №2. P. 440-448.

133. Lyons R.H., Ferguson B.Q., Rosenberg M. Pentapeptide nuclear localization signal in adenovirus El a. // Mol Cell Biol. 1987. V. 7. №7. P. 2451-2456,

134. Dang C.V., Lee W.M. Identification of the human C-myc protein nuclear translocation signal. // Mol Cell Biol. 1988. V. 8. №10. P. 4048-4054.

135. Robbins J., Dilworth S.M., Laskey R.A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence. // Cell. 1991. V. 64. №3. P. 615-623.

136. Kleinschmidt J.A., Seiter A. Identification of domains involved in nuclear uptake and histone binding of protein N1 of Xenopus laevis. // Embo J. 1988. V. 7. №6. P. 1605-1614.

137. Kiefer P., Acland P., Pappin D., Peters G., Dickson C. Competition between nuclear localization and secretory signals determines the subcellular fate of a single CUG-initiated form of FGF3. //Embo J. 1994. V. 13. №17. P. 4126-4136.

138. Subramanian A., Ranganathan P., Diamond S.L. Nuclear targeting peptide scaffolds for lipofection of nondividing mammalian cells. // Nat Biotechnol. 1999. V. 17. №9. P. 873-877.

139. Collins L., Fabre J.W. A synthetic peptide vector system for optimal gene delivery to corneal endothelium. // J Gene Med. 2004. V. 6. №2. P. 185-194.

140. Schneider H., Harbottle R.P., Yokosaki Y., Kunde J., Sheppard D., Coutelle C. A novel peptide, PLAEIDGIELTY, for the targeting of alpha9betal-integrins. // FEBS Lett. 1998. V. 429. №3. P. 269-273.

141. McKay Т., Reynolds P., Jezzard S., Curiel D., Coutelle C. Secretin-mediated gene delivery, a specific targeting mechanism with potential for treatment of biliary and pancreatic disease in cystic fibrosis. // Mol Ther. 2002. V. 5. №4. P. 447-454.

142. Liu X, Tian P.K., Ju D.W., Zhang M.H., Yao M., Cao X.T., Gu J.R. Systemic genetic transfer of p21WAF-l and GM-CSF utilizing of a novel oligopeptide-based EGF receptor targeting polyplex. // Cancer Gene Ther. 2003. V. 10. №7. P. 529-539.

143. Zeng J., Too H.P., Ma Y., Luo E.S., Wang S. A synthetic peptide containing loop 4 of nerve growth factor for targeted gene delivery. // J Gene Med. 2004. V. 6. №11. p. 1247-1256.

144. White S.J., Nicklin S.A., Sawamura Т., Baker A.H. Identification of peptides that target the endothelial cell-specific LOX-1 receptor. // Hypertension. 2001. V. 37. №2 Part 2. P. 449-455.

145. Cotten M., Langle-Rouault F., Kirlappos H., Wagner E., Mechtler K., Zenke M., Beug H., Birnstiel M.L. Transferrin-polycation-mediated introduction of DNA into human leukemic cells: stimulation by agents that affect the survival of transfected

146. DNA or modulate transferrin receptor levels. // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87. №11. P. 4033-4037.

147. Cristiano R.J., Roth J.A. Epidermal growth factor mediated DNA delivery into lung cancer cells via the epidermal growth factor receptor. // Cancer Gene Ther. 1996. V. 3.№1.P.4-10.

148. Ivanova M.M, Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A., Sobolev A.S., Landa V., Naroditsky B.S., Ernst L.K. Receptor-mediated transport of foreign DNA into preimplantation mammalian embryos. // Mol Reprod Dev. 1999. V. 54. №2. P. 112-120.

149. Sobolev A.S., Jans D.A., Rosenkranz A.A. Targeted intracellular delivery of photosensitizers. // Prog Biophys Mol Biol. 2000. V. 73. №1. P. 51-90.

150. Chan C.K., Jans D.A. Enhancement of MSH receptor- and GAL4-mediated gene transfer by switching the nuclear import pathway. // Gene Ther. 2001. V. 8. №2. P. 166-171.

151. Li D., Yu H, Huang H., Shen F., Wu X., Li J., Wang J., Cao X., Wang Q, Tang G. FGF Receptor-mediated Gene Delivery using Ligands Coupled to Polyethylenimine. // J Biomater Appl. 2007. V. 22. №2. P. 163-180.

152. Wu G.Y., Wilson J.M., Shalaby F., Grossman M., Shafritz D.A, Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery in vivo. Partial correction of genetic analbuminemia inNagase rats. // J Biol Chem. 1991. V. 266. №22. P. 14338-14342.

153. Гороховец H.B, Дигтярь A.B., Луценко E.B, Луценко C.B, Макаров В.А, Посыпанова Г.А, Северин Е.С., Северин С.Е., Фельдман Н.Б.

154. Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина, его конъюгат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей. // Патент RU 2285537 С1. 2006.

155. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А. Изучение экспрессии рецептора AFP в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода // Иммунология. 2005. Т. 26. №2. С. 122-125.

156. Hsia J.C., Er S.S., Тап С.Т., Estes Т., Ruoslahti E. alpha-fetoprotein binding specificity for arachidonate, bilirubin, docosahexaenoate, and palmitate. A spin label study. // J Biol Chem. 1980. V. 255. №9. P. 4224-4227.

157. Mizejewski G.J. alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: relevance to domain and subdomain structure. // Proc Soc Exp Biol Med. 1997. V. 215. №4. P. 333-362.

158. Liao C.W., Hseu Т.Н., Hwang J. A target-specific chimeric toxin composed of epidermal growth factor and Pseudomonas exotoxin A with a deletion in its toxin-binding domain. //Appl Microbiol Biotechnol. 1995. V. 43. №3. P. 498-507.

159. Wels W., Moritz D., Schmidt M., Jeschke M., Hynes N.E., Groner B. Biotechnological and gene therapeutic strategies in cancer treatment. // Gene. 1995. V. 159. №1. P. 73-80.

160. Sosnowski B.A., Gonzalez A.M., Chandler L.A., Buechler Y.J., Pierce G.F., Baird A. Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor (FGF2). // J Biol Chem. 1996. V. 271. №52. P. 33647-33653.

161. Bridges A.J. The rationale and strategy used to develop a series of highly potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of tyrosine kinases. // Curr Med Chem. 1999. V. 6. №9. P. 825-843.

162. Komuves L.G., Feren A., Jones A.L., Fodor E. Expression of epidermal growth factor and its receptor in cirrhotic liver disease. // J Histochem Cytochem. 2000. V. 48. №6. P. 821-830.

163. Schmidt M., Vakalopoulou E., Schneider D.W., Wels W. Construction and functional characterization of scFv(14El)-ETA a novel, highly potent antibody-toxin specific for the EGF receptor. // Br J Cancer. 1997. V. 75. №11. P. 1575-1584.

164. Fominaya J., Uherek C., Wels W. A chimeric fusion protein containing transforming growth factor-alpha mediates gene transfer via binding- to the EGF receptor. // Gene Ther. 1998. V. 5. №4. P. 521-530.

165. Chan C.K., Senden Т., Jans D.A. Supramolecular structure and nuclear targeting efficiency determine the enhancement of transfection by modified polylysines. // Gene Ther. 2000. V. 7. №19. P. 1690-1697.

166. Magin-Lachmann C., Kotzamanis G., D'Aiuto L., Cooke H., Huxley C., Wagner E. In vitro and in vivo delivery of intact ВАС DNA comparison of different methods. // J Gene Med. 2004. V. 6. №2. P. 195-209.

167. Wagner E., Kircheis R., Walker G.F. Targeted nucleic acid delivery into tumors: new avenues for cancer therapy. // Biomed Pharmacother. 2004. V. 58. №3. P. 152161.

168. Hatefi A., Megeed Z., Ghandehari H. Recombinant polymer-protein fusion: a promising approach towards efficient and targeted gene delivery. // J Gene Med. 2006. V. 8. №4. P. 468-476.

169. Paul R.W., Weisser K.E., Loomis A., Sloane D.L., LaFoe D., Atkinson E.M., Overell R.W. Gene transfer using a novel fusion protein, GAL4/invasin. // Hum Gene Ther. 1997. V. 8. №10. P. 1253-1262.

170. Cristiano R.J. Targeted, non-viral gene delivery for cancer gene therapy. // Front Biosci. 1998. V. 3. P. D1161-1170.

171. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. №14. P. 2730-2736.

172. Morris M.C., Chaloin L., Mery J., Heitz F., Divita G. A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier. // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. №17. P. 3510-3517.

173. Cartier R., Reszka R. Utilization of synthetic peptides containing nuclear localization signals for nonviral gene transfer systems. // Gene Ther. 2002. V. 9. №3. P. 157-167.

174. Erbacher P., Zou S., Bettinger Т., Steffan A.M., Remy J.S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability. // Pharm Res. 1998. V. 15. №9. P. 1332-1339.

175. Lou Y.L., Peng Y.S., Chen B.H., Wang L.F., Leong K.W. Polyethylene imine)-g-chitosan using EX-810 as a spacer for nonviral gene delivery vectors. // J Biomed Mater Res A. 2008. V. P.

176. Veithen A., Raze D., Locht C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. // Int J Med Microbiol. 2000. V. 290. №4-5. P. 409-413.

177. Fominaya J., Wels W. Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system. // J Biol Chem. 1996. V. 271. №18. P. 10560-10568.

178. Uherek C., Fominaya J., Wels W. A modular DNA carrier protein based on the structure of diphtheria toxin mediates target cell-specific gene delivery. // J Biol Chem. 1998. V. 273. №15. P. 8835-8841.

179. Bremner K.H., Seymour L.W., Pouton C.W. Harnessing nuclear localization pathways for transgene delivery. // Curr Opin Mol Ther. 2001. V. 3. №2. P. 170-177.

180. Lechardeur D., Lukacs G.L. Intracellular barriers to non-viral gene transfer. // Curr Gene Ther. 2002. V. 2. №2. P. 183-194.

181. Young J.L., Benoit J.N., Dean D.A. Effect of a DNA nuclear targeting sequence on gene transfer and expression of plasmids in the intact vasculature. // Gene Ther. 2003. V. 10. №17. P. 1465-1470.

182. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. Intracellular routing of plasmid DNA during non-viral gene transfer. // Adv Drug Deliv Rev. 2005. V. 57. №5. P. 755-767.

183. Pouton C.W., Wagstaff K.M., Roth D.M., Moseley G.W., Jans D.A. Targeted delivery to the nucleus. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. №8. P. 698-717.

184. Allen T.D., Cronshaw J.M., Bagley S., Kiseleva E., Goldberg M.W. The nuclear pore complex: mediator of translocation between nucleus and cytoplasm. // J Cell Sci. 2000. V. 113 (Pt 10). P. 1651-1659.

185. Kiseleva E., Goldberg M.W., Cronshaw J., Allen T.D. The nuclear pore complex: structure, function, and dynamics. // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2000. V. 10. №1. P. 101-112.

186. Chan C.K., Jans D.A. Using nuclear targeting signals to enhance non-viral gene transfer. // Immunol Cell Biol. 2002. V. 80. №2. P. 119-130.

187. Escriou V., Carriere M., Scherman D., Wils P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. // Adv Drug Deliv Rev. 2003. V. 55. №2. P. 295306.

188. Nair R., Carter P., Rost B. NLSdb: database of nuclear localization signals. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. №1. P. 397-399.

189. Collas P., Alestrom P. Nuclear localization signals: a driving force for nuclear transport of plasmid DNA in zebrafish. // Biochem Cell Biol. 1997. V. 75. №5. P. -633-640.

190. Bottger M., Zaitsev S.V., Otto A., Haberland A., Vorob'ev V.I. Acid nuclear extracts as mediators of gene transfer and expression. // Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1395. №1. P. 78-87.

191. Wagstaff K.M., Glover D.J., Tremethick D.J., Jans D.A. Histone-mediated transduction as an efficient means for gene delivery. // Mol Ther. 2007. V. 15. №4. P. 721-731.

192. Wagstaff K.M., Fan J.Y., De Jesus M.A., Tremethick D.J., Jans D.A. Efficient gene delivery using reconstituted chromatin enhanced for nuclear targeting. // Faseb J. 2008. V. 22. №7. P. 2232-2242.

193. Simonsson T. G-quadruplex DNA structures—variations on a theme. // Biol Chem. 2001. V. 382. №4. P. 621-628.

194. Schaffitzel C., Berger I., Postberg J., Hanes J., Lipps H.J., Pluckthun A. In vitro generated antibodies specific for telomeric guanine-quadruplex DNA react with Stylonychia lemnae macronuclei. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98. №15. P.8572-8577.

195. Paeschke К, Simonsson T, Postberg J, Rhodes D., Lipps H.J. Telomere end-binding proteins control the formation of G-quadruplex DNA structures in vivo. // Nat Struct Mol Biol. 2005. V. 12. №10. P. 847-854.

196. Usdin K. NGG-triplet repeats form similar intrastrand structures: implications for the triplet expansion diseases. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. №17. P. 40784085.

197. Simonsson T. The human TINF2 gene organisation and chromosomal localization. // Biochimie. 2001. V. 83. №5. P. 433-435.

198. Wright W.E, Tesmer V.M., Huffman K.E, Levene S.D., Shay J.W. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. // Genes Dev. 1997. V. 11. №21. P. 2801-2809.

199. Siddiqui-Jain A, Grand C.L, Bearss D.J., Harley L.H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress cMyc transcription. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99. P. 11593-11598.

200. Wittung P, Nielsen P.E, Buchardt O, Egholm M, Norden B. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. // Nature. 1994. V. 368. №6471. P. 561-563.

201. Анцыпович И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002. Т. 71. №1. С. 81-96.

202. King D.J, Bassett S.E, Li X, Fennewald S.A, Herzog N.K, Luxon B.A, Shope R, Gorenstein D.G. Combinatorial selection and binding of phosphorothioate aptamers targeting human NF-kappa В RelA(p65) and p50. // Biochemistry. 2002. V. 41. №30. P. 9696-9706.

203. Tasset D.M, Kubik M.F, Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. // J Mol Biol. 1997. V. 272. №5. P. 688-698.

204. Малахов А.Д, Коршун B.A, Берлин Ю.А. Синтез и флуоресцентныесвойства олигонуклеотидов, содержащих новую флуоресцентную метку п-(2-бензоксазолил)толан // Биоорг. химия. 2001. Т. 27. №6. С. 462-465.

205. Стрелецкий А.В., Козлова А.Ю., Есипов Д.С., Каюшин А.Л., Коростелева М.Д., Есипов С.Е. Определение молекулярных масс олигонуклеотидов методом MS-MALDI. // Биоорг. химия. 2005. Т. 31. №2. С. 151-158.

206. Balagurumoorthy P., Brahmachari S.K., Mohanty D., Bansal M., Sasisekharan V. Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences. // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. №15. P. 4061-4067.

207. Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y., Bystrom S.L., Graves M.H. Realtime multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. // J Clin Microbiol. 2004. V. 42. №3. P. 1290-1293.

208. Ram S., Shanker R. Computing TaqMan probes for multiplex PCR detection of E. coli 0157 serotypes in water. // Silico Biol. 2005. V. 5. №5-6. P. 499-504.

209. Tsourkas A., Behlke M.A., Bao G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. №19. P. 4208-4215.

210. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. // Clin Chim Acta. 2006. V. 363. №1-2. P. 48-60.

211. Dubey I., Pratviel G., Meunier B. Modification of the thiourea linkage of a fluorescein-oligonucleotide conjugate to a guanidinium motif during ammonia deprotection. // Bioconjug Chem. 1998. V. 9. №5. P. 627-632.

212. Dimroth K., Wolf K.H. Aromatic compounds from pyrylium salts. // Newer Methods of Preparative Organic Chemistry, Academic Press, New York,. 1964. V. 3. P. 357.

213. Katritzky A.R. Conversions of Primary Amino Groups into Other Functionality Mediated by Pyrylium Salts. // Tetrahedron. 1980. V. 36. №6. P. 679-699.

214. Potts K.T., Robinson R. Synthetical experiments related to the indole alkaloids. // J Chem Soc. 1955. V. P. 2675 2686.

215. Hensel H.R. Dialkylamino-Basen von Benzopyranen und Xanthenen. // Justus Liebigs Ann Chem 1958. V. 611. №1. P. 97-104.

216. Эльдерфилд P. Гетероциклические соединения. // "Иностранная Литература", Москва. 1954. Т. 2. С. 394.

217. Carpenter G., Cohen S. Epidermal growth factor. // Annu Rev Biochem. 1979. V.48.P. 193-216.

218. Hommel U., Harvey T.S., Driscoll P.C., Campbell I.D. Human epidermal growth factor. High resolution solution structure and comparison with human transforming growth factor alpha. // J Mol Biol. 1992. V. 227. №1. P. 271-282.

219. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Enhancement of drug sensitivity of human malignancies by epidermal growth factor. // Br J Cancer. 1995. V. 72. №3. P. 615-619.

220. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K., Bunn H.F. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87. №7. P. 2725-2729.

221. Murphy L.D., Herzoo C.E., Rudick J.B., Fojo A.T., Bates S.E. Use of polymerase chain reaction in the quantitation of mdrl gene expression. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 10351-10375.

222. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H., Birnstiel M.L. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1990. V. 87. №9. P. 3410-3414.

223. Epaulard O., Derouazi M., Margerit C., Marlu R., Filopon D., Polack В., Toussaint B. Optimization of a type III secretion system-based Pseudomonas aeruginosa live vector for antigen delivery. // Clin Vaccine Immunol. 2008. V. 15. №2. P. 308-313.

224. Rhie G.E., Jung H.M., Park J., Kim B.S., Mekalanos J.J. Construction of cholera toxin В subunit-producing Vibrio cholerae strains using the Mariner-FRT transposon delivery system. //FEMS Immunol Med Microbiol. 2008. V. 52. №1. P. 23-28.

225. Spano S., Ugalde J.E., Galan J.E. Delivery of a Salmonella Typhi exotoxin from a host intracellular compartment. // Cell Host Microbe. 2008. V. 3. №1. P. 30-38.

226. Karp M., Lindqvist C., Nissinen R., Wahlbeck S., Akerman K., Oker-Blom C. Identification of biotinylated molecules using a baculovirus-expressed luciferase-streptavidin fusion protein. // Biotechniques. 1996. V. 20. №3. P. 452-456, 458-459.

227. Ma X., Zheng W., Wang Т., Wei D., Ma Y. Optimization and high-level expression of a functional GST-tagged rHLT-B in Escherichia coli and GM1 binding ability of purified rHLT-B. // J Microbiol. 2006. V. 44. №3. P. 293-300.

228. Veerman A.J., Pieters R. Drug sensitivity assays in leukaemia and lymphoma. // Br J Haematol. 1990. V. 74. №4. P. 381-384.

229. Sun D., Thompson В., Cathers B.E., Salazar M., Kerwin S.M., Trent J.O., Jenkins T.C., Neidle S., Hurley L.H. Inhibition of human telomerase by a G-quadruplex-interactive compound. // J Med Chem. 1997. V. 40. №14. P. 2113-2116.

230. Berkers J.A., van Bergen en Henegouwen P.M., Boonstra J. Three classes of epidermal growth factor receptors on HeLa cells. // J Biol Chem. 1991. V. 266. №2. P. 922-927.

231. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molecular manifestations and molecular determinants of telomere capping. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. P. 253-263.

232. Timofeev A.M., Borovkova T.V., Akhlynina T.V., Nydenova N.M., Grineva N.I. Binding features of BCL2-targeted oligodeoxynucleotides with K562 cells. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V. 23. №6-7. P. 943-951.

233. Yoshina-Ishii С., Boxer S.G. Arrays of mobile tethered vesicles on supported lipid bilayers. // J Am Chem Soc. 2003. V. 125. №13. P. 3696-3697.

234. Yoshina-Ishii C., Miller G.P., Kraft M.L., Kool E.T., Boxer S.G. General method for modification of liposomes for encoded assembly on supported bilayers. // J Am Chem Soc. 2005. V. 127. №5. P. 1356-1357.

235. Chang-Cheng Y., Chompoosora A., Rotello V.M. The biomacromolecule-nanopartiele interface. //Nanotoday. 2007. V. 2. №3. P. 34-43.

236. Stanlis K.K., Mcintosh J.R. Single-strand DNA aptamers as probes for protein localization in cells. // J Histochem Cytochem. 2003. V. 51. №6. P. 797-808.

237. Бергер В., Беккер X., P. Б. Органикум. Практикум по органической химии. // "Наука". Москва. 1979. Т. 2. С. 353-377.

238. Vet J., Marras S. // In Oligonucleotide synthesis: Methods and Applications Humana Press, TotowaN J Ed Herdewijn P. 2004. V. 288. P. 273-290.