Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интернализация и внутриклеточный процессинг рецепторов ростовых факторов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Интернализация и внутриклеточный процессинг рецепторов ростовых факторов"

«в

ИНСТИТУТ цитологии российской академии наук

На правах рукописи

ДЬЯКОНОВА Мария Юрьевна

ИНТЕРНАЛИЗАЦНЯ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ПРОЦЕССИНГ РЕЦЕПТОРОВ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург

1993

Работа выполнена в Институте цитология РАН.

Научные руководители — доктор биологических наук, академии И. Н. Никольский; доктор биологических наук Я. Ю. Комиссарчик.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Г. Булычев; кандидат биологических наук А. Д. Харазова.

Ведущее учреждение: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Защита состоится « июня 1993 г.

п . /2> часов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «

мая 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор биологических наук Л. Н. Писарева

1

(£) — Институт цитологии РАН

i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ , •

Актуальность проблемы: Одно из центральных мест в клеточной биологии занимает исследование механизмов, регулирующих рост и размножение клеток. Особое внимание исследователей привлекает действие Факторов роста - белков, которые специфически стимулируют синтез ДНК и пролиферацию клеток.' Механизм действия Факторов роста активно изучается в последние года, тем не менее он остается недостаточно ясным. Следует отметить, что большая часть работ в этой области проводится in vitro, и обнаруживаемые закономерности не всегда точно соответствуют процессам, происходящим в клетке. В связи с этим нам представляется • важным проведение иммунно-морфологических исследований йа световом и электронно-микроскопическом уровне, позволяющих изучить локализацию белков, участвующих в передаче митогэиного сигнала.

Наиболее изученным Фактором роста является эпидермальный Фактор роста (ЭФР). Взаимодействие ЭФР с клеткой осуществляется через высоко специфичные рецепторы на плазматической мембране. Рецептор. ЭФР - белок 170 кДа с внешним лиганд-связывающим доменом, гидрофобной трансмембранной частью и внутриклеточным доменом, обладающим тирозинкиназной активностью. Протеинкиназа рецептора способна как к ФосФорилированию самого рецептора (автоФосФорилированиэ), так и к ФосФорилированию внутриклеточных субстратов. Поиск белков, которые фосфорилируктгся рецептором после его активации ЭФР и, вероятно, участвуют в процессе передачи сигнала является приоритетной задачей современной молекулярной и клеточной биологии.

Взаимодействие ЭФР с клеткой не ограничивается связыванием с рецептором на плазматической мембране. ЭФР поступает внутрь клетки с помощью механизма рецэпггор-Ьпосредованного эндоцитоза. Существуют различный точки зрения па роль эндоцитоза. Согласно одной из них, процесс эндоцитоза является частью негативно регулируемого механизма обратной' связи и. служит длн удаления активных рецепторов с поверхности клеток. По другой точке зрения, именно интерна лизованныэ рецепторы,. перемещаясь внутри клетки и взаимодействуя с различными субстратами, могут выполнять Функцию переноса стимулирующего сигнала с плазматической моибраны в ядро.

Для выяснения обидах закономерностей действия ростовых Факторов интересным и важным является сравнение интернализации и процэссинга различных Факторов роста. Поэтому в данной работе изучался та только процэссинг ЭфР.но и менее изученного Фактора роста, выделяемого тромбовдсгами (ФРТ).

Цели и задачи исследования: 1.Подучить .электронно-микроскопические (ЭМ) доказательства возмошости использования моноклональных антител (моноАТ) к рецептору ЭФР для изучения интернализации ЭФР-Р комплексов (ЭфР-РК). Провести ишунноцитохимическое исследование зндодигоза ЭФР-Р в клэтках А431

2.Оценить уровень спонтанного зндоцитоза в клетках А431 на электронно-микроскопическом уровне.

3.Изучить действие примаквина на рециклирование ЭФР-рецэпторных комплексов методой непрямой иммунноФлуоресцзнции.

4.Исследовать зависимость интернализации рецептора от его струотуры на примере рецептора ФРТ.

Б. Изучить внутриклеточную локализацию фосфолйшзы Cyl субстрата Фоорорилирования ЭФР-Р.

Научная новизна работы. Показан путь юггернализовашшго ЭФР-Р в клетках А431 на ЭМ уровне с помощью коньюгатов ,коллоидного золота с моноАТ к ЭФР-Р. Показано, что используемые моноАТ 5А9, являясь маркерами шпврнализованного рецептора, не влияют на связывание лиганда и процэссинг ЭФР-рецзигорных комплексов.

Представленное иммунвоцигохимическое исследование улътракриосрезов говорит о возможности использования этого иотода для изучения интернализации ЭФР-Р.

Обнаружено, что для клеток А431 характерен высокий уровень спонтанного конститутивного эпдоцигоза.

Показано, что лизосомотрошый амин примаквш частично ингибмрует рециклирование ЭФР-РК.

Изучение зндоцитоза нормального и мутантного рецепторов ФРТ позволило сделать вывод о важной роли .внутриклеточного домена реиэнгора душ лигавд-зависимоа интернализации.

Впервые показана внутриклеточная локализация фосфолшэзы Cyl на ЭМ уровне. Обнаружена ко-локализация ФЛ Cyl с ЭФР-Р на плазматической мембрана. При действии ЭФР происходит совместное

перераспределения этих белков. Впервые показана ко-локализация ФЛ СУ1 и ЭФР-Р в зндосомах- клеток А431 посла действия ЭФР.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные об интернализации и внутриклеточном процэссинга рэцзгггоров ЭФР и ФРТ необходимы для понимания механизмов Функционирования эндосомальиого аппарата клетки.

Подученные данные о ко-локализации ФЛ Су1 и ЭФР-Р на плазматической мембране и в зндосомах важны для понимания механизма передачи сигнала, регулирующего клеточную пролиферацию.

Используемые в работе методические приемы, в особенности иммуннозлектронно-микроскопическое исследование, могут быть успешно применены для исследования внутриклеточной локализации многих биологически активных веществ.

Примаквин используется в качестве противомалярийного препарата. Полученные данные по его действию на процэссинг рецэптора ЭФР необходимо учитывать при использовании примаквина в практических целях.

Апробация работы.Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Функциональная мордоУлогия клетки" (С.-Петербург,1991) и на Международной конференции "Клеточные программы роста, диФФеренцировки и неоплазии" (Хельсинки, Финляндия,1992).

Публикации.По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объём работы. Диссертация . изложена на /¿Ы? страницах машинописного текста, состоот- из введения, обзора литература, описания, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, состоящего • из2Х& наименований. Материалы диссертации иллюстрированы рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культивирование клотогс А431.

Клетки эпвдэрмлльной карциномы человека А431 были получены из Банка клеточных культур <МЩ РАН „ С.-Петербург). Клетки культивировали в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крушого рогатого скота в СО^-инкубаторо при +37°С.

2. адвйтрошо-мшфоскопшескш исследования.

2.1. Изучений ультраструктуры клеток А431.

Клетки А431 сеяли на покровные стекла. Через 48 ч , когда метай достигали состояния субконфлюента, покровные стекла переносили в рабочую среду (PC), содержащую среду Игла, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 20 мМ hepes, рН 7.3. В ряде случаев в PC добавляли ЭФР(100 нг/мл), полученный в наша лаборатории (Соркиа и др., 1989 ). Клетки Фиксировали 3% забуФвреяным глютаральдегидом и постфиксировали 1% 0е04, растворенным в том т буфера.заливали в смесь Эпона с Аралдитом по стандартной методика.

2.2. Иммуннозлектронно-мшфоскопическое исследование интернали-зации ЭФР-Р в клетках А431.

Коллоидное золото получали по методу Слота и Гита (Slot and СеигоДЭОб) .Коньюгаты моноАТ с золотом (AT-аолрто) получали ПО катоду ЛЙКОКа И Роса (Lucocq and RothJ385). МоноАТ 5А9 были получены (Сорокин и др., 1989) и ааддано очищены в нашей лаборатории. К покровным стоклам с клетками А431 поело промывют РО добавляли АТ-золото. Клётки инкубировали .1 ч при +4°С, затем ^часть стекол Фиксировали, а . часть - Фиксировали посла дополнительной инкубации в теплой среде в течении .часа при +37°С. Для запуска эндоцитоза в среду добавляли ЭФР (100 нг/мл), затем стекла с клетками нагревали до +37°С 1 мин,30 мин или 2 ч, посла чего Фиксировали для ЭМ исследовании как описано .выше. Б качество контроля вместо антител клетки инкубировали в растворе 10% сыворотки.

2.3. Изучат© криосрезов клзгок А431.

Клетки А431 выращивали на пластиковых Флаконах и брали в эксперимент через 48 часов после посева. К части клеток добавляли ЭФР(100 нг/мл) на 1 мин. Клетки снимали с пластика смесью трипсина с версеном, центрифугировали. Б мин при 1000 об/мин, промывали фосфэтным буфером (рН 7,4) и Фиксировали сие сью А% раствора парФормальдегвда с 0,04% раствором глутаральдэгида. Затем осадок клеток замораживали по . стандарггной методике и- получали ультракриосрезы

(Токи*авидЭ73). Часть сеточек со срезами окрашивали ПО( методу Токуяши (TokurавиДэвв) полинлональными антителами к ЭФР-Р (полученными- ИЗ лаборатории Dr.Carpenter), ЧЭСТЬ полинлональными антителами к ФЛ Су1 (так ие полученными из лаборатории Br.birpenter), ЧаСТЬ - ИНКубИроваЛИ В 1055 СЫВОрОТОЭ (контрольные сеточки) в течении 1 часа или в течении ночи. В качестве' вторых антител использовали коныогат 6 нм золота с КОЗЬИМИ антителами против кроличьих (Amereham). ДЛЯ морфологического анализа часть сеточек антителами не окрашивали.

17е}

3. Эксперименты с радиоактивным производным ЗФР - i-ЭФР и

коньюгатом коллоидного золота с моноАТ.

Клетки А431 сеяли на 24-луночную плату в концентрации ZOO

тыс. клеток на лунку.Через 48 ч клетки, достигшие состояния

1

монослоя, инкубировали в РС, содержащей 30 ж/ил i-ЭФР в течении 1 ч при +4°С.причем часть лунок инкубировали только с 125-г~ЭФР, в часть добавляли также 250HM моноАТ с коллоидным золотом,. а в часть - 50 нМ. моноАТ с золотом. Затем клзтки переносили в +37°С на 50 мин.Клетки промывали £ раза холодной РС и помещали в 0,2 М натрий - ацэтатныа буфер, рН 4.5 (НАБ) при +4°С на 2 мин для удаления поверхностно-связанного i-ЭФР. Двухмшутная обработка повторялась дважды, обе кислотные отмывки смешивали и использовали для измерения

1 рк

количества i-ЭФР, ассоциированного с плазматической

мембраной. Затем клетки солюбилизировали в. 1М наОН. Таким

образом с каждой ячейки определяли два параметра: количество

^ i-ЭФР на плазматической мембране и .количество • 1

внутриклеточного х-ЭФР.

ИммунноФлуоресцзнтное ' (ИФ) изучение действия примаквина на зндоцитоз ЭФР-Р в клетках А431.

К клеткам, выращенным на покровных стеклах, добавляли в РС ЭФР (100 нг/мл) одновременно с моноАТ к ЭФР-Р 5А9. Клетки инкубировали 1ч при Д°С, затем часть ( покровных стекол Фиксировали, а часть инкубировали при 37°С 0,5-1 ч без ЭФР и антител. В ряде экспериментов добавляли примаквин <sigua) в концентрации 0,3 мМ, часть стёкол затем отмывали от примаквина

в среде Игла с 10% содержанием сыворотки крупного рогатого скота .при 37°С в течения 1ч. Затем некоторые стекла посла промывки Фиксировали, некоторые - обрабатывали НАБ 'при 4°С в течение 3 мин для смывки ЭФР с поверхности клеток, а затем переносили в PC (с добавлением ЭФР или в его отсутствие) на Зч. Часть клеток инкубировали при 37°С, часть -при комнатной температуре • в атмоотере С0?.В ряда экспериментов на 3 ч добавляли 0,3 мМ примаквин. Клетки Фиксировали 4% Формалином в течение 10 мш, затем инкубировали 15 мин в PC с о,г% сапонином (Негк) и окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с флуорэсдентакм красителем Техав-1чк1 (Sigma). В качестве контроля к клеткам вместо моноАТ добавляли PC с 10Ж содерканивм сыворотки крупного рогатого скота.

б. Изучение штернализзции нормального и мутантного ФРТ-Р методами непрямой иммуннофлуорэсцэнции (НИФ) и с помощью 1251-ФРХ. . '

Опыты проводили на эпителиальных . клетках . яичника китайского хомячка СНО, ' полученных от доктора Хелдина

(C.-H-Heldln; Ludwig Institute for Cancer Research, Sweden), В

норме не имеющих рэцегтгора ФРТ и трансФицированных геном этого ^рецзптора. У некоторых из таких клеток зкспрессировался нормальный рецзптор {клетки СНО wt), у других - мутантнын рецзпггор с неизмененными зкстрацэллюлярной и трансмвмбранными доменами и почти полностью отсутствующим цигоплазматическим доменом (клетки СНО кем). Клетки культивировали в среде И2 с добавлением 10% эмбриональной коровьей сыворотки в С02-инкубаторе при 37°С на покровных стёклах. Через 48 ч, когда клетки достигали. состояния" субконФЛюента„ покровные стекла шрэносили в PC.Рокомбинантный ФРГ, очшщзнныа из зкспрессионной системы Saccharomycee cerevieiae И охарактеризованный В лаборатории доктора Хелдина (dstman et аьдэвв), ' добавляли к клеткам СНО - wt в концзнтрацки 100 нг/мл и к клеткам СНО всти в концентрации 300 нг/мл на 30 мин или на 2 ч. При этом клетки инкубировали в С02-иш;убаторэ при +3?°С,. В ряда экспериментов через Б мин после инкубацйи с ФРГ к клеткам добавляли хлороквин С'од мМ; sigma) на 30 мин или на 2 ч.Клетки Фиксировали 4%-ным ■ Формалином в течении 10 мин, затем инкубировали 15 иин в PC с

в

сапонином ( 0,2 % Merck), окрашивали мышиными монокло^альными антителами к рэцэпгору ФРТ В2, полученными и охарактеризованными в лаборатории доктора Хедцина при использовании очищенного свиного рецзптора ФРТ как антигена (Ronnatrarid et al-ДШВ) ЭТИ анТИТЭЛа СВЯЗЫВаюТСЯ С экстрацеллюлярной частью рецептора. В качестве вторых антител использовали овечьи антитела против мышиных, коньюгированные с Флуоресцентным красителем Texas-red (Sigma). ЭКСТОримеНТЫ ПО взаимодействию i-ФРТ с клетками проводили следующим образом. Клетки.высевали в пластиковые чашки, через 48 ч промывали PC и инкубировали при *37°С в PC, содержании 2 нг/мл 125г-ФРГ. По окончании инкубации клетки промывали 5 раз холодной PC. Для определения количества связанного с рецептором радиоактивного лигаяда чашки обрабатывали 0,2 М уксусной кислотой с 0,5 М HaCi, i« 2,7 в течении 5 мин на льду и быстро промывали тем же раствором, радиоактивность обеих промывок суммировали. Для определения количества интернализированвого " комплекса i-ФРТ-рзцэптор клетки после промывки холодной PC солюбилизировали в среде, содержавши 1 % Тритона х-юо, 10 % глицерина и 20 мМ hkpbs при 37°0 в течении 30 мин Скорость интернализации 'определяли как отношение интернализированного лиганда к поверхностно-связанному. В качестве контрольных экспериментов проводили инкубацию с 1251-ФРТ клеток СНО, не трансФвцированных геном рецептора. Полученные в ■ контроле значения радиоактивности вычитали из значений, полученных для клеток CHO-wt и сно-кст.

6. Изучение локализации фосфолипззы Су1 методом непрямой двойной иммуноФлуоресцэнции.

К клеткам А431, выращенным на покровных стёклах, добавляли ЭРР (80 нг/мл) на 1-5 мин. В ряде" случаев ЗФР не добавлялся. ' После промывки клетки Фиксировали 0,25% раствором акролеина на фосфатном буфере в течении 10 мин, после чего 5 мин обрабатывали 0,5% раствором детергента Triton-Х-юо, I Часть стекол обрабатывали смесью ташпслональнш антител к ФЛ Су1 и ' моноклональных антител к ЭФР-Р 2Е9 (полученными в лаборатории Pr-Boonstra) в течении 1 ч. Часть стекол такое же время инкубировали в 10% сыворотке в качестве контроля. Посла

промывок все стекла инкубировали в течении часа в смеси вторичных антител : обвзьяних против кроличьих, коньюпарованных с Флуоресцентным красителем rrrc, и ослиных против мышиных, коныогированных с другим флуоресцентным красителем - тюте.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.ашктронно-микроскопичэскоэ изучение эндоцитоза ЭфР-Р в клетках А431

До иммушоцитохшичвского изучения процесса интернализации ЭФР-РК нами было проведено электронно-микроскопическое (ЭМ) изучение морфологии клеток А431. На электронных микрофотографиях можно щэнтифицировать структуры зндосомального аппарата г- ранние зндосомы, мультивезикулярные тела (МВТ) с внутренними мелкими пузырьками, ранние и поздние лизосомы, содержащие миелиновые структуры. МВТ, так же как и аппарат Гольдки, часто локализованы в трицентриолярной зоне рядом с клеточным ядром. На криосрезах клеток А431, инкубированных с ЭФР в течении 1 мин с моноАТ к' ЭФР-Р, мы обнаруживали золото в ранних звдосомах на периферии клеток, а такие в тубулярных выростах этих эндосом. Морфология клэток, ^полученных нами в результате криоФиксации, была вполне удовлетворительна дая идентификации внутриклеточных щембранных структур. О другой стороны, эти срезы специфически окрашивались . полжслональными антителами к ЭфР-Р, что говорит о сохранении

последним антигенных свойств. % *

3.Кммунноцитохимическое исследование интернализации и последующей судьбы комшвксов ЭФР-Р-анпггела -золото. <AT-золото). "

Наш ¿ыли получены коныогаты моноклональных антител 5А9 с частицами коллоидного золота размером 10 нм' (АТ-золото). С помощью мы показали, что ни одна из концентраций

АТ-золото не препятствует ни связывании ЭФР с рецептором, вд процессу интернализации, ни рециклированию ЭФР-Р. Для максимального'связывания AT с рецептором клетки инкубировали с АТ^золотом в течении часа при +4°С. Данная температура не .мешает связыванию ЭФР или AT- с рецептором, но препятствует

интерналиэации. На ЭМ уровне:мы наблюдали частички коллоидного золота на Ш и особенно на довольно многочисленных складках мембраны и на микроворсинках. Для запуска эндоцитоза клетки А431, после 1 часа инкубации с АТ-золотом при +4°С, переносили в теплую среду с ЭФР. Если клетки Фиксировали через 1 мин, то на ЭМ уровне мы наблюдали начальные этапы эндоцитоза: кластеризацию рецептора в группы на ИМ, его перемещение в окаймленные ямки и ранние эндосомы. Кроме того, иногда можно было наблюдать частицу коллоидного золота в эндосомах на периферии клетки и на ПМ одаовременно. Если клатки Фиксировали через 30 минут после добавления ЭФР, то коллоидное золото в основном наблюдали в МВТ в районе аппарата Гольдаи, в непосредственной близости от ядра. Кроме того, на этой временной точке мы наблюдали наличие частиц золота на ПМ, что может говорить о рециклировании интерлализованных комплексов на поверхность клетки.Черэз 2 часа инкубации клеток с ЭФР колдоидаое золото визуализировалось в основном в лизосомах, часто находящихся в даринуклеарной зоне, хотя частицы АТ золота можно увидеть также и в МВТ и на ПМ, причем часто одновременно в одной клетке, что говорит о том, что рециклирование комплексов сохраняется в течении 2-х часов инкубации с ЭФР.

В последнее время проблема спонтанного, конститутивного зндоцгоза широко обсуждается, так как все шире применяются рзцопторные мутанты, но данные, получаемые с их помощью, противоречивы. Это может быть объяснено тем', что не все авторы учитывают скорость спонтанной интернаяизации, что накладывает свои отдачаток и на оценку' скорости лиганд-иядуцированного эндоцитоза.В задачу данного исследования входило изучение сронтанной, лиганд-независимой интернализацш. Для этого клетки А431, после связывания АТ-золото с рецептором при +4°С (эта температура ингибирует интернализацию, во не препятствует связыванию с лигандом), переносили в теплую среду и Инкубировали 1 час при +37°С. На ультратонких срезах мы могли ■раОлюдать практически все стадии эндоцитоза: наличие частиц золота на ПМ, его интернализацию через неокаймленныв ямки,иногда можно было видать достаточно длинный эндоцитознын канал. На щриФерии клеток визуализировались ранние эндосомы, содержащие золото. Причём иногда частицы коллоидного золота

располагались в тубулярных ответвлениях эндосом. В той же самой клетке можно было наати и МВТ с комлгжсами АТ-золота, связанными с внутренними везикулами. Наконец, выявлялись структуры последней, стадии эндоцитоза-лизосомы. В этом случае, вероятно, целостность АТ-золото комплексов уже была нарушена, и коллоидные частицы обычао_ были агрегированы в группы внутри лизосом. Основываясь на литературных и на собственных данных мы сделали вывод о том, тго в отсутствии ЭФР в клетках А431 существует -достаточно высокий ' уровень спонтанной, конститутивной материализации.

_ 3.Изучение влияния примаквина на эндодит'оз ЭФР-Р в клетках А431 В данном разделе работы показано ингибирующее действие примаквина на рециклирование ЭФР-Р. Ранее в. нашей лаборатории, было продемонстрировало, что в' клетках А431 ЭФР после шггернализации способен либо деградировать в лизосомах, либо рециклировать на поверхность в связанном с рецептором состояний (БогМп аидээд. Но где, на каг.ом этапа происходит

разделение этих путей, какйе органвлли клеток в нем участвуют -

' остается неясным. Для выяснения этого вопроса используются различные ингибиторы- эдцоцитоза. В данной работе нас интересовало действие примаквина. Ранее было показано, что при инкубации клеток А431 с 100-200 нг/мл ЭФР, коныогированным с родамином, в течение 1ч при 4°С наблюдается типичная картина диффузного распределения ЭФР в клетках А431- "светящиеся края" (Никольский и др. ,1087). Такие' же картины наблюдаются при инкубации клеток при тех к;е условиях с ЭФР и моноАТ к рецептору.Через 0,5-1 ч после • переноса клеток в 37°0 можно-наблюдать скопление эндосом в околоядерноа зоне, в районе аппарата Гольдам. Этот район ввден как сввтяшэвся "пятно",состоящее из тесно расположенных пузырьков, при этом свечение мембраны уменьшается (так как большая часть ЭФР-Р интернализуется).Если к клеткам на этапе инкубации при 37°С добавить 0,3 мМ примаквин, то через 1 ч клетки сильно изменяли свою морфологию, они округлялись, появлялись вытянутые отростки. В этих метках наблюдали компактные ярко-светящиеся "пятна" в районе ядра, отличающиеся от выше описанной локализации ЭФР-Р, в околоядерной зоне. Эффокт примаквина

ю

обратим : если клетки после 1ч инкубэцш с этим лизосомотрогпмм агентом отмывали в 10% сыворотка в течение того же времени, то клетки восстанавливали свою морфологию и характер свечения. Были проведаны эксперименты с длительной <3 ч) инкубацией клеток после обработки НАБ для смывания ЭФР с плазматической мембраны. Если инкубацию проводили при 37°С, то наблюдали свечение краев клетки, 'пятно" исчезало, что свидетельствовало о рециклировании ЭФР-Р на плазматическую мембрану. Если 3-х часовую инкубацию проводили в присутствии ЭФР, то выявлялась характерная для клеток А431 локализация рецепторных комплексов в околоядерноя зоне, аналогичная описанной выше, . что можно объясиить продолжающейся интеряализациеи ЭФР-Р и реинтернзлизациеа рециклированных ЭФР-Р. Если инкубация проводилась при 37°С в присутствии 0,3 мМ примаквина и без ЭФР, то выявлялось свечение околоядеряой зопы.Был проведен ряд экспериментов по аналогичной схеме, но при комнатной температуре в атмосфере СО^. Известно, что при комнатной температуре не происходит рециклирования ЗФР-РК. Как в присутствии ЭФР, так и без него, в клетках наблюдали "пятно", состоящее из тесно расположенных пузырьков в районе аппарата Гольдки. Это "пятно" сохраняется по-краяней мере 3 ч при 20°С. При добавлении 0,3 мМ примаквина карггина распределения ЭФР-Р наблюдалась такая ш.

Таким. образом, нами показано, что 0,3 мМ примаквина ингибирует рециклирование ЭФР-Р. До 'недавнего времени результатом воздействия лизосомотропных веществ на функции лизосом считали повышение внутрилизосомалыюго рН и связанное с ним торможение активности лизосомных Ферментов. Однако недавно было продемонстрировано, что: йь примаквш ингибирует деградацию асиалогликопротеина в концентрации 0,03 мМ, что в 3 раза ниш той, которая требуется' для нейтрализации кислого рНагеи еъ. аьдязи (2)- подавление активности гидролаз не связано с изменением уровня рН (Булычев,1991); (3)- моненсин и •метиламин - вещества , меняющие рН органелл, не влияют на рециклирование ЭФР-Р в клетках А431 (Соркин и др., 1989).Можно высказать предположение р возможности действия примаквина на длинный путь.рециклирования, т.е. на. эндосомы в районе аппарата Гольдки, но не путем изменения в них рН, а путем изменения

и

структурной организации мембран этих органелл.

4. Изучение интернализации нормального и мутантного рецзтЪра к Фактору роста, выделяемого тромбоцитами, трансФицированных в клетки СНО.

Работа, касающаяся изучения интернзлизации рецептора Факггора роста тромбоцитов (ФРГ), была проведена на клетках СНО, в норме не имеющих фРТ-Р и трансФицированных геном этого рецэотора. У одной линии клеток экспрессировался нормальный рецептор (шпш СНО -»ъ), у другой - мутантный рецзгггор с неизменёнными зкстрацэллодярным и трансмембранным доменами и почта полностью отсутствующим (кроме 19 ак) цигоплззматическим доменом (клетки СНО-ести). При добавлении к клеткам окм на . 30 мин при +37°С ФРГ методом НИФ были выявлены типичные картины эндоцитоза лиганда : (отсутствие • окрашивания плазматическое мембраны.и множество ярко светящихся эндосом внутри кдвток . При добавлении ФРТ к клеткам СНО-естм плазматическая мембрана светится,-а внутри клеток свечение почтц, полностью отсутствует. Если инкубация с лигандом продолжалась 2 ч при 37°, то. свечение клэток СНО-*ь практически полностью исчезало, . что свидетельствует о деградации лиганд-рецепгорных комплексов внутри клеток. В .случае клэток СНО-ести при продолжении инкубации с лигандом характер и интенсивность окрашивания . существенно не изменялись, иногда появлялось слабое свечение внутри клеток, похожее на свечение эндосомального аппарата.

В серии эксдариментов к' клеткам через 5 мин после инкубации с ФРГ добавляли лизосомотропный агент хлороквин в концентрации 0,1 мМ.При инкубации клеток СНО-кгь с ФРТ и. хлороквином в течении 2 ьч при 37°С картина кардинально изменялась по сравнению с действием ФРТ без хлороквина: вместо . множества мелких ' светящихся • эндосом или почта полного отсутствия свечения в этом случае наблюдали только отдельные ярко светящиеся крупные точки внутри клеток, свечение ш мелких эндосом и мембраны отсутствовало. Свечение клеток СНО-естм, икубированных 2 ч с ФРТ и хлороквином, не изменялось. В этом случае хлороквин вызывает задеркку процесса деградации и, по-видимому, наблюдаемые отдельные яркие пятна. в цитоплазме клеток соответствуют слившимся поздним эидосомам. Отсутствие

подобной окраски в клетках СНО-кстм указывает на отсутствие деградации рецептора в лизосомах этих клеток, что может свидетельствовать об отсутствии интернализаЦии или об очень низкой ее скорости, при которой рецэптор не может накопиться в поздних эндосомах клеток ОНО - естн.

Для получения представления о скорости эндоцитоза в клетках обеих сублиний, так же как и в исходных клетках СНО, лишенных рецептора, указанные клетки инкубировали различные периоды времени в присутствии 125г-фрг ( 2 кг/мл утри +37 °С. Так как данная концентрация лиганда слишком мала, что бы вызвать даун-регуляцию рецегггора, количество сайтов связывания с, ФРТ на плазматической мембране остается постоянным и увеличение отношения между количеством шггарнализированного и поверхностно - связанного лиганда отражает реальную скорость интернализацш в равновесном СОСТОЯНИИ {Wiley, Cunningham, 1902). Мы показали, что скорость интернализацют 1о51-ФРХ, связанного с нормальным рецептором клеток CHO-wt значительно выше, чем связанного с мутантаым рецептором меток сно - естм. •Основываясь на этих данных,' а также на иммуннофлуоресцентном исследовании мы сделали вывод о том, что в клетках с мутантаым рецептором происходит только' спонтанная, конститутивная интернализация рецептора и не происходил' быстрая, лиганд-зависимая. Эти данные важны для понимания роли различных частей рецептора в проведении сигнала.

5.Исследование локализации фосфолипззы Су1 ( ФЛ Су1 ) в клетках А431.

Мы использовали поликлональные антитела к ФЛ С yi и моноклональные 2Е9 к ЭФР-Р. В необработанных лигандом клетках А43.1 ЭФР-Р распределен по плазматической мембране, в местах близкого прилегания клеток наблюдалось более яркое свечение, возможно, за счет двух мембран соседних клеток. Мы обнаружили, что в той же самой клетке поли-АТ к ФЛ Су1 окрашивают те жэ ■области плазматической мембраны, что и мопо-АТ к рецептору. Через одну минуту посла добавления к клеткам ЭФР можно было видеть интенсивное раФФЛированда плазматической мембраны. РаФФлирующиэ. участки плазматической мембраны интенсивно окрашивались как поли-АТ к ФЛ Су1, так и моно-АТ. к ЭФР-Р. На

фотографиях, сделанных через одну - пять минут посла добавления ЭФР можно ввдетъ <муоресцентное свечение эндосом, содержащих ЭФР-Р. Эти же структуры были окрашены антителами к ФЛ Cyl. Надо отметить, что не все эндосомы в клетке окрашивались данными антителами.

Мы провели иммунноцитохимическое исследование с помощью антител к ЭФРГР и ФЛ Cyl на ультракрдасрезах клеток А431. Об локализации антител к ЭФР-Р ила речь выше. После обработок клеток лигандом через 1-5 мин полиАТ к ФЛ Cyl обнаруживались как на плазматической мембране, так и в эндосомах.

Таким образом, на световом и электронно-микроскопическом уровне мы показали ко-локализацию' на плазматической мембране ЭфР-Р и ФЛ Cyi в клетках А431. Обработка клеток ЭФР вызывала совместное перераспределение изучаемых белков: ЭфР-Р и ФЛ Cyl выявлялись совместно как в участках раФФЛирующзй мембраны,- так и в зндосомальных структурах. Надо сказать, что область изучения субстратов рецепторов ростовых Факторов является, -актуальной и соответственно „исследованию ФЛ Cyl уделяется особое внимание. Несмотря на большое количество ' работ, опубликованных за последние 3-4 года, существует всего три морфологических работы, касающихся локализации ФЛ Cyl (Gerten et-eO.J98a;Arteaga et-aL4991), Причем ТОЛЬКО . В ОДНОЙ из них показана внутриклеточная локализация ФЛ Cyl (McBride et.ai.499i).Поэтому наши данные о ко-локализации ФЛ Cyl и ЭФР-Р представляют интерес. Известно, что в клетках А431 примерно 122 ФЛ Cyl связано с мембраной. Через одну минуту после добавления ЭФР количество ПМ-связанного Фермента достигает 689S (Twkterud et.aUi390). Мы впервые на световом и-ЭМ уровне получили морфологическое доказательство локализации ФЛ Cyl в эндосомах, причем на световом уровне методом двойной иммуномуоресценцш мы показали Ко-локализацию ЭФР-Р и ФЛ Cyl в эндосомах через 1-5 мин после добавления ЭФР. Какова может быть роль связи ФЛ Cyl с эндосомами? -Возможно, что интернализованный рецептор продолжает Функционировать фосфорилируя ФЛ Cyl• и внутри клетки. Это может быть -важно, если предположить существование внутриклеточных субстратов как для ЭФР-Р, так и для ФЛ Cyl, недоступных у ПМ. Нельзя исключить того, что именно интерналвдовашшо .рецепторы, перемещаясь внутрь клаткй ■ и

взаимодействуя с различными субстратами, в частности с ФЛ Су1, могут выполнять Функцию переноса стимулируюшэго сигнала с ПМ в ядро.

Факты, представленные в данном исследовании, могут свидетельствовать о том, что эвдоцитоз играет в клетка несравненно более важную роль, чем просто удаление с Ш рецептора у:кэ связанного с лигандом. Для понимания главного вопроса - как передается сигнал для клеточного деления -необходимы более углубленные исследования как структуры рецептора, 'так и Функционирования отдельных частей эндосомального аппарата, а так же поиск субстратов для рецегггорных тирозипкиназ.

вывода

1. Показан внутриклеточный путь интэрнализовашюго рецептора к ЭФР. на электронно-микроскопическом уровне с помощью коныогатов моноклональных антител к рецептору с коллоидным золотом. Установлено, что используемые моноАТ 5А9, являясь маркером ЭФР-рецептора, не препятствуют- связыванию с лигандом, шггёрнализацш и внутриклеточному процессингу ЭФР-рецэпторных комплексов.

2. Выявлен высокий уровень спонтанного конститутивного эндоцитоза у ¡слеток А431

3. Получены новые доказательства ингибирувдзго действия примаквипа на рециклирование ЭФР-рзцепгориых комплексов.

4.Подтверждены дашшо о роли внутриклеточного домена рецептора для лиганд-зависимого эндоцитоза. На примере рецептора ФРТ показано, что рецептор, лишенный иятерцоллшярнои части, подвергается только спонтанной штернализации.

5. Впервые на электронно-микроскопическом уровне показана внутриклеточная локализация ФосФолипази Су1 - субстрата ФОСФорилирования ЭФР-рецегггора. Выяаленако-локализация ФЛ Су1 и ■ЭФР-рецептора на плазматической мембране и показано совместное перераспределение этих белков после действия ЭФР. Методами двойной иммушшФлуоросцеяцш и иммунной элоктронноя-микроскопии впервые показана локализация ФЛ .Су1 в эндосомах во время интернализации ЭФР-рецэпторных комплексов.

< СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

© ■

1.Дьяконова М.Ю..Соркин А.Д. Действие лизосомотропного агента примаквина на андоцнтоз эпвдермального Фактора роста в клетках А431.// цитология. 1991. Т.33, « 9.С.70-71.

2.Дьяконова М.Ю..Соркин _ А.Д. Особенности интернализации Нормальных и мутантаых рецепторов Фактора роста, выделяемого тромбоцитами.// Цитологи^, 1991. Т.33, и 8.С.99-100.

3.Дьяконова. М.Ю.,Соркин А. Д..Никольский Н.Н. Влияние . лизосомотропного агента примаквина на .эндоцитоз рецепторов ' зпидермального .Фактора роота в метках А431. // Цитология. 1992.

. Т.34, N 7.С.83-69.

. 4.Дьяконова М.Ю. ,Соркш А.Д. .Никольский , Н.Н. Особенности интернализации нормальных и мутанпшх рецепторов Фактора роста, выделяемого тромбоцитам^.// Цитология. 1992. Т.34, N 8.С.74-81. 5. Diakonova M_Y„,Sorkin A-D.,Nlkolcky НЛ. Internalization of normal and nutant the platelet-derived growth factor receptors.,// . Abet. The 7th- International Conference of the ' International Society of ■' Differentiation "Cellular Programmes for Growth, Differentiation, and Heoplasia". Helsinki, Finland, 1992, p20.