Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность популяции рецепторов эпидермального фактора роста в клетках А431 и их внутриклеточный процессинг

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность популяции рецепторов эпидермального фактора роста в клетках А431 и их внутриклеточный процессинг"

институт цитологии российской академии наук

На правах рукописи

ВДОВИНА Ирина Борисовна

удк 576.348.085,23.086.1

/

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОРОВ ЭПИДЕРМАЛЬКОГО ФАКТОРА РОСТА В КЛЕТКАХ А431 И ИХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ПРОЦЕССИНГ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург 1993

Рлбота выполнена в Институте цитологии РАН.

Научный руководитель ■— доктор биологических наук, акадедшк Н. Н. Никольский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Б. Н. Лейбуш; доктор биологических наук И. М. Константинова.

Ведущее учреждение: Биолого-ночпенный факультет С.-Петербургского Государственного университета.

Защита состоится «.И » Ш&НгЯ- 1993 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « > мая 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писареоа

Институт цитологии РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы основной акцент в изучении взаимодеиствия эпидермального Фактора роста ( ЭфР ) с клеткой сместился в сторону исследования, его рецептора,' поскольку стало ясно, что именно этот трансмембранныя гликопротеин, обладающий ЭФР-зависимой тирозинкиназной активностью, играет решащую роль в реализации зффэктэ ЭФР. Связывавиз ростового Фактора . с рецептором приводит как к автоФосФоршшрованию последнего, так и к ФОСФоршшрованию целого ряда клеточных белков по . тирозину. В свои очередь сам рецептор является субстратом для других протеинкиназ, ФосФорилирующих его по остаткам серила и треонина. Анализ связывания ЭФР с клетками продемонстрировал существование двух классов рецепторов, отличающихся по своему сродству к ЭФР. Высказывались многочисленные предположения о молекулярных основах этого' явления и связи его с состоянием ФосФорилировавия рецепторов, однако окончательных данных по этому вопросу нет.

С другой стороны, в уже ставших классическими работах

( WiUinghdm, Pastan, 1901 ) ПОКаЗЭНО, ЧТО ВЗаИМОДвЙСТВИЭ

ЭФР с клеткой не ограничивается связыванием с рецептором' на плазматической мембране: ЭФР-редапторные комплексы поступают внутрь клетки ' посредством рецептор-опосредованного зндоцитоза (РОЭ), попадая сначала в эндосомальный компартмент, а затем в лизосомы. С эндосомами. связана диссоциация ЭФР и рецептора, имеющая место во многих типах клеток, а также сортировка рецепторов ЭФР, направляемых на деградацию шш рециклирущих обратно в плазматическую мембрану.

Значение РОЭ до сих пор неясно. Многие склонны рассматривать его только как механизм дйсенситизации клеток, однако есть данные о важности интернализации, особенно на начальных . этапах зндоцкгоза, для реализации действия ЭФР. Однако данные о состоянии интернализованных рецепторов неполны и противоречивы.

Как следует из вышеизложенного, рецепторы ЭфР могут быть весьма неоднородны да своим свойствам.Возможно, швнао эта гетерогенность определяет различив как внутриклеточной судьбы ЭФР-роцептора, так и реакций клеток на ЭФР в зависимости от контекста. Однако неизвестно, каким образом различные элементы гетерогенности связаны с механизмом передачи ригнала.

Цели и задачи исследования.

1. Сравнить внутриклеточную судайу ЭФР в клетках А431 как непосредственно после стимуляции интернализации ( ранний эндоцигоз ), так и после длительной инкубации клеток в среда, содержащей ЭФР ( поздний эндоцитоз ).

2. Проанализировать участие высокоэффинных и низкоэффинных рецепторов ЭфР в раннем и позднем зндоцигозе.

3. Сравнить статус фосфорилирования рецепторов ЭФР, локализованных на плазматической мембране и внутри клетки.

Научная новизна работы.

_ Проведен сравнительный , анализ интернализации и компартмэнтализации ЭФР в клешах А431 как ■ непосредственно посла стимуляции зндоцитоза, так и посла • длительной инкубации клеток с ЭФР. Показано, что во втором случае имеет место замедление поступления ЭФР в лизосомы. Обнаружено, что степень выраженности зтого ЗФФекта пропорциональна концентрации ЭФР, использованной для длительной инкубации.

На плазматической мембране клеток А431 показано наличие двух. классов редагггоров ЭФР,. различающихся по своему сродстау к ЭФР. Обнаружено, что после длительной инкубации клеток 'А431 в среде, содержащей высокие концентрации ЭФР, количество рецепторов на' плазматической мембране уменьшается в 2-4 раза. Преимущественной интернализации рецепторов какого-нибудь одного класса не обнаружено.

Впервые прямо показано, что как легкие, так и тяжелые эндосомы клеток А431 содержат. рецепторы' ЭФР,

ФосФорилированные по тирозину, причем тяжелые эн,дос;эмы более гетерогенны по количеству фосфорилированных по тирозину рецепторов в расчете на одну везикулу, чем легкие.

Применение бифункциональных сшивающих реагентов, непроникающих и проникающих через плазматическую мембрану, позволило продемонстрировать повышенное содержание фосфотирозина в интенализованных рецепторах по сравнению с поверхностными. ФосФоаминокислоткый анализ показал наличие, по крайней мере,двух групп интернализсванных редапторов: ФосФорилированных преимущественно по тирозину • и ФосФорилироваявых преимущественно по серияу и треонину.

Научно-практическое значение работы. Представленные данные по раннему и позднему .эндоцигозу необходимы для понимания механизмов Функционирования зндосомального аппарата клзток, а также связи гетерогенности редагтгоров с определением внутриклеточной судьбы ЭФР-рецопторных комплексов.

Метод сдвига плотности зндосом в градиента Перколла с помощью антител и иммунозолота может быть применен для анализа содержания специфических антигенов в различных компаргментах клеток.

Применение бифункциональных реагентов, проникающих и непроникающих через биологические мембраны, позволяет' проводить сравнительный анализ распределения любых лиганд-репепторных комплексов, локализованных внутри клетки и на ее мембране.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались «а Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" ( С.-Петербург, 1991 ) , 31-вои" ежегодной • конференции Американского Общества по маточной биологии { Бостон, США, 1991 ), 1-вом. Всемирном конгрессе "Клеточная и молекулярная биология"( Париж, Франция, 1991 ), Совещании "Биология клетки в культуре" { С.-Петербург, 1992 ) и на научном семипзро лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.

Публикации. Па теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем работы. Диссертация изложена на -/V# ■ страницах машинописного текста и состоит . из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственны! исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего У/б" публикаций. Материалы диссертации иллюстрированы 14 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

В работе использовались клетки зпвдзрмальной карциномы человека линии А431, полученные из Банка клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для опытов клетки сеяли на пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм или 80 мм с плотностью 25-50 тыс./см2. В опыт брали монослойныэ культуры на 2-3 сутки после посева.

_ Метаболическое мечение клеток А431 р - орггоч-осФ атом проводили с помощью инкубации монослоя . клеток в течение 10-12 ч в бесФосФорноя среде ДМЕ, содержащей 100 мкпх/мл "2р-оргоФосФата. В каждую чашку добавляли по 1 мл, среда с изотопом.

li5i-MP получали по стандартной методике . с помощью иодо-гена (Wiley, Cunningham,. 1982)- С НвЗНаЧИТвЛЬНЫМИ модификациями. Ковалевтную пришивку 1251-ЭФР к рецептору проводили с помощью 1 мК'биссульФОсукцинимидилсубберата <bsss, pierce) или 1 мМ биссукцкнимвд&лсубберата (BSS, Calbiochem ) В ТвЧеНИЭ 20 МИН При 4°С.

Изучение динамики компарггментализавди 1231~ЭФР на клетках А431 при раннем эндодаггозе проводили следующим образом. Монослоаные культуры на чангках диаметром 80 мм интенсивно промывали холодной (4°С) инкубационной средой

Игла, ¡содержащей 0,1% БОА и 20 мМ буфера. нерез <рН 7,4).' помещали на лед, добавляли к там 4-5 мл инкубационной среды, содержащей 50-200 нг/мл 1"31-ЭФР. Связывание проходило при 4°С в течение 60 мин. После отмывки нвсвязавшегося лигавда зндоцитоз инициировали переводом клеток в среду температурой 37°С, не содержащую лиганда. По окончании инкубации чашки вновь помещали на лед. При необходимости удаления связанного с плазматической мембраной ЭФР клетки обрабатывали при 4°С Na-ацетатным буфером ( рН 4,5 ). После этого чашки промывали холодной средой Игла до нормальных значений рН и подвергали дальнейшей обработке для нанесения на градиент Перколла. Для исследования позднего эндоцитоза параллельные культуры инкубировали 3 ч при 37°С в. присутствии 10-200 нг/мл немеченого ЭФР. Затем обрабатывали клетки Na-ацетатным буфером ( рН 4,5 ) и проводили инкубации с 1251-ЭФР и стимуляцию позднего эндоцитоза так же, как описано выше для раннего.

Для Фракционирования в градиенте Перколла клетки с чашки собирали раббером в буфер ТЭС <10 мМ триэтанол-аминовый буфер, рН 6,7 , содержащий 1 мМ мз2ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,2% азида натрия). Лизис достигался 30-кратным пипетированием с помощью автоматической пипетки. Полученный гомогэнат центрифугировали 10.мин при 1000 об/мин 2 раза. Суммарный сушрнатант (микросомальная Фракция) добавляли к Перколлу таким образом, чтобы в конечном объеме (12 мл) содержалось 18,556 маточного раствора Перколла (1 часть 2,6 М сахарозы и 9 частей суспензии Перколла). Градаэнт 'Формировался центрифугированием в угловом роторе Р65 в течение 25 мин при 50000 д. Фракционирование проводили со дна через иглу. Объем каждой Фракции составлял 0,5 мл. Профиль градиента определяли с помощью набора маркерных шариков (Density Marker Beards, Pharmacia),

Радиоактивность Фракции-регистрировали с. помощью счетчика ТамМа-1". • '

А.одинная очистка антител на ФосФотарозин проводилась ка колонке, содержащей ФОСФотарозин-сеФарозу. Элшрованные антитела подвергав гель-Фильтрации на колонке, содеркащей софэдокс U-25 (piuum.icia), и диализу против фосфатного буфера.

Дня t осавдения ФосФорилированяого рецептора ЭФР из лизата клеток А431 проводили иммунопреципитацию антителами к ФосФотирозшу по стандартной методике. В качество иммуносорбента использовали 10% суспензию клеток золотистого стафилококка, Фиксированного Формалином (производства ИЭиМ им. Пастора).

Высоковольтный электрофорез. Посла гидролиза белков в 6,7 n нс1 лиофшмзированвш пробы растворяли в минимальном объема буфера (pH 1,9) следующего состава: 25 частей муравьиной кислоты, 78 частей ледяной уксусной кислоты, 887 частей дистиллированной вода (по объему). В 6y<tep било добавлена по 0,3-0,5 мкг каждой фосфоэминокислоты. Пробы раскапывали на целлюлозную тонкослойную пластину (nurct.) в точки нанесения. Затем пластину слегка смачивали буфером (pH 1,9) и начинали электрофорез в первой направлении. Электрофорез проводили с охлаждением пластины при силе тока 22 мА и напряжении 1500 В в течение 20 мин. Затем пластину подсушивали и омачивали буфером (Нр 3,5 ), который содержал 5 частей гарадина, 50 частей ледяной уксусной кислоты, - 945 частей дистиллированной вода {по объему) для электрофореза во втором направлении. Его . проводили с . охлаждением пластины при силе тока 20 мА и напряжении 1300 В в течение 1В мин. ..После этого пластину высушивали потоком холодного воздуха, опрыскивали 0,1% раствором нингщрина в ацетоне, при этом маркерные аминокислоты окрашивались. Положение радиоактивных фосфоэминокислот молекулы рецептора определяли путем сопоставления автограф? с окрашенными пятнами маркерных фосфоэминокислот на,пластине.

Электро ф а ре тича с кое разделение . белков проводили

•методом даск-элзктроФореза в присутствии sds в ПААГ(-по системе ЛЭМШМ (Laemmli, 1970). ДЛЯ. ЭВТОраДИОГрафИИ Г8ЛИ высушивали и экспонировали на'пленку PM-i (Гасма) с помощью усиливающих экранов при -70°С.

Динамика компаргтментализации ЭФР при раннем и позднем эндоцитозё.'

Для анализа раннего зндоцигоза монослойные культуры клеток А431 инкубировали в присутстаии 100 яг/мл меченого ЭФР в течение 10, 30 и 60 мин при 37 °С. Параллельно клетки предварительно эвдоцигировали 100 нг/мл немеченого ЭФР в течение 3 ч ( лозднш эндоцитоз ). По окончании инкубационного гориода чашки помещали на лед и количество связанного с плазматической мембраной i:'5i -ЭфР опрепэляли путем обработки клеток Na-ацетатным буфером. Затем клетки, собранные в буфер ТХ, использовали как для определения количества li5i-3®P, поступившего в клетку, так и для анализа компартментализации с. помощью центрифугирования в градиенте Перколлз. Результаты подобного опыта представлены на Рис.1. Как в идею из гистограммы, несмотря на падение общего количества, связанной с клеткой радиоактивности в случав позднего зндоцигоза "в обоих вариантах идет накопление интернализованного' 1251-ЭФР параллельно с' уменьшением количества метки на плазматической мембране. Однако интенсивность этого процесса меньше . при позднем эндоцигозвЛем не менее такой эффокт нельзя однозначно связывать с уменьшением скорости интернэлизации в результате длительной инкубации клеток с ЭФР, поскольку в ' «этом случае мы имеем невидимую компоненту предварительно интернализованного немеченного ЭФР, участвующего как в ' рециклировании, так и в повторной интернэлизации и, таким образом, "разбавляющую" поток меченого лиганда. В пользу этого предположения говорит обратная зависимость величины внутриклеточного накопления 1251-ЭФР от концентрации • немеченого.ЭФР.

Ранее было показано, что эндосомальныя компаргмэнт

с«и

Чаа

хт гот iom

X

{CO-

SO-

Ш

i i

1 1 £

í>

'Рис.1 Сравнение количества интернализованного Щ и поверхностно-связанного Q '"1-ЭФР при раннем (I) и поздней (II) экдоцитозе.

До стимуляции эндоцитоза влетвип (II) инкубировали 3 часа при 37 С со 100 нг/мд ЭФР, затем подвергали обработке ^-ацетатным буфером.

Связывание 100 .вт/тп »«Т-ЭФР дроводацш .% иин при 4 0 на клетках (I) и (Ш.аатеи клёпки в обоих вариантах инкубировали при 37 С 10,' 30 и 60 мин. Клетки вновь обрабатывали Уа-ацетатным буфером.

а-радиоактивность дана в абсолютных величинах

б-радаоактивность выраяена в % от общей радиоактивности минро-соыальной фракции.

а' за' а'

л>' &>'

срт

ЗМ-

ИЮ-

да-

м

Л' ¡1 ¿ú'

i ■ i i г^А ^»•S./NÍ % 1 II IV 1\ ^

1 ■ 1 \ Á\ ii 1 1. \ « ■ А \ '

Рис.2 Распределение в градиенте Ъерколла радиоактивности ,мт-эФР, связанного о андосомаии клеток А431, в условиях раннего (—) и позднего (---) андодитоза.

Клетки инкубировали так не,кал описано в пошшси к Рис.1

Клетки инкубировали *гг1-УФР пса ЗГС 10 1а,г;, 30 (б,д) и . 60(в,е) мин.

а,б,в -радиоактивность дана в абсолютных величинах

г,д,е -радиоактивность выражена в % от общей, радиоактивности иикро-сошльной фракции.

S ¡o i? ■ 5 /о ir А/ лрал^иа

клеток А431 на градиенте плотности Шрколла представлен двумя пиками со средней- плотностью 1,04г/мл (легкие эндосомы) и 1,05 г/мл (тяжелые зндосомы). Анализ динамики компаргментализации 1251-ЭФР при раннем эндоцитозе показал, что через 10 мин после инициации материализации основная доля 1251-ЭФР связана с легкими зндосомаии, а через 80 мин уже в основном седиментирует в области лизосом ( Рис.2 ). В случае предварительной инкубации клеток с 100 нг/мл ЭФР в течение 3 ч лишь небольшая доля меченого ЭФР через 60 мин достигала лизосом. Основная часть оставалась связанной преимущественно с легкими зндосомаии. Таким образом, длительная инкубация клеток с высокими концентрациями ЭФР приводит к замедлению поступления вновь интернализуемых порции ЭФР в лизосомы, причем степень выраженности этого эффекта возрастает при увеличении концентрации ЭФР, использованной для длительной.инкубации. Вновь поступающий в клетки ЭФР остается связанным преимущественно с легкими эндосомами. Как было показано ранее, рециклирование связано преимуществвно с легкими эндосомами, поэтому можно говорить об активации пути рециклирования в результате длительной инкубации клеток с высокими концентрациями ЭФР.

Замедление поступления ЭфР в лизосомы может быть связано с перегрузкой лизосомального аппарата клеток в результате одновременной интернализации большого количества ЭФР-рецзпторных комплексов. Мы проверили это предположение, проинкубировав клетки 3 ч с 50 и 200 нг/мл 1251-ЭфР. Таким образом, мы получили картину внутриклеточного распределения "" i-ЭфР на момент начала позднего зндоцитоза ( Рис.3 ). Из-представленного рисунка видно, что как абсолютное, так и относительное количество метки, . ассоциированной с лизосомэми через 3 ч инкубации, значительно меньше в случае высокой концентрации J2':'i-3®P, Лизосомы клеток, инкубировавшихся с 50 нг/мл 1251-ЭФР, смогли вместить по крайней мере в 3 раза больше ЭФР-связаннои радиоактивности, что свидетельствует об отсутствии перегруженности лизосомального аппарата. -

Из приведенных выше опытов вщщо, что внутриклеточный

А/ фракции

Рис.3 Распределение в градиенте Перколла радиоактивности микросо-мальной франции клеток А431,инну-

ШТТШ ЪГЖ 3«1р°

при 3?, С, затем клетки обрабатывали Уа-ацетатным буфером.

а - радиоактивность дана в абсолютных величинах, б - радиоактивность выражена в % от общей радиоактивности микро-сомалькой франции.

П5Т

Рио.4 Снатчард-анаяиз связывания 1-ЭФР клвткаш А431 без предварительной инкубации ( 1 ) и о предварительной инкубацией с 240 нг/ мл ЭФР в точение 3 часов ( £),

По оси абциос - количество связанного ^1-ЭФР, рМ/ 10ё. клеток.

По оси ординат - стяошение связанного 1-ЭФР к свободному.

процессинг ЭФР, интернализованного в первые моменты и через 3 ч после стимуляции зндоцитоза, различен. Некоторые авторы приводят данные о преимущественной интернализации в начальный период зндоцитоза высокозффинных рецепторов. Для проверки мы таюкэ провели Скэтчард-анализ связывания 1251-ЭфР с клетками А431 < Рис.4 ). Для этого монослойные культуры инкубировались с 0,05 - 200 нг/мл 12Ь1-ЭФР в течение 2 ч при 4°С для достижения равновесного связывания. Параллельные культуры' предварительно эндоцитировали 200 нг/мл ЭФР в' течение 3 ч при 37°С и обрабатывались Na-ацетатным буфером, рй 4,5. Таким образом, мы получили данные о связывающих сайтах на мембране клеток А431 на момент начала раннего и позднего эндоцитоза. По окончании связывания оценивалось количество радиоактивности, оставшейся в среде (свободная радиоактивность) и связанной с клетками. График, построенный на основании этих данных, позволяет оценить как количество связывающих сайтов, так и Kfl. Оказалось, что на поверхности клеток А431 экспонированы рецепторы двух классов: низкоаФФинные ( около 1,0 • 106 рецепторов на клетку ) с Кд порядка 1'10~®М, и относительно небольшой пул высокоэффинных рецепторов ( 2>104 рецепторов на клетку )с Кд 1'10~10M. Длительная инкубация с насыщающей концентрацией ЭФР привела к падении общего .числа рецепторов в 3 раза, причем уменьшение коснулось как низкоэффинных, так и высокоаффинных рецепторов в одинаковой степени.

ФосФоршгкрование по 'тирозину рецепторов ЭФР в эндосомах клеток А431.

Основной характеристикой Функционального состояния рецептора является его ФосФорилированиэ по тирозину. Многие авторы,исследовавшие этот вопрос, основное внимание уделяли рецептору, находящемуся на плазматической мембране, не касаясь его состояния в зндосомах. Мы изучали состояние рецептора'именно на этом этапе. Для этого микросомальную Фракцию клеток Д431, эндоцитировавших в течение 60 мин 1251-ЭфР ( 200 нг/мл )при 37°с, инкубировали с антителами

а

Рис.5 Распределение радиоактивности '"I-&SP по фракциям, полученным при центрифугировании микросомальной фракции клеток A43I в градиенте плотности Лерколла. .

..Клетки инкубировали о 200 нг/мл

I—ЭФР при 4 С и при 37 С в течение I часа, затем обрабатывали /га-ацетат. нш буфером.

1-звдсюож,и«ку<5ированные в присут-етвии контрольних глобулинов кролика,

2-эндосомы,инкубированные в присут--г-1-г- ствии антител н фосфотирозину.

s ю ■ . i5"¿; Заштрихованнне участки- соответствуют , ' фракциям,которые отбирали для ивкуОации■

а>рцщии с имлукозолотом и повторного центрифугирования в градиенте Перкодла.

... Рис.6 распределение радиоактивности .^I-Эфр по фракциям, '. полученным лри повторном центрифугировании легких (а,б) и тяжелых (в,г; эндосом клеток A43I в градиенте Перкодла.

. а,в - материал получен из эндосом, инкубированных о контрольными антателами,

б,г - материал получен из вндооом, инкубированных о антителами я фосфотирозиву.

1 - эндосош, не инкубированные о ишу но золотом, .

2 - вндосомы, инкубированные с шмунозолотом. •

*

срщ ¡W

te-

iooo

г m

5 10- /5" 5" 10 15 /V (ppa^kíjuü

g

• /V\

/,' \ \ Г ! \ '

Ш

на фосфотирозин и подвергали, центрифугированию в градиенте плотности Перколла (Рис. 5 ). После взаимодействия полученных препаратов с конъпгатом протеина А и коллоидного золота, везикулы, содержащие фосфотирозин в рецепторе увеличивали свою плотность, что приводило к сдвигу 1251-ЭфР-связаннов радиоактивности в сторону большей плотности в градиенте Перколла < Рис.6 ). Действительно, мы наблюдали такой сдвиг как ддя легких, так и для тяжелых эндосом (в отличие от контрольных клеток, где инкубации с антителами на'фосфотирозин не проводилось). Однако характер сдвига различен: если изменившая свою плотность доля легких эндосом седиментирует во втором градиенте относительно резким пиком, то тяжелые зндосомы после взаимодействия с антителами на фосфотирозин представляют собой весьма .гетерогенную популяцию. Гак как изменение плотности прямо пропорционально количеству доступных антителам остатков ФосФотирозина в каждой зндосоме, то можно заключить, что тяжелые зндосомы гораздо более гетерогенны либо по . количеству рецепторов на эндосому, либо рецепторы содеркат разное количество ФосФорилированных остатков тирозина. Однако совокупность имеющихся данных позволяет склониться к первой точке зрения и рассматривать тяжелые зндосомы как созревающие мультивезикулярные тела, успевшие перевести во внутренние пузырьки разное количество рецептора.

Изучение состояния фосформирования рецэптора зфр в клетках А431.

Монослойные культуры клеток инкубировали с 200 нг/мл 12Э1-ЭФР в течение 1 ч при 4°С, затем 1 ч прм 37°С. После тепловой инкубации некоторые культуры были обработаны вцзз. Поскольку действию вешз подвергается только поверхность клеток, то это дает нам возможность выявлять .ЭфР-рзцепторныэ комплексы, расположенные на плазматической мембране.'

. В параллельной серии клетки после инкубации при 37°С были обработаны №-ацэтатным буфером ( рН 4,5 ) и затем

проникающим реагентом bss. При этом- 125i -ЭФР пришивался только к интернализованным рецепторам. После обработки сшивающими реагентами клетки в обеих сериях экспериментов лизнровали буфером ripa. ' Лизат _ подвергали иммунопреципитации поликлональными антителами на фосфотирозин. Лизат и иммунопреципигат подвергали ПМГ-злектроФорезу с последующей авторадиографией. Посла авторадаографии геля интенсивность полос оценивали посредством сканирующей денситомэтрии, которая позволила нам рассчитать' относительное содержание ЭфР-рецепторных комплексов,, ФосФорилированных по тирозину. Средние значения составили 33+256 и 45Г456 от общего количества поверхностных и интернализованных ЭФР-рецэпторных комплексов,

С далью дальнейшего изучения состояния-.

ФосФорилирования ¡ рецептора ЭФР мы провели фосфоаминокислогный анализ. Выращенные в монослов клетки А431 метили метаболически j2f -ортофосфатом, затем инкубировали с 200 нг/мл-ЭФР при'4° С îî в течение 1 ч при 37°С, после чего некоторые культуры были обработаны Na-ацетатным, буфером ( рН 4,5 ). Все клетки лизировали буфером 'ripa. Полученный клеточный материал подвергали шмунопрэципигации антителами на рецептор или антителами на фосфотирозин. Иммунопреципитат обрабатывали для проведения двумерного высоковольтного электрофореза. . Полученные "результаты показывают, что пул интернализованных рецепторов-в клетках А431 гетерогенен и содержит,по крайней мере, две группы рецепторов: ФосФорилированных преимущественно по тирозину й преимущественно по сериву и треонину.

На основании изложенных выше экспериментальных и ■ литературных данных можно сделать заключение, что рецепторы ЭФР. в клетках А431 значительно различаются по своим Функциональным состояниям. Рецепторы обладают различной аффинностью по отношению к ЭФР, но, согласно нашим данным, рецепторы обоих классов интернализуются в одинаковой степени в различные периоды эвдоцитоза.

Даш в условиях насыщения дигавда не все рецепторы

фосфорилированы по тирозину,, что может свидетельствовать о различной тирозинкиназной активности. фосФоршмрованш но всей популяции рецепторов по тирозину характерно в том числе и для рецепторов, иятернализованных в эндоеомах. Однако доля фосфоршгаровапных по тирозину для интернализованных рецепторов несколько выше rio сравнению с рецепторами, локализованными на плазматической мембране, что может свидотельствовать о более высокой тирозинкиназной активности интернализованных рецепторов. По море перемощения río эндоцитозному пути возрастает гетерогенность распределения рецепторов, фосфоршшровашшх по тирозину, по эндосомам. Среди интернализованных рецепторов можно выделить, rio крайней море, две группы: преимущественно ФосФориллрованных по тирозину и преимущественно фосфорилировашшх по серину и треонину. Это может указывать на различную тирозинкиназную активность интернализованных рецепторов. Функциональная значимость выявленных различных груш рецепторов требует дальнейшего изучения.

выводи

1. Проведен сравнительный анализ динамики интернализации и компартментализацш зпидермального Фактора роста (ЭФР) в метках А431 в различные периода зндоцитоза: непосредствешо посла стимуляции интернализации (рзннии эндоцитоз) и после длительной инкубации клеток в сродо, содержащей ЭФР (поздний эндоцитоз). Методом субклеточного Фракционирования в градиенте плотности Парколла показано, что распределение ь :'[-ЭФР различно в этих даух случаях; при раннем зндоцигозе и5х-ЭФР после Фракции легких зндопом попадает во Фракцию тяжелых эвдосом'и лизосом, в то время как при позднем эндоцитозе - остается преимущественно связаяяш с легкими зндосомами; дальнейшее продвижение во Фракцию тяжелых эндосом и .лизосом замедлено. Сделан вывод, что ' при' позднем эндоцитозе. 12Ь1-ЭФР поступает преимущественно, на путь, рециклирования, а не на путь деградации. ■. '

2. Сделано предположение о существований концентрацшнно-загцсимого блока на стадии перехода лиганда от легких эндосом к лизосомам.

3. Показано, что клетки А431 содержат два класса реиэгггаров ЭФР: высокоаФФшшые рецепторы с Кд=10-1оМ . и низко аффинные рецепторы с К^Ю^'м. После длительно| инкубации, клеток А431 в • среде, содеркащей высокие концентрации ЭФР, количество. рецепторов на плазматической мембране уменьшается в 2-4 раза, причем . уменьшается количество как высокоэффиеных, так и • низкоэффинных рецзпторов. Преимущественной интернализации рецепторов какого-нибудь одного класса не обнаружено.

4. Методом сдвига плотности в градиенте Перколла, полученного с помощью антител на ФосФотирозин в комплексе с иммунозолотом показано, что как легкие, так и тяжелые зндосомы клеток А431 ' содержат рецептор ЭФР, ФосФорилированный по тирозину. ■ При этом тяжелые зндосомы более" .гетерогенны да количеству ФосФорилированных рецепторов на одну эндосому, чем легкие зндосомы. Сделан вывод о длительном сохранении тирозинкиназной активности рецептора ЭФР как в легких, так и в тяжелых эндосомах.

5.. Проведено сравнение уровня тирозинового фосфорилирования интернализованных и поверхностных рецепторов ЭФР. Установлено, что относительное содержание рецепторов ЭФР, ФосФорилированных по тирозину, составляет 33% и 45Я от общего количества поверхностных и интернализованных рецепторов, соответственно, что свидетельствует о преимущественной интернализации-рецепторов, ФосФорилированных по тирозину.

6. Анзлиз фосфоэминокислотного .состава показал, что пул интернализованных рецепторов в клетках А431 гэтерогенен по статусу фосфорилирования-и содержит, по крайней мере, ' дав группы рецзгтгоров: одни ФосФорилированы преимущественно по тирозину, другие - преимущественно по серину И треонину.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нестеров A.M., Вдовина И.Б., Корнилова ■ Е.С., Никольский Н.Н. Прямое доказательства ФосФорилирования по тирозину рецепторов эпидермального Фактора роста, интернализованных в зндосомах клеток А431// Цитология.-1991.-т.33.- С.26-31.

'2. Вдовина И.Б., Бурова Е.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. Сравнительный анализ раннего и позднего эндовдтоза эпвдермального Фактора роста в клетках А431// ' Цитология.- 1993.-т.35.-С.60-67.

3. Nikolsky N.N., Nesterov A.M., Lesan S.M., Vciovina I.В., Reshetnikova G.F., kudryavtseva N.V. Phosphorylation status of internalized epidermal growth factor receptors // Abstracts of the American Society- for Cell Biology. Boston, USA.-J.Cel1 Biol.-1991.-V.115.-P.13a.

4- Nikolsky n.N., Neete-'rov A.M., Lesan B.M., Vdovina I.В., Reshetnikova G.F., Kudr/avt5eva N.V. F'hosphori lated 'State of internalized epidermal growth factor rtjeoptars // Abstracts of 1-et World Congress- Cellular and molecular biology. Paris, Franca.-1991.- P.220.

5. ЛысанС.М., Вдовина И.Б. Рецептор эпидермального Фактора роста клеток А431 в процессе его интернализации

■ сохраняет способность активировать ЭФР-индуцибельные серин-. треощш-сдациФичные протеинкиназы // Цитология. - 1991.-Т.ЗЗ.- С,82-83.

6. .Нестеров A.M., Вдовина И.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. Метод иммуноизоляции эндосом клеток А431, содержащих интернализованныи эпидермальный Фактор роста, .с помощью антител к фосфотирозину > / Цитология.- 1991.- т.33. - С.90.

7. Вдовина И.Б., Соколова И.П., Корнилова E.q., Никольский Н.Н. Некоторые особенности отставленного эндоцйтоза эпидермального Фактора роста в клетках А431 // Цитология. - 1992,- т.34.- С.56. '