Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интернализация экзогенной ДНК в клетках культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и ее участие в процессе восстановления активности гена Каспазы-3

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Интернализация экзогенной ДНК в клетках культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и ее участие в процессе восстановления активности гена Каспазы-3"

На правах рукописи

005002143

Рогачёв Владимир Алексеевич

ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА МСТ-7 И ЕЕ УЧАСТИЕ В ПРОЦЕССЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНА

КАСПАЗЫ-З

03.02.07 - генетика

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2011

005002143

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН в лаборатории молекулярной биологии клетки, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Богачев С.С.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Омельянчук Л.В.. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Елисафенко Е.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреаедение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова,

г. Москва

Защита диссертации состоится «Ъ&> Н^л cf^iа 2011 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090 тел/факс: (383) 363-49-06 (1321); e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «II»

о^г>с^1л2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

р ■

Т.М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

Существует незначительное количество современных работ, описывающих взаимоотношения экзогенной ДНК и клетки, а именно: что за ДНК, и в какой форме присутствует в межклеточном пространстве; как происходит захват ДНК из околоклеточного пространства; что происходит с ДНК в цитоплазме; каким образом ведет себя ДНК в ядре. В настоящее время отсутствует разработанная концепция оборота экзогенной ДНК как генетической информации, дающая четкое представление о молекулярно-биологических характеристиках и функциональных возможностях этой ДНК в каждом моменте клеточного цикла. Тем не менее, каждый из указанных этапов в разной степени изучен и представляет часть знания необходимого для понимания общей картины этого сложного многофакторного процесса.

Многочисленные данные, полученные в настоящее время, свидетельствуют о том, что в межтканевых жидкостях и в плазме крови в норме всегда присутствует ДНК, которая является постоянным компонентом этих тканей организма (Anker et al., 1999; Anker, 2000). Более того, количество ДНК плазмы отражает функциональное состояние организма в целом.

Установлено, что существует несколько путей проникновения ДНК во внутриклеточное пространство. Проникновение экзогенной ДНК внутрь клетки может проходить за счет поглощения апоптозных телец (Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002). Описан рецептор - опосредованный путь проникновения экстраклеточного материала ДНК во внутренние компартменты эукариотической клетки. За этот путь доставки молекул ДНК отвечают рецепторы, расположенные на цитоплазматической мембране (Loke et al., 1989; Bennett et al., 1985; Zamecnik et al., 1994). При этом проведенные исследования подтверждают тот факт, что этот процесс не связан с деградацией ДНК и последующим ее ресинтезом внутри клетки (Ledoux, Charles, 1972).

Опубликованы результаты многочисленных экспериментов по изучению мутагенного эффекта экзогенной ДНК на эукариотические организмы. Главное на что указывается в этих работах это то, что существует трансформация признака связанная с воздействием экзогенной ДНК. Трансформация возможна как в культуре клеток, так и в живом организме. Полученные факты свидетельствуют о том, что экстраклеточная ДНК может усваиваться как генетическая информация и проявляться как фенотипический признак (Гершензон, 1939, 1966, 1975, 1996; Ledoux, 1965; Гершензон, Александров, 1982; Pulciani et al., 1982; Garcia-Olmo et al., 1999; Garcia-Olmo et al, 2000).

Разработка концепции воздействия экзогенной ДНК как генетической информации является важнейшей основой генной терапии будущего, которая охватывает все аспекты целенаправленного контролируемого изменения генома соматических клеток человека и исправления генетических дефектов и несоответствий, врожденно детерминированных или возникших в результате внешних воздействий.

Одной из моделей позволяющих определить некоторые молекулярные особенности взаимодействия соматической раковой клетки и экзогенной ДНК является модель культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека

MCF-7. В предлагаемом исследовании мы акцентировали внимание на изучении поведения фрагментированной экзогенной ДНК при ее проникновении в клеточные компартменты клеток линии MCF 7, и проверки гипотезы о возможности переноса генетического материала. Мы полагали, что в процессе культивирования, в определенном количестве клеток, за счет существующего механизма переноса генетической информации из экстраклеточной ДНК, произойдет возвращение к исходному генотипу на примере мутированного гена каспазы 3. При этом новое состояние ДНК и фенотипическое проявление функционирования гена каспазы 3 можно будет проверить экспериментально. Цели и задачи работы.

Цель работы - исследовать воздействие экзогенной ДНК на модели культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и возможности восстановления активности гена каспазы-3. В рамках целей предлагаемой работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить параметры поглощения экзогенной ДНК клетками культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.

2. Проанализировать взаимодействие экзогенной ДНК и реципиентного клеточного генома. Выяснить, происходит ли изменение фенотипа клеток и восстановление функциональной активности фермента каспазы 3 при инкубации культуры клеток MCF-7 с экзогенной ДНК человека.

3. Установить, связано ли восстановление функциональной активности фермента с исправлением мутации в 4 экзоне гена каспазы 3 клеток MCF-7 под действием экзогенной ДНК человека.

Научная новизна.

1. Обнаружено, что экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до минуты) достигает всех основных компартментов (цитоплазма, ядро) клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.

2. Установлено, что ДНК накапливается во внехромосомной фракции клеточного ядра клеток культуры MCF-7. Во внехромосомной фракции клеток MCF-7 может постоянно присутствовать до 2.0% от гаплоидного генома фрагментированной экзогенной ДНК

3. Показано, что линейный размер исходной фрагментированной ДНК, депонированной во внехромосомной фракции, возрастает от 200 - 500 п.н. до порядка 10 000 п.н. Увеличение размера является следствием лигирования фрагментов между собой.

4. Молекулярно - генетическими методами доказано, что восстановление функциональной активности фермента каспазы 3 линии MCF-7 связано с реверсивным исправлением дефектного локуса гена, которое происходит за счет гомологичного обмена экзогенного экстрахромосомального фрагмента ДНК с локусом хромосомы, несущим делецию.

Практическая значимость.

Даны качественная и количественная характеристики экзогенной ДНК доставляемой в основные клеточные компартменты (цитоплазма, ядро) соматической клетки.

Обнаружен эффект восстановления активности housekeeping гена Каспазы 3 произошедший в результате естественных репаративно-рекомбинационных процессов между хроматином соматической раковой клетки и гомологичного фрагмента экстраклеточной ДНК. Полученные результаты позволяют определить один из векторов генной терапии как возможность изменять генетический статус и фенотип малегнезированный клетки за счет длительного присутсвия в окружении раковой клетки достаточного количества экстраклеточной терапевтической ДНК в виде фрагментов размером 200-6000 п.н. и содержащей всю совокупность геномных последовательностей в немутаптной форме.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до минуты) достигает всех основных клеточных компартментов клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 (цитоплазма, ядро) и накапливается во внехромосомной фракции.

2. Инкубация культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, несущей делецию в гене каспазы 3, с экзогенной ДНК человека приводит к характерной апоптотической нуклеосомной фрагментации хроматина, что связано с реверсивным исправлением дефектной нуклеотидной последовательности гена.

Апробация работы.

Результаты работы представлены на рабочем совещании «Функциональная организация клеточного ядра» (Прага, 5-8 мая 2006 г.), международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 30 июля -3 августа 2006 г.), международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), II Съезде общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 21-27 июня 2009 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 5 работ в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах из списка ВАК.

Вклад автора.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой MCF-7 проводилась совместно с к.б.н. JI.B. Мечетиной и с.н.с, А.Г. Шиловым (ИХБиФМ СО РАН). Молекулярно - биологические эксперименты проводились под руководством д.б.н. С.С. Богачева с участием к.б.н. А.С. Лихачевой (ИЦиГ СО РАН).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, содержит 18 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культура клеток MCF-7. Основные особенности

Клетки аденокарциномы молочной железы человека - MCF-7 имеют делецию 47 п.н. в 4-ом экзоне гена прокаспзы-3. Отсутствие 47 п.н. в гене прокаспазы 3 приводит к пропуску 4 экзона при сплайсинге и сдвигу рамки считывания с появлением "преждевременного" стоп кодона в мРНК. Поэтому в клетках MCF-7 полностью отсутствует ключевой фермент апоптотического каскада - каспаза-3 (Janick etal., 1998).

Фенотипически, делеция в гене прокаспазы-3 проявляется в том, что при рецептор опосредованном апоптозе не происходит фрагментации ядерной ДНК клеток MCF-7. Так, например, апоптоз MCF-7, индуцированный фактором некроза опухолей альфа (ФНОа), сопровождается экспозицией на внешней поверхности цитоплазматической мембраны фосфатидилсерина, диссипацией трансмембранного потенциала митохондрий (SvF|x), конденсацией ядра, но при этом не наблюдается гидролиза ядерной ДНК.

В данной работе делеция в гене прокаспазы-3 аденокарциномы MCF-7 была использована как генетический маркер для проверки гипотезы о функциональности интернализованной клеткой экзогенной ДНК.

Культуры клеток и условия культивирования

Клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 и саркомы мыши - L929 предоставлены НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор". Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с ЮмМ L-глутамина и 50 мкг/мл стрептамицина ("Sigma", США) при 37°С в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург) в атмосфере с 5% С02 до плотности 0.7x107 клеток на 4 лунки в 24 луночном планшете. Для трансфекции добавляли 0.1 - 0.2 мг/мл фрагментированной ДНК плаценты человека. Время инкубирования варьировало от 5 до 40 дней.

Приготовление ДНК и предшественника

Препарат человеческой ДНК получали из плацент здоровых рожениц, результаты анализа крови которых отрицательны на наличие ВИЧ, сифилиса, гепатитов В и С. Для выделения ДНК использовали безфенольный метод. Фрагментацию ДНК осуществляли ультразвуковым дезинтегратором при частоте 22 КГц, в результате чего получали набор фрагментов ДНК от 200 до 500 п.н. ДНК плаценты человека метили ник трансляцией в присутствии фрагмента Кленова и [a-32P]dATP. Для удаления не включившихся предшественников ДНК переосаждали 2 раза изопропанолом (Гловер, 1988). На выходе после очистки получали 7-15 мкг меченой ДНК. ДНК разводили в соответствующем объеме дистиллированной воды и добавляли в каждую лунку планшета (в объеме, не превышающем 20 мкл на лунку). В каждой лунке находилось 250-350 мл среды. Аликвоту 1 мкл из рабочего объема отбирали на счет радиоактивности.

Аликвоту [a-32P]dATP разводили в соответствующем объеме Н2О. 1 мкл из разведенного трифосфата отбирали на счет радиоактивности. Одинаковое количество а по отношению к ДНК (по счету и объему), добавляли на точку.

Рестрикционные фрагменты метили в присутствии фрагмента Кленова и [а-32P]dATP по липкому концу, образовавшемуся в результате гидролиза

рестриктазой БаЮЬ После достраивания с помощью (11ЧТР и образования тупых концов, ДНК освобождали от не включившихся предшественников двукратным переосаждением изопропанолом из 0,ЗМ ЫаАс.

ДНК ПЦР фрагментов 506 и 230 п.н. метили в процессе ПЦР реакции с использованием специфических праймеров.

Приготовление клеточных экстрактов и анализ ДНК в клеточных компартментах

По завершении времени инкубации планшет помещали на лед. Среду количественно отбирали и немедленно добавляли Тритон Х-100 в буфере А (буфер А содержал 2 мМ СаСЬ, 0.5% Тритона Х-100). В каждую лунку добавляли 250 мкл лизирующего буфера, что составляло 1 мл на точку. Клетки оставляли с лизирующим буфером на льду в течение 10 минут. Лизированные клетки ресуспендировали несколько раз и наносили на 1 мл градиента 10% сахарозы на буфере А, содержащем 2 мМ СаС12. Центрифугирование проводилось в бакет-роторе при 600g 20 минут. Супернатант, представляющий цитоплазматическую фракцию, отбирали в отдельную пробирку и осаждали изопропанолом. Осадок ядер промывали дважды лизирующим буфером А. Ядра ресуспендировали в 500 мкл буфера А, содержащего 2 мМ СаС12, анализировали цитологически и переносили в пробирки от ротора .1А-21 центрифуги .12-21. К суспензии ядер добавляли до 2М ЫаС1 и до 1% ДСН. Лизат ядер инкубировали при 65°С 15 минут до полного просветления реакционной смеси без какого либо встряхивания. Лизат ядер центрифугировали при 21 000 об/мин (52 000 в течение 20 минут при 35°С. Супернатант, представляющий собой нуклеоплазму или внехромосомный переносили в другую пробирку. К супернатанту добавляли 1:10 объема №Ас и осаждали добавлением 0,6 объема изопропанола. К прозрачному чечевидному осадку, представляющему хромосомную фракцию, добавляли: 1) 100 мкл воды, позволяли набухнуть в течение 60 минут и сразу поводили электрофорез; 2) 500 мкл воды, позволяли набухнуть в течение 10 минут и осаждали изопропанолом; 3) растворяли осадок в буфере, содержащем 8М мочевины и 8% глиоксаля (денатурирующие условия).

Все процедуры выполняли при 0°С. Все образцы после проведенных обработок немедленно осаждали добавлением 0,6 объема изопропанола из 0,ЗМ раствора ЫаАс. Осадок растворяли в: 1) 100 мкл Н20; 2) в денатурирующем буфере при 65°С в течение 60 минут. Количество меченого материала определяли стандартным способом в эппендорфовских пробирках, опущенных в счетные флаконы на счетчике Яас ВсНа.

Выделение ядер и очистка ядерной ДНК Для анализа ядерной ДНК клетки промывали тремя сменами среды ЯРМ1 1649, обрабатывали трипсином (1 мг/мл) в среде ЯРМ! 1640, переносили в центрифужные пробирки, центрифугировали при 500 g. Среду удаляли, клеточный осадок ресуспендировали в среде ЯРМ! 1640. Процедуру отмывки клеток повторяли трижды, после чего клетки лизировали 50мМ Трис-НС1 буфером (рН 7,5), содержащим 1 % Тритона Х-100, 200 мМ №С1, и выделяли ядра центрифугированием в градиенте плотности 2,1 М сахарозы. ДНК из клеток МСР-7 выделяли как экстракцией смесью фенол-хлороформ, так и в безфенольной системе при инкубации с протеиназой К и без нее и анализировали

с помощью ПЦР на присутствие участка ДНК, несущего делецию в экзоне 4 гене каспазы 3.

Праймеры и ПЦР анализ

ПЦР и ОТ-ПЦР проводили по стандартным протоколам, с использованием наборов реактивов компании "Медиген" (Россия) и компании "BioRad" (США). Для амплификации фрагментов ДНК гена каспазы 3 использовались праймеры, фланкирующие район делеции: А1 - AAAGATCATACATGGAAGCGAATCAAT(27) и А2 - CAGTGCTTTTATGAAAATTCTTATTAT(27)

Для анализа мРНК гена каспазы 3 были синтезированы следующие праймеры: Пр.1 GAATGACATCTCGGTCTGGTA (21) Пр.2 TG A ATA ATGA АА AGTTTGGGT (21) Пр.З CTCTGGAATATCCCTGGACAACA (23) Пр.4 CATCACGCATCAATTCCACAAT (22)

34 И4 Э5 И5 Эб

At А2 j * 4.......| | j j ^ |

Пр.З Пр.1 пр.4 Пр2

Рис. 1. Схема расположения в гене каспазы 3 всех используемых праймеров.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5-2% агарозном геле (lxTAE, бромистый этидий) с использованием красителей бромфенолового синего или ксиленцианола. Гель фотографировали и, при необходимости, определяли интенсивность полос с помощью программы GelPro Analyser 3.0 ("Media Cybernetics, Inc.").

2.10. Центрифугирование в градиенте плотности NaCl Для проведения градиентного центрифугирования ядра, выделенные согласно описанной выше процедуре либо лизировали 0,5% ДСН и инкубировали с протеиназой К (Маниатис и др., 1984), либо лизировали 1,0% ДСН и 2М NaCl и прогревали при 65°С в течение 15 минут. Оба лизата наносили на ступенчатый градиент NaCl с шагом 5-25% и проводили центрифугирование (Гловер, 1988). Градиент раскапывали по 2 мл и ДНК осаждали этанолом из 0,3M NaAc. Осадок промывали 70% этанолом и использовали для ПЦР анализа.

Выделение и анализ апоптозной ДНК Для анализа фрагментации ДНК при апоптозе клетки MCF-7 и L929 инкубировали 24 -30 ч при 37°С в присутствии 0.1 мкг/мл ФНО-а (НИКТИ БАВ, Новосибирск) и 10 мкг/мл циклогексимида ("Sigma", США). Выделение ДНК из клеток и анализ электрофорезом в агарозном геле проводили по стандартной методике (Гловер, 1988).

Выделение суммарной РНК из культуры клеток Для выделения суммарной РНК из культуры клеток использовали Total RNA Purification Kit (V-gene Biotechnology Limited, Китай) согласно прилагаемому протоколу.

Секвенирование ПЦР фрагментов

Из агарозного геля вырезали куски с изучаемыми ПЦР фрагментами определенной длины и после трехкратного замораживания/оттаивания выделяли ДНК. Секвенирование полученных образцов было проведено в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН с использованием 16-капиллярного автоматического секвенагора ДНК ABI3130x1 по протоколам фирмы Applied Biosystems (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Распределение по клеточным компартментам и качественные изменения экзогенной ДНК размером 200 - 500 и.н., представляющей пул фрагментов, содержащий полный геном человека

Мы предположили, что наиболее "физиологичной" для распознавания механизмами доставки и утилизации будет ДНК фрагментированная до размера кратного нескольким нуклеосомным единицам. Такой размер соответствует размеру фрагментов апоптозной ДНК, присутствующей в плазме крови. Мы полагали, что сможем проследить путь и изменения, происходящие с ДНК при ее попадании в цитоплазму, ядро и хроматин в результате естественного механизма доставки, используемого клеткой. Использовалась геномная ДНК фрагментированная до фрагментов 500 п.н., которая была мечена [a-32P]dATP ник-трансляцией. Для анализа поведения экстраклеточной ДНК при ее взаимодействии с клеткой мы выбрали две стадии зрелости культуры (экспоненциальная фаза и фаза контактного торможения) а также два типа электрофоретического анализа (нативные условия и денатурирующие условия)

Рис 2. Анализ распределения по клеточным компартментам клеток культуры клеток MCF-7 фрагментированной экстраклеточной ДНК человека в зависимости от времени ее нахождения в культуральной среде. (Нативные условия проведения электрофореза, логарифмическая фаза роста культуры). Справа блоки агарозы окрашенные этидиумом бромидом. Слева рентгенограммы этих же блоков после высушивания. Цифры над блоками указывают время инкубации культуры клеток с меченой [a- P]dATP экзогенноии ДНК и [a-32P]dATP. Цифры справа от блоков - маркеры молекулярных весов в т. п.н. 180'а исходный [a-32P]dATP предшественник. Стрелками указаны фрагменты процессированной ДНК находящейся во внехромосомном пространстве.

(Рис. 2 и 3).Обнаружено, что экзогенная ДНК практически сразу доставляется во все проанализированные компартменты клетки (цитоплазма, ядерное пространство) а меченый материал обнаруживается инкорпорированным в

цвтоплазматнческая фракция

Ч П № W 1*3 1МГ. д»*

внехромосомная фракция

в IS1 30' I m H WtM'ITO.

Я

хроматин

О 15' Ж IW W Ш'- <1 15' W W lie' iWi ■

-

хроматин. В нулевой точке в активно делящихся клетках размер фрагментов соответствует размеру экстраклеточной ДНК добавленной в среду. Во всех остальных вариантах линейный размер ДНК увеличивается до размеров порядка 10 т.п.н. Чтобы определить, связано ли увеличение линейных размеров фрагментов с ковалентным объединением их концов внутри ядра, была выполнена серия денатурирующих форезов. Мы видим что увеличение линейного размера сохраняется в денатурирующих условиях, значит произошло

Рис 3. Анализ истинных размеров фрагментированной экстраклеточной ДНК человека во внехромосомной фракции клеток МСР-7 в зависимости от времени ее нахождения в культуральной среде. (Денатурирующие условия проведения фореза, логарифмическая фаза роста культуры). Цифры над блоками указывают время инкубации культуры клеток с меченой а "р экстраклеточной ДНК и [<х-32Р]с1АТР. 180'а - исходный [а-32Р](1АТР предшественник.

лигирование фрагментов между собой.

ВНЕХРОМОСОМНАЯ ФРАКЦИЯ

0 60' 120' 180'180'; 0 60' 120' 160' 180';, Т.П.Н.

I ШШ. «тш тш/. шт

»V

■ 4.3

В фазе контактного торможения все процессы происходят значительно менее интенсивно, чем в стадии логарифмического роста клеточной культуры (Рис. 4). В цитоплазматической фракции отчетливо видно накопление метки. Во внехромосомной фракции выявляется последовательное увеличение линейного

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ ФРАКЦИЯ

60' 120' 180' 180!( 0 60' 120' 180' 180!* т.п.н

ВНЕХРОМОСОМНАЯ ФРАКЦИЯ

О 60' 120' 180' 180!л

8:1

Рис 4. Анализ распределения по клеточным компартментам клеток культуры клеток МСР-7

фрагментированной экстраклеточной ДНК человека в зависимости от времени ее нахождения в культуральной среде. (Денатурирующие условия

проведения фореза, фаза контактного торможения). Справа блоки агарозы окрашенные этидиумом бромидом. Слева рентгенограммы этих же блоков после высушивания. Цифры над блоками указывают время инкубации культуры клеток с меченой [а-32Р]с1АТР экзогенной ДНК и [а-3~Р]с1АТР Цифры справа от блоков -маркеры молекулярных весов в т.п.н.

размера исходного фрагмента ДНК при увеличении времени экспозиции с меченой ДНК.

По-видимому, существует некоторое оптимальное или достаточное количество ДНК на одно ядро, при котором соотношение легитимной гомологической рекомбинации и хаотичной интеграции в хромосомы наименьшее. Постоянное присутствие в плазме крови 10-15 нг/мл апоптозной ДНК видимо составляет то количество, при котором поток экзогенной ДНК в клетку не активирует ее контролирующих систем. Клетка не индуцирует арест клеточного цикла и таким образом такое количество экзогенной ДНК является «безвредным» для ее жизнедеятельности.

Влияние экзогенной ДНК размером 200 - 500 п.п., представляющей пул фрагментов, содержащий полный геном человека, на активность гена каспазы 3 культуры клеток MCF-7 Анализ делеции в экзоне 4 гена прокаепазы 3 клеток MCF-7

Ранее было показано, что в гене прокаепазы 3 клеток MCF-7 имеется делеция 47 п.н., приводящая к дефекту в сплайсинге мРНК и к отсутствию прокаепазы 3 в этих клетках. Для подтверждения того, что используемый лабораторный клон MCF-7 является casp 3+ мутантным, ядерную ДНК клеток MCF-7 амплифицировали с праймерами, фланкирующими район предполагаемой делеции. Как видно из данных рис. 10 основным и единственным продуктом амплификации является фрагмент длинной 70 п.н. (Рис. 5, дорожка 2), который на ~ 50 п.н. короче фрагмента амплификации ДНК плаценты человека с теми же праймерами (рис. 5, дорожка 1).

Рисунок 5. Анализ продуктов амплификации ДНК с праймерами А] и А2 электрофорезом в 2% агарозном геле. Продукты амплификации ДНК: плаценты человека (1); клеток MCF-7, культивированных в течение ] недели (2), и трех месяцев (3) в среде RPMI 1640 в присутствии 10% ЭБС.

После продолжительного культивирования клеток МСР-7 (в течение 3 месяцев) не происходит изменения набора фрагментов амплификации, и единственным продуктом остается фрагмент протяженностью 70 п.н. (Рис. 5, дорожка 3). Следовательно, наличие делеции в гене капазы-3 является стабильным признаком используемого нами клона аденокарциномы молочной железы человека.

При амплификации ДНК выделенной из хроматина очищенных ядер МСК-7 клеток, подвергнутых обработке ДНК плаценты человека, наблюдается образование двух продуктов (рис. 6). Одного - размером 70 п.н., характерного для исходной линии МСР-7, и второго - 120 п.н., характерного для немутантного

гена, что свидетельствует о захвате ДНК из культуральной среды и ее транспорте в ядро. Мы предположили, что захваченная экстраклеточная ДНК интегрирует в реципиентный геном МСР-7, что приводит к восстановлению активности гена каспазы 3.

120 70

Рисунок 6. Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК, выделенной из хроматина очищенных ядер МСР-7 клеток, подвергнутых обработке ДНК плаценты человека с использованием праймеров А1 и А2.

Анализ изменения количества ПЦР продукта, соответствующего репарированному экзону гена каспазы 3, при длительном культивировании

MCF-7

Культивирование клеток MCF-7 в среде с ДНК плаценты человека на протяжении одного пассажа (3 дня (Рис 7., А)) с последующим культивированием в среде без ДНК (17 дней, 3 пересадки), сопровождается сохранением амплификации фрагмента размером 120 п.н. Этот факт указывает на то, что экзогеннаяая ДНК стабильно присутствует в реципиентном ядре на протяжении нескольких актов деления клеток.

Культивирование клеток в течение 40 дней в среде, содержащей ДНК плаценты человека, приводит к значительному накоплению реверсивного ПЦР фрагмента, о чем говорит изменение интенсивности при окрашивании бромистым этидием (Рис. 7, Б). Это наблюдение дает основание предположить, что с увеличением времени культивирования все большее число клеток становится носителем не дефектного фрагмента гена каспазы 3.

Фрагментация ДНК при апоптозе клеток MCF-7

При индукции апоптоза фактором некроза опухоли альфа (ФНОа) происходит ряд характерных изменений клеток MCF-7 - разрушение монослоя, конденсация ядер и утрата клетками морфологии, характерной для эпителиоцитов. Однако при этом не происходит олигонуклеосомной фрагментации ДНК даже после продолжительной инкубации (15 суток) клеток в присутствии ФНОа (рис. 8, А, дорожка 2). Эти результаты подтверждают тот факт, что инкубируемый лабораторный клон MCF-7 не продуцирует каспазу 3, в результате чего рецептор-опосредованный апоптоз не сопровождается активацией ДНКазного комплекса DFF40/DFF45.

Клетки MCF-7 культивированные в среде, содержащей фрагментированнуюДНК плаценты человека, вновь приобретают чувствительность к апоптотическому действию ФНОа. Индукция апоптоза ФНОа в таких клетках сопровождается олигонуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК (Рис. 8, А, дорожка 1).

Рис. 7. А. Анализ продуктов амплификации ДНК с праймерами А1 и А2 электрофорезом в 10 % ПААГ. Продукты амплификации ДНК:. 1. - клеток МСР-7; 2. - клеток МСР-7, культивированных в течение 3-х суток с постоянным присутствием экстраклеточной ДНК плаценты человека в культуральной среде; 3. - клеток МСР-7, культивированных в течение 3-х суток с постоянным присутствием экстраклеточной ДНК плаценты человека и 3-х суток без добавления ДНК плаценты в культуральную среду; 4. - тоже, как и во втором и 9 суток без добавления ДНК плаценты в культуральную среду; 5. - тоже, как и во втором вариантеми 17 суток без добавления ДНК плаценты в культуральную среду; 6. - плаценты человека. Гель окрашен бромистым этидием. Б. Анализ продуктов амплификации ДНК с праймерами А1 и А2 электрофорезом в нативном 10 % ПААГ. Дорожки соответствуют продуктам амплификации препаратов ДНК: 1 -хроматина интактных клеток МСР-7; 2, 3 - хроматина клеток МСР-7, культивированных в среде, содержащей 0.3 мг/мл ДНК плаценты человека, в течение 5 и 40 дней, соответственно; 4 -плаценты человека. Дорожка 5 - фрагменты ДНК с известной молекулярной массой. Гель окрашен бромистым этидием.

Было сделано предположение, что восстановленный специфический фенотип является следствием восстановления дефектного гена каспазы 3 и проявление ее активности в клетке, которое произошло в результате замещения дефектного участка на функциональный.

Для того, что бы проконтролировать возможность индукции апоптоза не гомологичной ДНК мы использовали в качестве ее экстраклеточного варианта ДНК спермы лосося, таксономически далекого от человека организма. Одновременно в течение четырех суток клетки МСР-7 инкубировали с ДНК человека и ДНК спермы лосося. Для контроля индукции апоптоза параллельно культивировали интактную культуру МСР-7. Смена культуральной среды производилась ежедневно. В среде содержалось 200 мюг/мл ДНК человека, либо ДНК лосося. Результаты эксперимента приведены на рис. 8, Б. Как следует из анализа фореграммы, индукция апоптоза обнаруживается только в случае культивирования клеток МСР-7 с ДНК выделенной из плаценты человека (Рис. 8, Б, образец 3). При выделении ДНК все образцы представляли собой вязкий липко-слизистый раствор высокомолекулярной ДНК, за исключением образца 4. В этой пробе полностью отсутствовала вязкость раствора, и какой либо намек на присутствие высокомолекулярной ДНК. Поскольку время инкубации клеток с. ДНК в настоящем эксперименте составляло всего четверо суток, и, как предполагалось только незначительная часть популяции клеток ревертировала

мутантный участок гена каспазы-3 к норме, то интенсивность нуклеосомной фрагментации не столь ярко выраженная, как в случае пятнадцатидневной

Рис. 8. А. Анализ индукции апоптоза клеток МСР-7 инкубированных в присутствии фрагментированной ДНК плаценты человека (5 суток с двумя сменами культуральной среды) (дорожка 1) и без неё (15 суток с четырьмя сменами культуральной среды) (дорожка 2). Обе культуры индуцировали к апоптозу ФНОа в концентрации 100 мкг/мл в течение 30 часов в среде содержащей 10 мкг/мл циклогексимида. ДНК

фракционировали в 1.8% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. На маркерной дорожке (3) ВБЗТ 1 гидролизат ДНК фага X.

Б. Анализ индукции апоптоза клеток МСР-7 инкубированных в присутствии 200 мкг/мл фрагментированной ДНК плаценты человека (дорожка 3), ДНК спермы лосося (дорожка 4), в отсутствие ДНК (дорожки 1. 2) и без индукции апоптоза фактором некроза опухоли (дорожка 1). Клетки инкубировали в присутствии ДНК 4 суток с двумя сменами культуральной среды. Культуры (дорожки 2, 3, 4) индуцировали к апоптозу ФНОа в концентрации 100 мкг/мл в течение 30 часов в среде содержащей 10 мкг/мл циклогексимида. ДНК фракционировали в 1.8% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. На маркерной дорожке (5) 100 ц.н. конкатомерная лестница.

инкубации культуры клеток МСР-7 в присутствии фрагментированной ДНК человека (Рис. 8, А, дорожка 1). Реверсия мутантного экзона 4 гена каспазы 3 является наиболее вероятной причиной активации полноценного апоптоза

ПЦР анализ мРНК клеток культуры клеток МСЖ 7 длительное время культивированных с экстраклеточной человеческой ДНК

Обнаружение в экстракте клеток обработанных человеческой ДНК фермента каспазы-3, либо соответствующей ей мРНК с «залеченной» мутацией в экзоне 4 могло быть прямым доказательством гомологической интеграции терапевтического фрагмента в хромосому мутантных клеток. Мы выбрали подход, связанный с обнаружением и анализом мРНК, который позволил бы прямым секвенированием показать места сплайсинга экзонов и присутствие в мРНК «залеченной» мутации (рис. 9).

И1

763

И2

ИЗ

2982

И 4

2897

115

И 6

«7

И 7

1535

H.H. 33 Экз!

167 Чю2

68 )иЗ

125 ')к|4

124 Эю5

176 ')к')6

121 Экз7

1806 'Зкз8

ПрЗ

Фрагмент 431 и.н.

Пр2

III ПрЗ Г1р1_

"ИрГ" "|1р2

Фрагмент 236 и.н.

Фрагмент 304 п.п.

Рис. 9. Выявление и анализ специфического участка мРНК гена каспазы 3 содержащего репарированный экзон 4, экзоны 5 и 6. I. Общая схема гена каспазы 3. II. Набор праймеров и ожидаемый ПЦР фрагмент гена каспазы 3 размером 431 п.н. в РТ процедуре. III. Набор праймеров и ожидаемые ПЦР фрагменты размером 236 п.н и 304 п.н. подтверждающие принадлежность фрагмента 431 п.н. к сплайсированным зкзонам 4, 5 и 6 с мРНК гена каспазы 3

Используя ОТ-ПЦР процедуру, был амплифицирован участок мРНК содержащий экзоны 4, 5 и 6. При этом в качестве прямого праймера использовался олигонуклеотид, гомологичный отсутствующему в геноме клеток MCF 7 участку 47 п.н, в 4 экзоне (праймер 3). В качестве обратного праймера использовался олигонуклеотид комплементарный хвостовой части экзона 6, причем последний нуклеотид которого соответствует последнему нуклеотиду экзона б (Рис. 9).

Первоначально из культуры клеток MCF 7 инкубированных с человеческой ДНК 15 суток была выделена суммарная РНК и синтезирована кДНК. Для выявления участка мРНК соответствующей гену каспазы 3, который содержал репарированную делецию в 4ом экзоне, были использованы праймеры 2 и 3 (Пр.2, Пр.З). В результате амплификации был получен искомый фрагмент размером 431 п.н. включающий сплайсированные экзоны 4 (без 20 начальных нуклеотидов), экзон 5 и экзон 6 (Рис. 10, А). Выявление этого фрагмента во фракции суммарной РНК означает, что суммарная РНК содержит мРНК гена капазы 3 с репарированной делецией 47 п.н. Для контроля правильности амплификации фрагмента 431 п.н. были получены 2 ожидаемых ПЦР продукта (фрагменты размером 236 п.н. и 304 п.н.) с использованием двух внутренних праймеров (Пр.1 и Пр.4), двух концевых праймеров (Пр.З и Пр.2) и ДНК фрагмента 431 п.н. в качестве матрицы (Рис. 10, Б) Сиквенс обоих фрагментов позволил сделать следующие заключение. Фрагмент 431 п.н. представляет собой кДНК копию участка мРНК гена капазы 3 содержащего сплайсированные экзоны 4 (без 20 начальных нуклеотидов, что определено местом посадки праймера), экзон 5 и экзон 6.

Рис 10. А. ОТ ПЦР амплификация суммарной РНК клеток MCF 7 с использованием праймеров Пр.2 и Пр.З: 1. исходная линия MCF 7. 2. MCF 7 инкубированные 15 суток с ДНК спермы лосося. 3. MCF 7 инкубированные 15 суток с экзогенной ДНК человека. Амплификация фрагмента 431 п.о. свидетельствует о существовании мРНК синтезирующейся с репарированного гена каспазы 3. Б. ПЦР амплификация:

1.-фрагмента 236 п.н (Пр.З - Пр.4).

2.-фрагмента 304 п.н. (Пр. 1 - Пр.2). Амплификация ПЦР фрагментов 236 п.н. и 304 п.н. свидетельствует о соответствии внутренней структуры фрагмента 431 п.н. району мРНК гена каспазы 3 содержащему репарированный экзон 4, экзоны 5 и 6

Левый край фрагмента 431 п.н. является репарировнным участком экзона 4, содержащим недостающие 47 нуклеотидов (область 320 - 367 мРНК каспазы 3, которая делетирована в исходной культуре (ИСК 7), и корректно объединенным с двумя следующими за ним экзонами.

Полученные данные свидетельствуют о том, что произошла гомологическая интеграция фрагмента экзогенной ДНК в дефектную область экзона 4. Интеграция произошла по механизму, описанному в работах (Ы а/., 2001; Ьагщз1:оп, вш^Шп, 2004), при котором срединная часть интегрируемого фрагмента не важна для процесса объединения. При сравнении сплайсированной последовательности фрагмента 431 п.н., содержащей экзоны 4, 5, и 6, с оригинальной последовательностью были обнаружены две вставки по 6 нуклеотидов (область 374 и 399 мРНК каспазы 3) (Рис 11), которые не сдвигают открытую рамку считывания (ОРС). В остальной части последовательности имеется несколько не значимых замен. Практически полная гомология оставшейся части прочитанной матрицы, где места объединения экзонов без выпадения нуклеотидов соответствуют последовательности, содержащейся в архиве вепеВапк, служат доказательством корректно прошедшего сплайсинга. Обнаружение репарированной мРНК и демонстрация активно протекающего апоптоза с характерной нуклеосомной фрагментацией свидетельствуют о появлении функционального фермента.

Су аProGluMetS«rL*uXl«KiiTyr

431 RH 5' CTCTGGAArATCCCTGGACAACAG ГТАГААААГ(3<1Д ГТ(ЗГССТСА£»АТ GAGTTT AT Т G СAT Т AT

мРНК 5* AAAGATCATАСAT G GAAG CGAAT СAAT G G ACTCTGGAATATCCCTGGACAACAGTTATJUWLTGGATTATCCTGACATGGGTTTА------TGT

290 300 310 320 330 340 350 360 370

Пр.З CyaProGluM*tGluLeu Cy»

L.

■ Эха 4

11« AxnLyaTrpAjnHis

ATAATAATTAATGATAAGAATAAGTGGAATCATAGAAGCACTGGAATGACATCTCGGTCTGGTACAGATGTCAATGTGGCAAACCTCAGGGAAA

ATAATAATTAATAATAAGAATTT------TCATAAAAGCACTGGAATGACATCTCGGTCTGGTACAGATGTCGATGCAGCAAACCTCAGGGAAA

380 390 400 410 . 420 430 440 450 460

II« Алл Fb« Hie _^ Пр. 1

'jK fi • ■ 3x15

CACTCACAAACTTGAAATATGAAGTCAGGAATAAAAATGATCTTACATGTCAAGAAATTGTGGAATTGATGCGTGATGTTTCTAAAGAAGATCAC

CATTCAGAAACTTGAAATATGAAGTCAGGAATAAAAATGATCTTACACGTGAAGAAATTGTGGAATTGATGCGTGATGTTTCTAAAGAAGATCAC 470 480 490 500 510 520 530 540 550

Э«я5 , 1 ( Эхэб

AGCAAAAGGAGCAGTTTTGTTTGTGTGCTTTGGAGCCATGGTGAAGAAGGAATAATTTTTGGAACAAATGGACCTGTTGACCAGAAAAAGGTAAC

AGCAAAAGGAGCAGTTTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCCATGGTGAAGAAGGAATAATTTTTGGAACAAATGGACCTGTTGACCTGAAAAAAATAAC 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650

AAGTTTTNNNAGAGGGGATTGTrGTAGAAGrCTAACTGANNNACCCAAACTTTTCATTATTCA 3'

AAACTTTTTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTCTAACTGGAAAACCCAAACTTTTCATTATTCAGGCCTGCCGTGGT 3'

660 670 630 690 700 710 720

Пр.2 ^_

730

ЭХ364

Рис. 11. Сравнение последовательности мРНК гена каспазы 3 содержащей экзоны 4, 5 и 6 (нижняя цепь) и секвенированных фрагментов 236 и 304 п.н. как внутренних копий, полученных с матрицы 431 п.н. (верхняя цепь).

Известно, что ген каспазы расположен на хромосоме 4, имеет размер 21751 п.н. и состоит из 8 экзонов. Экспрессия данного гена обеспечивает появление двух мРНК. Это транскрипты размером 17 и 19 т.п.н. и их белковые продукты (Janicke et al., 1998). Для появления функционального фермента каспазы 3 требуется сложный процесс считывания мРНК, при котором идет сплайсинг 8 экзонов. Делеция 47 п.н. в экзоне 4, приводит к пропуску 4-го экзона при сплайсинге, нарушению синтеза РНК и экспрессии активного фермента. ДНК, присутствующая в культуральной среде, фрагментирована до размеров 200 - 500 п.н. гидродинамическим способом. Это означает, что в эксперименте принципиально отсутствуют фрагменты, способные использоваться для синтеза полноразмерного продукта, дающего функциональный фермент. Вероятность того, что произошло лигирование нужных фрагментов в правильной ориентации с восстановлением ОРС каспазного гена и образование, тем самым, экстрахромосомальной матрицы, пригодной для синтеза фермента очень мала. На наш взгляд, интеграция в геном MCF-7 посредством гомологичной рекомбинации здорового фрагмента (Рис. 12),. реверсирующего ген каспазы к норме, представляется наиболее вероятным завершением событий перемещения экзогенной ДНК в проведенных опытах

процесс шмшогичкской гккомпинлцим

ДНК ФРАГМЕНТ

■3'

3-

попек юмологми. I инвазия. сш низ ДНК

. ЛИПП'ОПАМИК ДНК, НОССТЛНОНЛКПИ»; МОС'ЛКДОЛЛПЛЫНКЛ и

Рис. 12. Последовательность процессов при гомологичной рекомбинации

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что в культуре клеток возникает новый признак, носителем которого является исключительно внеклеточная фрагментированная аллогенная ДНК.

По результатам, полученным в данном исследовании, были сделаны следующие выводы:

1. Экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до минуты) достигает всех основных клеточных компартментов (цитоплазма, ядро) клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека МСР-7.

2. Установлено, что экзогенная ДНК накапливается во внехромосомной фракции ядра. Постоянно во внехромосомной фракции может присутствовать фрагментированная экзогенная ДНК в количестве до 2.0% от гаплоидного генома клетки.

3. Линейный размер исходной фрагментированной ДНК, депонированной во внехромосомной фракции, возрастает от 200 - 500 п.н. до порядка 10 000 п.н. Увеличение размера является следствием лигирования фрагментов между собой.

4. Используя в качестве модели делецию в гене каспазы 3 показано, что инкубация с экзогенной ДНК культуры клеток МСР-7, несущей указанную делецию, приводит к появлению характерной апоптотической нуклеосомной фрагментации хроматина. Фрагментация связана с реверсивным исправлением дефектной нуклеотидной последовательности гена каспазы 3, что предполагает восстановление функциональной активности фермента.

5. При увеличении времени инкубации с экзогенной ДНК процент клеток, которые несут фрагмент ДНК, соответствующий исправленному локусу гена каспазы 3, и количество клеток, вступающих в апоптоз, увеличивается.

ВЫВОДЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ

1. Rogachev V.A., Likhacheva A, Vratskikh О, Mechetina L.V, Sebeleva T.E, Bogachev S.S, Yakubov L.A, Shurdov M.A. Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell // Cancer Cell Int. 2006. V 11. P. 6-23. (перечень ВАК)

2. Yakubov L.A., Rogachev V.A., Likhacheva A.C. Bogachev SS, Sebeleva TE, Shilov AG, Baiborodin SI, Petrova NA, Mechetina LV, Shurdov MA, Wickstrom E. Natural human gene correction by small extracellular genomic DNA fragments // Cell Cycle. 2007. V. 6. № 18. P. 2293-2301. (перечень ВАК)

3. A.C. Лихачева, B.A. Рогачев, В.П. Николин, H.A. Попова, А.Г. Шилов, Т.Е. Себелева, Д.Н. Стрункин, Е.Р. Черных, ЕЛ. Гельфгат, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Участие экзогенной ДНК в молекулярных процессах, протекающих в соматической клетке // Информационный вестник ВОГиС. 2008. Т. 12, № 3, стр. 426-473. (перечень ВАК)

4. Е.В. Долгова, В.А. Рогачев, В,П. Николин, Н.А. Попова, А.С. Лихачева, Е.А. Алямкина, Т.Е. Себелева, Е.Р. Черных, ЕЛ. Гельфгат, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Лейкостимулирующее действие фрагментов экзогенной ДНК, защищенных прогамином, при вызванной циклофосфаном миелосупрессии мышей // Вопросы онкологии. 2009. Т. 55, № 6, стр. 761764. (перечень ВАК)

5. Е.А. Алямкина, А.С. Лихачева, В.П. Николин, Н.А. Попова, Е.В. Долгова, В.А. Рогачев, Т.Е. Себелева, Д.Н. Стрункин, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Действие экзогенной ДНК, ассоциированной с протамином, на рост экспериментальных опухолей мыши // Вопросы онкологии. 2009. Т. 55, № 6, стр. 765-768. (перечень ВАК)

6. А.С. Лихачева, В.А. Рогачев, О.В. Врацких, Л.В. Мечетина, Т.Е. Себелева, Л.А. Якубов, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Качественные и количественные характеристики экстраклеточной ДНК, доставляемой в ядра живых клеток // Цитология. 2007 Т.49, №9, стр. 770. II Съезд Общества клеточной биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Института цитологии РАН. 2007 октябрь, Санкт-Петербург.

7. А.С. Лихачева, В.А. Рогачев, Л.В. Мечетина, А.Г. Шилов, Т.Е. Себелева, Л.А. Якубов, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Естественная коррекция генов человека путем воздействия фрагментированной экстраклеточной ДНК на примере восстановления активности гена каспазы 3 клеток аденокарциномы MCF-7 // Цитология. 2007 Т.49, №9, стр. 770-771. II Съезд Общества клеточной биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Института цитологии РАН. 2007 октябрь, Санкт-Петербург.

8. В.А. Рогачев, Е.А. Алямкина, А.Г. Шилов, С.С. Богачев. Восстановление гена каспазы 3 клеток культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 при ее культивировании с фрагментированной ДНК человека // Материалы съезда, часть II, стр. 83. Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 2009 июнь, Москва.

Подписано к печати 11.10.2011 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ №61

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рогачёв, Владимир Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.!.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 История вопроса о мутагенном влиянии экзогенной ДНК.

1.2 Пути интернализации экзогенной ДНК в соматическую клетку.

1.3. Интеграция в реципиентный геном как путь утилизации интернализованных в ядерном пространстве фрагментов экзогенной ДНК.

1.3.1. Репарация по механизму гомологичной рекомбинации.

Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации.

1.3.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК.

Захват фрагментов ДНК.

1.4. Базовая концепция, характеризующая воздействие фрагментов экзогенной ДНК на соматическую клетку.

1.5. Общеклеточная рекомбиногенная ситуация, возникающая при нарушении систем контроля клеточного цикла (СИекрот!;). Влияние доступности хроматина на интеграцию фрагментов экзогенной ДНК

1.6. Особенности биологии раковой клетки.

1.6.1. Характеристика основных свойств неопластической клетки.

1.6.1.1. Нарушения регуляции клеточного цикла.•.

1.6.1.2. Изменения морфологии и движения клеток.

1.6.1.3. Отсутствие репликативного старения (иммортализация).

1.6.1.4. Изменения регуляции апоптоза. 1.6.1.4.1. Рецептор - зависимый апоптоз.

1.6.1.4.2. Каспазы.1.

1.6.1.4.3. Митохондриальный путь.

1.6.1.4.4. Семейство Вс1-2 протеинов.

1.6.1.4.5. Апоптоз и пролиферация.

1.6.1.4.6. Фагоцитоз апологических тел. 1.6.1.5. Генетическая нестабильность.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интернализация экзогенной ДНК в клетках культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и ее участие в процессе восстановления активности гена Каспазы-3"

Актуальность ;

Существует ограниченное количество современных работ, описывающих взаимоотношения экзогенной ДНК и клетки, а именно: что за ДНК, и, в какой форме присутствует в межклеточном пространстве; как происходит захват ДНК из

- I ■ • ■ ■ околоклеточного пространства; что происходит с ДНК в цитоплазме; каким образом ведет себя ДНК в; ядре. Еще меньшее количество работ позволяют

• ‘ . . . ‘ ! • • проследить судьбу экзогенной ДНК;В целом, начиная от момента ее попадания в межклеточную среду (плазма крови и межтканевая жидкость) вследствие апоптоза или иньт клеточных процессов; захватом; клеткой; доставкой- во внутренние компартменты клетки и интеграции* в реципиентный генома или утилизации? иным способом: В настоящее время, отсутствует разработанная концепция' оборота экстраклеточной ДНК как генетической информации, дающая четкое представление о молекулярно-биологических; характеристиках и функциональных < возможностях этой ДНК в каждом моменте: клеточного; цикла:. Тем не менее, каждый из указанных этапов в разной степени изучен-и представляет часть знанияг необходимого для понимания общей картины этого сложного многофакторного -процесса 1

Многочисленные данные, полученные в: настоящее время, свидетельствуют о том, что в межтканевых: жидкостях и в плазме крови в норме всегда' присутствует ДНК, которая является постоянным компонентом этих тканей организма! (Anker et .al1999; Anker, 2000). Более того, количество" ДНК' плазмы отражает функциональное состояние организма в целом: '

Начальным этапом взаимодействия клетки и экстраклеточнош ДНК является их контакт и преодоление экстраклеточным. материалом цитоплазматической; мембраны; Согласно1» проведенным в, последнее: десятилетие исследованиям установлено, что существует несколько; путей; проникновения; ДНК во внутриклеточное пространство. Проникновение экстраклеточной ДНК внутрь клетки может проходить за счет поглощения апоптозных телец; причем делать это могут различные клетки организма. (Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002). Описан рецептор. - опосредованный путь проникновения; экстраклеточнош 10 . материала ДНК во внутренние компартменты эукариотической клетки. За этот путь доставки молекул ■ ДНК отвечают рецепторы, расположенные на цитоплазматической мембране (Loke et al., 1989; Bennett et al., 1985; Zamecnik et al., 1994). ДНК проникает внутрь клетки в течение очень короткого времени. При этом проведенные исследования подтверждают тот факт, что этот процесс не связан с деградацией ДНК и последующим ее ресинтезом внутри клетки (Ledoux, Charles, 1972). ■

• • i . , ■ ■ , публикованы, результаты* многочисленных экспериментов^ по? изучению мутагенного эффекта экзогенной ДНК на эукариотические организмы.Главное на что указывается, в этих работах это то,, что существует трансформация! признака» ’ ' і ' ' ' 1 . - • • • • • связанная с воздействием; экстраклеточной ДНК. Трансформация? возможна? как в» культуре клеток, так, и в живом организме. Полученные факты свидетельствуют, of том;, что экстраклеточная* ДНК может восприниматься* как, генетическая-информация- и проявляться.; как фенотипический признак (Еершензон, 1939, 1966,

1975; 1996; Еершензощ.Александров! 1982; Garcia-01mo ^ a/;, 1999; Garcia-01mo>er al., 2000; Ledoux, 1965; Pulciani е/я/., 1982). . '

- ■ ’ I ' , ' ‘ • - .

Разработка, концепции оборота экстраклеточной ДНК как генетической информации является важнейшей основой генной терапии будущего охватывающей? все: аспекты целенаправленного! контролируемого- изменения генома соматических клеток человека и исправления генетических дефектов и несоответствий- врожденно; детерминированных или; возникших, в результате ВНЄШНИХі воздействий.

Одной из моделей позволяющих; определить некоторые молекулярные особенности взаимодействиям соматической раковой* клетки, и экстарклеточной экзогенной: ДНК является модель» культуры клеток» аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. В предлагаемом исследовании мы акцентировали внимание на изучении поведения фрагментированной экстраклеточной ДНК при ее проникновении в клеточные компартменты клеток линии MCE 7, и проверки гипотезы о возможности переноса генетического материала. Мы полагали, что в процессе, культивирования в определенном количестве клеток за счет существующего механизма переноса генетической информации из экзогенной ДНК произойдет возвращение к исходному генотипу на: примере мутированного гена каспазы 3. При этом новое состояние ДНК и фенотипическое проявление здорового гена каспазы 3 можно будет проверить экспериментально.

Цели и задачи работы

Цель работы - исследовать воздействие экзогенной ДНК на модели культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека МСР-7 и возможности восстановления активности гена каспазы-3.

В рамках целей предлагаемой работы были поставлены следующие задачи: I

1. Определить параметры поглощения экзогенной ДНК’ клетками культуры аденокарциномы молочной железы человека МСР-7.

2. Проанализировать взаимодействие экзогенной ДНК и реципиентного клеточного генома. Выяснить, происходит ли изменение фенотипа клеток и восстановление функциональной активности фермента каспазы 3 при инкубации культуры клеток МСР-7 с экзогенной ДНК человека. ■

3. Установить, связано ли восстановление функциональной активности фермента с исправлением мутации в 4 экзоне гена каспазы 3 клеток,МСР-7 под- действием экзогенной ДНК человека.

Научная новизна I

1. Обнаружено, что экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до минуты) достигает всех основных компартментов (цитоплазма, ядро) клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека МСР-7. . . ' ‘

2: Установлено, что ДНК накапливается во внехромосомной фракции клеточного ядра клеток культуры МСР-7. Во внехромосомной фракции клеток МСР-7 может постоянно присутствовать до 2.0% от гаплоидного генома фрагментированной I экзогенной ДНК ’

3. Показано, что линейный размер исходной фрагментированной ДНК, депонированной во внехромосомной фракции, возрастает от 200 - 500 п.н. до порядка 10 000 п.н. Увеличение размера является следствием лигирования фрагментов между собой. i 12

4. Молекулярно - генетическими методами доказано, что восстановление функциональной активности фермента каспазы 3 линии MCF-7 связано с I реверсивным исправлением дефектного локуса гена. I

Практическая значимость

Даны качественная и количественная характеристики экзогенной ДНК доставляемой в основные клеточные компартменты (цитоплазма, ядро) соматической клетки:

Обнаружен эффект восстановления активности housekeeping гена Каспазы 3 произошедший в результате естественных репаративно-рекомбинационных процессов между хроматином соматической раковой клетки и гомологичного фрагмента экстраклеточной ДНК. Полученные результаты позволяют определить один! из векторов генной терапии как возможность изменять генетический статус и фенотип малегнезированный клетки за счет длительного присутсвия в окружении раковой клетки достаточного количества экстраклеточной терапевтической ДНК в виде фрагментов размером 200-6000 п.н. w содержащей всю совокупность геномных последовательностей в немутантной форме.

Апробацияфаботы

Результаты работы представлены в материалах совещания «Функциональная организация клеточного ядра» (Прага, 5-8 мая 2006 г.), международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 30 июля —3 августа 2006 г.), международной молодежной научно-методической конференции

Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), II Съезда общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии. РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 21-27 июня 2009 г.). По теме диссертации опубликованы 5 работ в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

13

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой МСР-7 проводилась совместно с к.б.н. Л.В. Мечетиной и с.н.с. А.Г. Шиловым (ИХБиФМ СО РАН). Молекулярно - биологические эксперименты проводились под руководством д.б.н. С.С. Богачева с участием к.б.н. А.С. Лихачевой (ИЦиГ СО РАН).

Структура и объем работы I

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рогачёв, Владимир Алексеевич

выводы

По результатам, полученным в данном исследовании, были сделаны следующие выводы: I

1. Экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до минуты) достигает всех основных клеточных компартментов (цитоплазма, ядро) клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека МСР-7.

2. Установлено, что экзогенная ДНК накапливается во внехромосомной фракции ядра. Постоянно во внехромосомной фракции может присутствовать фрагментированная экзогенная ДНК в количестве до 2.0% от гаплоидного генома клетки.

3. Линейный размер исходной фрагментированной ДНК, депонированной во внехромосомной фракции, возрастает от 500 п.н. до порядка 10 ООО п.н. Увеличение размера является следствием лигирования фрагментов'между собой.

4. Используя в качестве модели делецию в гене каспазы 3 показано, что инкубация с экзогенной ДНК культуры клеток МСР-7, несущей, указанную делецию, приводит к появлению характерной апоптотической нуклеосомной фрагментации хроматина. Фрагментация связана с реверсивным исправлением дефектной нуклеотидной последовательности гена каспазы 3, что предполагает/, восстановление функциональной активности фермента.

5. При увеличении времени инкубации с экзогенной1 ДНК процент клеток, I которые несут фрагмент ДНК, соответствующий исправленному локусу гена каспазы 3, и количество клеток, вступающих в апоптоз, увеличивается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что при указанных экспериментальных условиях (культура клеток MCF-7, концентрация ДНК? количество клеток, реакционные среды) в ядро доставляется и постоянно присутствует во внехромосомной фракции определенное количество экзогенной экстраклеточной ДНК. Во внехромосомной фракции экзогенная экстраклеточная ДНК претерпевает изменения, увеличивающие ее линейный размер до порядка 10 т.п.н.

Экстраклеточная ДНК, депонированная во внехромосомной фракции, может выступать тем субстратом, который используется клеткой при? активном! репарационно-рекомбинационной ситуации, непрерывно существующею в -раковой клетке, для осуществления гомологической репаративной рекомбинации. Обмен гомологичными * сегментами и замещение мутантных локусов в процессе постоянного притока экстраклеточной ДНК, возможно, происходит по* механизму, описанному в работах (Li et al., 2001; Langston, Simington, 2004), когда сформированные одноцепочечные филаменты обоих краев экзогенного фрагмента находят гомологию в. хромосоме и образуют гетеродуплекс, который не захватывает срединную1 часть последовательности. Когда область гетеродуплекса удовлетворяет всем необходимым условиям при* сформированном рекомбинационной машине, происходит обмен между найденными* областями гомологии. При ■ этом! внутренняя часть терапевтического фрагмента интегрирУет в хромосому и становится единым целым с ней независимо от наличия значимой гомологии в центре фрагмента. '

Проведенные1 эксперименты свидетельствуют о том, что мутантный участок хромосомы 3 экзона 4 клеток MGF-7, заместился на фрагмент экзогенной экстраклеточной ДНК, не несущий делецию. При этом произошло восстановление генной 1 функции. Полученные данные предполагают, что интеграция экстрахромосомальной ДНК экстраклточного происхождения в реципиентную хромосому и восстановление функции гена была достигнута при гомологическом обмене соответствующего участка хромосомы и терапевтического экстрахромосомального фрагмента.

Мы полагаем, что роль экстраклеточной ДНК в горизонтальном переносе генетического материала только начинает осознаваться и что многие явления молекулярной биологии клетки могли бы быть глубже поняты при массированной экспериментальной проверке данной концепции и ее принятии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рогачёв, Владимир Алексеевич, Новосибирск

1. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост // Бм <^—2000. Т. 65. вып. 1. С. 127-138. .

2. Гершензон С.М. Вызывание направленных мутаций у Юге—^224melanogaster // Доклады Академии Наук СССР.1989.Том XXV, № 3 227. '

3. Гершензон С.М. Избирательность мутагенного действия ДНК и полинуклеотидов // Ж. Общей Биол. 1996. Т. 57. С. 661-683.

4. Гершензон С.М. Мутагенное действие ДНК и проблема напраз-з' мутаций //Генетика № 5. 1966. Май. С. 2-15.

5. Гершензон С.М.,. Александров Ю.Н. Мутагенное действие приро, синтетических полинуклеотидов и проблема направленных мут Журнал общей биологии. 1982.Т.ХЫП, № 6. С. 747-763.

6. Гершензон С.М., Александров Ю.Н., Малюта С.С. Мутагенное дI

7. ДНК и вирусов у дрозофилы // К. Наукова думка. 1975. С. 158.

8. Глазунова В.А., Штиль А.А. Митохондриалтные механизмы апоптоза на повреждение ДНК // Мол. Биол. 2008. Т. 42. № 5. С. 765-771.

9. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы // М. Мир. 1988. С. 538

10. Гранов А.М., Молчанов О.Е. Канцерогенез и иммунобиология о Фундаментальные и клинические аспекты // Вопросы онкологии. 2008 —4. С. 401-409.

11. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генегика бактерий // М. Мир. 1984. С. 1 —

12. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук:1.как

13. Васильева А.К., Архангельская А.А., Хряпенкова Т.Г. Митохондр.многоликий Янус//Биохимия. 2007. Т. 72. В. 10. С. 1371-1384.1

14. Карпова, И.С. Получение мутаций у Bacillus subtilis с помощью чужер ДНК// Молек. Биол. К. Наукова думка, 1979. вып. 23. С. 61-72.

15. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: iczr пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. вып. 1. С. 5-33.ои101

16. Копнин Б.П. Неопластическая клетка: основные свойства и механизмы их , возникновения // Практическая онкология. 2002. Т. 3 № 4. С. 229-235.

17. Душников У.Ф., Абросимов АЛО. Гибель клетки (апоптоз)// М. Медицина,2001. С. 192. '16. | Маниатис Е., Фрич. Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.

18. Молекулярное клонирование: Пер: с англ.//М.: Мир, 1984. С.480.'

19. Моргункова А.А'. Семейство генов р53: контроль клеточной пролиферации и программ развития организма // Биохимия: 2005. Т. 70. вып. 9: С. 1157-1176.

20. Николин В.П., Г1опова Н.А., СебелеваТ.Е., Стрункин Д;Н„. Рогачев В:А.,. Семенов Д.В., Богачев С О.,. Якубов Л.А., ШурдовМ.А. Влияние экзогенной

21. ДНК на рост экспериментальных опухолей // Вопросы онкологии. 2006а. Т.52. № 1. С. 66-69.

22. Попов Л.С., Корочкин, Л.И. Генетически программированная: смерть клеток. (апоптоз) // Генетика. 2004. Т. 40. С. 149-166.

23. Русинова Г.Г., Шарова Э.Г., Либинзон. Р;Е. Судьба гомологичной игетсрологичной ДНК в организме животных//Биохимия, 1969, Т. 34, вып.З,1. С.464-471. ;

24. Самуилов, В.Д., Олескин, А.В1., Лагунова, Е.М; Программируемая клеточная; смерть//Биохимия; 2000. Т. 65. № 8. С. 1029-1046.

25. Фильченков< А.А. Каспазы: регуляторы апоитоза и других клеточныхфункций//Биохимия. 2003^ Т, 68’ №4:. С. 453-456.

26. Хегай И*И:, Богачев С.С., Оськина И.II. Попова Н.А., Семенов Д.В., Шурдов М.А., Якубов Л .А. Изменение симптоматики гипоталамичсского несахарного диабета5 после: воздействия^гомологической экзогенной ДНК // Докл: РАН. 2004. Т. 396. № 4. С. 571-573;

27. Челобанов Б.П;, Лактионов П.П., Власов В.В. Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот // Биохимия. 2006. Т. 71. вып. 6: С. 725-741.102 ,

28. Чумаков ГТ.М. (Функция гена р53: выбор между жизнью и смертьЮ ^ Биохимия. 2000. Т. 65. вып. 1. С. 34-47.

29. Д1естова О.Е., Андреева А.Ю., Власов В.В. Якубов JI.A. Тр&йСГЮРткомплексов олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности в клеточное ядро // ДАН. 1999. Т. 368. С. 264-267. 1

30. Широкова А.В. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и в°ДногоIбаланса клетки. // Цитология. 2007. Т. 49. № 5. С. 385-394.

31. Якубов JI.A., Петрова Н.А., Попова Н.А. и др. Роль экстраклеточной вподдержании постоянства и изменчивости клеточных геномов. // ДокЛ2002. Т. 382. № 3. С. 406-410.

32. Abaji С., Cousineau- I., Belmaaza A. BRCA2 regulates horn°l°^OUS recombination in response to DNA damage: implications for genome stability aP carcinogenesis // Cancer Res. 2005. V. 65. № 10. P. 4117-4125.

33. Adams J. Ways of during: multiple pathways to apoptosis.// Gens and X^eve^2003. V.17. P. 2481-2495. '

34. Amyere М., Mettlen M., Van Der Smissen P. et al. Origin, originality, fUtlCti°ns’subversions and molecular signalling of macropinocytosis // Int J Med Мдс1:0^0^2002. V. 291. №6-7. P. 487-494. 1

35. Anker P. Quantitative aspects of plasma/serum DNA in cancer patients ^ Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. V. 906. P. 5-7.

36. Anker P., Jachertz D., Stroun M. et al. The role of extracellular DN.A- *ntransfer of information from T to В human lymphocytes in the cours^ 3X1 immune response // J. Immunogenet. 1980. V. 7. № 6. P. 475-48(1. *

37. Anker P., Mulcahy H., Chen X.Q., Stroun M. Detection of circulating 'tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients // Cancer Metasta^i^ Rev1999. V. 18. № l.P. 65-73.

38. Anker P., Mulcahy H., Stroun M. Circulating nucleic acids in plasma an<^ serum as a noninvasive investigation for cancer: Time for large-scale clinical stix^ *1.t J Cancer, 2003, V. 103(2), P. 149-152. ' ’

39. Apian P.D. Causes of oncogenic chromosomal translocation // Trends in Gr^?:lie*ics'2006. V. 22. № l.P. 46-55.

40. Arias-Lopez C., Lazaro-Trueba I., Kerr P. et al. p53 modulates homologousrecombination by transcriptional regulation of the RAD51 gene // The EMBO Rep. 2006. V. 7. № 2. P. 219-224. ,

41. Ashkenazi A., Dixit V. M. Death Receptors: Signaling and Modulation // Science. 1998. V. 281. P. 1305-1308.

42. Ayares D., Chekuri L.s Song K.Y., Kucherlapati R. Sequence homology requirements for intermolecular recombination in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. № 14. P. 5199-5203.

43. Bartsch S., Kang L.E., Symington L.S. RAD51 is required for the repair ofplasmid double-stranded DNA gaps from either plasmid or chromosomaltemplates // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. № 4. P. 1194-1205.

44. Baumann P., West S.C. Role of the human RAD51 protein in homologous ■ recombination and double-stranded-break repair // Trends Biochem. Sci. 1998. V.23. №7. P. 247-251.I

45. Bennett R.M., Gabor G.T. Merritt M.SM. DNA binding to human leukocytes.1

46. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of ,l DNA // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. № 6. P. 2182-2190.

47. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M. et al. Horizontal transfer of oncogenesby uptake of apoptotic bodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 11. P. 6407-6411.

48. Bergsmedh A., Szeles A., Spetz A.L., Holmgren L. Loss of the p21(Cipl/Wafl) cyclin kinase inhibitor results in propagation of horizontally transferred DNA // Cancer Res. 2002. V. 62. № 2. P. 575-579.

49. Bhargava P.M., Shanmugam G. Uptake of nonviral, nucleic acids by mammaliancells // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1971. V. 11. P. 103-192.I

50. Blume-Jensen P., Hunter T. Oncogenic kinase signalling // Nature. 2001. V. 411.1. P. 355-365.

51. Bolderson E., Scorah J., Helleday T. et al. ATM is required for the cellular response to thymidine induced replication fork stress // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. №23. P. 2937-2945.

52. Budker V., Budker T., Zhang G. et al. Hypothesis: naked plasmid DNA is takenup by cells in vivo by a receptor-mediated process // J Gene Med. 2000. V. 2. № 2.i 11. P. 76-88.I

53. Cavenee W.K., Dryja T.P., Phillips R.A. et al. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma // Nature. 1983. V. 305. № 5937. P. 779-784.i

54. Cell. 2007. V. 130. P. 223-233.

55. Conner S.D., Schmid S.L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. 2003. V. 422. № 6927. P. 37-44.

56. Cruns V., Yuan J. Protease to die for. // Gens and Devel. 1998. V. 12. P. 15511570.

57. Danial N. N., Korsmeyer S. J. Cell death: critical control points. // Cell. 20041 V.116. P. 205-219. ,

58. D'Anjou H., Chabot C., Chartrand P. Preferential accessibility to specific genomicloci for the repair of double-strand breaks in human cells // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32. №20. P. 6136-6143. '

59. De Diesbach P., Berens C., N'Kuli F. et al. Identification, purification and partialIcharacterisktion of an oligonucleotide receptor in membranes of HepG2 'cells // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. № 4. P. 868-874.

60. Evan G.I., Vousden K.H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer // Nature. 2001. V. 411. P. 342-348.

61. Gao C., Purge K., Koeman J., Su Y., Cutler M.L., Werts A., Haak P., Vande Woude G.F. Chromosome instability, chromosome transcriptome, and clonal evolution of tumor cell populations // Pnas. 2007. V. 104. P. 8995-9000.

62. Garda-Olmo D., Garcia-Olmo D.C., Ontanon J., Martinez E. Horizontal transfer of DNA and the «genometastasis hypothesis» // Blood. 2000. V. 95. № 2. P. 724725.

63. Gottlieb B., Beitel L.K., Trifiro M., Will knowledge of human genome variation result in changing cancer paradigms? // BioEssays. 2007. V. 29. P. 678-685.

64. Gottlieb T.A., Ivanov I.E., Adesnik M., Sabatini D.D. Actin microfilaments play a critical role in endocytosis at the apical but not the basolateral surface of polarized epithelial cells // J.Cell Biol. 1993. V. 120. № 3. P. 695-710.

65. Gray W.J., Colins C. Genome changes and gene expression in human solid tumors // Carcinogenesis. 2000. V. 21. P. 443-452.

66. Green D. R. Apoptotic Pathways: Ten Minutes to Dead // Cell. 2005. V. 121- P671.674. • '

67. Green D. R:, Reed J., C. Vitochondria and apoptosis.// Science. 1998. V. 281* P-1309-1316.I

68. Hall S.E., Savill J.S., Henson P., Haslett C. Apoptostic neutrophils arephagocytosed by fibroblast with participation of the fibroblast vitronectin receptor and'involvement of mannose/fucose-specific lectin // J. Immunol. 1994. V. 153- P-3218. ,

69. Hanahan D., Weinberg R.A. The Hallmarks of Cancer // Cell. 2000. V. 100. P- ^770. I ’

70. Hanss B., Leal-Pinto E., Bruggeman L.A. et al. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V- 95.i• № 4: P. 1921-1926. ‘ 1I

71. Hastings P.J., McGill C., Shafer B., Strathem J.N. Ends-in vs. ends-°utrecombination in yeast // Genetics. 1993. V. 135. № 4. P. 973-980.i

72. Hefeneider S.H., Bennett R.M., Pham T.Q. et al. Identification of a cell-sturface DNA receptor and its association with systemic lupus erythematosus // J Invest Dermatol. 1990. V. 94. P. 79-84.

73. Helleday T. Pathways for mitotic homologous recombination in mammalian cells // Mutat Res. 2003. V. 532. № 1/2. P. 103-115.

74. Herz J., Strickland D.K. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptort

75. J Clin Invest. 2001. V. 108. № 6. P. 779-784. '

76. Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E. et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood. 1999. V. 93. № 11. P. 3956-3963.

77. Ira G., Haber J.E. Characterization of RAD51-independent break-induced replication that acts preferentially with, short homologous sequences // Mol. Cell

78. Biol! 2002. V. 22. №18. P. 6384-6392.

79. Jiang G., Sancar A. Recruitment of DNA damage checkpoint proteins to damage in transcribed and nontranscribed sequences // Mol. Cell Biol. 2006. V. 26. № 1. P. 39-49.

80. Janicke R. U., Sprengart M. L., Wati M.R., Porter A. G. Caspase-3 requred for

81. DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis // J: Biol. Chem. 1998. V. '273. № 16. P. 9357-9360. 1

82. Karpfel Z., Slotova J. Chromosome aberrations caused by exogenous deoxyribonucleic acids // In: Genetic variations in somatic cells. Prague:

83. Academia. 1965. P. 127-132. ,i

84. Karpfell Z., Slotova J., Palecek E. Preliminary notes // Experimental. Cell Research. 1963. V. 32. P. 147-216.

85. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., HarashimaH. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. № 1. P. 32-45.

86. Kohzaki M., Hatanaka A., Sonoda E. et al. Cooperative roles of vertebrate Fbhl and Blm DNA helicases in avoidance of crossovers during recombination initiatedby replication fork collapse // Mol. Cell Biol. 2007. V. 27. № 8. P. 2812-2820.

87. Koulintchenko M., Konstantinov Y., Dietrich A. Plant mitochondria activity import DNA via the permeability transition pore complex // EMBO J: 2003. V. 22. P. 1245-1254.

88. Kucherlapati R.S., Eves E.M., Song K.Y. et al. Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by treatment of input DNA //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81.'№ 10. P. 3153-3157.

89. Langston L.D., Symington L.S. Gene targeting in yeast is initiated by twoindependent strand invasions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 43.1. P. 15392-15397.

90. Lawen A. Apoptosis-an introduction // Bioessays. 2003. V. 25. № 9. P. 888-896. '

91. Leal-Pinto E., Teixeira A., Tran B. et al. Presence of the nucleic acid, channel in renal brush-border membranes: allosteric modulation by extracellular calcium //

92. Am J Pliysiol Renal Physiol. 2005. V. 289. № 1. P. 97-106.

93. Ledoux L.' Uptake of DNA by living cells // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.1965. V. 4. P. 231-267. •

94. Ledoux, L., Charles P. Fate of exogenous DNA in mammals // In Uptake of Informative Molecules by Living Cells / Ed. L. Ledoux. North-Holland Publishing Company, Amsterdam, 1972. P. 397-413.

95. Lee S.H., Oshige M., Durant S.T. et al. The SET domain protein Metnase mediatesforeign DNA integration and links integration i to nonhomologous end-joining repair // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 50. P. 18075-18080. ^i";

96. Lees-Miller S.P., Meek K.- Repair of DNA double strand breaks by non-^homologous end joining V/Biochimie. 2003. V. 85.,№ 11. P. 1161-1173.

97. Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein. B. Genetic instabilities in human cancers Si; ,l //Nature. 1998. V. 396. P. 643-648.

98. Leon S.A., Shapiro B., Sklarofi D.M., Yaros, M.J. Free DNA in the serumrof*„cancer patients and the effect of therapy // Cancer Res. 1977. V. 37. № 3. P. 646650. .

99. Leung W., Maikova A., Haber J.E. Gene targeting by linear duplex DNAfrequently occurs by assimilation of a single strand that is subject to preferentialmismatch correction // Proc;,Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 13. P- 68516856. . .

100. Li J., Read L.R.„ Baker M.D. The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with, the formation of long regions of heteroduplex-DNA associated with two crossing-over events // Mol. Cell Biol. 2001. V. 21. № 2. P. 501-510.

101. Likhacheva A.S., Nikolin V.P., Popova N.A. Rogachev V.A, Prokhorovich M.A,

102. Sebeleva T.E, Bogachev S.S, Shurdov M.A. Exogenous DNA can be captured by stem cells and be involved in their rescue from death after lethal-dose y-radiation // Gene Ther. Mol. Biol. 2007b. V. 11. P. 305-314. 1 '

103. Lin J., Krishnaraj R., Kemp R.G. Exogenous ATP enhances calcium influx iniintact thymocytes // J. Immunol. 1985. V. 135. № 5. P. 3403-3410.• l

104. Lin, Y., Waldman A.S. Capture of DNA sequences at-double-strand breaks in mammalian chromosomes // Genetics. 2001’. V. 158:*№ 4. P. 1665-1674.

105. Lisby M., Barlow J.H., Burgess R.C., Rothstein R. Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins // Cell: 2004: V. 118. № 6. P. 699-713.I

106. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. • Characterizations of oligonucleotide transport into living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. № 10. P. 3474-34781j

107. MacFarlane M., Williams A.C. Apoptosis and disease: a life or death decision.//

108. EMBO reports. 2004. V. 5. № 7. P. 674-678. : *

109. Orr-Weaver T.L., Szostak J.W., Rothstein R.J. Yeast transformation: a modelsystem for the study of recombination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. №10. P. 6354-6358. ' 1

110. Paques F., Haber J.E. Multiple pathways of recombination* induced by doublestrand breaks in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V.i63. №2. P. 349-404.

111. Philchenkov A., Zavelevich V., Kroczak T.J., Los M. Caspases and cancers:mechanisms of inactivanion and treatnt modalities //Exp. Oncol. 2004. V. 26. №2 P 87-97. ,

112. Perucho M:, Hanahan D., Wigler M. Genetic, and physical linkage of exogenousisequences in transformed cells // Cell. 1980. V. 22. P. 309-317.t

113. Philchenkov A., Zavelevich M., Kroczak T.J., Los‘M. Caspases and cancer: mechanism of inactivation and new treatment modalities // Exp. Oncol. 2004. V.26. № 2. P 82-97.

114. Ponder B.A.J. Cancer genetics //Nature. 2001. V. 411. P. 336-341.

115. Pulciani S., Santos E., Lauver A.V. et al. Oncogenes in solid human tumours // Nature. 1982. V. 300. № 5892. P. 539-542.

116. Richardson C., Stark J.M., Ommundsen M., Jasin M. Rad51 overexpression promotes alternative double-strand break repair pathways and genome instability // Oncogene. 2004. V. 23. № 2. P. 546-553.

117. Rodrigue A., Lafrance M., Gauthier M.C. et al. Interplay between human DNA repair proteins at a unique double-strand break in vivo // The EMBO J. 2006. V.25. № l.P. 222-231.

118. Rubnitz J.s Subramani S. The minimum amount of homology required for homologous recombination in mammalian cells // Mol: Cell Biol. 1984. V. 4. №11. P. 2253-2258.

119. Saaristo A., Karpanen T., Alitalo K. Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis // Oncogene. 2000. V. 19. P. 6122-“ 6129

120. Saintigny Y., Lopez B.S. Homologous recombination induced by replication inhibition, is stimulated by expression of mutant p53 // Oncogene. 2002. V. 21. №3. P. 488-492.i

121. Savill J., Fadok V., Henson P., Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis // Immunol. Today. 1993. V. 14. № 3. P. 131-136.

122. Sherr C.J. Cancer Cell Cycles // Science. 1996. V. 274. P. 1672-1677.1

123. Sherr C.J. The Pezcoller Lecture: Cancer Cell Cycles Revisited // Cancer Res.2000. V. 60. P. 3689-3695.1..

124. Shi F., Gounko N.V., Wang X. et al. In situ entry of oligonucleotides into brain cells can occur through a nucleic acid channel // Oligonucleotides. 2007. V. 17. №1. P. 122-133.1..

125. Slebos R.J., Resnick M.A., Taylor J.A. Inactivation of the p53 tumor suppressorgene via a novel "A lu rearrangement // Cancer Res. 1998. V. 58. № 23. P. 53335336. 1123 . Smith K. Theoretical mechanisms in targeted and random integration of transgene

126. Symington L.S; Focus on recombinational DNA repair // The EMBO Rep. 2005:

127. V. 6. №6. P. 512-517. , ' '

128. Szekvolgyi L., Rakosy Z., Balint B;L. etal. Ribonucleoprotein-masked nicks at50.kbp intervals in the eukaryotic genomic DNA // Proc. Natl Acad.| Sci. USA.2007. V. 104. № 38. P. 14964-14969. .

129. Takata M., Sasaki M.S., Sonoda E. et al: The Rad51 paralog Rad5IB: promotes homologous recombinational repair// Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. № 17. P. 64766482.133; Tanaka H., Cao Y., BergstromD:A., Kooperberg C., Tapscott S.J., Yao M.

130. Intrastrand Annealing Leads to the Formation of a Large DNA Palindrome and Determines the Boundaries of Genomic Amplification in Human Cancer // Mol. Cel. Biol. 2007. V. 27. № 6. P. 1993-2002.

131. Thomas K.R., Deng C., Capecchi M.R. High-fidelity gene targeting in embryonic stem cells by using sequence replacement vectors // Mol. Cell Biol. 1992. V. 12. №7. P. 2919-2923.

132. Thomas K.R., Folger K.R., Capecchi M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome'// Cell. 1986. V. 44. № 3. P. 419-428.

133. Tutt A., Bertwistle D., Valentine J.‘ et al. Mutation in Brca2 stimulates error-prone homology-directed repair of DNA, double-strand" breaks occurring between repeated sequences // The EMBO J. 2001. V. 20. № 17.“ P. 4704^471(5.

134. Vispe S., Cazaux C., Lesca C., Defais M! Overexpression of Rad51 proteinii # stimulates homologous recombination and increases resistance of mammaliancells to ionizing radiation // Nucl. Acids Res. 1998: V. 26. №12. P. 2859-2864’.

135. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990. V. 247. № 4949. P. 1465-1468.

136. Zamecnik P., Aghajanian J., Zamecnik M. et al. Electron micrographic studies of transport of oligodeoxynucleotides across eukaryotic cell membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 8. P. 3156-3160.