Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфоров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфоров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганнческой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

На правах рукописи

Миронова Кристина Евгеньевна

Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирукнцих нанофосфоров для фотоиндуцированного разрушения

раковых клеток

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

7П15

005561601

Москва-2015

005561601

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. Л. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Научный руководитель: член-корр. РАН,

доктор биологических наук, проф. Деев Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: член-корр. РАН

доктор биологических наук, проф.

доктор биологических наук, проф.

Тоневицкий Александр Григорьевич, заведующий отделом трансляционной онкологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Московского Научно-исследовательского онкологического института имени П.И.Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Прасолов Владимир Сергеевич, заведующий лабораторией биологии клетки Федерального государственного бюджетного учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгардта Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное

образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова», Химический факультет

Защита состоится <30у> 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного

совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук по адресу. 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, а также на сайте института www.ibch.ru

Автореферат разослан « »Не-

ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В. А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В современной онкологии все большее значение приобретают высокотехнологичные методы диагностики и лечения, требующие при их разработке объединения физических, химических и биологических подходов для увеличения эффективности и безопасности лечения. Одним из таких методов является фотодинамическая терапия (ФДТ) - относительно новый, но уже широко используемый в клинике метод щадящего лечения онкологических заболеваний, который позволяет воздействовать на опухоль локально, активируя светом предварительно доставленный в опухоль химический фотосенсибилизатор (ФС), что приводит к образованию активных форм кислорода, вызывающих гибель клеток. В 2007 году в России данный вид терапии был внесен в «Перечень видов высокотехнологичной медицинской помощи, оказываемой за счет средств федерального бюджета в федеральных медицинских учреждениях». На сегодняшний день ФДТ с использованием низкомолекулярных ФС успешно применяется в лечении разных видов опухолей, однако имеет ряд недостатков: только поверхностное воздействие, недостаточная селективность и частое возникновение местных неспецифических реакций. Поэтому актуальной задачей является создание новых ФС, которые могли бы удовлетворять одновременно нескольким условиям: избирательно накапливаться в опухолевой ткани; не вызывать фотодерматит и другие побочные реакции; иметь высокий квантовый выход образования синглетного кислорода; обладать постоянством состава и свойств как при хранении, так и при введении в организм; не являться токсичными в отсутствие облучения и относительно быстро выводиться из организма.

Многие современные подходы к созданию ФС имеют своей целью адресную доставку молекул к опухоли. В настоящее время селективности добиваются либо путем пассивного накопления ФС в опухоли за счет различий в метаболизме и внутриклеточных процессах в опухоли по сравнению со здоровыми тканями, либо за счет химической конъюгации ФС с адресными молекулами, специфично связывающимися с опухолевыми клетками. Поскольку оба подхода имеют ряд значительных недостатков, создание адресных ФС, избирательно воздействующих только на опухолевые клетки определенного молекулярного профиля, остается весьма актуальной проблемой.

Достижения современной молекулярной онкологии в области изучения механизмов опухолевого перерождения и резистентности опухолей к терапии свидетельствуют о необходимости комбинированных подходов к лечению онкологических заболеваний. В клинической практике для усиления эффекта ФДТ часто прибегают к использованию

комбинированной терапии в сочетании с цитостатиками, и изучение их совместного действия с разрабатываемыми ФС также представляет важную задачу.

Используемые сегодня ФС, как правило, возбуждаются коротковолновым светом, не проникающим в глубь тканей, поэтому их применяют для лечения либо небольших поверхностных опухолей на коже и слизистой оболочке, либо опухолей на внутренней поверхности различных органов с локальной доставкой света оптоволокном в сочетании с лапароскопией. Актуальной проблемой является расширение области применения ФС, поиски решения которой лежат в двух направлениях: создание нового поколения ФС с максимумами поглощения в «окне прозрачности» биоткани (750-1000 нм), что позволит воздействовать на патологический очаг в глубине тканей, и поиск альтернативных подходов для доставки коротковолнового света в глубь тканей.

Разработка новых адресных ФС с улучшенными фотолюминесцентными характеристиками и поиск альтернативных подходов для доставки возбуждающего света в глубь тканей является важной задачей, решение которой позволит получить новые соединения, перспективные для фундаментальных исследований и терапии социально значимых опухолевых заболеваний, а также позволит создать общую методическую основу для конструирования аналогичных адресных ФС с другими иммунологическими характеристиками.

Цель работы: создание и изучение свойств флавинового рекомбинантного ФС, специфичного к опухолевым клеткам аденокарциномы молочной железы, и поиск подходов к доставке возбуждающего УФА1 и синего света в глубь тканей с использованием апконвертирующих нанофосфоров

Задачи:

1) Создание, физико-химическая и иммунохимическая характеристика рекомбинантного иммуноФС на основе флавинового белка и адресных мини-антител;

2) Изучение фотоцитотоксичности рекомбинантного иммуноФС, состоящего из флавинового белка и адресных мини-антител, на линии НЕК2/пеи-гиперэкспрессирующих опухолевых клеток;

3) Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров

а) Создание и исследование донорно-акцепторных пар, возбуждаемых ближним ИК-светом, на основе апконвертирующих нанофосфоров и рекомбинантного флавинового иммуноФС;

б) Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые получен и охарактеризован генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-miniSOG на основе адресных противоопухолевых мини-антител 4D5scFv и фототоксичного белка miniSOG. Показана опосредованная рецептором интернализация иммуноФС 4D5scFv-miniSOG и селективная фототоксичность по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека.

Впервые изучена возможность доставки УФА1 (340-400 нм) и синего света, возбуждающего флавиновые ФС, к опухолевым клеткам с использованием сочетания адресных флавиновых ФС и апконвертирующих нанофосфоров (НАФ). Впервые показана способность НАФ (донор энергии), характеризующихся УФА1 и синим излучением, передавать энергию возбужденного состояния на фототоксичный белок 4D5scFv-miniSOG (акцептор энергии) по механизму фёрстеровского резонансного переноса энергии и вычислен фгрстеровский радиус, отделяющий донор от акцептора. Впервые разработан способ адресной доставки НАФ к клеткам аденокарциномы молочной железы человека с помощью адресного полипептида DARPin-mCherry, специфичного к опухолевому рецептору HER2/neu. Впервые показана селективная фотоцитотоксичность адресного ФС HAO:DARPin-mCherry по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека при облучении ИК-светом.

Степень достоверности и апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: XI конференция «Лазеры и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и применения» (2014, Шатура); 5th International conference on advanced nanomaterials (2014, Авейру, Португалия); VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (2013, Москва, Россия); Международная молодежная научно-практическая конференция "Биофизика биоэнергетических процессов" (2013, Звенигород, Россия); IV International Symposium «Topical problems of biophotonics - 2013» (2013, Нижний Новгород, Россия); XXIV Зимняя молодежная научная школа ИБХ РАН «Перспективные

направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва, Россия); 16-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2012, Пущино, Россия).

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 118 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, заключения, списка цитируемой литературы, включающего 220 ссылки, и приложения. Диссертация содержит 41 рисунок и 3 таблицы.

Публикации

По материалам работы опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Разработка генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-miniSOG и характеристика его функциональных свойств

Одной из актуальных задач современной фотодинамической терапии (ФДТ) является разработка «адресных» фотосенсибилизаторов (ФС) для селективного воздействия на опухоль. Для этого ФС химически присоединяют к «адресной» молекуле, например, к моноклональному антителу, обладающему специфической аффинностью к определенному поверхностному опухолевому маркеру. В нашей лаборатории предложена концепция создания генетически кодируемых иммунофотосенсибилизаторов (иммуноФС) - гибридных белков, состоящих из адресного домена (мини-ангител) и цитотоксического эффекторного домена (фототоксичные белки). Так, в 2009 году впервые в мире был создан адресный генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-KiIIerRed, способный селективно поражать раковые клетки при возбуждении зеленым светом.

В данной работе генно-инженерным способом нами был сконструирован, получен в бактериальной экспрессионной системе и охарактеризован новый иммуноФС 4D5scFv-miniSOG.

Эффекторный домен в молекуле иммуноФС представлен флавопротеином miniSOG (mini Singlet Oxygen Generator), который способен продуцировать активные формы кислорода (АФК) при облучении синим светом. Данное свойство обусловлено наличием в составе флавопротеина простетической группы - окисленного флавинмононуклеотида (ФМН), который образуется в клетке из рибофлавина (Рф, витамина Вг).

Адресная часть иммуноФС представлена рекомбинантным гуманизированным мини-антителом 4D5scFv, специфичным к рецептору эпидермального фактора роста человека HER2/neu и содержащим в составе единой полипептидной цепи вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей молекулы иммуноглобулина. Домены 4D5scFv и miniSOG в сконструированном гибридном белке соединены при помощи гибкого пептидного линкера. ИммуноФС снабжен на С-конце пентагистидиновым пептидом.

Для наработки рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG клетки Е. coli штамма SB536 трансформировали полученной нами плазмидой pSD-4D5scFv-miniSOG, содержащей ген целевого белка под контролем 1ас-промотора. После оптимизации условий культивирования штамма был получен белок 4D5scFv-miniSOG с выходом 1.5 мг на 1 л культуры бактерий.

Целевой белок очищали при помощи Ni2+-NTA металл-аффинной хроматографии. Анализ фракций белка проводили с использованием электрофореза в 12.5% ПААГ в денатурирующих условиях. Было показано, что белок имеет молекулярную массу, близкую к расчетной (42 кДа; рис. 1А). Аутентичность белка подтвердили с помощью вестерн блот анализа (рис 1Б) и MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Было изучено, насколько сохранились свойства отдельных модулей в составе рекомбинантного белка, необходимые для его использования в качестве адресного иммуноФС. Анализ спектров поглощения и испускания белка 4D5scFv-miniSOG в сравнении с оптическими характеристиками исходного белка miniSOG (рис. 1В) показал, что при возбуждении 4D5scFv-miniSOG синим светом наблюдается его флуоресценция в зеленой области с максимумами 500 и 526 нм, что соответствует спектру испускания свободного miniSOG.

Способность полученного белка связываться с рецептором HER2/neu оценили методом поверхностного плазмонного резонанса (рис. 1Г)- Расчет показал, что константа диссоциации комплекса 4D5scFv-miniSOG с HER2/neu составляет 10±2 нМ, что близко к значению этого же показателя для свободного мини-антитела 4D5scFv (9±2 нМ). Таким образом, было доказано, что обе части бифункционального рекомбинантного белка сохранили свои свойства.

1 2 3 4 5 кДа

_ 200

_ 150

120

_ 100

■w-Л -—- SO

—, 70

i "ЧЯЦ — 60

>ж*жт 50

...... í>

: 4 . .. ( 40

f " , 30

—

Рисунок 1. Очистка и характеристика рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG. А -электрофорез в 12,5% SDS-ПААГ очищенного препарата белка 4D5scFv-miniSOG: 1- полный клеточный лизат до индукции, 2- лизат клеток после индукции; 3 - очищенная фракция 4D5scFv-miniSOG; 4- нерастворимая фракция; 5- маркер молекулярных масс Page RulerUnstained protein ladder (Fermentas). Б - результаты вестерн блот гибридизации очищенного белка с антигистидиновыми антителами (дорожки 1-4 соответствуют дорожкам 1-4 на рис. А). В - спектры поглощения и эмиссии белков miniSOG и 4D5scFv-miniSOG. Г -сенсограмма связывания белка 4D5scFv-miniSOG с рекомбинантным внеклеточным доменом рецептора HER2/neu, нанесенным на сенсорный чип СМ-5 в количествах 1500 и 5000 P.E.

Для исследования фототоксического действия полученного белка 4D5scFv-miniSOG в качестве модели для экспериментов in vitro использовали линию клеток аденокарциномы молочной железы человека (SK-BR-3) с повышенным уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu (~lxlО6 молекул HER2/neu на клетку). Гиперэкспрессия этого маркера характерна

также для клеток ряда опухолей яичников, легких, желудка, простаты и др. В качестве контроля использовали НЕР2/пеи-отрицательную линию клеток китайского хомяка СНО.

Предварительно провели оценку связывания иммуноФС 4D5scFv-miniSOG с поверхностью опухолевых клеток SK-BR-3 при помощи конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710-NLC) (совместно с ИОФ РАН им. A.M. Прохорова)1. Было продемонстрировано, что при инкубации клеток SK-BR-3 с иммуноФС в течение 1 ч при +4°С (условия, при которых исключена рецептор-опосредованная интернализация белка) 4D5scFv-miniSOG эффективно связывается с поверхностью клеток SK-BR-3 (рис. 2А). После дополнительных 30 мин инкубации при +37°С происходит проникновение 4D5scFv-miniSOG внутрь клетки (рис. 2Б), о чем свидетельствует равномерный флуоресцентный сигнал внутри клеток. В то же время на клетках СНО, которые не несут на своей поверхности рецептор HER2/neu, флуоресцентного сигнала не наблюдали.

;...... ;; -. ' v • ш^ЯЯш 1 Мембранная локализация

BHlEZuSH 50 pm 50 цт

Ннтерналщацнн

50 pm 50 pm

Рисунок 2. Конфокальные изображения клеток SK-BR-3 после инкубации с 4D5scFv-miniSOG при 4°С (А) и после дополнительных 30 мин инкубации при 37°С (Б). Левая панель соответствует изображениям клеток в проходящем свете, средняя панель - флуоресцентные изображения в зеленом канале, правая панель - наложение флуоресцентных изображений в зеленом и синем каналах. Ядра клеток окрашены красителем Hoechst 33342

1 Автор выражает благодарность Анастасии Рябовой за получение конфокальных изображений клеток

7

Для определения внутриклеточной локализации адресного иммуноФС 4D5scFv-miniSOG клетки линии SK-BR-3 инкубировали с иммуноФС, обрабатывали красителями органелл MitoTrackerRed (митохондрии) и LysoTracker Red (лизосомы) и помещали в СОг-инкубатор на 20 мин и 3 ч, соответственно. Было показано, что большая часть 4D5scFv-miniSOG в результате такой обработки попадает в лизосомы (рис.ЗА). Количественный анализ коэффициентов колокализации, выполненный с помощью пакета программ Carl Zeiss LSM-710-NLO, показал, что белок 4D5scFv-miniSOG содержится в 72% лизосом клетки и только в 28% митохондрий клетки (pnc.3Aiv и 3Biv). Эти данные служат дополнительным подтверждением тому, что белок проникает в клетку рецептор-опосредованным эндоцитозом.

4D5scFv-miniSOG I"

LysoTracker

Наложение I

4D5scFv-miniSOG I u

Рисунок 3. Определение внутриклеточной локализации 4D5scFv-miniSOG в клетках SK.-BR-3, окрашенных красителем митохондрий MitoTrackerRed (А) и лизосом LysoTracker Red (Б). Представлены микрофотографии флуоресценции 4D5scFv-miniSOG (i, зеленый канал), окрашенных органелл (ii, красный канал), наложение микрофотографий флуоресценции зеленого и красного каналов (iii), диаграммы рассеяния по частоте и интенсивности сигналов флуоресценции белка и окрашенных органелл(У1).

II. Изучение фотоцитотоксичности полученного белка на линии опухолевых клеток при облученни синим светом

Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG проводили in vitro с помощью стандартного МТТ-теста на клетках SK-BR-3, инкубированных в течение 1 ч при 37°С с белком 4D5scFv-miniSOG в диапазоне концентраций от 1 нМ до 500 нМ (рис.4А). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, обработанные отдельными компонентами

сконструированного иммуноФС - мини-антителом 405зсРу и фототоксичным белком ггишБСЮ, а также его кофактором ФМН (рис. 4Б). Было показано, что дозозависимое снижение жизнеспособности клеток ЗК-ВЛ-З происходит после обработки их иммуноФС 405зсРу-ппш8СЮ с последующим облучением, в то время как в отсутствие облучения токсичность не проявляется. Было показано, что 405зсРу-пнш5СЮ оказывает избирательное фотоцитотоксическое действие на клетки, гиперэкспрессирующие НЕЯ2/пеи, и не влияет на жизнеспособность НЕК2/пеи-отрицательных клеток СНО (рис. 4В).

<й да в о с

В 20

- 4D5scFv

- miniSOG

- FMN

4D5scFv-miniS3G (нМ)

4D5scFv or miniSOG a FMN taM)

—q— облучение —Q—без облучения —¿j— паклитаксел

100

4D5scFv-miniSOG (нМ)

Рисунок 4. Цитотоксичность 4D5scFv-miniSOG in vitro. Концентрационные кривые цитотоксичности 4D5scFv-miniSOG на клетках SK-BR-3 (А) и СНО (В) при различных условиях: наличие и отсутствие облучения, добавление таксола. На рис. Б представлены концентрационные кривые цитотоксичности отдельно взятых 4D5scFv, miniSOG и FMN на клетках SK-BR-3.

Относительная фототоксичность Ю50 (концентрация вещества, вызывающая 50% гибель клеток) белка 4В55сРу-гшш500 на клетках SK-BR-3 составила 160 нМ. Было показано также, что при наибольшей исследованной концентрации белка 405зсру-пшш800 - 500 нМ количество выживших клеток составило 21%. Сравнение показателя ГС50 полученного нами белка с литературными данными показало, что 405зсРу-гшт800 в 3 раза эффективнее, чем

ранее полученный в нашей лаборатории первый генетически кодируемый ФС 4055сРу-КШег11ес1 и в 4 раза эффективнее, чем применяемый в клинической практике низкомолекулярный фотосенсибилизатор Фотофрин.

В современной онкологии для увеличения эффективности лечения используют комбинированное воздействие на опухоль агентов с различным механизмом действия. Так, в клинической практике для увеличения эффекта ФДТ часто используют цитостатики -препараты, воздействующие на быстро делящиеся клетки. Для увеличения эффективности созданного нами иммуноФС мы использовали цитостатик паклитаксел, который ингибирует клеточный цикл в фазе и М. Для изучения совместного действия белка 4055сРу-гшш5СЮ с щггостатиком мы взяли паклитаксел в 1 нМ концентрации, вызывающей снижение жизнеспособности клеток БК-ВЯ-З до 40%. В этом случае также показана выраженная дозовая зависимость жизнеспособности клеток от концентрации 4055сРу-гшш5СЮ (рис. 4А). Использование комбинации 1 нМ паклитаксела и 250 нМ иммуноФС 4В55сРу-гшш8СЮ для воздействия на опухолевые клетки привело к их 100% гибели после облучения (рис. 4А).

В случае НЕ112/пеи-отрицательных клеток СНО сочетанное применение 405$сРу-гтитЗСЮ не усиливало действия 1 нМ паклитаксела (рис. 4В). Таким образом, цитотоксическое действие 405зсРу-тЫ5СЮ было избирательным по отношению к клеткам, гиперэкспрессирующим НЕ112/пеи, как при облучении, так и при сочетанном применении с паклитакселом.

Важной и актуальной проблемой при создании нового ФС является выяснение механизмов гибели клетки при его фотоиндуцированном воздействии, которая может проходить по типу некроза или апоптоза.

Для определения типа клеточной гибели морфологию опухолевых клеток, обработанных иммуноФС 4В55сРу-[гиш5СЮ, изучали непосредственно после облучения под микроскопом. Было обнаружено, что через 30 мин происходит увеличение клеток в размере, а также нарушение целостности мембраны. Известно, что такое грубое нарушение целостности клетки, которое, как правило, наблюдается сразу после воздействия, характерно для некроза. Клетки, не обработанные иммуноФС 4В55сРу-пнш500, но облученные в том же режиме, не проявляли видимых морфологических изменений. Также НЕЯ2/пеи-отрицательные клетки яичников китайского хомяка СНО, использованные в качестве контроля, не изменили свою морфологию после обработки белком и последующего облучения. Полученные результаты позволили нам предположить, что обработка клеток иммуноФС 4055сРу-тЫ50С с последующим облучением избирательно вызывает некроз опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих НЕЯ2/пеи.

Для более тонкого изучения механизма цитотоксического действия иммуноФС 4D5scFv-miniSOG был использован колориметрический метод определения уровня активности эффекторной каспазы-3, которая на сегодняшний день является достоверным маркером апоптоза. Было показано, что в клетках SK-BR-3, обработанных иммунотоксином 4D5scFv-miniSOG, уровень активности каспазы-3 сравним с отрицательным контролем (клетки SK-BR-3 в PBS). В то же время на клетках SK-BR-3, обработанных индуктором апоптоза - 2 мМ СаСЬ, активность каспазы-3 увеличивается на порядок по сравнению с отрицательным контролем.

В качестве еще одного независимого метода определения типа клеточной гибели был использован цитометрический метод определения фракции клеток с фрагментированной хромосомной ДНК. В данном эксперименте было показано, что популяция клеток SK-BR-3, обработанная иммунФС 4D5scFv-miniSOG с последующим облучением, не содержала значимого количества фрагментированной хромосомной ДНК.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу клеточной гибели при фотоиндуцированном воздействии сконструированного иммуноФС 4D5scFv-miniSOG по типу некроза. Известно, что в организме некроз вызывает резкую воспалительную реакцию и привлечение репаративных механизмов, которые являются нежелательными для многих клинических случаев. С другой стороны, этот тип клеточной гибели может бьпъ преимуществом при лечении опухолей небольшого размера, так как некроз усиливает действие иммунной системы и привлекает лейкоциты в место опухоли, тем самым осуществляя презентацию антигена.

В результате данного этапа работы нами был получен и охарактеризован новый уникальный белок - иммунофотосенсибилизатор 4D5scFv-miniSOG, который специфически связывается с НЕР2/пеи-гиперэкспрессирующими клетками аденокарциномы молочной железы человека, интернализуется и вызывает их фотоиндуцированный некроз при облучении синим светом.

III. Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров.

Сконструированный нами иммуноФС 4D5scFv-miniSOG, а также используемые в клинике низкомолекулярные ФС возбуждаются видимым светом, не проникающим в глубь тканей. Такие ФС применяют для лечения либо небольших поверхностных опухолей на коже

11

и слизистой оболочке, либо опухолей на внутренней поверхности различных органов с локальной доставкой света оптоволокном в сочетании с лапароскопией.

Из литературы известны низкомолекулярные ФС, применяемые для визуализации и терапии с возбуждением в ближней ИК области спектра. Однако следует отметить, что их применение ограничено системной цитотоксичностью и невысоким выходом АФК.

Оригинальным решением данной проблемы является использование НАФ, способных эффективно переизлучать ИК-свет накачки в УФ/видимой области спектра.

В настоящей работе было предложено изучить возможность использования этого эффекта для фотоиндуцированного разрушения клеток ИК-светом, хорошо проникающим в ткани, путем возбуждения сконструированного иммуноФС, а также присутствующих в опухолях эндогенных ФС, в том числе флавиновой природы. Для этого необходимо было, во-первых, создать и исследовать донорно-акцепторные пары, в которых НАФ выступают в роли донора возбуждающей энергии, а сконструированный нами флавиновый иммуноФС 4D5scFv-miniSOG - в роли акцептора, а во-вторых, доставить НАФ в опухолевую клетку и изучить его потенциал в качестве ФС при облучении ИК-светом.

Ш.1. Создание и исследование донорно-акцепторных пар НАФ: 4D5scFv-miniSOG, возбуждаемых ближним ИК-светом.

Мы предположили, что для разрушения опухолевых клеток сконструированным иммуноФС 4D5scFv-miniSOG путем фотоиндукции ИК-светом необходимо создать подходящую донорно-акцегтторную пару ФС:НАФ, способную к эффективному переносу энергии с донора на акцептор. Среди подобных пар, основанных на использовании НАФ, описанных в литературе, наибольшей эффективностью отличаются те, в которых ФС переходит в возбужденное состояние посредством фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) от возбужденной частицы. Эффективность его определяется тем, что возбужденный НАФ передает энергию на ФС за счет безызлучательного переноса энергии, т.е. без испускания фотонов. В результате такого процесса энергия возбужденного состояния наночастицы переносится на ФС, который в свою очередь передает энергию на молекулярный кислород, переводя его из основного триплетного состояния в цитотоксичное синглетное.

Для того чтобы донорно-акцепторная пара обменивалась энергией по механизму FRET, необходимо соблюдение следующих важных условий: 1) перекрывание спектров испускания донора и поглощения акцептора; 2) относительная близость донора и акцептора (-5 нм), так как вероятность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния

между ними; 3) совпадение ориентации дипольного момента донора и акцептора; 4) достаточное время жизни возбужденного состояния донора.

Спектр поглощения 4D5scFv-miniSOG находится в УФ-А и синей областях с максимумом на длине волны 450 нм. В качестве донора для 4D5scFv-miniSOG были подобраны апконвертирующие неорганические наночастицы NaYF4, солегированные редкоземельными элементами Тт3+ и Yb3+ (НАФ(Тт3+)), со средним размером ВО нм (рис. 6А), синтезированные A.B. Нечаевым (МИТХТ им.М.В. Ломоносова, Москва). Полученные совместно с ИПЛИТ РАН данные о спектральных характеристиках НАФ(Тт3+) и 4D5scFv-miniSOG свидетельствуют, что данная донорно-акцепторная пара удовлетворяет первому условию (рис. 6Б). При возбуждении излучением с длиной волны 975 нм НАФ(Тш3+) имеют несколько основных линий люминесценции с максимумами на длинах волн 345, 360, 450, 475 и 800 нм (рис. 7Б, черная линия), первые четыре из которых перекрываются со спектром возбуждения сконструированного нами иммуноФС 4D5scFv-miniSOG (рис. 6Б, штриховая линия). Таким образом, по тушению флуоресценции донора и возникновению более длинноволновой флуоресценции акцептора (стоксов сдвиг) можно оценивать FRET.

НАФ*»

4D5scFv-miuiSOO«Mi 405»Fv-Bimi$(X«o.

/Vmuii iicaiMJ. нм

Рисунок 6. А- фотография апконвертирующих нанофосфоров НАФ(ТтЗ+), полученная при помощи просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ); Б - Спектр антистоксовой люминесценции НАФ при возбуждении излучением лазера на длине волны 975 нм (черная линия) и спектр поглощения (штриховая линия) и флуоресценции (серая линия) 4D5scFv-miniSOG.

Выполнение трех других условий возникновения FRET предстояло выяснить экспериментальным путем.

Поскольку изначально синтезированные частицы покрыты олеатной оболочкой и гидрофобны, для получения FRET-пары на основе НАФ(Тт3+) в биосовместимом виде нам потребовалось, во-первых, решить проблему стабилизации этих наночастиц в водных дисперсиях. Для этого А.Н. Генераловой (ИБХ РАН) была проведена гидрофилизация их

13

поверхности с использованием реакции с гидроксидом тетраметиламмония (ТМАГ), которая позволяет частично удалить координационно-связанный олеат, стабилизируя наночастицу в буферных и водных растворах.

Методом динамического рассеяния света нами было показано, что полученные водорастворимые НАФ являются монодисперсными и имеют размер ~80 нм. Методом электрофоретического рассеяния света было показано, что дзета-потенциал поверхности НАФ(Тш3+), гидрофилизованных ТМАГ, составляет -30 мВ, что свидетельствует о стабильности частиц в водных растворах.

Далее к водной дисперсии модифицированных наночастиц в концентрации 80 мкг/мл добавляли 20 мкМ 405зсРу-гшш5СЮ, после чего проводили измерение спектров люминесценции донорно-акцепторной пары, сформированной за счет физиосорбции белка на поверхности наночастицы. На рис. 7 представлен спектр фотолюминесценции комплекса НАФ(Тш3+)-иммуноФС при возбуждении на длине волны 975 нм. В спектре фотолюминесценции регистрируется широкая полоса флуоресценции 405зсРу-гшш8СЮ, а линии люминесценции наночастиц, попадающие в полосу поглощения белка, теряют энергию.

Рисунок 7. Спектр излучения комплекса НАФ(Тш3+):405зсРу-miniSOG в PBS при возбуждении на длине волны 975 нм.

5,1,0x10"-

н 8,0*10'-

= б.ОхЮ3-S

s 4.0x10ä-*

= 2.0x10

0,0-

300 350

Г v\

400 450 500 550 600 650 Длина волны, нм

Полученный результат служит косвенным доказательством того, что созданная нами донорно-акцепторная пара HA®(Tm3+):4D5scFv-miniSOG обменивается энергией по механизму FRET, однако не позволяет судить о процессе количественно. Для оценки эффективности процесса FRET требуется измерение времени жизни люминесценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Это позволяет рассчитать эффективность процесса FRET (ri) по следующей формуле: т]=1 - (tDA/tD)

где tDA — время жизни донора в присутствии акцептора и tD — время жизни донора в отсутствие акцептора. Эффективность FRET также может быть выражена в процентах: т]%=

4*100%.

В результате измерения времен жизни возбужденного состояния совместно с ИПЛИТ РАН было показано, что наибольшая эффективность процесса характерна для перехода энергии на длине волны 475 нм и составляет 11%. На длине волны 360 нм эффективность переноса составила 3%. Также было показано, что на длинах волн 450 и 345 нм переноса энергии не происходит.

Как было сказано выше, вторым условием, ограничивающим эффективный FRET, является расстояние между донором и акцептором (R). Определить расстояние можно, вычислив значение фёрстеровского радиуса (Ro), который является максимальным расстоянием между молекулами донора и акцептора, при котором будет происходить передача энергии по механизму FRET на уровне 50%. Как правило, значение Ro находится в пределах от 2 до б нм.

Так, для двух длин волн, участвующих в процессе переноса энергии: 475 и 360 нм, были вычислены значения фёрстеровских радиусов донорно-акцепторной пары HAO(Tm3+):4D5scFv-miniSOG: Ro475km=2.7 нм и R03W)HM=2.0 нм.

Зная эффективность FRET и Ro, можно определить фактическое расстояние между донором и акцептором (R) по формуле:

R = Ro* [(1/ г|) -1]1/6

Таким образом, было рассчитано, что для длины волны 475 нм Д475нм = 3.8 нм, для длины волны 360 нм Д360™ = 3.6 нм. Расхождение в оценках расстояния между донором и акцептором, полученное для двух длин волн, может быть связано с ошибками при измерениях времени жизни.

Для эффективной апконверсионной фотолюминесценции очень важную роль играет поверхность НАФ, так как на ней находится множество ионов Тш3+ и Yb3+, которые могут передавать возбуждение на воду, что будет вызывать тушение люминесценции. Для устранения эффекта тушения при получении НАФ(Тт3+) использовалась методика покрытия «активных» частиц «неактивной» оболочкой NaYF.», или core/shell технология. Таким образом, расчет расстояния между донором и акцептором (R) указывает на то, что толщина «неактивной» оболочки НАФ(Тт3+) в среднем составляет 3.7 нм. Однако для того, чтобы в донорно-акцепторной паре HAOfTm'^DSscFv-miniSOG происходила эффективная передача энергии по типу FRET, толщина неактивной оболочки у наночастицы не должна превышать 2.7 нм (значение фёрстеровского радиуса для длины волны 475 нм).

Для того чтобы доказать возможность генерации синглетного кислорода во FRET-паре HAO(Tm3+):4D5scFv-miniSOG при возбуждении ближним ИК, мы использовали

15

флуоресцентный сенсор синглетного кислорода Singlet oxygen sensor green (SOSG, Life Sciences, USA). SOSG специфически взаимодействует с синглетным кислородом с образованием продукта реакции, обладающего флуоресценцией с максимумом на длине волны 525 нм при облучении синим светом. При добавлении к водной дисперсии HAa>(Tm3+):4D5scFv-miniSOG реактива SOSG мы регистрировали рост интенсивности флуоресценции с течением времени при облучении на длине волны 975 нм, что доказывает наработку синглетного кислорода (рис. 8). Поскольку 4D5scFv-miniSOG также обладает флуоресценцией на длине волны 525 нм, исходное значение интенсивности флуоресценции водной дисперсии HA<t>(Tm3+):4D5scFv-miniSOG не соответствует нулевому.

Время, с

Также, при добавлении тушителя образования синглетного кислорода азида натрия (NaNî) к водной дисперсии смеси НАФ(Тш3+) и 4D5scFv-miniSOG было зарегистрировано прекращение роста интенсивности флуоресценции, что свидетельствует об ингибировании процесса образования синглетного кислорода.

Таким образом, была показана принципиальная возможность к безызлучательной передаче энергии в донорно-акцепторной паре HAO(Tm3+):4D5scFv-miniSOG с последующим образованием синглетного кислорода и обозначено направление исследований по усовершенствованию структуры наночастиц НАФ(Тт3+), которые могут использоваться в паре с 4D5scFv-miniSOG, а также с другими флавиновыми ФС в дальнейшем. А именно, для того чтобы добиться 50% эффективности FRET в данной системе и позволить проводить модификацию поверхности НАФ толщина неактивной оболочки NaYF4 не должна превышать 2.7 нм.

Ш.2. Разработка способа адресной доставки апконвертнрующих нанофоефоров к опухолевым клеткам п исследование их фотоцитотокснчиоети при облучении ближним ИК-светом.

Известно, что в клетках содержится ряд эндогенных ФС, в том числе флавиновой природы, спектры возбуждения которых также могут перекрываться со спектром антистоксовой люминесценции НАФ(Тшл+). Потому представлялось перспективным создать адресные НАФ(Тш3+), специфично взаимодействующие с опухолевыми клетками, и изучить их цитотоксичность, фотоиндуцируемую ИК-светом.

Для нацеливания НАФ(Тш3+) на клетки аденокарциномы молочной железы и другие опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие поверхностный маркер НЕЯ2/пеи, мы выбрали сконструированный нами бифункциональный белок ОАЯРш-тСЬеггу.

В состав бифункционального белка ПАЯРт-тСЬеггу в качестве адресного модуля, способного с высокой селективностью узнавать поверхностный маркер НЕЯ2/пеи, входит белок ОАЯРт9-29, принадлежащий к новому классу нацеливающих молекул неиммуноглобулиновой природы, в качестве детектирующего модуля применен красный флуоресцентный белок шСЬеггу.

Бифункциональный белок ОАЯРш-тСЬеггу был получен и охарактеризован физико-химическими методами, а также использован для качественной и количественной детекции рецептора НЕЯ2/пеи на поверхности клеток. Устойчивость к изменениям рН и отрицательный заряд ОАЯРш-шСЬеггу (р1=5.1) определяют пригодность данного белка для проведения процедуры биоконъюгации с отрицательно заряженными НАФ(Тш3+), покрытыми РМАО (дзета потенциал -30). К тому же, флуоресцентное мечение частиц удобно для наблюдения их локализации в клетке. Данный гибридный белок с высоким выходом был наработан в бактериальной системе экспрессии и очищен в одну стадию при помощи металл-аффинной хроматографии. иЛЯРт-тСИеггу, как было показано, имеет высокую специфичность к рецептору НЕЯ2/пеи (Кп=4.5 нМ), а также является фотостабильным. Поскольку флуоресцентный белок иЛЯРт-тСЬеггу является конечным целевым рекомбинантным продуктом, он не требует дополнительного мечения, характеризуется постоянством состава и воспроизводимостью оптических характеристик.

Конъюгацию НАФ(Тш3+)-РМАО с адресным белком ОЛЯРт-тСНеггу, специфичным к опухолевому маркеру НПЯ2/пеи, осуществляли с использованием ЕОС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) в качестве сшивающего реагента. Несвязавшийся белок отделяли с помощью нескольких циклов центрифугирования.

Специфичность связывания полученных конъюгатов с клетками изучали на НЕЯ2/пеи-положительных клетках SK-BR-3 в сравнении с фибробластами человека, не гиперэкспрессирующими рецептор HER2/neu на своей поверхности. Для этого добавляли конъюгаты HA®(Tm3+)PMAO:DARPin-mCherry к клеткам, инкубировали 5 мин, после чего отмывали и анализировали на флуоресцентном микроскопе. Было показано, что конъюгаты связываются с мембраной клеток SK-BR-3, в то время как на мембранах фибробластов не было обнаружено флуоресцентного сигнала. При помещении клеток в СОг-инкубатор на 30 мин происходит интернализация рецептора, и флуоресцентный сигнал детектируется уже внутри клетки в виде ярких отчетливых точек.

Методом колокализации было показано, что через 2 ч после инкубации конъюгаты HAO(Tm:,+)-PMAO:DARPin-mCherry попадают в лизосомы, о чем свидетельствует желтый сигнал, полученный в результате наложения красного флуоресцентного сигнала конъюгатов и зеленого сигнала лизосом, окрашенных красителем LysoTracker Green DND-26 (рис.9).

Рисунок 9. Внутриклеточная локализация HA<t>(Tm3+)PMAO:DARPin-mCherry. А-светлопольное изображение; Б - наложение изображений В и Г (желтый сигнал); В -лизосомы SK.-BR-3, покрашенные LysoTracker Green DND-26 (зеленый флуоресцентный сигнал); Г - HAO(Tm'+)PMAO:DARPin-mCherry (красный флуоресцентный сигнал)

Фотоиндуцируемую ИК-светом цитотоксичность полученных иммуноконъюгатов по отношению к опухолевым клеткам SK-BR-3 изучали на разработанном в ИПЛИТ РАН эпилюминесцентном инвертированном микроскопе с возможностью возбуждения и регистрации сигнала как от апконвертирующих наночастиц, так и от стоксовых

18

флюорофоров. Собранная установка позволяет проводить облучение клеточной культуры с площадью поверхности до 500 нм2 на длине волны 975 нм.

В первую очередь нами были подобраны условия облучения клеточной культуры, исключающие тепловой шок в клетках. Было показано, что плотность потока энергии ИК-лазера, равная 4 Вт/см2, не влияет на жизнеспособность клеток SK-BR-3.

Для изучения цитотоксичности HAO(Tm3+)-PMAO:DARPin-mCherry клетки SK-BR-3 культивировали в ячейках 96-луночного планшета, инкубировали их с конъюгатами в течение 5 мин, тщательно отмывали PBS и добавляли йодид пропидия (PI), флуоресцирующий краситель, который окрашивает ядра мертвых клеток с поврежденной мембраной. Было показано, что в отсутствие облучения клетки сохраняли целостность мембраны в течение, как минимум, 3 ч.

Так как ранее нами было показано, что плотность потока энергии лазера 975 нм, равная 4 Вт/см2, не вызывает изменения температуры в лунке выше 37°С, она была выбрана для облучения клеток. В результате, облучение клеток, к которым не добавляли конъюгаты, в данном режиме в течение 40 мин не привело к их гибели в течение 3 ч (контрольный эксперимент).

В то же время морфология клеток с конъюгатами уже через 20 мин после облучения начинала изменяться. В течение часа после облучения мы наблюдали появление слабого флуоресцентного сигнала в цитоплазме клеток, что может объясняться связыванием PI с РНК цитоплазмы, и свидетельствует о нарушении целостности мембран клеток. В то же время, ядра некоторых клеток начинали окрашиваться, и клетки приобретали округлую форму. На рис.10 приведены изображения клеток SK-BR-3, полученные через 150 мин после окончания облучения. Снимки были сделаны в красном флуоресцентном канале, который соответствует испусканию PI, при помощи черно-белой камеры. На рисунках 10В и Г можно заметить, что в зоне облучения практически все клетки приобрели округлую форму и стали проницаемы для PI, что, вероятнее всего, говорит о некрозе.

Таким образом, повреждение мембран клеток могло произойти либо за счет локального нагрева частиц, либо за счет их фототоксичности, так как данные НАФ(Тт3+) имеют УФА линии люминесценции.

Чтобы установить, причастно ли ультрафиолетовое воздействие к полученному эффекту мы проделали аналогичный эксперимент с НАФ, допированными ионами Ег3+ вместо Тт3+. Полученные НАФ(Ег3+) не имеют УФА/синих линий люминесценции и характеризуются наличием линий люминесценции в зеленой области спектра. По аналогии с НАФ(Тш3+) НАФ(Ег3+) покрывали полимерной оболочкой РМАО и конъюгировапи с DARPin-mCherry. В результате эксперимента, проведенного в тех же условиях, что и с

19

использованием НАФ(Тт3+), практически все клетки сохраняли целостность мембраны, за исключением двух, ядра которых окрасились. Наличие двух некротических клеток мы связываем с их чувствительностью именно к термическому воздействию от локально нагретых наночастиц (рис. ЮА и Б).

Г ] Р1 Б и* « 10 минут

1 ■о\> 'К'ШК Г \ V .. А V ./Г"» ■ • <, ■ ' л». 40 минут ^

д % оЯлучешн • Е * 1 , 10 минут •

Рисунок 10. Изображения клеток SK.-BR.-3, инкубированных с НАФ(Тш3+) (УФ-А/синие) и НАФ(Ег3+) (зеленые), конъюгированными с ОАЯРш-тСИеггу через 150 минут после облучения (длительность облучения 40 или 10 мин)

Ранее в некоторых работах уже обсуждалось использование НАФ в фототермической терапии (ФТТ). ФТТ заключается в фотоабсорбции с последующей генерацией тепла из поглощенного света, что приводит с термической абляции раковых клеток. Но так как ионы

лантаноидов имеют низкий коэффициент экстинкции, или слабое оптическое поглощение, НАФ, как правило, имеют ограниченную способность конвертировать свет напрямую в тепло, что подтверждается нашим экспериментом.

Таким образом, сравнение полученных результатов по цитотоксичности НАФ, испускающих в зеленой и УФА/синей областях спектра, говорит в пользу того, что действие последних обусловлено именно фототоксичностью, а не термическим эффектом.

На сегодняшний день имеется несколько работ, посвященных использованию НАФ, легированных тулием, в паре с акцепторами УФА света, например, с ДНК или с цигостатиком доксорубицином, но ни в одной из них не описывается их фототоксичность. Одной из причин может быть отсутствие УФА линий люминесценции используемых в таких работах НАФ, в то время как наши частицы имели эти линии (рис.бБ).

Таким образом, данным экспериментом на клетках ЗК-ВЯ-З, инкубированных с коньюгатами НАФ(Тт3+):ОАКРт-тСЬеггу мы показали, что облучение их ближним ИК-светом в течение 40 мин является цитотоксичным и, предположительно, вызывает некроз. Также, мы доказали, что цитотоксичность обусловлена УФ-А светом, излучаемым в процессе апконверсии, но не фототермическим воздействием.

Выводы:

1. Получен и охарактеризован генетически кодируемый иммуноФС 4П5зсРу-пиш5СЮ; показано его специфическое связывание с рецептором НЕК2/пеи (константа диссоциации 10±2 нМ) и опосредованная рецептором интернализация внутрь клеток аденокарциномы молочной железы человека с преимущественной локализацией в лизосомах.

2. Показано, что иммуноФС 4В5зсРу-тш500 оказывает избирательное цитотоксическое действие на клетки аденокарциномы молочной железы человека (1С50 = 160 нМ) при облучении синим светом, вызывая гибель по типу некроза. Достигнута 100 % гибель опухолевых клеток при сочетанном применении 405зсру-питЗСЮ в концентрации 250 нМ и цитостатика таксола® в концентрации 1 нМ.

3. Получены и исследованы донорно-акцепторные пары, включающие НАФ в качестве доноров возбуждающей энергии и флавиновый белок 4В5зс1Ч,-тЫЗОО в качестве акцептора энергии; показано, что фёрстеровский резонансный перенос энергии реализуется в указанных парах только в отсутствие полимерной оболочки на поверхности НАФ, фёрстеровский радиус составляет 2-2.7 нм.

4. Получен иммуноФС НАФЛАКРт-тСЬеггу, представляющий собой НАФ, конъюгированный с адресным полипептидом ОАЯРт-тСИеггу, и показано его специфическое связывание с поверхностью клеток аденокарциномы молочной железы человека с последующей интернализацией и локализацией в лизосомах.

5. Показано, что полученный иммуноФС НАФЛАКРт-тСИеггу вызывает гибель опухолевых клеток при облучении ближним ИК-светом, что обусловлено его апконверсией в УФА 1-свет, возбуждающий эндогенные клеточные ФС.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1) Mironova К.Е.*, Proshkina G.M.*, Ryabova A.V., Stremovskiy O.A., Lukyanov S.A., Petrov R.V., Deyev S.M. Genetically Encoded Immunophotosensitizer 4D5scFv-miniSOG - a highly selective agent for specific photo-killing of tumor cells in vitro. Theranostics. 2013; 3(11):831-40.

2) Миронова K.E., Черных О Н., Рябова A.B., Стремовский O.A., Прошкина Г.М., Деев С.М. Высокоспецифичный гибридный белок DARPin-mCherry для флуоресцентной визуализации клеток, гиперэкспрессирутощих онкомаркер HER2/neu. Биохимия. 2013; 79(12):1700- 1706.

3) Гребеник Е. А., Генералова А. Н., Нечаев А. В., Миронова К. Е., Стремовский О. А., Лебеденко E.H., Звягин А. В., Деев С.М. Специфическая визуализация опухолевых клеток с помощью антистоксовых нанофосфбров. Acta naturae. 2014; 6(4):51-57.

4) Прошкина Г. М., Миронова К. Е., Деев С. М., Петров Р. В. Изучение механизма циготоксического действия иммунофототоксина 4D5scFV-miniSOG на HER2/neu-положительные опухолевые клетки человека ДАН. 2015; 460(2)

Тезисы докладов на конференциях:

1) К.Е. Миронова, Е.В. Хайдуков, В.А. Семчишен, А.Н. Генералова, A.B. Нечаев, A.B. Звягин, С.М. Деев. Комплексный фотосенсибилизатор дзя селективного поражения опухолевых клеток инфракрасным светом. XI конференция «Лазеры и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и применения» (2014, Шатура, Москва)

2) К. Mironova, Е. Khaydukov, V. Semchishen, A. Generalova, A.Nechaev, A.Zvyagin and S.Deyev. Photosensitizing complex for targeted photodynamic therapy at infrared excitation. 5th international conference on advanced nanomaterials (2014, Авейру, Португалия)

3) К.Е. Миронова, E.B. Хайдуков, В.А. Семчишен, А.Н. Генералова, Г.М. Прошкина, A.B. Нечаев, A.B. Звягин, С.М. Деев. Комплекс UCNP - DARPin -miniSOG для фотодинамической терапии направленного действия. VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (2013, Москва, Россия)

4) Миронова К.Е., Прошкина Г.М, Генералова А Н., Хайдуков Е.В., Семчишен A.B., Звягин A.B., Деев С.М. Белок-фотосенсибилизатор miniSOG и апконвертирующие наночастицы. Международная молодежная научно-практическая конференция "Биофизика биоэнергетических процессов" (2013, Звенигород, Россия)

♦Вклад в работу данных авторов равнозначен.

23

5) Mironova K.E., Proshkina G.M., Ryabova A., Deyev S.M. Photo-induced cytotoxic effect of 4D5scFv-miniSOG on HER2/neu-overexpressing cells. Proceedings of IV International Symposium «Topical problems of biophotonics - 2013» (2013, Нижний Новгород, Россия)

6) Миронова К.Е., Деев С.М., Прошкина Г.М. Получение и характеристика генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора для селективного поражения опхолевых клеток человека, гиперэкспрессирующих рецептор HER2/neu.: XXIV Зимняя молодежная научная школа ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва, Россия)

7) Миронова К.Е., Деев С.М., Прошкина Г.М. Иммунофототоксин 4D5scFv-miniSOG направленного действия: получение и функциональная характеристика. 16-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2012, Пущино, Россия)

Подписано в печать:

30.07.2015

Заказ № 10879 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru