Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Апоптоз раковых клеток человека, индуцируемый рекомбинантным аналогом лактаптина
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Апоптоз раковых клеток человека, индуцируемый рекомбинантным аналогом лактаптина"
На правах рукописи
ФОМИН АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ
АПОПТОЗ РАКОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРУЕМЫИ РЕКОМБИНАНТНЫМ АНАЛОГОМ ЛАКТАПТИНА
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Новосибирск - 2012
005049192
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины
СО РАН
Научный руководитель:
к.б.н. Рихтер Владимир Александрович
Официальные оппоненты:
Сергиев Пётр Владимирович, д.х.н.,
Московский государственный университет
им. М. В. Ломоносова, химический факультет, доцент
Зенкова Марина Аркадьевна, д.б.н., профессор, Институт химической биологии и
фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
Защита состоится « 26 » декабря 2012 г. в 12— часов
на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт ак. Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Автореферат разослан » 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве развитых стран онкологические заболевания занимают второе место среди причин смертности взрослого населения. Поэтому, усовершенствование методов лечения и разработка новых средств терапии онкологических заболеваний является приоритетной задачей биохимии, молекулярной биологии и медицины.
Апоптоз или программируемая клеточная гибель - процесс, необходимый для поддержания численности и функциональности клеток организма в норме, а также для удаления дефектных клеток. Одним из наиболее продуктивных подходов к созданию современных оико-тераневтических средств является разработка новых индукторов и модуляторов апоптоза раковых клеток.
Понимание механизма действия препарата на клеточном уровне позволяет подробно исследовать возможные молекулярные мишени его действия и проводить направленное конструирование молекул с улучшенными свойствами. Кроме того, такие комплексные исследования позволяют прогнозировать чувствительность различных опухолей к определенным лекарственным средствам.
Известно, что молоко человека содержит белки и пептиды, вызывающие апоптоз раковых клеток. Ранее в нашей лаборатории из молока человека был выделен и идентифицирован один из таких пептидов. Было показано, что этот пептид имеет молекулярную массу 8 кДа и является иротеолитическим фрагментом к-казеина человека. Выделенный из молока человека пептид получил название лактаптин.
Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аналогов лактаптина и исследование механизма их действия на клетки человека в культуре.
В ходе работЕ>1 необходимо было решить следующие задачи:
- Сконструировать и охарактеризовать рекомбинантные аналоги лактаптина.
- Разработать методы выделения и очистки рекомбинантных аналогов лактаптина.
- Исследовать цитотоксическую активность рекомбинантных аналогов лактаптина по отношению к опухолевым и иемалигнизированным клеткам человека в культуре.
- Провести анализ основных биохимических маркеров гибели клеток, индуцируемой рекомбинаптнымп аналогами лактаптина.
- Провести поиск и идентификацию белков, взаимодействующих с рекомбинантнымн аналогами лактаптина в клетках человека.
- Провести анализ изменения траискриптома клеток человека иод действием рекомбинантных аналогов лактаптина методом гибридизации РНК на полнотрапскриптомпых чипах Illumina.
- На основании полученных экспериментальных данных разработать модель цитотоксического действия рекомбинантных аналогов лактаитина на клетки человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. Созданы генно-инженерные конструкции, с использованием которых получены рекомбинантные аналоги лактаптина. Установлено, что генно-инженерный аналог лактаптина RL2 вызывает гибель раковых клеток человека различного тканевого происхождения в культуре, в том числе клеток адснокарциномы молочной железы человека с ER-положительным и ER-отрицательным статусом, и не оказывает цитотоксического действия на немалигнизированные мезенхимальпые стволовые клетки жировой ткани человека. Впервые разработаны методы выделения и очистки рекомбннантного аналога лактаптина RL2, позволяющие получать препараты RL2 для инъекционного применения при проведении доклинических испытаний. Впервые охарактеризован механизм цитотоксического действия рекомбннантного аналога лактаптина RL2 на раковые клетки человека. Показано, что RL2 проникает в клетки, взаимодействует с белками цитоскелета и индуцирует апоптотичсскую гибель раковых клеток по рецепторному и митохондриальному путям.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на конференциях: "The ЕМ ВО meeting 2010: advancing the life sciences" (Барселона, 2010); "lind International conference physico-chemical biology" (Новосибирск, 2011); VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2011); V Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2012); "Postgenomic Technology for Biomedicine" (Новосибирск, 2012); "Programmed cell death in biology and medicine" (Москва, 2012); 37th FEBS "From Single molecules to Systems Biology" (Севилья, 2012), 20th Euroconference on Apoptosis "From Death to Eternity" (Рим, 2012).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 133 страницах, содержит 33 рисунка и 8 таблиц. Библиография содержит 232 литературных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Получение рекомбинантных аналогов лактаптина. Для конструирования рекомбинантных аналогов был проведен анализ аминокислотных последовательностей лактаптина и к-казеина человека, и подобраны последовательности фрагментов к-казеина RL1 и RL2 (Рис. 1). В структуру выбранных фрагментов были введены дополнительные последовательности, содержащие 6 а.о. гистидина, позволяющие эффективно
выделять данные фрагменты нч лизатов клеток-продуцентов аффинном хроматографией на металл-хелатирующих сорбентах.
каммл-кл Willi
1 ' ¡ ллк i л II i и II ■
^ :и м С\чЧ1 ! MI |.ч
vi С. I' '' " I ЛГ1--1
1 ■ ULI • iiiiSiiiuiiimi
R1.2 (¡(iMiiiHiniii
Рис. 1. Схема структур генно-инженерных аналогов лактаптина. Серым прямоугольником обозначена последовательность к-казеина человека (182 аминокислотных остатка), выделением указаны фрагменты, соответствующие лактаптину и его генно-инженерным аналогам RLI и RL2. LP- последовательность лидерного пептида к-казенна.
Для конструирования фрагментов ДНК, кодирующих последовательности RLI и RL2, был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена к-казеина человека с использованием базы данных GenBank. Пуклеотидмая последовательность, соответствующая фрагменту RL1, находится в 3-ем экзоне, а последовательность, соответствующая фрагменту RL2 во 2-ом и 3-ем экзонах гена к-казеина. С учетом того, что 18 пуклеогидов последовательности RL2 находятся во 2-ом экзоне гена к-казеина, был выбран олигонуклеотидный праймер, включающий данную нуклеотидную последовательность на З'-концс. Получение фрагментов ДНК, кодирующих рекомбинантные аналоги лактаптина RL1 и RL2, проводили методом Г1ЦР геномной ДНК плаценты человека. Конструирование плазмидных ДНК, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных аналогов лактаптина, проводили реетриктазно-лигазпым методом на основе векторной плазмиды pGSDI под промотором РНК-полимеразы фага Т7. Встройку фрагментов ДНК, кодирующих RL1 и RL2, в плазмиду pGSDI проводили по сайтам эндонуклеаз рестрикции Sali и ßg/ll. Клонирование векторных плазмид проводили в клетках E.coli XL-Blue. Правильность встройки фрагментов ДНК, кодирующих RL1 и RL2, в рекомбинантные конструкции подтверждали секпенированпем ДНК методом Сэнгера. По результатам секвенировання были выбраны плазмидные рекомбинантные ДНК, содержащие правильную структуру фрагментов RLI и RL2 гена белка к-казеина человека. Штаммы-продуцеиты рекомбинантных аналогов лактаптина создавали па основе клеток E.coli BL21(DE3) методом СаСЬ-зависимой трансформации компетентных клеток.
Таким образом, были сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие последовательности ДНК фрагментов гена к-казеина человека RL1 и RL2, соответственно, и получены штаммы-продуценты генно-
] (IHIII
инженерных аналогов лактаптнна.
Выделение и характеризацня рскомбипантных аналогов лактаптнна. Рекомбинамтные аналоги лактаптнна выделяли из лизатов клеток-продуцентов E.coli аффинной хроматографией на Ni-NTA-агарозе. Для очистки аналогов от неспецифически сорбирующихся на Ni-NTA-агарозу белков E.coli проводили предварительную элюцию буфером, содержащим 50 мМ имидазола (Рис. 2, а), что позволяло получить белковые препараты с содержанием рекомбинантных аналогов >95% (Рис. 2, б).
Рис. 2. а. Хроматограмма лизата клеток Е. coli - продуцента RL2 на Ni-NTA агарозе. Хроматографические фракции: Л - белки, не взаимодействующие с сорбентом; В - белки, элюируемые буфером, содержащим 50 мМ имидазола; С -белки, элюируемые буфером, содержащим 250 мМ имидазола; D - белки, элюируемые буфером, содержащим 6 М гуанидин-HCI. б. Электрофоретическое разделение белков хроматографических фракций (Рис. 2, а) в 12% SDS-ПААГ. Дорожки: I - белки лизата клеток E.coli; 2 - белки фракции А; 3 - белки фракции В; 4 - белки фракции С; 5 и 7 - белки, элюируемые буфером, содержащим 6 М гуанидин-HCI (в присутствии 1% 2-меркаптоэтанола и в невосстанавливающих условиях, соответственно); 6 - рекомбинантный аналог лактаптнна RL1; 8 - набор белков с известными молекулярными массами.
При подборе условий выделения аналогов из лизатов клеток-продуцентов было установлено, что при концентрации имидазола в элюенте 250 мМ происходит полная десорбция аналога RLI с Ni-NTA-агарозы. После нанесения на Ni-NTA-агарозу лизата E.coli - продуцента аналога RL2, элюция буфером, содержащим 250 мМ имидазола, приводила к десорбции лишь 10 - 15% RL2 (Рис. 2, а). Количественной элюции аналога RL2 удавалось достичь только с использованием хаотропных агентов (6 М гуанидин-HCI). Принимая во внимание тот факт, что оба аналога содержат идентичные С-концсвые б-Шв-последовательности, обеспечивающие высокое сродство к Ni-хелатным сорбентам, можно предположить, что повышенное сродство RL2 к сорбенту по сравнению с RL1 обусловлено сочетанием низкой растворимости этого белка в буфере с физиологической
о
\
rli RL: I
1!
ионной силом (при рН>6,5) и его способности образовывать олигомерные формы.
Анализ белковых препаратов рекомбипаптпых аналогов лактаптина
электрофорезом в ПААГ показал, что представлен одним
полмпептидом с молекулярной массой 8.9 кДа (Рис. 2, б, дорожка 6), что соответствует массе рассчитанной теоретически.
Препараты в отсутствие 2-меркаитоэтанола содержали две формы белка с массами 14 и 28 кДа в соотношении ~ 30:70%, соответственно (Рис. 2, б, дорожка 7). В восстанавливающих условиях (1% 2-меркаптоэтанола) происходила полная диссоциация формы с массой 28 кДа с образованием формы с массой 14 кДа (Рис. 2, б, дорожка 5). Эш данные показывают, что КЬ2 продуцируется клетками Е.соИ в форме ковалентного гомодимера, субъедипицы которого образуют межмолекулярпые дисульфидные связи.
В структуре генно-инженерных аналогов лактаптина 11Ы н 1*1.2 содержится 8 (КЫ) и 13 (ЯЬ2) потенциальных сайтов расщепления трипсином. При исчерпывающем трипсинолизе КЫ и 11Ь2 может образовываться, соответственно, 9 и 14 пептидов, из которых 8 (1<Ы) и 10 (КЬ2) пептидов имеют молекулярные массы более 500 Да и могут быть идентифицированы МА1Л)1-ТОР масс-спектрометриен. При проведении масс-спектрометрического анализа фрагментов тримсинолиза и
было идентифицировано 6 и 8 пептидов, соответственно (Табл. I). Из данных представленных в таблице 1 видно, что пептиды, полученные при исчерпывающем трипсинолизе ЯЫ и 1*1.2, обеспечивают практически полное покрытие струкгур аналогов. Из этого следует, что первичные структуры полученных рекомбинантных аналогов лактаптина 1<Ы и ЯЬ2 соответствуют клонированным нуклеотидным последовательностям к-казеина человека.
Таблица 1. Пентид|»1, идентифицированные МАЬ01-ТОР масс-спектрометрией в составе рекомбинантных аналогов лактаптина ЯЫ и
масса щи шла. Да амшюкне.штман иос.ичшшк'.м.посм. пен шла Попиши в структуре им Попиши в структуре иЬ2
1 «60,8 УГЛаШМОЦКИ^УК 4-18
2919,4 ГЛРУУЧ'МУУУС^УРУУШМЬУУК 19-42
1479.8 К1*Л1А1МЫ1*У \'1,И 1 - 13 43 - 55
2080.1 ТУУЛ^ЛУУПРНЛОИЧЖ 14-31 56-73
1506,8 ОУМ'^ШЧ'ТУУК 32 - 44 74-86
1585.9 Ю^иН^ПЛММ'К 45-58 87- 100
1714,0 ктми^плмм'кк 45-59 87- 101
1691,8 [| IIIIII [| 1 64 - 78 106- 120
Таким образом, масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсинолиза рекомбинантных аналогов лактаптина ИЫ и показал, что их первичная структура соответствует структуре генно-иженериых конструкций (Рис. 1).
Сравнительный анализ цитотоксического действия НЫ и К 1.2 на клетки аденокарниномы молочной железы человека МСР-7. Сравнение цитотоксического действия рекомбинантных аналогов лактаптина и 1<Ь2 проводили на культуре клеток МСР-7, поскольку именно эти клетки проявляли чувствительность к цитотоксическому действию лактаптина из молока человека. Клетки инкубировали с КИ и 1<Ь2 в различных концентрациях в течение 72 ч, и оценивали изменение их жизнеспособности относительно контрольных, не обработанных клеток с использованием МТТ-теста. Выло обнаружено, что короткий аналог лактаптина 1<Ы вызывал слабое подавление жизнеспособности клеток МСР-7 (7 - 10%), в то время как инкубация МСР-7 с КЬ2 в концентрациях 30 - 60 мкг/мл приводила к снижению жизнеспособности клеток на 62% (Рис. 3).
¡НШ
0 7 30 60
Концентрация, мкг/мл
Снижение жизнеспособности клеток МСТ-7 иод действием 1*1^2 сопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза: откреплением от пластиковой подложки и конденсацией цитоплазмы и ядер (первичные данные не приведены). Поскольку в состав ИЬ2 входит фрагмент к-казеина с 23 по 66 а.о., отсутствующий в КН. можно заключить, что этот фрагмент, важный для формирования мультимерных форм белка, необходим также для проявления цитотоксического действия этого белка на клетки.
Так как рекомбинантный аналог ИЫ не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток МСР-7, в дальнейших экспериментах мы использовали только аналог
Цитотоксическое действие на клетки человека различного
тканевого происхождения. Сравнительный анализ чувствительности опухолевых клеток к действию КЬ2 проводили на клетках аденокарциномы молочной железы МСТ-7, карциномы легкого А54е) и карциномы гортани Пер-2 человека с использованием МТТ-геста. Установлено, что
Рис. 3. Изменение
жизнеспособности клеток МСР-7 при инкубации с ЯЫ и Ш.2 в различных концентрациях в течение 72 ч; за 100% принята жизнеспособность клеток, инкубированных в отсутствие аналогов.
жизнеспособность клеток А549 через 72 ч инкубации с К1-2 снижалась на 45%, а клеток Пер-2 - на 30% (Рис. 4). Жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека МЯС при инкубации с не отличалась от жизнеспособности необработанных клеток.
100
°°80 m
п 60
И 40 H
S20 0
0 7 30 60
Копнет рация RI.2, мкг/\1Л
Рис. 4. Изменение
жизнеспособности клеток MCI--7, А549, i 1ер-2 и MSC, инкубированных с RL2 в течение 72 ч; за 100% принята жизнеспособность клеток, инкубированных в отсутствие аналогов.
Снижение жизнеспособности клеток А549 и I1ер-2 не сопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза, фрагментации ядерной ДНК этих клеток не происходило даже при длительной инкубации с RL2 (5 суток; первичные данные не приведены).
Таким образом, было установлено, что чувствительность клеток к ци то токсическому действию аналога лактаптина RL2 убывает в ряду MCF-7>A549>Hep-2»MSC. 11ри этом снижение жизнеспособности происходило только у раковых линий клеток, нсмалигнизированные стволовые клетки человека оказались практически не чувствительны к действию этого белка.
Полученные результаты позволяют рассматривать рекомбинантный аналог лактаптина RL2 в качестве основы для создания противоопухолевого препарата.
Очистка pcKovißiniairiиого аналога лакгапгипа RL2. Выделение рекомбинантных белков из лизатов клеток E.coli аффинной хроматогра(|>ией на металл-хелатных сорбентах в ряде случаев позволяет получить субстанцию, обогащенную по целевому белку и содержащую менее 10% примесей белков клеток-продуцентов. При этом целевая субстанция может также содержать примеси не белковой природы, например, ДНК бактерий и компоненты их клеточной стенки, в том числе липополисахариды (ЛПС), определяемые LAL тестом. Дополнительные стадии очистки позволяют уменьшить содержание ЛПС в субстанции RL2.
Фракция RL2, полученная аффинной хроматографией на Nli-NTA-агарозе (Рис. 2, а, фракция D) содержала ~ 300 ЕЭ на I мг RL2. Очистку RL2 от примесей ЛПС проводили с помощью 2-х хроматографических стадий, включающих анионообменную хроматографию на Q-сефарозе и катионообменную хроматографию на SP-сефарозе.
На стадии анионообменной хроматографии RL2 не связывался с
сорбентом и элюировался при нанесении. Часть примесей связывалась с сорбентом и десорбировалась на этапе промывки буферным раствором, содержащим 0,5 M NaCI, в результате чего количество ЛПС в целевой фракции с RL2 составило ~1() ЕЭ на мг белка.
В процессе дальнейшей очистки на SP-сефарозе RL2 полностью связывался с сорбентом. Элюцию эндотоксинов проводили раствором А, содержащим 0,5 M NaCI при нейтральном рН, а элюцию RL2 - буферным раствором Б (pli 4.5), содержащим 0,5 M NaCI и 3 M мочевину. После обессоливания диализом фракции RL2, элюируемой буфером Б, содержание
Рис. 5. а. ВЭЖХ на
обращенно-фазовом сорбенте С-18. пик 2 соответствует б.
Электрофоретический анализ К 1.2 в ПЛЛГ с 0.1% ЗГ«. Дорожки: 1 выявление К 1.2 методом Всстерн-блоттинга с моноклональными антителами; 2 окраска геля
раствором кумасси 0-250. 3 - окраска геля ионами серебра. 4 - набор белков с известными молекулярными массами (окраска ионами серебра).
Анализ оптического профиля ВЭЖХ при длине волны 220 нм показал, что фракция RL2 содержит два основных пика (Рис. 5, а). При этом относительная площадь пика 2, соответствующего КЬ2, составила не менее 97%. Из данных рисунка 5, б видно, что анализируемый препарат очищенного RL2 содержит примеси с большей электрофоретической подвижностью. Данные примеси являются продуктами деградации молекулы [<Е2, т.к. содержат антигенную детерминанту и детектируются специфическими моноклональными антителами.
Таким образом, после 2-х стадий очистки ионообменной хроматографией получен препарат RL2 с чистотой не менее 97% и содержанием ЛПС-1 ЕЭ на 1 мг белка.
Согласно требованиям государственной фармакопеи XII (ГФ XII, ОФС 42-0062-07) при проведении доклинических испытаний не допускается использование инъекционных препаратов с чистотой менее 95% и содержанием бактериальных эндотоксинов более 10 ЕЭ на дозу. Методы выделения и очистки RL2, предложенные в данной работе, позволяют получать субстанцию RL2 с чистотой, удовлетворяющей требованиям ГФ XII для инъекционных препаратов, и в количествах, достаточных для проведения доклинических испытаний. Кроме того данная субстанция стабильна при хранении в стерильной упаковке при температуре ог +2 до
ЛПС в элюате составило ~1 ЕЭ/мг.
Г
I
~ — —тз 'РИИ
+8"С не менее 5 мее.
Таким образом, разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного аналога лактаптина RL2, позволяющие получать препараты RL2 для инъекционного применения мри проведении доклинических испытаний.
Анализ цитотокеического действия инъекционого препарата KL2 па клетках MCF-7, MDA-MB-231 и MSC в культуре. Анализ цитотоксического действия инъекционного препарата RL2 проводили с использованием культур клеток аденокарцином молочной железы человека MCF-7, MDA-MB-231 и немалигнизированных стволовых клеток жировой ткани MSC. Культуры клеток MCF-7 и MDA-MB-231 характеризуются различным уровнем экспрессии рецептора эстрогенов (ER): клетки MCF-7 являются ER-положительными, а MDA-MB-231 ER-отрицательными.
Для анализа влияния инъекционного препарата на жизнеспособность клеток в культуре клетки MCF-7, MDA-MB-231 и MSC' инкубировали с очищенным препаратом RL2 (0.1 - 0.4 мг/мл) в течение 2-х периодов удвоения клеточных популяций. Для клеток MCF-7 и MDA-MB-231 период удвоения популяции составляет -24 ч, а для клеток MSC -56 ч. Жизнеспособность клеток, обработанных RL2, определяли относительно контрольных не обработанных клеток с использованием МТТ-теста. Из данных, представленных на рисунке 6, видно, что повышение концентрации RL2 в культуральной среде клеток MCF-7 и MDA-MB-231 приводит к снижению их жизнеспособности. При этом жизнеспособность MCF-7 и MDA-MB-231, инкубированных с RL2, снижается на 50% при концентрации RL2 в среде менее 0,3 мг/мл. Жизнеспособность клеток MSC при инкубации с RL2 в течение МО ч не снижается относительно жизнеспособности не обработанных RL2 контрольных клеток (Рис. 6).
2, мг/мл
Рис. 6. Изменение
жизнеспособности клеток MCF-7, MDA-MB-231 и MSC,
инкубированных с различными концентрациями RI.2 в течение 48, 48 и 112 ч, соответственно; за 100% принята жизнеспособность клеток, инкубированных в отсутствие аналога.
ИК50(ИК50- концентрация препарата, вызывающая торможение роста клеток на 50%) RL2, рассчитанная по кривой зависимости роста культуры от концентрации 1*1^2 в среде, для клеток МСТ-7 составила 0,24 мг/мл, а для
клеток MDA-MB-231 - 0,25 мг/мл. Из полученных данных следует, что клетки MCF-7 с ER-положительным статусом и клетки MDA-MB-23I с ER-отрицательным статусом проявляют практически одинаковую чувствительность к цитогоксическому действию RL2.
Таким обратом, полученные результаты позволяют рассматривать RL2 как основу противоопухолевого лекарственного средства для терапии как ER-положительных, так и ER-отрицательных злокачественных новообразований молочной железы.
Анализ транслокации фосфат ндилсерина на внешнюю поверхность плазматической мембраны клеток MCF-7. Одним из наиболее характерных изменений плазматической мембраны клетки при апоптозе является экспозиция полярной части фосфатидилсерина (PS) с внутренней стороны липидного бислоя на внешнюю сторону.
В настоящее время наиболее доказательные методы выявления апоптотических клеток основаны на дифференциальном окрашивании цитоплазматической мембраны флуоресцентно-меченым белком аннексином V, который аффинно связывается с полярной частью PS. При этом апоптотическис клетки остаются непроницаемыми для йодида пропидия (PI), окрашивающего клеточные нуклеиновые кислоты.
Рис. 7. Диаграммы
распределения клеток MCF-7 по интенсивности окраски FITC-меченым аннексином V (FITC) и йодидом пропидия (PI): а - клетки MCF-7, инкубированные с RL2 в течение 24 ч, 6 клетки MCF-7. не обработанные К12; Q1 и Q2 -популяции жизнеспособных и апоптотических клеток,
соответственно.
Для того, чтобы оценить изменения плазматической мембраны клеток MCF-7 под действием RL2, клетки окрашивали индикаторами FITC-аннексин V/PI и анализировали проточной цитофлуориметрией. Изменение уровня транслокации PS на внешнюю поверхность плазматической мембраны в клетках, обработанных RL2, определяли относительно базового уровня в не обработанных контрольных клетках. Из данных рисунка 7, а видно, что при инкубации клеток MCF-7 в присутствии RL2 в течение 24 ч доля апоптотических клеток составила -83% (квадрант Q2). а жизнеспособных -16% (квадрант Q1). В то же время, в культуре контрольных клеток MCF-7 доля популяции Q2 составила -25%, а Q1 - -73% (Рис. 7, б). Следовательно, инкубация клеток с RL2 ведет к увеличению доли апоптотической популяции с 25 до 83%. При этом снижение жизнеспособности клеток под действием RL2 сопровождалось
морфологическими изменениями, характерными для апоптоза клеток в культуре: откреплением от пластиковой подложки, конденсацией цитоплазмы и ядер (первичные данные не представлены).
Таким образом, было установлено, что рекомбинантный аналог лактаптина вызывает транслокацию Р8 на поверхность плазматической мембраны МСТ-7, что является одним из признаков индукции аноптогической гибели клетки.
Анализ изменения трапсмембранного потенциала митохондрий клеток МСР-7 под действием КЬ2. Для анализа изменения ДМ'т митохондрий клеток МСТ-7, происходящего под действием К 1,2, были использованы флуорофоры ПЮС6 и JC-l. Эти флуорофоры проникают в жизнеспособные клетки и накапливаются и активных митохондриях. При этом 1)ЮС(, флуоресцирует в зеленой области спектра, а .1С-! способен флуоресцировать в двух областях спектра в зависимости от его локальной концентрации: при концентрациях ЛС-1, достигаемых в активных митохондриях, его молекулы агрегируют, образуя олигомерные структуры, флуоресцирующие в красной области спектра (590 нм). При низкой локальной концентрации .1С-1 происходит разрушение агрегатов красителя, что приводит к сдвигу максимума спектра флуоресценции в зеленую область (525 нм).
Из данных, представленных на рисунке 8, а, видно, что после инкубации клеток с Кпроисходит смещение максимума распределения клеток по интенсивности флуоресценции красителя 1Ж)С(, в сторону меньших интенсивностей (Рис. 8, а, кривая 2). В клетках, окрашенных .1С"-1, происходит накопление популяции клеток с пониженной флуоресценцией в красной области спектра (Рис. 8, б, кривая 2).
Рис. 8. Распределение клеток МСТ-7, не обработанных RL2 (пик /). н после 24 ч инкубации с RL2 (пик 2) по и нтенсивности флуо ресценци и
митохондриапьных красителей DiOC6 (а) и JC-1 (б).
Следовательно, оба флуорохромных индикатора дают возможность наблюдать уменьшение числа клеток с активными митохондриями в образцах, инкубированных с RL2. Эти данные позволяют сделать вывод, что апоптоз MCF-7, индуцируемый RL2, сопровождается диссипацией трансмембранного потенциала митохондрий. Известно, что диссипация трансмембранного потенциала митохондрий может являться индикатором нарушения проницаемости внутренней ММ. Поэтому представленные данные позволяют предположить, что действие RL2 на клетки MCF-7
приводит к нарушению проницаемости внутренней ММ и активации апоптотического каскада по митохоидриадыюму пути.
Анализ активации инициаторных каспаз в клетках \1CF-7 под действием Для оценки вклада инициаторных каспаз в процесс гибели клеток адеиокарциномы молочной железы человека МС.Т-7 под действием 1^2 был проведен анализ накопления активных форм каспаз-8 и -с) методом Вестерн-блоттинга с антителами к этим каспазам (Рис. 9).
Рис. 9. Изменение уровня инициаторных каспаз в клетках МСК-7, инкубированных с КЬ2 12. 24. 48 и (6) 72 часа. Вестерн-блот: а
прокаспазы-8 и -9 в клетках, инкубированных с .2 (образцы 12 -72), и в контрольных клетках (К); б -активные формы каспаз-8 и -9 в клетках, инкубированных с Я1.2 (образцы 12 72), и в контрольных клетках (К); к - относительные
I*
юсгшаЗ
!? м 4Я п « и га « п к
интенсивности иммуноокраски
белковых полос Вестерн-блота, соответствующих активным формам каспаз -8 и -9, определенные с помощью программы GelPro 5.0.
Из данных рисунка 9 видно, что уже через 12 ч после добавления RL2 (0,1 мг/мл) к клеткам MCF-7 происходит заметное накопление активных форм как каспазы-8, так и каспазы-9. Количество активных форм инициаторных каспаз-8 и -9 синхронно возрастает с увеличением времени инкубации клеток с аналогом. Синхронность изменения уровня активации каспаз-8 и -9 (Рис. 9) указывает на эквивалентность вкладов апоптотических путей, опосредованных этими каспазами, в процесс гибели клеток МСТ-7 под действием RL2.
Так как RL2 вызывает апоптогические изменения клеток, в которые в равной степени вовлечены каспаза-8 и каспаза-9, можно также заключить, что в апоптозе клеток MCF-7 участвуют активаторные элементы как рецептор-опосредованного сигнального каскада, так и митохондриальные факторы.
Анализ активации эффекторных каспаз, ДНКазм DFF40 и олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 под действием
RL2. Известно, что в клетках MCF-7 существует делеция 50-ти п.п. в 111-м экзоне гена каспазы-3. В результате делеции в клетках MCF-7 отсутствует ключевой фермент аноп готического каскада - каспаза-3. Однако известно, что в этих клетках функции каспазы-3 выполняет капаза-7.
Уровень активации касназы-7 в клетках MCF-7, инкубированных с
1<Ь2, определяли методом Вестерн-блот анализа с использованием специфических моноклональных антител. Из данных рисунка 10, а видно, что после 48 ч инкубации клеток МСТ-7 с 1<Ь2 (0,1 мг/мл) происходит специфический гидролиз прокаспазы-7 с образованием неактивной формы р2()-р1 I и ее последующее расщепление, приводящее к появлению большой субъединицы р20.
m-* 66-*
не. ее ♦
*l+r.........
: J »и-'«
Рис. 10. а Анализ активации прокаспазы-7 в клетках MCF-7. инкубированных с RL2. методом Вестерн-блоттинга. Дорожки: I - набор белков с известными молекулярными массами, 2 - клетки MCF-7, не обработанные RL2. 3 - клетки MCF-7. инкубированные с RI.2 (0.1 мг/мл) в течение 48 ч; ö Анализ протеолитического расщепления нуклеазы DFF45 в клетках MCF-7. инкубированных с RL2, методом Вестерн-блоттинга. Дорожки: I - набор белков с известными молекулярными массами, 2 - клетки MCF-7, не обработанные RL2. 3 - клетки MCF-7. инкубированные с RL2 в течение 48 ч:«- Электрофоретический анализ продуктов олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 в 1,5% агарозном геле. Дорожки: I - набор фрагментов Д1IK с известными молекулярными массами, 2 и 4 -геномная ДНК клеток MCF-7, не обработанных RL2, 3 и 5 - геномная ДНК клеток MCF-7, инкубированных с RL2 48 и 120 ч, соответственно.
Для определения уровня активации ДНКазы ЭРР40 был проведен Вестерн-блот анализ фрагментов протеолитической деградации ее ингибитора [ЗКР45 с использованием специфических моноклональных антител. Изданных рисунка Ю, 6 видно, что инкубация клеток МСР-7 с КЬ2 в течение 48 ч не приводит к специфичному протсолизу [)РР45, и, следовательно, к активации !)РР40.
Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток МСР-7 под действием проводили методом элекгрофоретического разделения
геномной ДНК в агарозном геле (Рис. 10. в). Появление олигонуклеосомных фрагментов ДНК наблюдалось лишь через 120 ч инкубации клеток МСТ-7 с КЬ2 (0.1 мг/мл).
Из полученных данных следует, что при действии рекомбинантного аналога лактаптина К 1^2 на клетки МСР-7 происходит индукция апоптотической гибели клеток, сопровождающаяся активацией инициаторных каспаз-8 и -9 и эффекторной каспазы-7. При этом олигонуклеосомная фрагментация ДНК наблюдается лишь на поздних
стадиях апоптоза клеток MCF-7.
Анализ проникновения и локализации RL2 в клетках человека.
Проникновение и локализацию RL2 в клетках исследовали методом флуоресцентной микроскопии на культурах клеток MCF-7 и MSC. Для этого было синтезировано производное RL2 с ковалентно присоединенным красителем 5(6)- карбокситетраметилродамииом (RL2-Rh). Клетки, растущие в лунках 96-луночного планшета, обрабатывали конъюгагом RL2-Rh (0,05 мг/мл) и анализировали распределение конъюгата в клетках на приборе IN CELL (GE Healthcare). Ядра клеток окрашивали DAPI.
Рис. II. Распределение конъюгата RL2-RH в клетках MCF-7 и MSC. Фото фаф и я ф лу о рес цен гн ы х
препаратов клеток MCF-7 и MSC, обработанных коныогатом RL2-Rh; стрелками отмечены области локализации родаминового конъюгата RL2 в клетках. Окраска ядер - DAPI.
Из данных рисунка I 1 видно, что конъюгат RL2 с карбокситстраметилродамином проникает и накапливается в цитоплазме как раковых клеток MCF-7, так и иемалигнизированных клеток MSC. При этом флуоресценция клеток, окрашенных RL2-Rh, характеризуется максимальной интенсивностью па границе цитоплазмы и плазматической мембраны (Рис. II). Распределение интенсивности флуоресценции в клетках MSC, окрашенных RL2-Rh, сходно с распределением интенсивности флуоресценции стресс-фибриллярных структур (Рис. 11, MSC). Похожее распределение интенсивности флуоресценции наблюдают при анализе актинового цитоскелета различных клеток, например, остеобластов.
Таким образом, RL2 проникает как в раковые клетки MCF-7, так и в немалигнизированные клетки MSC и распределяется в обоих типах клеток сходным образом, что указывает на то, что противоопухолевая активность RL2 не связана со способностью избирательно проникать в раковые клетки. При этом механизм проникновения RL2 в клетки остается не выясненным.
Выделение и идентификация белков, взаимодействующих с UL2. Определение белков-партнеров рекомбинантного аналога лактаптина RL2 проводили методом аффинной хроматографии лизатов клеток MCF-7 с последующим масс-спектрометрическим анализом трипсинолизатов белков.
Для выявления белков, взаимодействующих с RL2, хроматографию проводили на сорбенте с иммобилизованным RL2. Для исключения белков, не специфически взаимодействующих с сорбентом, проводили хроматографию лизата клеток MCF-7 на сорбенте, не модифицированном RL2.
Для сохранения нативной укладки белков клетки MCF-7 лизировапи в буферном растворе с физиологической ионной силой и pH. Известно, что электростатические белок-белковые взаимодействия ослабеваю! при повышении ионной силы раствора. Поэтому, элюцию белков, связавшихся с сорбентом, проводили в изократическом режиме в буферных растворах с возрастающей ионной силой (Рис. 12).
Рис. 12. Хроматографическое разделение белков лизата клеток MCF-7 аффинной хроматографией; кривая 1 - хроматограмма белков лизата клеток MCF-7 на СН-сефарозе с ковалентно иммобилизованным RL2; кривая 2 - хроматограмма белков лизата клеток MCF-7 на СН-сефарозе; Фракции: А - белки, не связавшиеся с сорбентом; В - белки, элюируемые буфером, содержащим 300 мМ NaCl; С - белки, элюируемые буфером, содержащим I М NaCl; D белки, элюируемые 6М гуанидин-HCI.
Белки хроматографических фракций (А, В, С, D) анализировали электрофорезом в 12% ПААГ в денатурирующих условиях с последующей окраской геля раствором кумасси. Локализацию в геле белков, взаимодействующих с RL2, определяли, сравнивая электрофореграммы белков из опытных (Рис. 13, дорожки lb, 2b, 3b, 4Ь) и контрольных фракций (Рис. 13, дорожки 1а, 2а, За, 4а). Всего было обнаружено и проанализировано 3 белковых образца, специфично связывающиеся с КЬ2-ссфарозой: образец 1 белки с электрофоретической подвижностью в диапазоне 45 66 кДа, образец 2 белки с электрофоретической подвижностью 66 116 кДа и образец 3 белки с электрофоретической подвижностью 35 45 кДа (Рис. 13, дорожка 2Ь). Эти белки гидролизовали трипсином в геле и анализировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ масс-спектров проводили в программе FlexAnalysis 2.4.
Рис. 13. Электрофоретическое разделение белков фракции, полученных аффинной
хроматографией лизата клеток MCF-7 на СН-сефарозе (дорожки отмечены индексом а) и на СН-сефарозе с иммобилизованным RL2 (дорожки отмечены индексом Ь); Дорожки: I белки фракции А, 2 - белки фракции В, 3 - белки фракции С, 4 - белки фракции D, 5 - набор белков с известными молекулярными массами; звездочкой отмечены белки, вырезанные из геля для проведения масс-спектрометрического анализа.
При проведении масс-спектрометрического анализа фрагментов трипсннолнза белков, содержащихся в образце I и 2, были идентифицированы 14 пептидов а и (5 цепей тубулина человека и 5 пептидов а-актинина-1. Все идентифицированные белки являются белками цитоскелета. В связи с низким качеством масс-спектра образца 3 его анализ не привел к интерпретируемым результатам.
Таким образом, в результате поиска белков клеток MCF-7, способных взаимодействовать с RL2, были выделены и идентифицированы белки цитоскелета: белки семейства губулинов (а и (i цепи тубулина) и а-актинин-1. Полученные результаты позволяют предположить, что при инкубации клеток MCF-7 с рекомбинантным аналогом лактаптина RL2, RL2 способен проникать в цитоплазму клеток н взаимодействовать с белками цитоскелета а и/или р тубулином и а-актинином-1, что подтверждается данными флуоресцентной микроскопии о локализации родаминового конъюгата RL2 в клетках MCF-7 и MSC.
Анализ изменений транекриптома клеток MCF-7 под действием RL2 методом гибридизации РНК на чипах Illumina. Для обнаружения генов, экспрессия которых изменяется под действием RL2, было проведено полногеномное исследование изменений транекриптома раковых клеток человека, обработанных рекомбинантным аналогом лактаптина RL2. Клетки MCF-7 инкубировали с RL2 (0,4 мг/мл) в течение 8, 18 и 28 ч, и сравнивали изменение концентраций мРНК клеток, обработанных RL2, и контрольных не обработанных клеток.
Результаты гибридизации суммарной мРНК клеток MCF-7 были представлены в виде матрицы Nx6, где N = 48000 - число представленных на микрочипе транскриптов. Каждая строка матрицы представляет профиль интенсивностей сигнала ¡-ого транскрипта, распределенного по 6 образцам: 3 образца - клетки MCF-7, инкубированные с RL2 в течение 8, 18 и 28 ч., и 3
- 1S.4 lit
контрольных образна - клетки MCF-7, культивированные без RL2 те же промежутки времени. Значения иптенсивностей были нормализованы с использованием метода "постоянных рангов". Для каждого значения интенсивности сигнала трапскриита был рассчитан минимальный уровень статистической значимости p-Value. Для дальнейшего анализа экспрессии генов были отобраны 8660 сигналов, для которых значение p-Value<0.()5.
Анализ изменения экспрессии генов в клетках MCF-7 после инкубации с RL2 характеризуется изменениями представленности следующих наиболее значимых транскриптов: циклинов А, В, Ii и D, белка р53, белков, контролирующих функционирование веретена деления при митозе (Bubi, ВиЬЗ и Mad2), а также а и ß субъединиц белков, формирующих коропую часть прогеасом.
Инкубация клеток MCF-7 с RL2 в течение 8 и 18 ч характеризуется достоверным повышением относительной концентрации мРНК изоформ циклима В - BI и В2 по сравнению с контрольными клетками. Эти данные могут свидетельствовать о задержке клеточного цикла при переходе клеток из G2 в М фазу под действием RL2. Мри этом в препаратах клеток, инкубированных с RL2 28 ч, относительная концентрация мРНК этих цикли поп уже мало отличается от контроля. В клетках, инкубированных с RL2, концентрация мРНК циклима А2 повышена во всех точках измерения. Это может быть связано с увеличением популяции клеток, синхронизированных в S или G2 фазах клеточного цикла.
Концентрация мРНК циклима DI понижена в клетках, инкубированных с RL2 в течение 8 и 18 ч, и достоверно увеличивается к 28 ч. Различия в концентрациях мРНК циклина Fl во всех парах опыт/контроль незначительны.
Полученные результаты, в совокупности с данными литературы, позволяют предположить, что в клетках, инкубированных с RL2, происходит синхронизация (остановка) клеточного цикла в G2/M фазе (8, 18 ч) и, возможно, в S/G2 - фазе (28 ч).
Анализ изменения концентрации мРНК гена р53 в клетках MCF-7 показал, что относительная концентрация мРНК белка р53 увеличивается с увеличением времени инкубации клеток с RL2, и через 28 ч превышает концентрацию мРНК р53 в контрольных клетках на 5 единиц. Необходимо отмстить, что, в отличие от ряда других линий клеток рака молочной железы (T47D и MDA-MB-468), ген белка р53 клеток MCF-7 не содержит мутаций, вызывающих его инактивацию. Следовательно, повышение концентрации мРНК р53 в клетках MCF-7 можно рассматривать как одни из маркеров апоптоза, индуцируемого RL2.
При проведении функционального анализа изменения экспрессии генов клеток MCF-7 под действием RL2 были сформированы 3 подмножества генов (инкубация клеток с RL2 8 ч, 18 ч и 28 ч), уровень транскрипции которых достоверно был выше, чем в контрольных клетках.
Анализ проводили с использованием базы данных GO при помощи расширения ClueGO программы Cytoscape.
Рассмотрение результатов анализа позволило выделить наиболее многочисленные функциональные группы генов. После 8 ч инкубации клеток MCF-7 с RL2 происходит увеличение количества мРНК следующих групп генов: генов конденсации хромосом, генов центромерных регионов хромосом, а также группы генов, участвующих в задержке клеточного цикла. После 18 ч инкубации происходит увеличение экспрессии в группах генов организации цитоскелета микротрубочек, генов кинетохоров конденсированных хромосом и регуляции митотического цикла. После 28 ч инкубации происходит увеличение экспрессии в группах генов организации актинового цитоскелета и регуляции митотического цикла, а также увеличение концентрации мРНК р53 и группы генов ответа клетки на поврежденния ДНК.
Модель механизма апоптотнчсскон гибели клеток MCF-7, индуцируемой RL2. На основании полученных экспериментальных данных, в совокупности с данными литературы, предложена модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой RL2 (Рис. 14).
Данная модель включает проникновение RL2 в цитоплазму клеткн и взаимодействие его с белками цитоскелета а, ß-цеиями тубулина и а-актинином-1. Известно, что а-актинин выполняет адаитерную функцию при формировании комплексов фокальных адгезии, связывая цитонлазматический домен ß-интегрина с актиновыми филаментами. Предполагается, что RL2 приводит к дестабилизации и диссоциации адгезивных комплексов. Диссоциация адгезивных комплексов в раковых клетках может способствовать активации белка р53. Накопление активной формы белка р53 приводит к индукции аноптоза клетки по рецепторпому и митохоидриальному путям, что сопровождается активацией инициаторных каспаз-8 и -9. Взаимодействие RL2 с а- и ß-цепями тубулина в составе микротрубочек может приводить к высвобождению митохондриального проапоптотического фактора Bim в цитоплазму клетки. Накопление данного фактора в цитоплазме приводит к формированию митохопдриальпых пор и вносит вклад в активацию апоптоза по митохоидриальному пути. Далее инициаториые каспазы-8 и -9 активируют эффекторпую каспазу-7, что приводит к апоптотической гибели клетки.
...................Ii .............................«рииовый
Рис. 14. Модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой RI.2.
ВЫВОДЫ
1. Методами геиной-инжеиерии сконструированы аналоги лактаптииа RLI и RL2. Разработаны методы выделения и очистки рекомбинантного аналога лактаптииа RL2 с использованием аффинной и ионообменной хроматографии, позволяющие получать RL2 с чистотой не менее 97%.
2. Показано, что RL2 эффективно тормозит пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, вызывает снижение жизнеспособности клеток аденокарциномы легкого человека А549 и карциномы гортани человека Пер-2 и не подавляет жизнеспособность немалигнизированных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека MSC.
3. Установлено, что гибель клеток MCF-7, индуцируемая действием RL2, проходит по механизму апоптоза. При этом наблюдается транслокация фосфатидилсерина па внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны, диссипация трансмембранного потенциала митохондрий клеток и активация инициаторных каспаз-8 и -9 и эффекторной каспазы-7.
4. Показано, что RL2 проникает в цитоплазму клеток MCF-7 и MSC и взаимодействует с белками цитоскелета а, ß-тубулииом и а-актинином-1.
5. При исследовании изменений транскриптома MCF-7 иод действием рекомбинантного аналога лактаптииа RL2 методом гибридизации РНК на
полнотранскриптомных чипах Illumina было показано, что происходит увеличение уровня экспрессии гена ТР53 и группы генов, участвующих в р53 зависимом ответе клетки на повреждение ДНК.
6. На основании полученных экспериментальных данных, в совокупности с данными литературы, предложена модель механизма аионтотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой рекомбинантным аналогом лактаптнна RL2, включающая взаимодействие RL2 с белками цитоскелета и активацию белка р53, что приводит к индукции рецепторного и митохондриального путей апоптоза и последующей гибели клетки.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Фомин A.C., Семенов Д.В., Кулнгина Е.В., Коваль O.A., Бабкина И.П., Тикунова Н.В., Матвеева В.А., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Генно-инженерные аналоги потенциального противоопухолевого пептида лактаптина// Вестник НГУ. -2010. -Т. 8. -С. 17-25.
2. Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkinal.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogues of novel milk pro-apoptotic peptide lactaptin and their effect on cultured human cells // The Protein J.-2010.-V. 29.-P. 174-180.
3. Фомин A.C., Коваль O.A., Семенов Д.В., Потапенко M.О., Кулигина Е.В.,
Кит Ю.Я., Рихтер В.А. Анализ биохимических маркеров апоптоза клеток MCF-7, индуцируемого рекомбинантным аналогом противоопухолевого пептида лактаптина // Биоорган, химия, -2012. -Т. 38. -С. 92-98
4. Тикунова Н.В., Семенов Д.В., Бабкина И.Н., Кулигина Е.В., Коваль O.A.,
Фомин A.C., Матвеева В.А., Матвеев А.Л., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Рекомбинантная плазмидная днк pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом каппа-казеина человека, и рекомбинантным пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апонтотической активностью по отношению к раковым клеткам // Патент РФ № 2401307 (дата приоритета: 15 мая 2009 г.)
5. Матвеев Л.Э., Матвеев А.Л., Семенов Д.В., Фомин A.C., Кулигина Е.В., Матвеева В.А., Тикунова Н.В., Бабкина И.FI., Рихтер В.А. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к пептиду, обладающему апонтотической активностью по отношению к раковым клеткам человека // Патент РФ № 2402605 (дата приоритета: 17 сентября 2009 г.)
Подписано в печать 07.11.2012 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 130 экз. Заказ № 122.
Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Фомин, Александр Сергеевич, Новосибирск
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
04201350327
Фомин Александр Сергеевич
АПОПТОЗ РАКОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРУЕМЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫМ АНАЛОГОМ ЛАКТАПТИНА
03.01.04 - биохимия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель: Кандидат биологических наук Рихтер Владимир Александрович
Новосибирск 2012
СОДЕРЖАНИЕ.................................................................'...........................................................2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................5
ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................11
ГЛАВА 1 МЕХАНИЗМЫ ИНДУКЦИИ И РАЗВИТИЯ АПОПТОЗА И ПРОАПОПТОТИЧЕСКИЕ БЕЛКОВЫЕ ФАКТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)........13
1.1 Введение.............................................................................................................................13
1.2 Рецептор-опосредованный путь апоптотической гибели клетки..................................15
1.2.1 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли..........................................15
1.2.2 Структурная организация рецепторов смерти..........................................................16
1.2.3 Механизм сигнальной активации рецепторов смерти.............................................16
1.2.4 Индукция апоптотической гибели клетки через активацию рецептора TNFR1 ...17
1.2.5 Индукция апоптотической гибели клетки через активацию рецептора CD95......20
1.2.6 Участие интегриновых рецепторов в индукции апоптотической гибели клетки .23
1.3 Эндогенный путь апоптоза...............................................................................................26
1.3.1 Внутриклеточные механизмы индукции апоптоза..................................................26
1.3.2 Факторы, регулирующие проницаемость мембраны митохондрий.......................28
1.3.3 Митохондриальный путь индукции апоптотической гибели клетки.....................32
1.4 Регуляторы и индукторы апоптоза...................................................................................35
1.4.1 Каспазы и их классификация.....................................................................................35
1.4.2 Клеточные субстраты эффекторных каспаз..............................................................41
1.4.3 Роль белка р53 в апоптозе..........................................................................................42
1.5 Белковые факторы - индукторы апоптотической гибели опухолевых клеток............44
1.5.1 Проапоптотические цитокины TNF-a, FasL и TRAIL.............................................44
1.5.2 Моноклональные антитела, индуцирующие апоптоз..............................................46
1.5.3 Интерфероны...............................................................................................................48
1.5.4 Интерлейкин-24 (IL-24/mda-7)...................................................................................49
1.5.5 Вирусные белки, индуцирующие апоптоз раковых клеток....................................49
1.5.6 Рибонуклеазы, индуцирующие апоптоз раковых клеток........................................52
1.5.7. Кротамин.....................................................................................................................55
1.5.8 Белки и пептиды молока, индуцирующие апоптоз раковых клеток......................56
1.6 Заключение.........................................................................................................................58
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................59
2.1 Материалы и реактивы......................................................................................................59
2.2 Антитела, ферменты и субстраты....................................................................................59
2.3 Дезоксирибонуклеотиды...................................................................................................60
2
2.4 Буферные растворы...........................................................................................................60
2.5 Методы................................................................................................................................60
2.5.1 Получение продуцентов рекомбинантных аналогов лактаптина........... .................60
2.5.2 Выделение рекомбинантных аналогов лактаптина RL1 и RL2 из лизатов клеток E.coli..............................................................................................................................................61
2.5.3 Очистка рекомбинантного аналога лактаптина RL2...............................................62
2.5.4 Обращенно-фазовая ВЭЖХ рекомбинантного аналога лактаптина RL2..............62
2.5.5 Культуры клеток..........................................................................................................63
2.5.6 Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста...........................63
2.5.7 Анализ экспозиции фосфатидилсерина на поверхности цитоплазматическои мембраны клеток MCF-7............................................................................................................63
2.5.8 Анализ изменений трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF-7 64
2.5.9 Анализ активации каспаз методом проточной цитофлуориметрии.......................64
2.5.10 Получение 11Ь2-сефарозы.........................................................................................64
2.5.11 Синтез родаминового конъюгата рекомбинантного аналога лактаптина RL2 ...65
2.5.12 Флуоресцентная микроскопия клрток MCF-7 и MSC............................................66
2.5.13 Иммуноферментный анализ проникновения RL2 в клетки MCF-7.....................66
2.5.14 Иммуноферментный анализ рекомбинантного аналога лактаптина RL2............67
2.5.15 Определение концентрации белка методом Бредфорда........................................67
2.5.16 Афинная хроматография лизатов клеток MCF-7 на 11Ь2-сефарозе......................68
2.5.17 Трипсинолиз белков в ПААГ...................................................................................68
2.5.18 Масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсинолитического гидролиза белков............................................................................................................................................69
2.5.19 Анализ масс-спектров пептидов с использованеием базы данных Swiss-Prot....69
2.5.20 Электрофоретический анализ ДНК клеток MCF-7................................................69
2.5.21 Анализ белковых препаратов электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS......69
2.5.22 Вестерн-блотт анализ белков и лизатов клеток......................................................70
2.5.23 Анализ содержания липополнеахаридов в препаратах RL2.................................70
2.5.24 Подготовка препаратов суммарной клеточной РНК клеток MCF-7 для
гибридизации на чипе НТ-12 (Illumina)....................................................................................71
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................72
3.1 Введение.............................................................................................................................72
3.1.1 Конструирование рекомбинантных аналогов лактаптина......................................72
3.1.2 Выделение и характеризация рекомбинантных аналогов лактаптина...................75
3.2 Анализ цитотоксического действия генно-инженерных аналогов лактаптина на
клетки человека в культуре.....................................................................................................79
3.2.1 Сравнительный анализ цитотоксического действия RL1 и RL2 на клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7..............................................................79
3.2.2 Анализ цитотоксического действия RL2 на клетки человека различного тканевого происхождения..........................................................................................................80
3.3 Получение инъекционной формы рекомбинантного аналога лактаптина RL2...........81
3.4 Анализ цитотоксического действия инъекционого препарата RL2 на клетках MCF-7,
MDA-MB-231 и MSC в культуре...........................................................................................84
3.5 Механизм цитотоксического действия RL2 на клетки MCF-7.....................................86
3.5.1 Анализ транслокации фосфатидилсерина на внешнюю поверхность плазматической мембраны клеток MCF-7................................................................................86
3.5.2 Анализ изменения трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF-7 под действием RL2......................................................................................................................88
3.5.3 Анализ активации инициаторных каспаз в клетках MCF-7 под действием RL2..91
3.5.4 Анализ активации эффекторных каспаз, ДНКазы DFF40 и олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 под действием RL2..........................................................92
3.6 Анализ проникновения и локализации RL2 в клетках человека...................................96
3.7 Выделение и идентификация белков, взаимодействующих с RL2.............................100
3.8 Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 под действием RL2 методом
гибридизации РНК на чипах Illumina..................................................................................106
3.8.1 Первичный анализ результатов гибридизации РНК на чипе HT-12 (Illumina)... 106
3.8.2 Изменение экспрессии индивидуальных генов клеток MCF-7 под действием RL2 .....................................................................................................................................................106
3.8.3 Функциональный анализ изменения экспрессии генов клеток MCF-7 под действием RL2...........................................................................................................................109
3.9 Модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой RL2......114
ВЫВОДЫ..................................................................................................................................118
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................119
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А549 - культура клеток карциномы легкого человека
AIF (Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial) - проапоптотический фактор, локализованный в межмембранном пространстве митохондрий
ANT (ADP/ATP translocase) - белок, участвующий в транспорте АТФ и АДФ, локализованный на внутренней митохондриальной мембране
Apaf-1 (Apaf-l/apoptosis proteases activating factor) - проапоптотический фактор, участвующий в формировании апоптосом, и в процессе активации инициаторной каспазы-9
АРС (Anaphase-promoting complex) - анафазный промоторный комплекс ASK-1 (Apoptosis Signal-regulating kinase-1) - протеинкиназа, участвующая в активации проапоптотического сигнального каскада
ATM (Ataxia telangiectasia mutated) - сериновая протеинкиназа, являющаяся сенсором 2-х цепочечных разрывов геномной ДНК и активирующая различные белки регуляторы клеточного цикла и целостности геномной ДНК
Bad (Вс12 antagonist of cell death) - цитоплазматический проапоптотический фактор, гомолог семейства Вс1-2, содержащий ВНЗ домен
Bak (Bcl-2 homologous antagonist/killer) - мембранный проапоптотический фактор, гомолог семейства Вс1-2, содержащий 3 ВН домена
Вах (Apoptosis regulator Вах) - мембранный проапоптотический фактор, гомолог семейства Вс1-2, содержащий 3 ВН домена
Bcl-2 (B-cell lymphoma-2, Apoptosis regulator Bcl-2) - антиапоптотический регулятор, гомолог семейства Bcl-2, содержащий 4 ВН домена
BcI-XL (Bcl-2-like protein 8) - антиапоптотический регулятор, гомолог семейства Bcl-2, содержащий 4 ВН домена
Bfm (Bcl-2-like protein 3) - мембранный проапоптотический фактор, гомолог семейства Bcl-2, содержащий 3 ВН домена
ВН1/2/3/4 - функциональные домены белков семейства Bcl-2
Bid (ВНЗ-interacting domain death agonist) - цитоплазматический проапоптотический фактор, гомолог семейства Bcl-2, содержащий ВНЗ домен
Bim (Bcl2-interacting mediator of cell death) - цитоплазматический проапоптотический фактор, гомолог семейства Bcl-2, содержащий ВНЗ домен
CARD (Caspase recruitment domain) - функциональный домен белков, участвующих в процессах олигомеризации и активации инициаторной каспазы-9 и провоспалительных каспаз
Chk2 (Checkpoint kinase 2) - серин/треониновая протеинкиназа, участвующая в регуляции задержки клеточного цикла в ответ на повреждение геномной ДНК CD95 - рецептор смерти Fas
cFLIP (cellular FLICE inhibitory protein) - клеточный ингибитор активации инициаторных каспаз-8 и -10
cIAPl/2 (cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2) - семейство белков - ингибиторов апоптоза
CRD (cystein reach domain) - цистеинбогатый домен
CYLD (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase CYLD) - убиквитин карбоксипептидаза, участвующая в регуляции NF-kB
DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол DD (death domain) - домен смерти
DDR (DNA damage response) - сигнальный путь ответа клетки на поврежденную
ДНК
DED (death effector domain) - эффекторный домен смерти
DFF40 (DNA Fragmentation Factor 40) - ДНКаза человека 40 кДа - функциональный гомолог ДНКазы мыши CAD
DFF45 (DNA Fragmentation Factor 45) - ингибитор ДНКазы DFF40 DiOC6 - 3,3'-дигексилоксокарбоциашш йодид
DISC (death inducing signaling complex) - сигнальный комплекс, в составе которого происходит активация инициаторных каспаз-8 и -10 DR (death receptor) - рецептор смерти E4orf4 - белок капсида аденовирусов EGFR - рецептор эпидермального фактора роста
ERBB - гомолог В вирусного онкогена эритробластной лейкемии птиц (синоним EGFR/HER)
EndoG - эндонуклеаза G
FAK (focal adhesion kinase) - тирозинкиназа, участвующая в формировании комплексов фокальной адгезии
FAM - карбоксифлуоресцеин
Fas - рецептор смерти первого типа, относящийся к семейству рецепторов фактора некроза опухоли
FasL - лигаид рецептора смерти Fas FITC - флуоресцеинизотиоцианат
GAS (interferon gamma activating sequence) - группагенов, активируемых при интерфероновом ответе клетки
Н2АХ - гистон, синтезируемый в G1 или S фазе клеточного цикла, и участвующий в регуляции задержки клеточного цикла в ответ на образование 2-х цепочечных разрывов геномной ДНК
НЕР-2 - культура клеток карциномы гортани человека HER - рецептор семейства эпидермального фактора роста человека ICAM1 (Intercellular adhesion molecule 1) - белок межклеточной адгезии, участвующий в миграции лейкоцитов
ICE (interleukin-ip-converting enzyme) - цистеиновая протеаза человека, катализирующая активацию интерлейкина-ip IGF1R- инсулиноподобный фактор роста IkB (inhibitor NF-kB) - ингибитор фактора транскрипции NF-kB IKK (Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase) - протеинкиназа, участвующая в деградации ингибитора фактора транскрипции NF-kB
ILK (Integrin-linked kinase) - адаптерный белок, участвующий в формировании адгезивных комплексов
Ipaf (inflammatory proteases activating factor) - белок, являющийся структуро образующей субъединицей инфламосомы
IRF1 (Interferon regulatory factor 1) - фактор регуляции интерферонового ответа JC-1 - 5,5',6,6'-тетрахлор-1,Г,3,3'-тетраэтилбензимидазолкарбоцианин йодид JNK (Stress-activated protein kinase JNK) - семейство серин-треониновых протеинкиназ, участвующих в различных клеточных процессах, в том числе в клеточной гибели
LAL (Limulus Amebocyte Lysate) — лизат амебоцитов мечехвоста MALDI TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight) - метод времяпролетной масс-спектрометрии, основанный на десорбции и ионизации молекул под действием лазерного излучения
MCF-7 - культура клеток аденокарциномы молочной железы человека Mdm2 (Double minute 2 protein) - убиквитинлигаза, участвующая в протеосомальной деградации р53
MSC - культура немалигнизированных стволовых клеток жировой ткани человека МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид
7
NAD- окисленный никотинамиддинуклеотид NADP - никотинамнддинуклеотидфосфат
NEMO (NF-kappa-B essential modulator) - субъединица комплекса белков, участвующего в деградации ингибитора фактора транскрипции NF-kB NF-kB (nuclear factor - kB) - фактор транскрипции
Noxa (Immediate-early-response protein APR) - p53 регулируемый фактор, участвующий в процессе активации каспазы-9
NS1 (Non-structural protein 1) - неструктурированный белок вирусов Omi/HtrA2 (High temperature requirement protein A2) - сериновая протеиназа, локализованная в межмембранном пространстве митохондрий
OPG (Osteoprotegerin) - фактор, ингибирующий остеокластогенез и, относящийся к семейству TNFR
р38 (Mitogen-activated protein kinase р38) - семейство серин-треониновых протеинкнназ, участвующих в различных клеточных процессах, в том числе в клеточной гибели
р53 - фактор, подавляющий рост опухоли PARP - поли-(АДФ рибоза)-полимераза PI - пропидий йодид
PI3K (phosphatidyl inositol 3-kinase) - тирозинкиназа, участвующая в формировании комплексов фокальной адгезии
PIDD (p53-induced protein with a death domain) - проапоптотический фактор, участвующий в процессе активации каспазы-2 PLAD - цистеин богатый домен CRD1
РТРС (permeability transition pore complex) - сложный митохондриальный комплекс, участвующий в транспорте ионов и молекул через мембрану митохондрий PS - фосфатидилсерин
Puma (р53 up-regulated modulator of apoptosis) - p53 регулируемый фактор, участвующий в процессе активации каспазы-9
RAIDD (Caspase and RIP adapter with death domain) - проапоптотический фактор, участвующий в процессе активации каспазы-2
RIP1 (receptor-interacting protein 1) - протеинкиназа, участвующая в формировании цитоплазматического комплекса рецептора фактора некроза опухоли RL1 - рекомбинантный аналог лактаптина 1 RL2 - рекомбинантный аналог лактаптина 2 SDS - додецилсульфат натрия
Smac/DIABLO (Direct IAP-binding protein with low pi) - митохондриальный белок, подавляющий функцию ингибиторов апоптоза LAPs
Src (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src) - тирозиикиназа, участвующая в формировании комплексов фокальной адгезии
STAT-1 (Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta) - фактор транскрипции
TAB2/3 (TGF-beta-activated kinase 1 and MAP3K7-binding protein 2/3) - субъединица комплекса белков, участвующего в деградации ингибитора фактора транскрипции NF-kB TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухоли TNFR (tumor necrosis factor receptor) - рецептор фактора некроза опухоли TRADD (TNFR-associated death domain) - адаптерный белок, содержащий домен смерти, связанный с цитоплазматическим доменом рецептора фактора некроза опухоли
TRAF2/5 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2/5) - белок, связанный с цитоплазматическим доменом рецептора фактора некроза опухоли
TRAIL1/2 (TNF-related apoptosis-inducing ligand 1/2) - лиганд рецептора смерти, относящийся к семейству фактора некроза опухоли
Трис - 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол UBD - убиквитин-связывающий домен
UPR (Unfolded protein response) - ответ клетки на неправильную укладку белков USAN (US Adopted Names) - номенклатура моноклональных антител и их фрагментов, принятая в США
VDAC (Voltage-dependent anion-selective channel protein 1) - потенциал-зависимый анионный канал, локализованный на внешней митохондриальной мембране VEGF - эндотелиальный фактор роста сосудов VEGFR - рецептор эндотелиального фактора роста сосудов XIAP (Baculoviral IAP repeat-containing protein 4) - ингибитор каспазы-3, -7 и -9
АДФ - аденозин- 5'-дифосфат АТФ - аденозин-5'-трифосфат дАДФ - дезоксиаденозин-5'-дифосфат дАТФ - дезоксиаденозин-5'-трифосфат а.о. - аминокислотный остаток ДМСО - диметилсульфоксид ИФА - иммуноферментный анализ ЛПС - липополисахариды
ММ - митохондриальная мембрана ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ЭДТА- этилендиаминтетраацетат ЭР - эндоплазматический ретикулум
ВВЕДЕНИЕ
Ежегодно во всем мире от злокачественных опухолей умирает свыше 7 млн человек и диагностируется около 10 млн новых слу�
- Фомин, Александр Сергеевич
- кандидата химических наук
- Новосибирск, 2012
- ВАК 03.01.04
- Сравнительная характеристика цитотоксических белков и апоптотических процессов в клетках лимфоидной и нелимфоидной природы
- Роль PEDF в образовании фибриллярных внеклеточных структур при миопии
- Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки
- Разработка технологии суспензионного культивирования клеток CHO для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а
- Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики