Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибиторы проникновения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в клетку

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ингибиторы проникновения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в клетку"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д.И.ИВАНОВСКОГО

; : и сл

На правах рукописи

ПАВЛОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ИНГИБИТОРЫ ПРОНИКНОВЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА'(ВИЧ)

В КЛЕТКУ.

03.00.03. молекулярная биология'

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН. _

Научные руководители - член-корреспондент РАМН, доктор био-.

логических наук, профессор I ' КЛИМЩО С.М.

- старший научный сотрудник КАРАМОВ Э.В. ,

Официальные оппоненты - доктор .- Медицинских наук

СИДОРОВИЧ И.Г.

кандитат биологических наук ЗВЕРЕВ В.В.

Ведущее учреждение • - Научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится 1994г..

в £С-часов на заседании Специализированного Совета Д.001.20.01. при НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (Москва, 123098, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан ддочг.

Ученый секретарь

Специализированного совета ' ,

кандидат медицинских наук А.М.ЖУКОВСКИЙ

)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Прошло уже более 10 лет с момента обнаружения БИЧ - вируса, признанного причиной СГИДа. к'настоящему моменту Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) зарегистрирован во всех странах мира. Причем, в некоторых развитых странах, таких как США, CIЩ ухе вышэл на третье месго по смертности, обогнав онкологические заболевания. В мире к 1994г. выявлено более 700 тыс. больных, из них погибли около 200 тыс. человек. В России 692 человека :1ме:от диагноз ВИЧ-инфекция, 95 человек уте умерли. По прогнозу зкспертоз BOB к 2000г. ожидается около 40 млн. инфицированных людей на Земле. Пандемия продолжает расширяться.

Соответственно возрастает необходимость в эффективных противовирусных препарате:*. Существуют самые разнообразные подходы к конструированию новых хишотерапевтических средств. В подавляю-пем большинстве экспериментальных работ поиск перспективных препаратов с анти-ЕИЧ активность» Еедетск не вслепую, а с цел&й подавить некоторые из известных стадий жизненного цшаа вируса. С этой точки зрения перспективны исследования ранних этапов жизненного цикла ВИЧ, г именно стадии проникновения, состоящей из эдгвоии, рецепции и фузии. Ингибиторы этих процессов могут являться одновременно и инструментами фундаментального исследования, л отпраьной точкой молекулярного дизайна новых противовирусных средств.

С другой стороны, с момента открытия ЗИЧ, одним из ключевых вопросов ретровирусологки стало изучение механизма, с помощью которого в результате ьирусной инфекции происходит истощение едкого из классов Т-лк\г>оцктов, а именно Т-хелперов вследствие существенного иитопатического эффекта [Gallo et al., 1984, Levy et ai., 19Я4], з конечном счете приводящее к иммунодефициту при СПИДе. Согласно одной из гипотез, основную роль в гибели клеток от ВИЧ ртрапт процессы, опосредованные вирусными поверхностными гликопро-гепгами d.ifsun et al.,19861, особенно Еирусиндуцирован-ное слияние клеток с формированием синцитиев.

Изучение ранних событтм в репликации ВИЧ затаю потому, что пзаикодзйствие мембран вируса к клетки является критическим моментом в инфекционном процессе у с5елочечн«х вирусов. Именно поэтому атап проникновения БИЧ потенциально важная микень для противовирусной терапга.

Уже показано, что соединения, содержащие отрицательно заряженные конные группы (полианионы), могут блокировать репликации

БИЧ в культуре клеток. Причем, в отличие от азидотимидина и его аналогов, полианионы различной природы способны еще и подавлять слияние инфицированных и неинфицированных ¡теток ШИзиуа еЬ а1., 1988]. Имеющиеся на сегодняшний день даяние говорят о том, что такие соединения препятствуют адсорбции вирионов на поверхности клеток, но не проникают в цитоплазму [Уещерякова, 19923. т.е. ингибировгние инфекции происходит на стадии взаимодействия вирусного гликспротелна £р120 и рецептора клеточной поверхности СМ.

Как ухе отмечалось, ключевым моментом проникновения ВИЧ в клетку является фузия. Работами Карамова с соавт. (1952), СотрапБ с соавт. (1990) показано, что синтетические пептиды, соответствующие И-концу трансмембранного гликопротеина ВИЧ £р41, могут влиять на функциональное состояние клеточных уеьйран, а также блокировать слияние клеток, вмешиваясь в процесс проникновения зируса в клетку-мишень. В экспериментах с конъюгатами пептидов с различны.^ белками и синтетическими полимерами было продемонстрировано, что действие пептидов зависит не только от аминокислотной последовательности пэптвда, но и от заряда молекулы и ее кэнфорыации С51еризЬк1п а1., 1990, 1992]. } С другой стороны, имеется сведения о том, что способность ВИЧ-инфицированных клеток к слиянию не коррелирует с количеством С04-рецепторов, но зато пропорциональна количеству экспрессирс-ванных на поверхности клеток молекул ЬГА-1, одного из интегрино-вых рецепторов [бгиЬег а1., 19Э1, Рап1а1ео о1 а1., 16913. Показано, что ВИЧ-индуцированное образование синцития требует участия интегриков, представителей суперсемейства рецепторов те точней адгезии. Изучение противовирусной активности ингибиторов интегриновых рецепторов может оказаться кобым подходом в проблеме альтернативного механизма проникновения ВИЧ в клетки интегрин-опосредованным СМ-не зависимым путем.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в КИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, плановая тема N65, по изучению молекулярных механизмов ранних этапов жизненного цикла БИЧ и возможности специфического хкмиотерапевтического воздействия на эти процессы. Мы приводим данные 1) по влиянию полианионов (сульфатированных хитозанов) на процесс проникновения ВИЧ; 2) по действию пептидов фузии из ер41 ВИЧ на репликацию ВИЧ; 3) по противовирусной активности аджоена - инактиватора интегриновых рецепторов, возможно, опосредующих альтернативный механизм проникновения ВИЧ в клетки-мишени.

Дель у гадачл кселодованкя

Цель работы - изучение возможностей и механизмов икгибирова-ния жизненного цикла БИЧ на стадии "ранних событий": адсорбции и фузии, соединениям:! полианиокнсй природы и пгптздааи фузии из_ ВИЧ-1; исследование одного из возможных С04-независимых путей проникновения ВИЧ в клетку мишень, путем блокирования ви-руеиндуцированного образования синцитиев веществами, препятствующий гонотипической адгезии. Для достижения поставленной цели репалнсь следующие задачи:

1. Исследование влияния сульфатированных производных хитина и хитозаьа, различающихся природой, зарядом и пространственной ориентацией заместителей в элементарном зЕене полисахарида, на процессы ВИЧ-инфекции (вирусиндуцироваяное образование синцитиев и продукция вирусных антигенов). Определение наиболее значимых фактороз для максимальной антивирусной активности этих соединений, сопоставление структур.

2. Оценга сульфатнрозанных производных хитозана, как возможных химиотералэвт:<чески>: средств.

3. Изучение 1леханиона подавления ВИЧ-инфекции пептидами ■ фузии из ^р41 ВИЧ-1, путе»1 анализа воздействия пептидов на разные этапы жизненного цикла вируса, в том числе: адсорбцию, осгаатнуа транскрипции к интеграцию провирусного генома, а чгк^.е на про-дуда якрусках антигенов и вирусикдуцироЕзаное сняцитнеобразо-вание.

4 Исследование влияния последовательности зминскислот, носителей и мжроокругенхя пептидов, путей го: различных модификации (амнноы'слотных замен, конъюгировачия с различными природными и синтетическим;! по зиме рами), на антивирусную активность этих соединений.

5. Оценка блокирующей акткзности соединения, являющегося ач-лсстеричееким инэктиваторсм интегркновых рецепторов адгезии, на процессы Зйрусиндуцированяого образования ешцэтиеь и продукцию вчрусных антигенов.

Научная иов:гзК1 результатов ::ссл5дс.зания.

Исследована анти-БИЧ активность некоторых производных хитина и хитозана, различждихоя зарядом, природой и пространственном расположением „заместитэлей (з т.ч. сульфатных групп) в элементарном звене хитозана. Выявлено, что 3 группы сульфаэт'рованкых производных хитозана значительно подазлявт как вирусную репликацию, так 7 ьчрус-индуцированное образование синцитиев в дозоза-змс.чмой форме (ИД50 составляет 0.08-2.00 мкг/мл) пря отсутствии

видимой токсичности. Был сделан вывод, что для подавления репли-кативной активности ВИЧ важно наличие и местоположение сульфатной группы в звене хитозана.

Впервые показано, что расположение сульфатной группы при С-6 в цэпях хитозана является необходимым, но не достаточным условием проявления максимальной анти-ВИЧ активности для данного класса полиаминогликанов, при этом увеличение. содержания этих групп в цепях хитозана выше определенного значения, вероятно, не играет существенной роли. Омвидно, ватное значение имеет молекулярная масса и полидесперсность этих соединен™, а также природа и пространственное расположение других заместителей в структурном звене хитозана.

В целях возможного использования препаратов сульфатированных производных хитозана рассчитан химиотерапевтический индекс для наиболее активных соединении .

Впервые исследовано влияние 22-членного пептида из гр41 ВИЧ-1 в различных модификациях (в том числе конъюгированного с некоторыми природными и синтетическими полимерами) на вирусную адсорбцию и ВИЧ-индуцированное образование синцитиев. Установлено, что пептиды фузии ннгибируют синцитиеобразование и продукцию вирусных антигенов, не препятствуя специфически адсорбции вируса на поверхности клеток и не подавляя активность обратной транскрип-тазы вируса, но уменьшают количество интегрированной провирусной ДНК. Эти данные позволили сделать вывод о том, что пептиды фузии БИЧ направленно воздействуют на процесс проникновения вируса в клетку через клеточную мембрану.

Доказано, что действие лептидов фузии на ВИЧ-инфекцию является специфическим, и для его проявления важны не только аминокислотная последовательность и наличие свободного И-конца молекулы пептида, а также природа, заряд и пространственная организация носителя.

Установлено, что аллостерический инактиватор интегриновых рецепторов - адхоен - способен подавлять вирусиндуцированное образование синцитиев и продукцию вирусных антигенов. Это свидетельствует о роли интегринов з процессах слияния клеток, а также может указывать на существование альтернативного механизма проникновения ВИЧ в клетки (интегрин-опосредованный СМ-независимый путь).

Выдвинуто предположение, что комплексное.применение ингибиторов рецепции, адгезии и фузии может быть эффективным способом предотвращения ВИЧ-инфекции клеток-мишекей.

-

Значение работа для теории и практики

Диссертационная работа представляет собой часть исследовании, проводимых в ГОЛ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН, посвященных изучению молекулярных механизмов проникновения ВйЧ в клетки и возможное^:; химиотерапевтического воздействия на эти процессы.

Отобранные сульфатированные производные хитозана, обладавдие высокой анти-ШЧ а;стивностыо, особенно при подавлении вирусинду--цирозанного образования сичцитиев, с максимальным химиотерапев-тическим индексом. В дальнекяем они могут быть рассмотрены в качестве возможных перспективных средств для лечения СПИД.

Исследование влияния синтетических пептидов из гр41 на ВИЧ-инфекцию подтвердило специфичность действия этих препаратов. Установлена стадия жизненного цикла вируса, которую блокируют эти пептиды - Фузия.. Обнаружение конкретной молекулярной мишени для пептвдомимзтиков дает ключ к пониманию молекулярного механизма проникновения ВИЧ в клетку-мишекь.

Обнаруженная нами противовирусная активность аджоена - ал-лостерического инактиватора интегриновых рецепторов, мотет служить подтверждением возможности существования альтернативного механизма проникновения БИЧ в клетки: интегрин-опосредованного С1Э4-несависимого пути.

Применение аджоена или других ингибиторов интегринов в комбинации с традиционными противовирусными средствами может иметь перспективы при лечении ВИЧ-инфекции.

Новые научные факты, представленные в диссертации, дополняют современные представления о механизмах взаимодействия вируса с клеткой-юиеныо.

ОсноЕнаэ полояепля, кжеезиые на газету

1. Сульфатированные производные хитозана являются эффективными ингибиторами зирусиндуцкрованяого образования синцитиев и способны подазллгь рзи^-сацтаэ ВИЧ.

2.- Антивирусная активность произзодгшх хитозана зависит от налагая и местоположения сульфатной группы в элементарном звене хитозана. Важное значение жгет молекулярная масса и поли-десперснсотъ ггих соединений! а такие природа и пространственное расположение другмх заместителей.

Пептиды фузии, соответствующие М-концевой области ЕИЧ, тгибируют вирусиндуцпрсвакное образование синцткев и продукция вирусных антиггноз, направленно блокируя процесс сл::пния вирусной оболочки с клеточной мембраной (фузию).

4. Действие пептидов фузии на ВИЧ-инфекцию язляется специфи-

ческим и для его проявления важны на только аминокислотная -последовательность и наличие свободного N-конца молекулы пептида, но и природа, заряд и пространственная организация носителя.

5. Аллостерический инактиватор интегриновых рецепторов - ад-жоен - способен подавлять вирусиндуцированкое синцитиеобразова-ние и репликацию ВИЧ, что свидетельствует о роли интегрмнов з процессе слияния клеток, а также может указывать на сужестЕова-ние альтернативного механизма проникновения ВИЧ в клетки (интег-рин-опосредованный СМ-незавизимый путь).

Публикация результатов исследования и апроб^м работа,

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Основные результаты представлены на конкурсе молодых ученых £ НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМЧ й 1395г, на II международной конференции по СПИДу (Ст. Петербург, 1993).

Диссертация апробирована 23.12.93 на конференции отдела молекулярной биологии вирусоз КИИ вирусологии им.Д.К.Ивановского РАШ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на ...стр. машинописного текста и состоит из следующих разделов к глав: введение, обзор литературу (3 главы), собственные исследования (4 главы), выводы, список литературы. Список литературы вклачает источника-, из которых-'/? отечественных и-^¿зарубежных.

■ж * *

Автор пользуется случаем выразить искреннию благодарность своим научным руководителям член-корреспонденту РАМН, профессору Клименко С.Ы. и старшему научному сотруднику, руководителю группы иммунохимии НИИ вирусологии им.Д.К.Ивановского Караыову З.В. за оказанную помощь в выполнении диссертационной работы, ценные советы и рекомендации. От всей души благодари старгаего научного сотрудника, к.б.н. Корнилаеву Г.В. за оказание всесторонней консультативной и практической помощи. Быразжачз искренняя благодарность всем соавторам и коллегам из группы иммунохимии НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

В экспериментах использовались следующие линии CD4+ клеток: Н9 , МТ4, СЕМ (клон 13); хронически инфицированные линии, полученные в группе иммунохимии НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского

РАМН: H9/RF, СЕМ/LAI (последние две в качестве линий-продуцентов ВИЧ).

Вирус

Вирус для заражения (ВИЧ-1) получали из культурального супер- . натанта хронически инфицированных линий H9/RF и CEM/LAI. Титр вируса, содержащегося в супернатанте, составлял 1.0-2.0 х х105 ТСШ5о/мл.

Сульфатированные производные хитозана (СГОС)

СПХ были синтезированы и любезно предоставлены канд. хим. наук А.И.Гамза-саде (Институт пищевых веществ РАН). Хитозан-'(по-ли-е(1-4)гдвкозамин)- это дезацетилированное производное хитина ракообразных. Исследованные в работе производные хитозана (XT), в том числе и сульфатированные, получали по ранее списанным ме-тодккзм [¡Äizzarelli S. et al., 1985].

Препараты пептида

Пептиды фузии ВИЧ были синтезировали и любезно предоставлены канд. xia.i. наук Андреева С.М. с соавт. (Институт иммунологии МЗ России). Конъюгага пептидов с белками и синтетическими полимерами были получены по ранее описанным методикам Шветкоз Д.Е. с соавт., 1SS0; Andreev S.M. et al., 1991].

Аджоен

Аджоэн был синтезирован и лэбезно предоставлен доктором Тата-ринцевым A.B. с соагт. (Московский государственен университет). Адг.эен, (Е, Z)-4,5,9-тритиздодека-1,6,11- триен-9- оксид, был получен и разделен на стер-эоизомери согласно [Block M.L. et al., 19863; спектральные характеристики синтезированных продуктов соответствовали описанным в литературе (данные не представлены).

Использовали культуральнне, вирусологические к иммунологические методы, подробная характеристика которых представлена в соответствуют;гх разделах работы.

^ Цч?отокс1инос'1'ь препаратов определяла путем подсчета живых и мертвых клеток (МТ4, Н9, СЕМ13) после окрашивания их 0.1% раствором тркпаковего синего на 3 сутки культивации в присутствии различных концентраций препаратов.

Испытание антивирусной активности

Активность вирусной репликации в присутствии .и отсутствии препаратоз оценивал:? по содержанию антигена в культуразьных пробах методом VBep.-.офазного иммуноферментного анализа (ELISA) по методу, разработанном/ в группе »кмунохимии Ж1 вирусологии ¡а».Д.И.Ивановского РАМН [Жданов В.Ч., Карамов Э.В. с соавт., 1938].

Тест ингибирования синцитиеобразования

Неинфицированные клетки линии Н9 и хронически инфицированные H9/RF сокультивировали в концентрации 5х105/мл в соотношении 2:1, дающем максимальное количество синцитиев. Испытуемые препараты в различных концентрациях добавлялись к инкубационной смеси. Исследования проводились в 96-ти луночных панелях ("FLOW", "Costar", CSA) в о&ьэмз 140 мкл на лунку. Подсчет синцитиев производили через 16 часов визуально во всем объеме лунки. Учитывали синцитии, размеры которых в 2.5-3.0 и более раз превышали диаметр нормальной клетки Н9. Контролем максимального синцитиеобразования считали количество синцитиев на лунку после сокульти-вацда клеток Н9 и H9/RF бев добавления исследуемых препаратов.

' Исследование взаимодействия ВИЧ с кчеткой

К 500 мкл суспензии клеток Н9 (5х105/мл) добавляли 50 мкл меченного С^Нметионином вируса (105 имп/мл). После инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут, клетки были осаждены низкоскоростным центрифугированием, и в оставшемся супернатанте определяли уровень радиоактивности. Эффективность адсорбции определяли по разности между обзим количеством радиоактивности, связанной с введенным в клеточную культуру вирусом и количеством радиоактивности, связанной с вирусом, не адсорбировавшемся на поверхности клеток и оставшемся в супернатанте.

Депная подимеразная реакция

К 400 мкл. осветленной вируссодержащей (СЕМ/LAI) культураль-ной жидкости добавлялись препараты пептидов" в концентрациях 1 или 10 мкМ, после чего полученный инокулят вводился в культуру клеток СЕМ13 (общее количество: 2х106 клеток). Инкубация проводилась при комнатной температуре - 30 мин. и затем при 37°С - 2 часа. Клетки осаждались низкоскоростным центрифугированием, дважды промывались в PBS и лизировались согласно методике- Cetus в лизирущем буфере с протеинагой К. Реакция проводилась с использованием Perkin-Elmer/Cetus амплификатора и Taq полимеразно-го набора, согласно рекомендациям производителя, в течении 30 циклов. Амплифицированная ДНК исследовалась методом слот-блот гибридизации. Для детекции использовалась биотиновая олигонукле-отидная проба SK19 ÍOu С.Y. etal., 1988]. Гибридизация проводилась по стандартной методике [ManiatIs Т. et al., 1982] с использованием стрептавидин-пероксидазного конъюгата.

Обратнотранскриптазная реакция

Обратнотранскриптазная реакция (RT) проводилась по стандартной методике [Hoffman et al., 1985, Гараев с соавт., 1988]. По-

лимеразная активность исследовалась при добавлении экзогенного синтетического праймера poly(rA)-ollgo(dT). Пептидные препараты добавлялись непосредственно в реакционную смесь в конечной концентрации 10 мкМ. Активность обратной траяскрюттазы определялась-по урознзз включения [3HJTTP в кислотойерастворимую фракция.

Получение пептидных антисывороток

Кролики вакцинировались 200 мкг Р385 в полком адагванте Фре-. инда тремя подкожными иммуяизациями с 2-х недельными интервалами. Образцы сывороток исследовались в ELISA с использованием различных пептидов фузии, адсорбированных на пластике в 95-ти луночной панели £143 и в HTLV-II! Western blot (Dupont) .(работа выполнена sa базе Института иммунологии Ш России под руководством Андреева C.lí. и Мещеряковой Д.В.).

Элестронно-микроскопическоа исследование препаратов пептида

Для электронной микроскопии 10 мкл 5мМ раствора пептида в DMS0 смешивали со 100 мкл фосфонатяого буфера (PBS), pH 7.4. Этот раствор инкубировался в течение ночи при комнатной температуре, затем наносился на Formvar сетку с карбонсзым покрытием на 30 секунд. Избыток суспензии удалили и окрасили препарат 2% ура-яил ацетатом. Сетки исследовались в Jeol 100S электронном микроскопе при &0 кВ (Григорьев В.Б. и др).

Достоверность полученных в экспериментах результатов оценивали по критерию Стъкдента. Результаты считали достоверными при ■ Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния пожакнонов (суль£атнрсвашшх производных хютзака) ка процесс проникновения вируса иммунодефицита человека з клетку.

Был синтезирован ряд соединений - производных хитозана (ПХ), разлетающихся по степени их сульфатирования и кислотно-оснозным свойствам (табл.1, рис.1).

Рис.1. Обобщенная структурная формула производных хитозана.

- 10 -

Табл.1 Характеристики производных хитозана

N Шифр Состав Содержание серы, % Характеристическая вязкость, с11/е

1 2 ХТ-1 ХТ-11 1?1- н 1?2- Н - 3.00 0.11

3 хт-ш Й1- СН2С00" Кг- СОСНз - 2.10

4 5 6 ХГ-1У ХТ"-1У XI* "-IV 1?1- н Яг- й-соо" \ ЯЭз' ■ 7.0 7.0 7.0 СЧ*чСО ООО

IV со ХТ-У ХТ-У1 1?1- БОз" 1?2- Н 15.0 6.5 0.19 0.09

9 ХТ-УП БОз" 1*2- 1?-С00" 10.4 0.21

10 ХТ-УШ !?1" БОэ" (?2- я-соо" Э0з~ 13.7 0.09

Анализ воздействия этих соединений на репликацию ВИЧ показал (рис.2), что ни хитозан с содержанием НН2-групп около 85% (ХТ-1), ни его частично дезаминированный образец ХТ-П не обнаруживают кгких-либо признаков анти-ВИЧ активности. Усиление кислотных свойств в случае соединения ХТ-IV приводит лишь к едва заметному антивирусному эффекту, который практически не изменяется при варьировании длины полимерной цепи.

. Между тем, высокозамещенный сульфат хитозана (ХТ-У), содержащий сульфатные группы преимущественно при С-6, заметно активней, хотя общий отрицательный ' заряд . у данного соединения частично уравновешен слабоосновными ЛН2-группами при С-2.

Можно предположить, что большая активность ХТ-У в сравнении, например, с ХТ-IV обусловлена более высоким содержанием сульфатных гру-лп (15Х и 7г серы соответственно). Но, с другой стороны, ХТ-УI, содержаний сульфатные группы при С-6 примерно в равном количестве с ХТ-IV, проявляет заметное антивирусное действие. Поэтому мы делаем вывод, что определяющим фактором в подавлении активности ВИЧ является расположение сульфатной группы при С-6 в -элементарном звене хитозана. Очевидно, важное значение также

Рис. 2 Подавление репликации ВКЧ-1 штамм RF в клетка» Н9 в присутствии производных хитозана.

IS 8.000 SYI1I Ezzavn

ESJYi

ES3Y

SSJY

IBS],. II. П1

*3араженные ¡тетки культивировали в течение 72 часов в присутстшс! разггмкых концентраций препаратов XX (I-V7II) и декстраасулафата (DS) с м.е. 8000. Экспрессии антигена определяли «входом '¿ФА, за 1C3Z принимали количество антигена, обнаруживаемого в iip-.öe без препаратов. По оси ордгшат - X акззтвяоети рглл:л:ацг1И вкрус», определяемой г ELISA, по о см гбщксс - кок-цегргдкк преперт.тез (мкт/ил).

шеет молекулярная масса и полидисперскэсть этих соединений, природа и ^ростраксазенпое расположение других заместителей в структур.;:^ звепэ хитозана.

Следует отметить, что введение СООН-группы в хито-зан-б-О-сульфат, как зто имеет место для X7-VII и XT-VIII может оказывать позитивное злкяки; на активность соединения, но лишь при наличии определенным образом ориентированной сульфатной группы.

Наиболее активным соединением из числа исследованных нами производных хитозана оказался образец ХТ-VIII, содержащий две сульфатные группы и одну карбоксильную на элементарное звено хи-

тозана. Эхо соединение способно подавлять ВИЧ-инфекцию на 91.62 при довольно низкой концентрации вещества, равной 1 мкг/мл.

Табл. 2. Оценка терапевтического индекса сульфатированных производных хитозана.. декстрансульфата и AZI.

Препарат ИД50 (мкг/мл) ЦТД50 (мкг/мл) ЦТД50/ИД50

1 ДС 8000 3.6 5000 ^ 1389

2 А.2Т 0.03 50 1667

3 XT-VI 0.5 >5000 >10000

4 XT-V 0.9 4900 5444

5 XT-VII 0.22 >5000 >22727

6 XT-VII I 0.12" >5000 >41667

*ИДзо " концентрация вещества, подавляющая репликацию вируса RF в клетках Н9 на 50%.

*ЦТЙ50 " концентрация вещества, вызывающая снижение жизнеспособности клеток Н9 на 502.

*Терапевтическкй индекс определялся отношением ЦТД50 к ИД50.

Практически все изученные производные хитозана и хитина не обладают токсическим действием вплоть до концентрации 500 мкг/мл. При увеличении концентрации до 5000 мкг/мл большинство соединений обнаруживают незначительный токсический эффект и только препарат XT-V при этой концентрации вызывает гибель клеток - на 40-502 больше, чем в контроле.

Таким образом, можно сказать, что несмотря на различия в структуре и молекулярной массе, в основном все исследованные производные хитозана и хитина оказались малотоксичными. Однако, даже приблизительный расчет химиотерапевтического индекса показывает, что эта величина достаточно высока и превышает таковую для AZT, признанного одним из лучших ингибиторов ВИЧ (табл.3).

В тесте синцитиеобразования наиболее эффективными соединениями оказались сульфатироЕанные производные хитозана XT-VII и XT-VIII. При концентрациях этих препаратов, равной 10 мкг/мл, достигалось почти 1002-ное ингибирование процесса синцитиеобразования, причем в этом тесте 502-ная доза составляла 0.1-0.03 мкг/мл. Эффективность сульфата хитозана XT-V была .в 6-8 раз ниже. Остальные соединения, даже в высоких концентрациях (100 мкг/мл) проявляли незначительную активность, либо вовсе не были активными.

ЧУ

- -

Рис. 3 Подавление сишрггкеобразования в присутствии производных хнтозана при сокулыквацни клеток Е9 и S9/RF.

^DS 8.С00

эмп

GZZVII

шч

ЕЯ IV ®Й1, 13

ш

ил 1,0 10,0

*Клетк>: НЗ ffií/KF сокулыизировали в концентрации 5х105/кл s соотнесении 2:1, дачйцеи иакеихальное количество еккцмгиев через 16 часов. За ICO," приткали число образовавшихся синцнтлег; в пробе без препаратоа. По оск ординат - X образовавшихся гс*»» turnea от контроля ш;$е;щии, но оси nöci^tcc - концеятраш:и препаратов (ичг/ул).

Сравнивгя каши данные по анти-ВИЧ актизности с данными других азтсров, кадс отыатить, что сульфгтированкые производные хитоза-ка оказались гораздо эффективнее многих у*е известных сульфопо-лисахаридов (з т.ч. декстран сульфата с м.в. ЮкД [Baba ¿t al., 1990а]. и др.). Сходной активностью в подавлении синцитиеобраао-вания обладали ляыь сульфатирозаниые полимеры (PVAS и PAVAS) акриловой кислоты с молекулярным весом 10 и 20kD [Bate et al., 1990Ы.

Оценивая антивирусный зф^экг производных хитозага- (XT-VII и XT-V1II) и А1Т в аналогичных условиях, следует отмотать, что они близки, несмотря на различные механизм действия.

В литературе нет единого мнения относительно механизма блокирования рецепторного взаимодействия gpl2ü-r¡D4 сульфоиолксагари-дами. С одной стороны, данные, представленные Mitnjya Н. с

-3.4-

соавт. (1988) и позже Callahan L.N. с соавт. (1991), говорят о взаимодействии СПХ с вирусным гликопротеином, что блокирует связывание ВИЧ с CD4+ клетками и препятствует связыванию нейтрализующих антител с УЗ-областыо. Но также Parish C.R. о соавт. (1989) показано, что сульфополимеры могут реагировать с gpl20 связывающим участком С04-рецептора.

Проведенные нами исследования, показали, что пептиды из V3-области gpl20 снимают ингибирующее действие сульфополисахари-дов в тесте синцитиеобразования. Было выдвинуто предположение, что механизм подавления ВИЧ-инфекции этими препаратами имеет стадию - электростатическое взаимодействие с положительно заряженными аминокислотам в N-концевой зоне V3 gpl20.

В дальнейшее экерериментах было проанализировано действие полианионов в двух различных системах: блокирующая активность в ELISA и в тесте синцитиеобразования. При этом наблюдалась полная корреляция: СПХ. которые блокировали связывание специфических антител с пептидами из PND и С-конца gpl20 в конкурентной ELISA, были также активны в культуре клеток. Для данного эксперимента использовали ДС 5х105 и хитозан XT-VII в двух концентрациях, вызывающих, примерно 75Z и 1002 ингибирование синцитиеобразования. Два пептида - Р4(307-329) и Р5(301-323) из PND двух штаммов вируса, Ш и BRU, в концентрации 250 мкг/мл (90 мкМ) полностью нейтрализовали блокирующее действие как ДС, так и хитозана (рис. 4). Была выявлена четкая зависимость доза-эффект. Модифицированный по эпсилон-аминогруппе лизина пептид 5 и Р6(310-323) не влияли на активность ДС. Пептид Р8 (495-516) вызывал лишь незначительное увеличение числа синцитиев. Пептид Р12(842-861 gp41) при концентрации 250 мкг/мл был токсичен дм клеток, однако в меньших концентрациях достаточно эффективно нейтрализовал действие ДС.

Вся совокупность полученных результатов показывает, что механизм ингибирсвания ВИЧ-инфекции СПХ может быть обусловлен наличием электростатического взаимодействия полианйонов с основным нейтрализующим доменом gpl20 301-323 (PND) и/или с С-концевой областью gpl20 (495-516), причем для процесса связывания имеет значение не только плотность заряда, но и специфичекое сочетание аминокислотных остатков, включающее, по крайней мере, две соседствующие положительно заряженные аминокислоты: Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg, т.к. модификация даже одного лизина приводит к утрате взаимодействия.

8 тесте синдитиеобразовакия. А: 03 в конлекграаии 2.5 нкг/кл: 03 в концентрации 0.25 нкг/нл. Абсписса:- кониентрашя пеютша в растворе: ордината: * синшотеа по сравнен!» с контрольна уровнен без добавления каких-либо соединения. Аналогичые концентрационные зависимости были получены для ХТ-УИ. результата представляют совой среднее значение для трех независим« экспериментов со стандартам отклонением не более 10%«.

Изучение действия синтетических пептидов фузии, соответствующих U-концсвой области gp41 ВЛЧ-i, на репликацию вируса.

В настоящей работе исследовалась проблема специфичности действия пептидов фузии из ер41 на ВИЧ-индуцированное слияние клеток. Для решения этой задачи изучалась активность различных пептидов ( в том числе: пептидов фузии ЕЧЧ - табл.3, конъюгатов этих пептидов с BSA и синтетическими полимерами - табл.4, гидрофобного пептида из трансмембракной области гдикопротеина D вируса простого герпеса - PKSV) в тесте синцитиеобразования.

PHSY не оказывал значительного влияния на ВИЧ-инфекцию, з-отличие от 22-членного пептида фузии ВИЧ ?385, который цр:; концентрации Юм:-?! подавлял образование синцитиев на 90% (.рис.5). Гомологичная замена С-концевой аминокислоты Arg г пет ил о Р385 на Lys в Р514 не влияла на активность пептид-?. (?514 обладал тем же действием на синцитиесбразованкс, что и Р385 с 5CZ гпггибирух1-щей концентрацией примерно Ю"6 - 10~7 Ы). с другой стороны, Р525, который отличался от Р385 только одним аминокислотным остатком Arg513 (С-концевая аминокислота ?р!20, табл. 3),

Табл. 3. Аминокислотные последовательность синтетических пеп-ТИДОЕ фузии.

Аминокислотный анализ Под пептида

ВИЧ к>120----> ----> ВИЧ ср41 VCREKR AV GI bALFLGFLEAAGST^R 511 538 AVSlGALFLGFLGAAGSTkiGAR FLGFLGAAGSIMSAR AYSÎ6ALFLSFLGAAGSTM5AK R A YG1GALFLGFL6A AGSTMGn k AVSIGALFLGFLQ4A33TMa«K- Suc-BSA • : P385 P338 РЬ'л4 P525 P554

* -Suc-BSA - сукцшшлированный.бычий сывороточ^й альбумин.

не ингибировьл образования синцитиев, что может указывать на специфичность действия пептидов фузии из gp41 на 2/ГЧ инфекцию. Конъюгагы пептидов P3S5 и Р514 с GEL. (Р583.Р535); с СТлЬАСР по М-концевой амшогруппе_(Р5?8),'а также Р5Р2 не проявляли никакой активности в этом тесте (рис.5, табл.4).

Данные электронномикроскопического исследования свидетельствуют о том, что Р385 из-за своей высокой гидрофобности в годных растворах образует нитевидные агрегаты, причем некоторые

Табл. 4. Характеристики конгюгатов пептидов фузии с природными и синтетическими полимерами.

.Код Носитель Содержание Заряд конец SIA*

пр-?а + пептид пептида в при пептида

конъюгате pH 7.0

(мкг/мл)

Р554 BSA-SucOSu+P51i 100 _ Свободен +

Р573 СУМ-AcpOSU+P385 60 - Блокирован -

P5S0 СVM-AcpOSU+P514 70 - Свободен' т

Р582 CVM-AcpOSU+P514 180 + Свободен -

Р583 . Gel-SucOSU+P514 190 + Свободен ■ -

P5S5' — _ . ■■ ,.,_. 6el-SucOSU-iP514 80 - Свободен -

*SIA - активность препарата пептида в тесте синцитиеобразова-ния. (-) означает, что препарат пептида в самой высокой из исследованных концентраций ингибирует ВИЧ-индуцированное синци-тиеобразование менее, чем на 502.

BSA-SucOSU -^сукцинилироЕанный бычий сывороточный альбумин.

CVM-AcpOSU - сукцинилированный сополимер N-винилпирролидона и ангидрида малеиновой кислоты, модифицированный по эпсилон амино-капроковой кислоте.

Gel-SucOSU - сукцинилированный желатин.

кристаллические образования наблюдались в культуральной жидкости даже в световой микроскоп.

Исследование иммунореактивности пептидов показало, что кроличьи пептидные антисыворотки к Р385 реагировали в ELISA с адсорбированным на пластике Р385 и С-концевым Р388 с титром 1:3200, тогда как гидрофобная N-концевая часть пептида не обладала антигенной активностью.В то же время, единичная гомологичная замена С-концевого аргинина з Р385 на лизин в Р514 привела к изменению только иммунологических свойств пептида.

В тесте Western blot те же самые образцу сывороток не реагировали ни с gp41 ни с gpl60 (данные не показаны). Эти результаты говорят о недоступности пептидов фузии в вирусных гликопротеи-зах, адсорбированных на нитроцеллюлозной мембране, для антител. С другой стороны, тот факт, что 46% (11 из 24) образцов сызоро-ток от ВИЧ-позитивных пациентов распознавались в твердофазной ELISA с адсорбированным на пластике Р385, может указывать на пептид фузии gp41, как на аятигенозиачимый участок. Однако, высокая вариабельность 538 аминокислоты у изолятов ВИЧ-1 [Сле-пупкин В. А. с соавт., 1990] (этот аминокислотный остаток играет

- IS ■

Рис.5. Подавление ВИЧ-индуцированяого синцитиеобразования препаратами пеиыдов фузии при сокультивации клеток НЭ и H2/RF.

л Количество синцитнев подсчитывали во всем объеме лунки через 24 часа ¡¡ультиЕированкя. За 100% приникали количество сигчци-тиев в пробе без препаратов. Полигздаяы: декстран сульфат (ДО) с м.ь. 5С0 тыс. и pcly-glu - полнглютацинавая 1шслсга кепольгеиа-лись в качестве позжшного и негасшного коитполай, ссот-вегсзекно; кзнд^нтрац:;! этих ¿с-чссхв шкерллксь в мг/;.:л. Концентрации кояььгатов пептидов дакы_ по п&пыду. Ирсх^гхлеиххо ряшг отражает средние значепет результатов шеси; ьс~авис:с:нх экспериментов. По оси ординат - 2 образован :я аигциткев ь присутствии препаратов пептидов от контроля кнфекцж. По оси абсцисс - концентрации препаратов -1ое(С, мМ).

важную роль в формировании антигенной детерминанты пептида фузии) может отвечать за действительно низкий процент реактивности Р385 с позитивными сыворотками.

Табл. 5. Подавление репликации ВИЧ-1 в клетках Н9 в присутствии препаратов пептидов фузии.

Шифр пептидов Концентрации (мкМ) Титр ВИЧ антигена

Контроль 270

Р385 10 30

1 90

Р525 10 90

1 270

. Р554 10 <10

1 30

Р578 10 90

1 270

Р580 10 10

1 90

Р582 10 270

1 270

Р583 10 270

1 270

Р585 10 270

1 '' 270

*Были сделаны тройные серийные разведения культуральной жидкости, начиная с 1:10. В контроли добавляли соответствующее количество БСА. Экспрессия антигена определяли методом ELISA. В таблице представлены средние значения трех независимых экспериментов.

Эффективность ингибирувщего действия пептидов на репликацию ВИЧ определяли по титру вирусного антигена при титровании супер-натанта в ELISA. Наиболее активным оказался конъюгат P514-BSA (Р554), который в концентрации 10 мкМ полностью блокировал продукцию ВИЧ антигена (табл.5).

Для изучения влияния носителей на антивирусное действие пептидов использовались конъюгаты Р385 и/или его аналога Р514 с различными синтетическими или природными полимерами (табл. 5). Конъюгирование PS14 с бычьим сывороточным альбумином - BSA (Р554) или синтетическим полимером CMV-ACP (Р580) по лизиновой эпсилон-аминогруппе привело к усилению анти-ВИЧ активности пептидов (табл. 5, рис.5).

С другой стороны, у коныогата Р385 с CMY-ACP по N-концевой NH2-rpynne (Р578) подавляющее действие на ВИЧ инфекцию полностью отсутствовало.

Было также исследовано влияние микроокружения на ингибирующее действие пептида. Р514 в комплексе с отрицательно заряженным

■ -20-

сингетическим полимером (Р580) проявлял такую же активность, подавляя ШЧ инфекцию, как и комплекс Р514 с ВЗА (Р554) (рис. 5, табл. 5). Однако, введение положительно заряженной аминокислоты, аргинина, в молекулу полимера снижало блокирующее действие коныогата (Р582). Р514 конъюгированный с желатином (Р583, Р585) не был активен ни в тесте синцитиеобразоваяия ни в ELISA, независимо от заряда молекулы полимера. Такая потеря антивирусной активности может быть обусловлена третичной структурой комплекса.

Для того, что бы подтвердить заключение о том, что пептиды фузии и их шгыогаты могут воздействовать только на первую стадию жизненного цикла БИЧ и не влияют на события после интеграции вирусного генома, было исследовано действие конъвгатог на хроническую ВИЧ инфекцию (клеточная линии K3/RF). Ни один кз изученных препаратов не проявил никакого значительного эффекта в этим эксперименте.

С целью определения точной мишени для ингибирующего действия пептидов, было исследовано влияние P3S5 на адсорбцию БИЧ. - Для этого 35С-меченный вирус инкубировался с клетками линии Н9 в течении 30 мин. при комнатной температуре в присутствии или отсутствии пептида, после чего клетки осагдались низкоокоростка центрифугированием и в супернатакте измерялся уровень радиоактивности. Результаты показали отсутствие какого-либо ингибирующего действия на вирусную адсорбция (табл. б). Во всех экспериментах адсорбирсвалось около 507. меченного вируса. Наблюдаемое небольшое уменьшение адсорбции не зависело от концентрации пептида и может быть обусловлено неспецифическим воздействием больших агрегатов пептида.

Табл.6. Действие синтетических пептидов ф;гзии на адсорбцию

ВИЧ.

Пептид Концентрации (мкМ) Уровень радиоактивности ' супернатанта (7.)

' Контроль 53,7

Р335 10 45,1

0,1 44,9 '

* 3$фективнозть адсорбции определяли по разности между общим количеством радиоактивности, связанной с .введенным з клеточную культуру вирусом и количеством радиоактивности, связанной с вирусом, не адсорбировавшемся на поверхности клеток и оставшемся в

- и-

супернатанте. В контроль добавлялось соответствующее количество ЕЮ). В таблице представлены средние значения результатов, получениих в четырех независимых экспериментах.

Данные цепной полимеразной реакции показали, что Р580 и Р554," которые наиболее активно кнгибировали образование синцитиев я продукцию вирусного антигена, уменьшают образование провирусной ДНК (рис.6).

Для.исключения возможности воздействия препаратов пептидов непосредственно на обратную транскркптазу, была проведена стандартная обратнотранскриптазная реакция в присутствии и отсутствии препаратов. Ни один из пептидов не оказал значительного влияния на активность фермента (данные не показаны). Тагам образом, можно сделать вьгасд о том, что пептиды из гр41 ВИЧ направленно иягибируюг процесс проникновения вируса в клетку.

Прослеживаемая Четкая корреляция данных, полученных- в трех независимых тестах (тест ингибирования синцитиеобразования, им-муноферментный анализ и полимеразная цепная реакция), может служить до!саз?.тельством того, что действие синтетических пептидов из йр41 на ВИЧ инфекцию является специфичным и зависит ке только от аминокислотной последовательности пептида, но и от заряда и пространственной организации носителя.

ркс.б. Влиянкэ пепглдоз фузхи :га процесси проникновения ВИЧ в клетки. _

8 9

1 2

10 - - 3

11 . —• 4

12 " - • . 5

13 ; б

14 - - '7

*Полнаеразная цепная реакция проводилась согласно нетодкхэ Се1ин с парой праймеров, ограничивающих высококонсерзааивнкй участок еае ВИЧ. Амплифицированная ДНК анализировалась истодом слот-блот гибридизации. (1) Р554, 10 ыкМ; (2) Р554, 1 мкМ; (3) Р578, 10 мкМ; (4) Р578, 1 ИкМ; (5) Р580, 10 мкМ; (6) Р580, 1 мкМ; (7) Р582, ЮыкЫ; (8) контроль клеток; (9) Р583, 10 мкМ; (10) Р585, 10 мкЫ; (11) декстран сульфат, 10 мг/мл; (12)

-22 -

декстрая сульфат, 1 мг/мл; (13 и 14) контроль инфекции.

Механизм подавления ВИЧ инфекции пептидами фузии пока еще точно не установлен. Нами обнаружено, что их действие наиболее выражено на стадии проникновения вируса в клетку. В принципе, пептиды могут взаимодействовать либо с вирусом, либо с клеточной мембраной. Результаты нашего исследования могут быть объяснены наличием на поверхности клеточной мембрана специфических рецепторов или участков связывания с пептидом фузии gp41. Наши пептиды, видимо, могут специфически блокировать рецепторы фузии, не давая gp41 ВИЧ взаимодействовать с ними, препятствуя тем самым вирусилдуцированяому слиянию мембран. Эту гипотезу подтверждают результаты более ранних работ, когда пр;; добавлении пептидов непосредственно в культуру клеток наблюдалось более зыра ;:енное антивирусное действие.

Richardson и Cboppin в 1932г. обнаружили рецептор для К-концевого района пептида фузии парамиксовирусов, который обладает сильной гомологией с gp41 ВИЧ. Они вычислили, что на одну клет::у приходится Зх10б подобных участков связывания, имзющях лигпдную природу. Позже было показано, что антитела к гликолшмдам могут ингибировать проникновение БКЧ в некоторые клетки [Yahi N. étal ., 1992], и зкспреосированный ка ч'-етсчной поверхности gp41 мажет индуцировать с;:нцитиесбразовак-:е в отсутствие поверхностного гликопротеина ВИЧ [Ferez et al., 199£]. Cti: дак тне подтверждают нэше предположение, но точно рецептор для !!-концевого участка трансмембргчногс г.:икопротеикз ВКЧ еще не установлен. Ее следует искэтчзть и возможность направленного взаимодействия синтетических пептидов фузии с gp41, что у приводит к блокированию БИЧ инфэкции.

Адисэн, ка:; блокатср зитегркк-завнеи-'ых процессов в системе клеток, ;лфкцирсзанных БПЧ

Ддкоен - (Е,2)-4,5,9-тр/Л'иадодекд-1,б,11-триек-9-оксид представляет собой терпеноид, выделенный из экстрактов чеснока (Allium sativum) , блокирует агрегащ.ю тромбоцитов, ивдуцировак-ную ^семи известными на сегодняшний дьнь агонистами , за счет аллэстерглеской инактивации тромбоцчтарнсго интегрина G? llb/IIIa CApltz-Castro et al., 1986].

Высокая степекъ гомологии интегринов друг другу, их иммунологическое и структурное сходство , а также общность выполняемых ими функций привели нас к предположению, что аджоен может также

ингибировать 1) адгезивные взаимодействия лейкоцитов; 2) ВИЧ-индуцированное слияние лейкоцитов.

Влияние аджоена на слияние клеток исследовалось на модели синцитиеобразования в культуре ВИЧ инфицированных клеток. Аджоен. ингкбиоовал слияние клеток линии HS с клетками хронически инфицированного клона H9/RF с ИЦ50 приблизительно 45 нМ (рис. 7). Следует отметить, что кластеры, формируете ктетками Н9 в нормальных условиях (в отсутствии инфекции) такке разрушались аджо-еком (данные не представлены).

Данные, которыми мы располагаем, не позволяют точно идентифицировать молекулярную "мипень" для аджоена. Ранее было показано, что аджоен препятствовал . гомотипическим адгезивным взаимодействиям нескольких типе? клеток, в том числе: активированных человеческих тромбоцитов и нейтрофиллов. В условиях нашего эксперимента исследовалось действие препарата на CD4+ Т-лимфоб-лгеты. 3 межклеточных взаимодействиях С04н Т-клеток участвуют, помимо LeuCAM , чнтегрины VLA-4 и VLA-5 , лигандом для которых является фибронэктин. В определенных условиях фибронектин может кроме того связываться с тромбоцитарным интегрином GP ПЬ/Ша CParise et al., 1986], рецепторная функция которого блокируется аджоеном [Apltz-Castro et al., 1985]. S этой связи представляет интерес гипотеза Yokohama с соавт. (1989), предположивших, что на поздних этапах активации человеческие и мышиные Т-лимфоциты гкспресскруют ПЬ/Ша. Таким образом, на основании литературных данных можно предположить, что аджоен способен взаимодействовать по крайней мере с несколькими интегриновымк рецепторами (GP 11Ь/Ша, LFA-1, Mac-l, VLA-4, VLA-5). Согласно нашей рабочей гипотезе, препарат либо связывается с высококонсерватизным регионом молекулы изтегрина, либо взаимодействует с их мембранным микроокружением tRendu et al., 1989] и тем -самым инактивирует рецепторы. На клеточном уровне инактивация такого рода проявлялась бы как отсутствие (или выраженный дефицит) специфичных для данной клетки интегриксв, т.е. как неспособность к формированию агрегатов (тромбоциты, нейтрсфиллы), дезинтеграция клеточных кластеров (CD4+ Т-лимфобласты) или отсутствие слияния (ЕИЧ-инфицированные клетки).

Для оценки возможного влияния аджоена на репликацию ВИЧ определялся уровень имыунореактивных вирусных антигенов в суперна-тантах зараженных клеток, культивировавшихся в присутствии препарата или его растворителя, методом ELISA. Репликация ВИЧ-1 штамм RF в клетках линии Н9 подавлялась с ИД50 примерно 25 мкМ

Влияние аджоена на репликацию ВИЧ-1 штамм CEM:LAI в клетках линии СЕМ13 бьшо более выраженным ВД50 примерно 5 мкМ рис.7 . Так как аджоен в ■ водной среде может существенно терять активность вследствие гидролиза, мы провели эксперимент с дробным введением

Рис. 7. Влияние адкоена на процесс сикцкгне образ оваютя и репликацию ЕИЧ.

рис. а) Клетки линии Н9 «¡культивировались с клетками хронически ияфщирозагшсй лишш H9/RF в соотн(ме1жи 2:1 (концентрация 4.5х105/мл). Препарат добавлялся перед сокулыивацкей к клеткам К9. Sa 1002 гтрипктс количество синцитиев, образовавшихся через 16 "асов культагстсзания в отсутствие гджоекг. Учитывались синцитии, ргзазр которых превшая диаметр нормальной клетки Н9 в 3 и раз. По оси ординат - 7. образования скгцетпэв е

присутствие коодектрациб г^ткс^ка (уг коктрс.п). По оси

абсцисс - кощентргцйи препарата (ж!1).

* рис. б) Клеткм линии СЕК13 (5x105/i.u) заражали суперьатгттсм хроклчсски инфииггрсванной лшезх CEIVLAI. Кккубгтщя 72 -аса при 37°0 и 5% СОо. Экспрссско пнтитена оценивали по его содержаhjm ь кул^гуральньк пробст иетсдоы ELISA, за 100% принимали обгцее ко-лкчэство антигенов ВИЧ в супернатантах в отсутстьке адкоена через 72 часа культивирования. По оси ордмат - X подавления .СИЧ инфекцкл различными концаихращлкк а^гоеяа (от контроля п::$ек-цки). По оси абсцисс - концентрации препарата.

препарата. Адасоея вносился в лунку с исследуемой клеточной системой в количестве 50 нМ каждые 12 часов. Это привело к существенному повышению противовирусной активности: в системе CEM13-CEM/LAI через 72 часа наблюдалось 307. подавление инфекции при суммарной концентрации 0.25 мКМ.

Мы изучили токсическое действие аджоена на некоторые клеточные культуры, в том числе Т-клеточные лейкеыические (СЕМ, МТ4, МТ2) и лимфоидные (Н9, Yurkat) линии. Аджоен оказывал токсическое действие на исследуемые опухолевые Т-клетки. Причем, лейке-мические линии оказались гораздо менее чувствительными к'аджоену (ЦТДюо " 500 мКМ; 72 часа инкубации), чем Т-лимфоидные культуры - 50 мкМ. Следует подчеркнуть, что клетки СЕМ, которые'были наиболее устойчивы к токсическому действию аджоена, зкспрессируют на своей поверхности незначительные количества интегриновых рецепторов. Мы предполагаем, что наблюдаемая токсичность аджоена для некоторых клеточных линий связана с его блокирующим воздействием на интегрины, так как для поддержания жизнеспособности Т-лимфобластов' требуются функционально активные рецепторы адгезии. Это соображение подтверждают результаты экспериментов на первичных клеточных культурах, в частности фибробластах, на поверхности которых, интегриновые рецепторы практически отсутствуют. В этом случае не обнаруживалось видимого токсического действия препарата (данные h¿ показаны).

Что касается противовирусной активности аджоена, то она также могла быть связана с его влиянием на определенные интегрин-зависимые процессы (отличные от адгезии). Известно, что интеграция клеток мишеней с моноклональными антителами против CD18 непосредственно перед заражением ВИЧ приводит к снижению пика активности обратной транскриптазы [Patarroyo et al., 1990, Valentin et al., 1990). Кроме того, в CD4+ клетках с генетическим дефицитом LeuCAM репликация ВИЧ происходит с характерным лаг-периодом, отсутствующи в нормальных клетках [Gruber et al., 1991, Pantaleo et al., 19913. Мы считаем, что интегрины не только опосредуют формирование межклеточных контактов между сливающимися ВИЧ инфицированными клетками, но и участвуют в регуляции репликации. Это объяснение хорошо согласуется с общепринятым в настоящее время представлении об интегринах как о рецепторах поверхности, регулирующих внутриклеточные процессы [Dustin, 1990].

Альтернативное объяснение состояло бы в том, что интегрины могут опосредовать как молекулярное "узнавание", так и последующее слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной (С04-незави-

симый " путь проникновения в клетки), однако участие адгезивных рецепторов в интернализацш БИЧ остается гипотетическим из-за отсутствия прямых доказательств.

Если опосредованное кктегрикауи проникновение ВИЧ в клетки мишени действительно имеет место, можно ожидать, что адкоеи будет блокировать попадание вирусов в 004" клетки и ограничивать число потенциальных резервуаров инфекции.

Нами обнаружена противовирусная активность адотоена, что мсг.ет указывать на существование альтернативного механизма проникновения ШЧ в клетки: интегрин-опосредованный С04 -независимый путь.

Применение аджоена или других инактиваторов пнтегриновых рецепторов в комбинации с традиционными противовирусными средствами ысакет иметь перспективы при лечении ВИЧ инфекции.

-22В Ы 3 О д ы.

1. Исследована анти-ЗИЧ активность некоторых производных хитина и хитозана, различаются зарядом, природой и пространственные расположением заместителей, в первую очередь - сульфатных групп в элементарном звене хитозана. Сравнительный анализ' противовирусного действия этих соединений показал, что наличие сульфатных групп ' является необходимым условием для подавления ВИЧ-инфекции. Выявлено, что 3 группы сульфатированных производных хитозана значительно подавляют как вирусную репликацию, так и вирус-индуцированное образование синцитиев в дозозавкеимой форме (ИД=о состазлчет 0.08-2.00 мкг/мл) при отсутствии видимой токсичности.

2. Показаю, что расположение сульфатно;; группы при С-6 з цепях хитозана является критическим условием для проявления максимальной анти-ВИЧ активности для данного класса полиаминоглика-:ю2, при этом увеличение содержания этих групп в цепях хитозана вьшэ определенного значения ( 13-14 Z ) не играет существенной роли. Очевидно, важное значение имеет молекулярная масса и поли-десперсность этих соединений, а также природа и пространственное расположение друга заместителей з структурном звене хитозана.

3. Показано,"' что механизм ингибирования БИЧ-инфекции сульфа-тированными-полисахаридами обусловлен, по-видимому, специфическим взаимодейстзием полианконоз с (PMD) принципиальной нейтрализующей детерминантой и/или С-концезой областью gpl20. Для процесса связывания важна плотность заряда и специфическое сочетание аминокислотных остатков, включающее, по крайней мере, две соседствующие положительно заряженные аминокислоты.

4. Исследовано влияние 22-членкого пептида из gp41 ВИЧ-1 в различных модификациях (в том числе конънгированкого с некоторыми природными и синтетическими полимерами) на гирусную адсорбцию и ВИЧ-индуцированное образование синцитиев. Установлено, что дачный пейтид ингибируег синцитиеобразование и продукцию вирусных антигенов, не препятствуя специфически адсорбции вируса на поверхности клеток, ке подавляя активность обратной транскриптазы вируса in vitro, но уменьшат количество интегрированной провирусной ДНК. Таким образом, пептиды фузии ВИЧ направленно воздействуют на процесс проникновения вируса в клетку через клеточную мембрану.

5. Показано, что действие пептидов фузии на ВИЧ инфекцию является специфическим, и для его проявления важны не только аминокислотная последовательность и наличие свободного И-конца мо-

лекулы пёпткда, а также природа, заряд и пространственная организация носителя.

6. Установлено, что аллостерический инактиЕзтор иктегркновых рецепторов - аджсен - способен подавлять вирусикдуцированнсе оо-разовааие синлитиев к продукцию вирусных антигенов. Это свидетельствует о роли интегриноз в процессах слияния клеток, а тагж может указывать на существование альтернативного механизма проникновения БИЧ в клетки (интегрин-опосредованный СБ4-независимый путь).

СПИСОК РАБОТ. аТУБЛИКОЗАННЦХ .ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Tatarintcev А.V., Vrzheshch F.V , Schegolev А.А., Ersnov

D.E., TurgievA.S., Kornilayeva В.V., Makarova T.V., Karaiov

E.V.// 19Э2. Aicsne antagonizes integriri-dependent processes ir; HIV-infected 7-lirafoblasts.-AIDS.-b N 10.- p.1212-1215.

2. Tatarincev A. V., Makarova T.V., Karanr.ov E.V., Kornilayeva 6.V., Vrzheshch P., Schtgolev A., Yershov D.Tux-glov A.// 1992. Ajoene blocks HlV-mediated syncytia formation: possible approach to anti-adhesion therapy of AIDS. VIII Inter. Cor.f. on AIDS, Amsterdam, The Netherlands. Publ. abstr.-V З.-p S9.

3. SlepushKin V.A., Kornilayeva 6.V., Andreev S.M., Sidorcva M.Y., Kiaschevioh G.R., Raduk S.V., Makarova T.Y., Lukashov V.V., Karamov E.V.// 19Э2. HIV-1 penetration into cells. Do cell membranes contain receptors for gp41 fusion peptide ?. там же, post. abstr.-V. 2, p. A51.

4. Kornilayeva G.V., Makarova Т.V.. Gamsa-zarie A.I., Karamov E.V.// 1992. Anti-HIV activity of sulfated derivates of chitosan. там же, post.abstr.-V.2, p.A5o.

5. Tatarintcev A.Y., Vrzheshch P.V., Schegolev A.A., Yershov D.E., Karamov E.V., Kornilayeva 6.V., Makarova T.V., Fedorov N. A., Turglev A. S.//1992. Inhibition of ill V replication by ajoene: possible interference with the CD4-Independent pattaayof HIV entry. J. of Cellular Biochemistry.-V.2.- p.125.

6. Karamov E.V., Kornilayeva G.V., Makarova Т.V., Tatarintcev A.V., Vrzheshch P., Schegolev A., Yershov D , Fedorov i*i., Turgiev A.// 1992. Cytotoxic effect of ajcene on neoplastic T-cells Is possibly related to it's action on integrins. там *e.-V.3.-p.l68.

7. А.В.Татаринцев, П.В.Врхещ, Д.Э.Ершов, А.А.Цеголев,

А.С.Тургиев, Э.В.Карамов, Г.В.Корнилаева, Т.В.Макарова, Н.А.Федоров, С.Д.Варфоломеев// 1992. Аджоен блокирует интегрин-зависимые процессы в системе клеток, инфицированных ВИЧ. Вестник PAMH.-N ll-12.-c.6-10.

8. Kornilayeva G. V., Samza-zade A. I., Makarova Г.V., Sklar-' A.M., Naslbov S.M., Karamov E.V.// 1992. Chitosan-o-sulfate as antl-HIV agent. VII meeting "Actual problems of allergology, Immunology and AIDS". Kaunas. abstr.-lV. 17.

9. Slepushkin V.A., Kornllayeva G.Y., Andreev S.M., Sldorova M.V., Petrukhina A.O., Matsevich 6.R., RadukS.V., Grigoriev. V.R., Makarova T.V., Lukashov V.V., Karamov E.V. // 1993. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) penetration into target cells by synthetic peptides mimicking the N-terminus of the HIV-1 transmembrane glycoprotein. Virology.-V. 194. -p..'

10. Макарова T.B., Корнилаева Г.В., Гамзазаде А.И., Андреев C.M., Мещерякова Д.В.. Карамов Э.В.// 1993. Механизм ингибирую-щего действия сульфатированных производных хитозана на ВИЧ-инфекцию. Актуальные проблемы инфекционной патологии. Санкт-Петербург. , с.160.

11. Корнилаева Г.В., Макарова Т.В., Гамза-заде А.И., Скляр A.M., Насибов С.М., Каратов Э.В. // 1994. Сульфатироватаые производные хитозана, как ингибиторы ВИЧ-инфекции. Иммунология." (Принята в печать).