Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирующее действие антител и их комплексов на коллаген-зависимую активацию тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибирующее действие антител и их комплексов на коллаген-зависимую активацию тромбоцитов"

1 •

4 РГ-8 ОД

-, р у мм 1ПОЛ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

На правах рукописи

Степанова Ирина Петровна

ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИТЕЛ И ИХ КОМПЛЕКСОВ НА КОЛЛАГЕН-ЗАВИСИМУЮ АКТИВАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ

Специальности: "Биохимия" 03.00.04;

"Физиология человека и животных" 03.00.13

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994 г.

Работа выполнена в группе инженерной иммунологии ИЭК КНЦ РАМН (руководитель к.б.н., в.н.с. С.П. Домогатский), -а также в лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ГНЦ РАМН (заведующий д.м.н., профессор В.А. Макаров).

Научные руководители: к.б.н.. в.н.с. С.П. Домогатский, к.б.н., с.н.с. Г.В. Башков

Официальные оппоненты: д.б.н., в.н.с. группы инженерной энзимологии ИЭК КНЦ РАМН А.В. Максименко, д.б.н., профессор, заведующий лабораторией термодинамики бйосистем Института Химической Физики РАМН М.А. Розенфельд

Ведущее учреждение - Кафедра физиологии человека и животных (заведующий - академик РАМН, профессор И.П. ' Ашмарин) Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Зашита состоится в 11-00 ч. "15" июня 1994 года в

Кардиологическом Научном Центре РАМН по адресу: 3-я Черепковская ул., 15 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН Ученый секретарь специализированного совета, к.б.н. Т.И. Венгерова

< *

. * '

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность разработки новых подходов к профилактике тромбоцит-зависимого тромбообразовзния в артериях состоит в высокой частоте ранних реокклюзий, сопровождающих операции чрескожной транслюминапьной коронарной ангиопластики, аорто-коронарного шунтирования, терапевтического тромболизиса (J.E. Tcheng et al., 1991). Морфологическим субстратом, причиной развития острого тромбоза является механическая обструкция сосуда формирующимся тромбом в результате повреждения, разрыва интимы после ангиопластики, экспонирования в просвет сосуда тромбогенного фибриллярного коллагена, активации и агрегации тромбоцитов с высвобождением субстанций (АДФ, ТХА2, серотонин), вызывающих агрегацию других тромбоцитов и вазоконстрикцию.

Результатом активации системы свертывания крови является образование фибрина, скрепляющего и стабилизирующего тромбоцнтарный сгусток.

Механизм острых реокклюзий артерий после тромболизиса в значительной степени сходен с таковым при баллонной ангиопластике. Однако, пусковым моментом является не механическая травма интимы, а контакт с кровью тромбогенных субэндотелиальных структур после лизиса фибрина на их поверхности.

Применяемые в настоящее время в клинической практике антитромбопгческие средства (фибринолитики, антикоагулянты, антиагреганты, вазодшхятаторы) не являются достаточно эффективными для профилактики острых реокклюзий после операций ангиопластики и тромболизиса. Фибринолитики (активаторы плазминогена) растворяют тромбоцитарно-фибриновый сгусток, вызывая экспонирование в кровоток подлежащих тромбогенных субэндотелиальных слоев сосудистой стенки.

Для осуществления антитромботического действия ашикоагулянта гепарина требуется наличие плазменного кофактора - антитромбинз III. Антитромбин Ш в присутствии гепарина инактивирует тромбин, факторы -Vila, Ха, Xla, ХПа свертывания крови. Однако, антитромбин III не действует

связанный с поверхностью тромбоцитов или с фибрином тромбин (Fcnton, 1989). Защипанный таким образом тромбин способен вызывать активацию и агрегацию других тромбоцитов.

Ацетилсалициловая кислота (аспирин) ингибирует метаболизм арахидоновои кислоты, блокируя циклооксигеназу тромбоцитов, предотвращая экспонирование тромбоиитарных проагрегаторных гликопротеиновых рецепторов и агрегацию тромбоцитов. Однако, ацетилсалициловая кислота не полностью блокирует проагрегаторное действие коллагена поврежденной сосудистой стснки (E.S. Barnathan et al., 1987). Нитровазодшиггаторы вызывают расширение сосуда, но слабо падавляют образование и рост пристеночною тромба (Р.Н. Graves et al., 1992).

Теоретически представляется возможным препятствовать росту тромба путем блокада взаимодействия тромбоцитов с индуктором агрегации, влияя на рецепторные белки клеток или непосредственно на индуктор. Антитела к поверхностным гликопротеидам тромбоцитов Ilb/Illa, lb, la, а также к циркулирующим и секреторным адгезивным макромолекулам (фактору фон Виллебранда, фибриногену, фибронектину, тромбоспондину) эффективно снижают акпиацию и агрегацию тромбоцитов (H.V. Anderson et al. 1992, H.J. Weiss et al., 1S39). Однако, вопрос о возможности ингибирования тромбоцит-зависимого тромбообразования посредством экранирования основного тромбогеннсго материала сосудистой стенки, коллагена, недостаточно изучен. Структуру трзыба формируют как тромбоциты, так и фибрин. Тромбоциты образуют головку тромба, взаимодействующую с подлежащими соединительнотканными структурами сосудистой стенки. Фибрин образует хвост тромба, выступающий в просвет сосуда или полностью перекрывающий его (М. Verstraete et al., 1989). Иммобилизация тромболитического фермента урокиназы в месте тромбообразования может вызывать быстрый и эффективный лизис сформировавшегося тромбоцитарно-фибринового сгустка. Таким образом, представляются возможными следующие пути профилактики тромбоцит-зависимого тромбообразования в артериях:

1) экранирование антителами иктерстициального коллагена.

2) иммобилизация тромболитического фермента - урокиназы в месте тромбообразования для повышения эффективности антитроыботического действия антиколлагеновшх антител.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния антител к коллагену, иммобилизованной в месте тромбообразования посредством биспецифического коньюгата урокиназы, из индуцированное коллагеном тромбоцит-зависимое тромбообразование в системах in vitro и in viva.

Были поставлены следующие задачи:

1. Получение поликлональных антител к коллагену и моноклональных неннгибирующих антител к про/урокиназе человека.

2. Подбор оптимальных условий выделения антител к коллагену.

3. Получение гетероконьюгата антител к коллагену с неинтибирующими антителами к про/урокиназе.

4. Разработка устройства, моделирующею in varo условия индуцированного коллагеном тромбообразования в сосудах при высоких скоростях пристеночного сдвига.

5. Изучение возможного антитромбогенного действия антител к коллагену, биспецифического коньюгата и локального эффекта иммобилизованной в месте тромбообразования урокиназы в условиях in vitro и in viva.

Научная новизна.

Разработана тест-система, позволяющая оценивать шцуцированное коллагеном тромбообразование in vitro. Отличительной особенностью системы является возможность воспроизведения высоких скоростей сдвига, сравнимых со скоростями пристеночного сдвига в крупных артериях эластического типа. На примере коллагена впервые - реализован подход к профилактике тромбообразования путем использования первичных индукторов активации тромбоцитов в качестве мишени для антитромботической терапии.

и

Показано, что антитела к коллагену 1—III типа, гстсроконьюгат антител к коллагену и про/урокиназе подавляют коллаген-зависимое тромбообразованис в условиях m vitro и in vivo на модели тромбоцит-зависимого тромбообразогсашя у крыс. Антитромбогенное действие гетероконьюгата антител обусловлено наличием антител к коллагену в его составе.

Иммобилизованная в месте тромбообразования посредством гетероконьюгата антител уроклназа не усиливает антитромбогенного действия коньюгата.

Прастиуеское значение.

Результаты исследования расширяют теоретичесике представления о механизмах взаимодействия тромбоцитов с основным индуктором тромбообразованшя сосудистой стенки - коллагеном. Показана возможность мнгибирования индуцированного коллагеном тромбообразования в условиях ir. vitro и in vivo.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на XXXII сьезде Германского общества по тромбозу и гемостазу (Мюнхен, 1994 г.), а также на заседании мехслабораторнсго си.;,шара ИЭК КНЦ РАМН от 6 мая 1994 года.

Структура и обьем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, приложения к результатам исследования и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 9 тайлиц и 15 рисунков, 8 микрофотографий. Список литературы включает 190 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Коллаген I-III типа крысы получали из сухожилий хвостов крыс экстракцией 2% пепсином (в./об.) с последующей очисткой путем многократного персрастЕОрени« в 500 шМ уксусной киспоте, рН 2,5 и

осаждением IM NaCl при кислых и нейтральных значениях pH (RJ. Morin el al., 1980). Рекомбинантная проурокиназа была получена да опытно-экспериментальном предприятии НЭК КНЦ РАМН. Рекоибинантную проурокиназу активировали каталитическими количествами плазмина. Амидолитическую активность урокиназы определяли по способности расщеплять синтетический олигопептидный субстрат фермента S-2444 (Kabi Diagnostika, Sweden).

Поликлональные антитела к коллагену I-1I1 типа крысы ползали iiö сыворотки иммунизированных кроликов путем аффинной хроматографии на иммуносорбенте коллаген крысы-Сефароза CL-2B (Pharmacia, Sweden). Элюцию антител проводили 40 шМ Na-цитратным буфером, pH 2,8. содержащем 50% этиленгликоль. Концентрацию антител в элюате определяли спектрофотометрически, принимая A'^jso 1ет='4,0. Специфичность антиколлагеновых антител определяли твердофазным иммунорферментным анализом (ELISA).

Моноклональные антитела выделяли из культуральнои среды гибридом линиии UNGs путем ионнообменной хроматографии на DEAE-Toropearl (Tova Soda, Japan). Элюцию проводили ступенчатым градиентом 10 mM Na2HP04/ 10 шМ Na2HP04, 150 mM NaCl, pH 8,0. Концентрацию антител в элюаче определяли на спектрофотометре (А1Й280 icm=14,0). Специфическое связывание с одно/двухцепочечными формами урокиназы определяли метшом ELISA. Проводили проверку реактивности моноклональных антител с урокиназой мочи крысы. Антитела иммобилизовали на CNBr-Сефарозе 4В (Pharmacia, Sweden), затем наносили крысиную мочу. Активность активаторов плазминогена мочи крыс до нанесения на сорбент и в элюатах определяли методом фибриновых пластин (T-Astrup et al., 1952).

Синтез биспецифического коньюгата антител к коллагену и про/урокиназе проводили путем химической коньюгации малсииидобензоил сукцинимидил- (MBS) и сукцинимидилацетшгтиоацетаь (SATA)

модифицированных антител (R.I.S. Duncan el al., 1983). Для очистки

е

коньюгата. а таюке определения его молекулярной массы проводили аналитическую гель-фильтрацию на колонке с ультрагелем АсА-44. Об образовании ковалентной связи между антителами судили по результатам SDS-электрофореза.

Бифункциональную активность коньюгата по сравнению с активностью (не)моднфицированных антител определяли методом ELISA.

Неингибирующую активность моноклональных антител в составе коньюгата определяли по способности связанной коньюгатом урокиназы расщеплять синтетический олигопептидный субстрат S-2444.

Устройство и способ моделирования тромбообразовзния in vitro.

Для моделирования коллаген-индуиированного тромбообразования использовали культуральные пластины (multiwel!, Linbro) с коллагеновым покрытием. Обогашенную тромбоцитами плазму (ОТП) вносили в лунки пластин, перемешивали с помощью специальной мешалки из

магнитожесткого материала, вращающейся в магнитном поле генератора.

ОТП получали из цельной крови доноров путем ее центрифугировании (¡60g). Количестве тромбоцитов определяли на автоматическом счетчике клеток (Sysmex counter PL-100, Japan). Оно составляло 4.5 - 5 х 10s кл/мл. В качестве антикоагулянта использовали 130 тМ Ыа-цитратный буфер. Для качественной оценки взаимодействия тромбоцитов из ОТГ1 с коллагеновой подложкой или с поверхностью пластика проводили фазово-контрастную, а также сканирующую электронную микроскопию дна лунок.

Данную - модель тромбообразовзния использовали для оценки взаимодействия тромбоцитов из ОТП с коллагеновой подложкой, обработанной антителами к коллагену (100 мкг/мл), бифункциональным коньюгатом аштггел к коллагену и про/урокиназе (100 мкг/мл) или комплексом коиьюгат (100 мкг/мл) + урокиназа (5 мкг/мл, 100 000 ЕД/мл). ОТП вносили в лунки, перемешивали со скоростью 1 об/с в течение 12 минут. Для оценки действия несвязанной коньюгатом урокиназы, в ОТП при взаимодействии с коллагеновым субстратом вчссили урокиназу (5 мкг/мл).

После окончания взаимодействия тромбоцитов из ОТП с коллагеноног подложкой плазму отсасывали, лунки промывали раствором Тироле. Подсчитывали количество клеток в ОТП до и после взаимодействия г коллагеновой поверхностью, обработанной различными агентами. Разнима соответствовала количеству адгезировавших к коллагеновому субстрату тромбоцитов.

Моделирование коллагенозависнмого ттюмбообпазования in vivo.

Модель артепио-венозного шунта (Т. Umetiru et а!.. 1978). В остром эксперименте использовали самцов крыс линии Wistar весом 250-280 г. Крыс наркотизировали уретаном в дозе 1,5 г/кг. Выделяли правую v. jugularis и левую а. carotis communis. В сосуды вставляли канюли, которые соединяла посредством разьемного полиэтиленового шунта, заполненного гепарином (5l¡ ЕД/мл). В срединную часть шунта по ходу сброса крови вставляли обработанную коллагеном шелковую нить. Кровь циркулировала через шунт в течение 30 минут, затем нить, покрытую агрегатами тромбоцитов извлекали из кровотока,взвешивали. На каждом животном проводили по 3 циркуляции крови через шунт, вводя при этом 0.2 мл гепарина внутривенно.

v. jugularis

покрытая коллагеном шелковая нить

сброс крови

а. carotis com.

Рис.1. Схема артерио-венозного шунта у крыс

Для проверки действия антител к коллагену, биспеиифического коньюгата. а также иммобилизованной к поверхности коллагена урокиназы на коллагеновые нити перед внедрением к кровоток животного сорбировали антитела к коллагену (100 и 400 мкг/мл), бифункциональные антитела (100 мкг/мл), комплекс коньюгат (100 мкг/мл) + УК (5 мкг/мл, 100 000 ЕД/мл). В качестве контроля в кровоток вводили коллагеновые нити после сорбирования на них IgG кролика (100 мкг/мл), альбумина (2 мг/мл), моноклональных антител к про/урокиназе (100 мкг/мл), урокиназы (100 000 ЕД/мл). На одном животном проводили 3 циркуляции крови через шунт, каждый раз внедряя нить, обработанную одним и тем же агентом. Нити извлекали из кровотока, промывали физиологическим раствором, после чего взвешивали, определяли среднее значение массы тромба на нити. Схема эксперимента представлена на рис.1. В экспериментах использовано 120 животных.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены как средние значения анализируемых величин со средне-квадрапгшыми отклонениями (М+ш). Достоверность различий определяли по непарному t-критерию Стьюдента-Фишера. Достоверными считались результаты с уровнем значимое™ менее 0,05. Вычисления проводились по программе SAS (SAS Inst. Inc., USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика антител, использованных для синтеза бифункционального коньюгата анпггел к коллагену и про/урокиназе представлена на рис. 2.

Получение и характеристика коньюгата антитела к коллагену и неингибируюшего моноклонального антитела к про/урокиназе.

Модификацию антител проводили двумя различными гетсрофун юш он ал ьн ы in агентами: MBS и SATA, что позволило избежать образования гемоконьгагатов. Использование SATA для введения SH-групп в белок имеет рчд прснмушсс-гз: S!i-ipyi«rc стабилизирована ацетильным

ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ

К коллагену крысы К Бси-Дси-РА

Вид антител поликлональные, ингибирующие, 1д в моноклональные , неингибирующие, 1дС

Источник получения сыворотка крови иммунных кроликов культуральная среда гибридом 5

Метод выделения аффинная фроматография на коллаген - Сефарозе С1. 2В ионнообменная хроматография, 0ЕАЕ-Тоуареаг1

Молекулярная масса 160 кОа 160 кОа

Сродство к лиганду К лис. Ю-9 М Кдис.Ю'12 М

Специфичность взаимодействуют с коллагеном крысы 1-Ш типа взаимодействуют с рекомбинантной урокиназой реи-РА) и проурокмназой (вси-РА) человека; мочевой геи-РА человека; мочевой Бси-РА/юи-РА коые.

Рис. 2

ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЬЮГАТА

Компоненты моноклонапьные антитела к scu-/tcu-PA + поликлонапьные антитела к коллагену I-III типа • крысы

Способ получения химическая коньюгация SATA- и MBS- модифицированных белков

Способ очистки гель-фильтрация на АсА-44

Свойства мол. масса = 320 kDa - (по профилю гель-фильтрации и данным электрофореза в ПААГ- DSNa); моноклонапьные антитела в составе коньюгата но ингибируют активность scu-/tcu-РА; поликлональные антитела в состава коньюгата связываются с коллагеном крысы I-III типа.

Рис. 5

радикалом, но перед проведением реакции коньюгации с MBS-модифицированным антителом ацетильная группа легко удаляется в присутствии гидроксиламина. Копалентная связь между двумя молекулами антител образуется за счет восстановления серой малеимидного кольца MHS-модифицированной молекулы. Характеристика коньюгата представлена на рис. 3. Для очистки гетероконьюгатов антител к коллагену с моноклональными антителами к про/урокиназе, а также оценки степени соотношения дн- и полимерных молекул в его составе проводили аналитическую гель-фильтрацию на колонке с ультрагелем АсА-44 (60 см х 2 см), предварительно калиброванной белками с известно]! молекулярной массой. При гель-фильтрации коньюгата белок элюпровали в виде 3-х хроматографических компонентов (рис. 4). Около 20% белка содержалось в первом компоненте, 40% - во втором, 35% - в третьем. Таким образом, при данной степени модификации антител (2 SH-группы на молекулу UNG5 и 5 мапеимидных групп на молекулу крол1ГЧьего антитела) основным продуктом реакции являлся димер коньюгата (компонент II), который элюировался со свободным обьемом колонки. Первый хроматографический компонент соответствовал полимерному коныогату с молекулярной массой более 350 VDa, а в минорном компоненте элюировались низкомолекулярные примеси. Выход димерного коньюгата составил 40%. Полученный гетероконыогат антител к коллагену с моноклональными антителами к про/урокиназе использовали для доставки урокиназы на обработанные коллагеном поверхности при моделировании коллаген-индуцированного тромбообразования в системе ш гтат>, а также для изучения действия локализованной в месте тромбообразования урокиназы на модели индуцированного коллагеном тромбообразования в артерно-венозном шунте у крыс.

Моделирование индуцированного коллагеном ттюмбообрз.човзния in virrn.

Описание устройства для моделирования коллаген-индуиированного тромбообразования в системе in vitro дано в разделе "Материалы и методы''. Оптимальными условиями проведения реакции взаимодействия тромбоцитов

ОЧИСТКА КОНЬЮГАТА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К ПР0-/УР0КИНАЗЕ С ПОЛИ-КЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ К КОЛЛАГЕНУ КРЫСЫ ГЕЛЬФИЛЬТРАЦИЕЙ НА УЛЬТРАГЕЛЕ АсА-44

Фракции: I - полимер коньюгата с мол. массой > 350 "kDa, И - коньюгат с мол. массой = 320 kDa, III -непрореагировавшие IgG, IV - примеси.

Рис-М

из ОТП с коллагеновым покрытием дна лунок культуральных пластин являются следующие:

1) сорбция коллагена 1-Ш типа крысы на дно лунок культуральных пластин;

2) перемешивание ОТП (5 х Ю8 кл/мл) в лунках со скоростью I об/с в течение 12 минут;

3) отмывка коллагенового субстрата от неадгезировавших клеток раствором Тироде.

Данная модель индуцированного коллагеном тромбообразования позволяет выполнять следующие условия:

1) создание градиента высоких скоростей сдвига, сравнимых со скоростями пристеночного сдвига в крупных артериях эластического типа. При скорости вращения мешалки 1 об/с на расстоянии радиуса от центра вращения, скорость сдвига на дне лунки составляет 500 с":

2) достижение 40% адгезии тромбоцитов из ОТП при взаимодействии с коллагеновым субстратом;

3) возможность изучения различных стадий взаимодействия тромбоцитов с кодлагеновой подложкой (адгезия, формирование псевдоподий, распластывание на поверхности коллагена, адгезия тромбоцитов из плазмы на поверхность распластанного тромбоцита, образование тромбоподобных агрегатов).

Адгезия тромбоцитов на коллагеновой подложке. Электронная микрофотография, увеличение х 5 ООО .

Фото 1.

V :> • ...

Л

Фото 2. Взаимодействие тромбоцитов

с поверхностью пластика. Электронная микрофотография, увеличение х 2 500

Таким образом, данная модель тромбообразования воспроизводит условия для коллагенозависимой активации и агрегации тромбоцитов (фото 1).

При взаимодействии тромбоцитов с поверхностью пластика не наблюдалось морфологических признаков их активации (фото 2).

Изучение действия антител к коллагену. биспецисЬического коньюгата антитела к коллагену с антителом к про/упокиназе. а также локализованной на коллагеновой поверхности уроки;:озы на индуцированное коллагеном

тромбообразование в системе in vitro. Поскольку интерстициальный коллаген I-HI типа является мощным индуктором контактной активации и агрегации тромбоцитов (М. Verstrate, 1989), представлялось целесообразным блокировать его тромбогенные свойства посредством экранирования его поверхности ингибируюшими антителами. Б случае же образования тромбоцитарно-фибринового сгустка предполагалось, что действие локализованной в месте тромбообразования урокиназы приведет

1Г

к быстрому и эффективному его лизису. Для проверки данного предположения использовали модель тромбообразования, описание которой дано в разделе "Материалы и методы".

После взаимодействия тромбоцитов из ОТП с коллагеновым субстратом дна лунок культуральных пластин, а также с коллагеновой поверхностью дна, обработанной антителами к коллагену, бифункциональным коньюгатом антител к коллагену крысы и про/урокиназе человека или комплексом коньюгат + урокиназа, подсчитывали колэтество клеток в ОТП. Вычисляли количество адгезировавших к коллагеновому субстрату клеток. Полученные данные сведены в таблицу 1. Как видно из таблицы, наименьшее количество тромбоцитов 2,1 х ]08 кл/мл осталось в ОТП после взаимодействия с коллагеновой поверхностью, наибольшее - 3,7 х 108 кл/мл, 3,9 х 10s кл/мл, 3,6 х 10s кл/мл после взаимодействия с коллагеновой поверхностью, защищенной антителами к коллагену, бифункциональным коньюгатом или комплексом коньюгат + урокиназа соответственно. Таким образом, число адгезировавших к поверхности коллагена тромбоцитов составляет 2.8 х 108 кл/мл, но при обработке коллагеновой поверхности антителами к коллагену, коньюгатом, комплексом коньюгат + урокиназа число адгезировавших тромбоцитов гораздо меньше, и составляет 1,2 х 10s кл/мл, 1,2 х 108 кл/мл, 1,0 х 10s кл/мл соответственно. На основании данных, представленных в таблице 1, вычисляли процент ингибирования тромбообразования под действием различных агентов как выраженную в процентах разницу между количеством адгезировавших к коллагеновой подложке тромбоцитов и количеством клеток, адгезировавших к коллагеновой подложке, обработанной антителами к коллагену, биспецифическим коньюгатом к коллагену и про/урокиназе, комплексом коньюгат + урокиназа (рис. 5). Таким образом, антитела к коллагену, гетероконьюгат антител на 50% снижают адгезию тромбоцитов к коллагеновому субстрату и формирование тромбоиитарных агрегатов в системе in vitro. Урокиназа в комплексе с коньюгатом не усиливает анппромбогенного действия коньюгата (различия между тремя группами данных недостоверны, Р

Таблица -{

Влияние антител к коллагену, их производных и урокиказы на коллаген-индуцированную адгезию и агрегацию тромбоцитов in vitro.

Кол-во Кол-во Кол-во

клеток клеток в адгезир

Сорбция Концен- Кол-во после промыв- опавших

на трация, клеток в взаимод ном р- клеток,

пластик мкг/мл ОТП, с подло- ре • 107мл

■108/мл жкой, Тироде,

■10°/мл •108/мл

. 5,0 4,6 ± 0,2 0,046 ± 0,33 ±

0,014 0,16

коллаген 10 5,0 2,1 ±0,2 0,090 ± 2,80 ±

0.023 0,21

коллаген 10 5,0 3,7 ±0,1 0,10 ± 1,23 ± .

+ + 0.02 0,14

антитела 10

к кол-ну

коллаген 10 5,0 3,9 ±0,2 0,08 ± 1,06 ±

4- + 0,01 0,14

коньюгат 10

+ +

УК 5

коллаген 10 5,0 3,6 ±0,1 0,1 ± 1,26 ±

+ + 0,02 0,13

коньюгат 10

коллаген 10 5,0 2,7 ±0,1 0,09 ± 2,10 ±

+ + 0,01 0,14

УК 5

В таблице приведены средние значения 5-ти экспериментов, указаны средние квадратичные отклонения. УК - рекомбинантная урокиназа, 100 ООО ЕД/мл.

ВОЗДЕЙСТВИЕ АНТИТЕЛ К КОЛЛАГЕНУ, БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО КОНЬЮГАТА И УРОКИНАЗЫ НА КОЛЛАГЕН-ИНДУЦИРОВАННОЕ ТРОМБООБРАЗОВАНИЕ Ш УГЛЮ

коллагену + УК

Рис. 5

> 0.05) Урокиназа (100 ООО ЕД/мл, 5 мкг/мл) на 25% снижает количество адгезировавших к коллагеновому субстрату тромбоцитов (рис. 5). Действие урокиназы отличается от действия антител к коллагену (Р < 0,01).

Предполагаемый механизм антитромбогенного действия антител к коллагену, бифункционального коньюгата состоит в экранировании ими тромбогенной поверхности коллагена и, тем самым, ингибировании индуцированной коллагеном контактной активации и агрегации тромбоцитов. Одним из возможных механизмов действия несвязанной коньюгатом урокиназы является расщепление фибриногена плазмы, и, таким образом, нарушение взаимодействия тромбоцитов друг с другом.

Исследование коллагенозависимого тпомбообразования in vivo-

В дальнейшем антитромбогенное действие антител к коллагену, бифункционального коньюгата антител к коллагену с моноклональными антителами к про/урокиназс, а также комплекса коньюгат + урокиназа изучали ш vivo, на модели тромбообразования в артерио-венозном шунте у крыс. Шелковую нить, покрытую коллагеном 1-Ш типа крысы, помешали в кровоток животного, как описано в разделе "Материалы и методы". Результатом являлось накопление и нарастание на нити тромбоцитарной массы (таблица 2). Обработка коллагеновой нити растворами альбумина или IgG кролика незначительно снижала массу тромба на нити. Не отмечалось статистически достоверных различий между действием альбумина и IgG кролика (Р > 0,05). Кратковременная (1 мин) обработка коллагеновой нити антителами к коллагену крысы значительно снижала ее тромбогенные свойства: вес образующихся на нити тромбов уменьшался в два раза по сравнению с весом тромбов на коллагеновой нити. Антитела к коллагену вызывали значительно большее ингибирование тромбообразования, чем IgG кролика или альбумин. Не отмечалось статистически достоверных различий между действием антител в концентрациях 100 или 400 мкг/мл (Р > 0,05).

Таблица 2.

ИЗМЕНЕНИЯ ВЕСА ТРОМБА (СРЕДНИЕ ЗНАЧЕНИЯ ± СРЕДНЕ КВАДРАТИЧНЫЕ ОТКЛОНЕНИЯ) В РЕЗУЛЬТАТЕ ОБРАБОТКИ ВВОДИМОЙ В КРОВОТОК КРЫСЫ КОЛЛАГЕНОВОЙ НИТИ РАЗЛИЧНЫМИ АГЕНТАМИ

Обработка -

коллагено БСА, 2 мг/мл Щси-РА,

вой нити: 100 000 ЕД/мл

1,1 ±0,2

Коллаген, 7,8 ± 0,5 6 ±0,2 7 ±0,8

250

мкг/мл

Обработка Антитела к Моноклона Бифункцио Кроличьи

коллагено коллагену льные нальные 1дС,

вой нити: 100 400 антитела к антитела, 100

мкг/мл Бси-Дси- 100 мкг/мл

РА мкг/мл .

Коллаген, 3,4 4,3 5,6 ±0,5 4,4 ±0,3 5,8 ±0,3

250 ±0,3 ±0,4

мкг/мл

Шси-РА,

100мкг/мл

1 МИН - - ¿,5 ± 0,2

5 мин - - 4,9 ±0,1

Каждая группа состояла из пяти животных. Каждый белок инкубировали с коллагеновой нитью в течение 5 минут. РКси-РА сорбировали в течение 1 и 5 минут. БСА - бычий сывороточный альбумин, г1си-РА - рекомбинантный двуцепочочный активатор плазминогена.

Следующий класс антител, которые были тестированы в данной системе -мышиные моноклональные антитела к про/урокиназе человека/крысы. Наблюдалось некоторое снижение массы тромба на нити, обработанной этими антителами. Однако, данное снижение тромбообразования находилось в пределах уровня изменения тромбообразования под действием или альбумина (Р > 0.05).

В результате обработки коллагеновой нити, вводимой в кровоток животного, бифункциональными антителами к коллагену крысы и про/урокиназе человека/крысы наблюдалось значительное снижение тромбообразования по сравнению с -тромбообразованнем на коллагеновой нити или на коллагеновой нити, обработанной (Р < 0,05).

Бифункциональные антитела более значительно ингибировали тромбообразование, чем мышиные антитела к про/урокиназе человека/крысы (Р < 0,05).

Исследовали также тромбообразование на коллагеновой нити после I минутного взаимодействия с урокиназой (100 000 ЕД/мл). Масса тромба на нити снижалась незначительно: не отмечалось статистически достоверных различий между действием урокиназы и альбумина (Р > 0,05).

Ингибируюшее действие бифункциональных антител к коллагену крысы и про/урокиназе человека/крысы статистически достоверно сравнимо с действием этих же антител после связывания урокиназы (Р > 0,05). Увеличение времени связывания урокиназы с конъюгатом антител от 1 до 5 минут не усиливало их антитромбогенного действия.

На основании полученных данных вычисляли процент ингибирования тромбообразования как выраженную в процентах разницу между весом тромба на коллагеновой нити и весом тромба на коллагеновой нити, обработанной антителами к коллагену, бифункциональным коньюгатом антител к коллагену и про/урокиназе человека/крысы, комплексом коньюгат + урокиназа, урокиназой, альбумином, ^С кролика, моноклональными антителами к про/урокиназе человека/крысы (рис. 6).

АНППРОиВОТИЧБСКИЙ ЗФОИСГ АНТИТЕЛ К КОЛЛАГЕНУ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ НА МОДЕЛИ ТР0НВ0ЦИТ-ЗАВИС1Ш0Г0 ТРОМВООВРАдОВАШШ У КРЫС

{75-

550

25

1Соллпгся Урзгттлга ЦаЪз

+ ктйутт кролика к уропшггг

ЛЪэ колА>ктшогатп>1соньюгат + УК»МаЬв УК»УК

'/«Л____

1 1£ГЯ Б 1£ЕП

У/ ¿л— У/А

АЪз е г: Нельгэгкт > Кспьгзгкт 1{опызгйт

соптхзгтау гэлткгзлу + +

урстщг^'п урялхх^г'а

Рис.е

Таким образом, на основании вышеизложенного можно заключить, что антитела к коллагену, коньюгат антител к коллагену с антителами к про/урокиназе и комплекс коньюгат + урокиназа ингнбируют на 50% индуцированное коллагеном тромбоцит-зависимое тромбообразование в артерио-венозном шунте у крыс.

Урокиназа не потенцирует антитромбогенное действия коньюгата антител к коллагену с антителами к про/урокиназе.

Антитромбогенное действие бифункционального коньюгата антител с обусловлено наличием антител к коллагену в его составе.

Выводы

1. Для исследования процессов контактной активации тромбоцитов в условиях," приближенных к физиологическим, созданы и использованы две модельные системы, в которых поверхность, покрытая нативным коллагеном экспонируется либо (А) в кровоток животного, либо (Б) in vitro омывается богатой тромбоцитами плазмой при перемешивании со скоростью, соответствующей скорости тока крови в магистральных артериях.

2. Используя обе модели параллельно и независимо, изучена возможность подавления нарастания тромбоподобньк агрегатов на коллагеновых поверхностях либо путем локального связывания на них активной урокиназы (активатора плазминогена), либо путем экранирования коллагена антителами к нему.

3. Кратковременная обработка коллагеновой поверхности специфичными к коллагену антителами столь же эффективна для подавления тромбообразования, как и доставка урокиназы в составе иммуноконьюгата, что позволяет предположить, что подавление контактной активации путем экранирования коллагена является наиболее действенным способом зашиты поврежденных кровеносных сосудов от образования пристеночных тромбов.

у '

лз

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Устройство и способ моделирования тромбообразования in vivo. - Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. N 1, 1994 (соавт. Домогатский С.П.).

2. Антитромбогенный эффект урокиназы, связанной с коллагеновой подложкой посредством бифункциональных антител. - Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. N 2, 1994 (соавт. Домогатский С.П., Пыбульская М.В.).

3. Collagen-targeted antibodies inhibit platelet-dependent thrombosis. -Annals of Hematology, Suppl. II to Vol. 68, p. A 100, 1994 (in cooperation Bashkov G.V., Domogatsky S.P.). 38-th Annual Meeting of the GTH, Munich, Germany, Feb. 1994.

4. Collagen-targeted antibodies inhibit platelet-dependent thrombosis in vivo.-Thrombosis Research, 1994 (accepted for public, in cooperation Bashkov G.V., Domogatsky S.P.).

5. Collagen as a potential target for the arterial thrombosis prevention. - VIII International Symposium of the Biology and Vascular Cells. Heidenburg, 1994 (submitted for public, in cooperation Domogatsky S.P., Bashkov G.V.)

6. Antithrombotic activity of bifunctional antibodies conjugate to urokinase-type plasminogen activator (u-PA)/collagen: lack of u-PA potential effect. XIII International Congress on Fibrinolysis. Louvein, Belgium, 1994 (submitted for public, in cooperation Domogatsky S.P., Bashkov G.V.).

7. Collagen as a potential target for the arterial thrombosis prevention. Congress on Mechanism of Coronary Thrombosis in Unstable Angina Acute Infarction, May, Rome, 1994 (accepted for public, in cooperation Bashkov G.V., Domogatsky S. P.).