Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ В СЕЛЕКЦИИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS V. GALLERIAE — ПРОДУЦЕНТА ЭНТОБАКТЕРИНА

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ В СЕЛЕКЦИИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS V. GALLERIAE — ПРОДУЦЕНТА ЭНТОБАКТЕРИНА"

\

> /

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

имени Б. И. ЛЕНИНА ■ ■

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИ И ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ

На правах рукописи

i наседкина!

Галина Анатольевна

индуцированный мутагенез в селекции производственных штаммов bacillus thuringiensis v. galleriae — продуцента энтобактерина

06.01.11 — фитопатология и защита растений

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1973

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДШЙЯ СЕШЖОХОЗЯЙСТВШНШС

НАУК ИМЕНИ В.И.ЛЕНИНА Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты - растений

ИНДУЦИРОВАННЫЙ: МУТАГЕНЕЗ В СШШИИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ВАС1Ш1Ц ТН0К1К01ВМЗШ у. иА1Д*£М1АЕ -ПРОДУЦЕНТА ЭНТОБАКТЕРИНА

06.01.И - фитопатология и защита растений Автореферат ^аосертации насоисканиеученой'степени кандидата биологических неук-'

На правах рукописи

НАСЕДКИНА Гадина Анатольевна

-тйаа !) •а ссеьд-Л.

Ленинград 1973

Цапрваьгъ

> Работа выполнена в лаборатории микробиометода Все-

союзного научно-исследовательского института защиты реете !ний за период аспирантской подготовки 1966-1969 г.г.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из 6 глав. Список литературы вкяюча-'ет 165 названий, в том числе 69 на иностранных: языках, : Работа иллюотрирована 23 таблицами и 9 рисунками. ..-/■■ Научный руководитель .- кандидат сельскохозяйственных наук Н.С.Федоринчик." Официальные оппоненты: , I. доктор медицинских наук И.К.Олейник 2. кандидат биологических наук М.М.Левитин, Ведущее предприятие - Биологический институт ' • СО АН СССР, г.Новосибирск ; Автореферат разослан'. /<Р О й^ЛиЛ- 197.3г. ■

; Защита диссертации состоится 1975 г. " час

на заседании Ученого Совета Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений. ' ;■„':.

С диссертадией'можно ознакомиться в библиотеке Института.: ■ ' " ."-• V. ; ■

' - Отзывы просим высылать по адресу Ленинград, Центр, ул. Герцена,-42, Всесоюз1тй научно-исследовательский ; ' институт защиты растений." Ученощ- секретарю.

;„'/" - До.настоящего времени промышленное производство бактериальных препаратов для защиты растений от вредителей осуще-, "' ствляется на основе штаммов .получаемых вз природы.;' Такие штам- ■

мы характеризуются морфологической неоднородностью популяции;: . : НИЗКОЙ продуктивноСТЫ) и неустойчивостью лизогенных СВОЙСТВ.' . V ■ На первых этапах разработки и освоения промышленной

_ : , . технологии биопрепаратов использование диких штаммов'яБляется вполне оправданным,-Однако, опыт развития отечественной и зару-..бекной промышленности микробиологического синтеза показал, что -рентабельность крупнотоннажного производства биологических4 препаратов и снижение их себестоимости могут быть достигнуты • только на основе использования штаммов, получаемых в результа- ■■" . те индуцированного мутагенеза.; ■''"■■.-■"

■ ; - " В последние годы в производстве энтобактерина-3 про-V- исходит-переход к крупнотоннажному.производству/ Это повлекло за собой острую потребность в-обеспечении промышленности'высо- ■-. непродуктивными и вирулентными штаммами, обладающими устойчивы' ми лизогенными свойствами. Существующие методы естественного' отбора штаммов уже не могут удовлетворить'возрастающие требо- : вания, .предъявляемые к производственным культурам.■■ Одним из . ; .'. перспективных путей'Для успешного решения этой, задачи являет' ся использование различного рода мутагенов/ К числу послед- ч

них, вызывающих генотипические изменения у микроорганизмов, , относятся многие вещества химического или-биологического происхождения, ' ■ ■ . ■

Задача наших исследований состояла в том, чтобы изучить основные закономерности изменчивости культуры Вас.ььи-: г1п«1ввв1» у.б»Ивр1ав, индуцированной различнымимутагенами', .:■■*■■ в целях разработки метода получения высококачественных штам-' мов для производства'энтобактерина, •

Исследования в области направленной селекции энтомопа-тогенных кристаллообразуладих бактерий находятся еще в началь-- . нойтстадии и до настоящего времени опубликованы лишь отдеяь-ные сообщения, касающиеся^-изучения влияния некоторых Докторов на мор^олого-культуральные и биохимические признаки этих куль- 1 тур. '.'-..:.

3

• • ' ' -

.. ' _ А.Б.Гукасян и Л.Л.МаланоЕ /1968/ применяла обработку . . : • : рентгеновскими и гамма-лучами для повышения . вирулентности :; : культура Вас. tuviensis ïrass.et.Ouk..активной;против [ryce-VY-i-■ ниц'сибирского шелкопряда. Аналогичные исследования проводил :. А;А.Машанов на культуре Вас. insectus , патогенноЙ для того ; . ". ле "вредителя.

.. " Небольшое число работ посвящено влияние ультрафио- ;:• ' . летовых лучей и некоторм антибиотиков /стрептомицина, тетра- ... ' .циклина и террамицина/ аакудьтуру Baa,th«ingi«n»te »-.¿«пАго--; lieue /Талалаева.Чеиезова, Кузнецова,1968; Каткова," Талала- .• ева,1968; Колесшщкая, Талалаева,19бд/. .^ЛЛЛЛ-'Л^

••• В работах зарубежных' исследователей рассматриваются . ;; -- вопросы морфологической или■биохимической изменчивости куль- \

тур Bac.thwingieneie под действий« гамма-лучей, УФ-лучей, Лсазгаечнойэнергиижнекоторшсвеществх1шическойпрароды .¿ЛЛ' / Saimoff ,1963,1965,196^; Агопвоп ,Wer*me ,1965 И Др./.Од— ; ' нако в этих работах не изучалась возможность повышения вн- " '"• • " : сектицидной активности^ энтомопатогенных бактерий о помощью -л мутагенных факторов. •/ . •" . ' . 'V'-;^";'

' Мы в своих исследованиях по индуцированной изменчиво- ; - г X сти 'культуры Вас. th. r.ealltriA*. опирались на большой и . -' Vуспешный опыт селекционной работы в области получения фаго^ ^устойчивых и высокоактивных штаммов активомицетов и бактерий продуцентов биологически активных веществ.

СОВСТВЕЬТШЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I. • Материалы и методы. : , '.: -

В опытах по индуцированной изменчивости'Вас.гь. v.gal- . i«rla« были использованы штаммы различного происхождения, гг ^ полученные в лаборатории микробиометода ВИЗР /65-1,.64-10, • \ • •'. XC-I, 34-3/, а также два штамма" /11-67 и 37-68/, длительное : время,"использовавшиеся в производстве энгобактеряна-3. ■ 'Л -'Б качестве ыутагенов 'мы применяли ' этиленимия в концен- ' трации 0,20,1% и 0,01% при экспозиции-15 мин.,30 мин., ~ :• : '•-45 мин, ,60 мин. и 24 час.; бактериофаги-64 и 65 - с -множест-,

венноотьо заражения,Iii, j 10:1,;50:1, IOOiI'h 500:1, а также ; ^калиевую' соль "ó енз илп ёнициллина. с; концевтраци ей ^ его в среде .ЮСО ei/мл. :• . \ .

4V.""*''' В опытах по изучению естественной и штудированной из--„меячивости культур Вас. th. г. gel leriae мы, применяли мясопеп-, тонный .агар уЛЕА/.': При .изучении изменчивости исходных,штам-мов по гтризнаку продуктивности , за основу которой "мы брали ^ титр спор и кристаллов в культуральной жидкости, использовались мясопептонный бульон и нукурузво-глюкозная среда /куку- ; рузный экстракт-2,02.по сухоцу весу, глюкоза-0,7$& /. : ,'■,:: ^ Этиленимин дяя обработки разводили стерильной дистиллированной водой|непосредственно перед употреблением..Опоры Bac. th.v. в«11«г1ае отмытые фосфатным буфером, вносили, в: колбу о соответствующим, разведением этиленимина в встряхивали на качалке при 28°С в течение заданной экспозиции. " ".. ; При обработке бактервофагамиисследуемув культуру и . 'Дат в соответствующих соотношениях выращивали в.жидкой куку-рузно-глшознойсреде на качалке ори 28°с; В процессе внращи- -вания каждне 12 часов отбирали пробы для контроля ! за разви--' ^тием^^льт^ы. Дальнейшее выделение фагоустойчивых мутантов

■ проводили с'помощьD метода отпечатков,.широко описанного р литературе /Жданов, Торосян, 1965, Алихаяяа,1 Жданов,1967,в -др., Ledorberg «i.- alrfI952/. .-■.■■;■.

■ :1 > Обработку и сходной куль туры пенициллином мн проводили . методом ^непрёрнвного'_воздействия антибиотика в- агаризоваа- ■' -пой среде /МПА/. Мя ■ экзго'Гспоры трех<^о"чно!Гкультуры Бас. t h. v. 6 al 1«т i *« вне евали на ША,, в который предаарительно : вносили 1000 ед/млгсреды пенициллина.'

' • Выявление закономерностей индуцированной'изменчивости . проводилось'на;о<жове^изучения следущихiпризнЦов'. культуры: а. сдособность.^к^кристаллообразовашш; б. некоторые блохжш-} ческие признаки»/сбраживание.оахаров, лицето-вителлиноваяре-ахция, продуцирована е л еаициллииазн/; в. чувствительно сть kV некоторнм испытуемым фагам /64,65,23,36,П2/; г. устойчивость ; лизогенных: свойств; д,' инсектицидная активностьдля, Gaileria Melonalla., слулаа;е*й в наших .иссяедегаизях биологическим -

тест-объектом; е. продуктивность вариантов.'' V -" "л

' Изучение биохимических свойств проводилось по методш-1' : кам, рекомендуемым в литературе /Беттхер,1961, Чайковская," Еенкина,1962А~ . -• " ,■.■.■..■■--.■ " -'■■:■ "-^л".

При изучении лизогенных свойств выделяемых мутантов, ^ а таете их чувствнтельаости к* фагам были:использованы обще—. , принятые методики Л>аутенщтейнД955, Адаме,1961/,т . '

. Изменчивость' мутантных вариантов по приэнаку вирулентности для тест-наоекомого характеризовалась нами почиолу плюс- и минус-вариантов. К числу плюо-вариантов мы относили "культуры, вирулентность которых выходила за пределы исходного штамма /уровень вероятности 99% /, к минус-вариан-. дтам относили все некристаллогевные варианты и варианте,* выходящие 'за пределы X ЗЛ .. ^-'-лV ' Определение вирулентности вариантов проводили методом * / свободаог'о вскармливания гусениц тест-объекта весом 80+15 мг; Концентрация спор и кри сталлов'. при заражении 100-150 млн/мл . .

'•-А ■ Продуктивность вариантов оценивали'либо чашечным мето-/ . дом, либо путем.прямого счета в камере Горяева. Однако в. виду трудо емкости этих1методов, мы разработали применительно к ' нашим условиям деяситометрическиЗ' метод определения щхуцгк-'тивности на фото»лектроколорвмегре-М в квветах I мм без све--тофильтра, ".'-:. . ■''■*' '/^Ч ''¡1

: ;Статистическую обработку подученных результатов сро--"-водили по общепринятое методике /Ашмарин^ Воробьев,1962,"-Захаров, Квитко, 1967/, 7 ? ^"■■

2. Цттагевно^ действие бактетш^ьных; фаг9в на различные " ктльтущ Вас.' Лшу^к!«)«!» .

. В исследованиях по изучению мутагеннагодейотвия бак- х териалышх фагов мы использовали вирулентный -фаг65,'вид еденный, при массовом фаголизиое штамма Методомотпечатков мы определили оптимакьцую множественность заражения, которая для фага 65 составляла 10:1* Обработка этим фагом штамма 65-1 обеспечила наибольший выход внеоковирулентши цутаитов, ус- : тойчивих в лабораторных условиях к фагам 65 и 64 одноврёмен-; г но. При множественности заражения 10:1 количество фагоустой-6

чивых мутантов составляло 9,2-10,25? /в контроле• безчобработ- ^л^. ян;-0»Е?'/.ча выход'^ивнта дда;^^ л; ■

составлял 7,15? по* сравнению с 3,2# в контроле. .; • . — -V ' " В вариантах-опыта,'где штаммы подвергались обработке • > '-■> фагом 64"i выход выооковирулевтянх мутантов практически ве уве-. ,. личивадся :6,3£ гв опыте и 5,05t -в контроле, Подученные нами"■ ' мутанты, устойчивые к фагу' 64, оставались, чувствительными к - фагубб. Это позволяет сделать выводо том, что бактериофаг s - выявляется специфическим мутагеном, индуцируя у обработан- : "

• ,* шсс'штаммов только признак устойчивости кфагу 64. • ' Vf; Исходя их этого, мы обработали фагом 65 с множественно- -• .; сты> заражения-10:1 ряд штаммов Вас. th.'v.g4ii»ria« *', вы-' -

-деленных из разных насекомых. В результате было установлено ; /таблица1/,что частота фагоустойчивнх мутантов для некоторых . "".■; V- штаммов /34-3 и 37-68;Гвыше, чем для остальных культур и ра-.! ' Х < нее изученного штамма 65-1. В то "же враля для штамма 11-67 : ;, частота фагоустойчивых мутантов оказалась более низкой по . , сравнению со штаммом 65-1..Тем не менее различия по частоте - ' \ ■ ■ ■■ ^ Таблица I. .

;-Влиянве фага 65 на изменчивость Вас» thurineien*i«T. gel-

Название BD ХОД

штамма фагоустойчивых плюс— минус-

■. * ■■. ■. ^ мутантов вариантов вариантов

64-10 - 9Д . 5,4+1 .24,443,8

37-68 ■ 11,2 - 5,6+2,23 24,2+4,3 ^

11-67 ' 7,3+ 4,2+2,26 29,0+4,42

.34-3 хо,5 ,; 3,8+1,37 .., 26,е+4,29

XC-I : ;э,22 ■ 5,5+2,17 24,7±4,08 .

Контроль без,обработки ■'•:•• • -V

,64-10 - . 0,05 3,2±1.4 7,2^2,98

37-68: - од .3,3+1,47 5,9+2,51 Л •

11-67 -. 0,08; 3,0+1,37 . , 9,1^3,01

34-3 :■■'■' о,г 2,8+1,31 ; ^

'XD-1 : ' -? 0,5 ' 4,0+1,% 8,6+1,99 : -

фагоустойчивых' мутантов для разных штаммов Bao. th. т. galle-riae вполне допустимы в пределах ошибки опыта. Это показы- -вает;-что все исследованные культуры взаимодействуют-с фагом , 65 по-видимому,: аналогичным' образом. Сходные - данные; получены и при оценке фагоустойчивых мутантов на вирулентность.' Выгод шос-вариантов у всех-обработанных штаммов и «значит ель- v но отличался от такового у штамма 65-1.' Нашими эксперимента-' 'mh¿ по,изучению изменчиво ста штаммов в результатевоздействяя фагюм.65 установлено, что этот бактериофаг не является специфическим цутагеном/так как он вызывает: вариабельность исход- ; ной ^культуры по нескольким признакам одновременно.

' ;Ряд фагоуотойчивых и вирулентных мутантов Вас. tb. v. «al leriae , 'полученных в результате обработки фагом 65,;оцени-" вались в заводских условиях.

■ ''. ' ' ■ ■ ; Таблица 2.

Характеристика фагоуотойчивых вариантов Вас, thuri»£iensls v. gallería« , полученных путем обработки фагом 65 и испытанных в производстве знтобактерина-3. . \

Исходный; 'Цутантный Вирулентность на средах^ Стер спор'в'.

vштамм . вариант твердой жидкой -; культураль- . НОЙ ЖИДКОСТИ

млрд/мл

65-1 Ф 5 . 100 . 85 ■; ■ 0,8

Ф 15 95 . 100 0,7

XC-I} Ф 24 ' ; : 100 ■ ' 85- : ■ 0,9

Ф 49 ."■-' 100 . .. 95 ■ - : 0,94 .■'/.:

11-76 0 14 • • ioo -'. 95 0,95

Ф 18 ■ 100 75 0,92

37-63 Ф 39 100 '."- • ■ 85 - . 0,92

'.■,., ; .у- Ф 42 "V- 95 . • 90 1,3

Ф 51 1 . 95 ■' 75 ': ■ V- 0,95 •

■ : Как можно видеть из данных таблицы 2, все мутантныо варианты- показалилвысокую. вирулентность для биологического тест-объекта как на твердой, так и в жидкой средах. Они не выделяли'вирулентных мутантов симбиотического фага и.не да-

вали ■ в" лабораторных условиях спонтанного фаголизиса;, Однако -при использовании этих вариантов в качестве продуцентов эн-' тобактерйна в производственных емкостях довольно скоро обна—. Дружилась их способность' к выделению вирулентных фагов, лидирующих культуру-хозяина. Изучение литературы, касающейся вопросов взаимодействия'бактериальных фагов и клеток бактерий, позволило нам найти объяснение этому явлению / zind«r ,1958/ i При взадмодейатвии различных штаммов Вас, .th.vj galleria« '. с вирулентным фагом 65 образование фагоустойчивых-мутантов- ; -происходит за счет возникновения комплекса фаг-клетка,' относительно стабильного при целом .ряде .пересевов в лабораторных 'условиях'» В.производственных, условиях при культивировании в ■больших емкостях количество этих комплексов.резко падает, ''так как фаговый материал располагается ассиметрично и при делении отщепляются,фагочувствительные клетки.' Последние делятся быстрее, .чем комплекс фаг-клетка, что приводит к полному вытеснению чувствительными клетками фагоустойчивых форм. .. . В. опытах, .где исходная культура обрабатывалась умеренным -фагом 64, образование мутантов,, устойчивых я этому фагу, происходило за счетлизогенизации, но в этом случае сохранялась чувствительность ко всем другим фагам. . "V . :;

Таким образом, мы установили мутагенное действие бакте- ■■-риофага 65 на признак устойчивости к фагам 64 и 65 одаовре- ; ыенно а также на выход плюс-вариантов, активных для биологического тест-объекта. Однако тот факт, что подученные мутант-ные варианты оказались нестабильными в производственных условиях, заставил нас отказаться в дальнейших исследованиях от использования-фага как биологического мутагена.. 3. Мутагенное действие эуиленимина,-

■ '■.' Алкилирующие агенты, к числу которых относится этилени-мин, действуют преимущественно на дезоксирибонуклеивовую кислоту /ДЩ/,: заключающую в себе наследственную информацию клетки. Местом действия таких агентов могут быть лиЗсГфосфатные группы, либо основания, входящие в состав ДНК. В реакции ал-килирования фосфатных групп вступает чаще всего ДНК, находя-

щаяся в стадия репликации. Такое воздействие необратимо и - X приводит к летальному исходу. Реакции алкилирования основа: ний,наблюдаются при действии алкилирующих веществ на покоя- . щугся ДНК. Наиболее активными в химическом отношении являются азот гуанина и аденина. Их взаимодействие с алкилирущи— ми агентами приводит к депуринизации оснований,'что в конеч- • ■ном ит©ге;выражается либо в летальном; либо вцутагеннои. воздействии на микроорганизмы /БартошевичДЭбб, Сойфер,1969/. В : этом случае важное значение имеет дозаагента, используемого ;.■■ для.обработки. При'использовании "мягких" доз этиленимина, -дающих гибель микроорганизмов не более 30^,-будет преобладать : мутагенный эффект, тогда как при "жёстких* дозах агента будет;: преобладать летальное действие. \\

Подходя к выбору мутагенных факторов для лизогенных культур, важно учитывать и индуцирующее действие этих веществ на активность профага, то-есть влияние его на способность лиэо-,г генных культур освобождать вирулентные мутанты симбиотическо-го фага в жидкой питательной-среде. К факторам, обладающим высокой индуцирующей способность!), относятся УФ-дучи, ыитоми-цин-С, ванкомицин и другие /ФаутенштеЙн,1971/. Этиленимин -■ также упоминается в числе факторов, индуцирующих' профагод-'нажо это его свойство по сравнению с вышеуказанными фактора- ' ми значительно ниже. - - - ; ■ ; :

' В литературе мы не напита сведений относительно изменчивости культуры Вас. гь. .у. в«11вг!»« под действием этиленимина.. Поэтому задача исследований' заклсчалась в раэрешенид' -; следующих- вопросов:' I.определение летальных и мутагенных доз этиленимина; ¿.изучение вариабельности некоторых признаков-""; данной культуры под действием этиленимина. \

Летальное действие этиленимина изучалось на двух.штамм мах данной культурГ/1X-6? и ХС-1/.при концентрации 0,2%,; 0,1% и 0,0ХЙ и разных экспозициях /таблица 3/. Этими опытами установлено,- что выживаемость бактерий падает но мере увели- ' чения'концентрации этиленимина, а. также с увеличением време-'.; . ни обработки. V.. '..V .. • ;>

' ' " ' ■ ' Таблица 3.

Детальный эффект этиленвмива на два штамма Вас. Итг1пв1«лз1з

V Концентрация -^Экспозиция ВЫ Ж ИВ А Б М ОСТЬ %

\ Штамм ХСт1 ';■ " Штамм 11-67

0,2% "' Ч ■ -

15 мин. \ 27,5+1,6 26,8±1,52

• 20 мин. 15,4+1,21 13,8+1,11

30 мин. 11,2^,83 10,1+0,8 : ,

. 45 мин. з,?+р,з ■ 3,2+0,41

: 60 Мин. /•=.••" 1,7*0,43 1,3+0,27

0,1 %

15 "мин. "■* -,, 30,7+0,59 - 32,8 +1,26

30 мин. . 19,2+1,45 . , 23,5 +2,35

45 мин.1 ■■. * , 9,65+0;5 :8,65+0,43

60 мив. „" 5,67+0,39 5,2 +0,84

0,01 % .

; - 24 час. " ".:'.- 5,0+0,25 ."■ Л' ~ "г'"' ■

Контроль 95,8+2,89 98Д+2,07

■\ Морфологическая изменчивость культуры Вас. №. г!ае иэучалась;на штамме ХС-1. Мы установили, что с увеличением дозы мутагена увеличивается количество мутантов.с нети-: личными колониями А, II типа и ветвиотае/.,Колонии,1,,типа-блестящие.с ровными краями и гладкой поверхностью оказались , авидолентннмя. Другие типы колоний давали такую же изменчивость по инсектицидной активности, как и типичные колонии "" /блестящие, о концентрическими кругами на поверхности/.

, При изучении вариабельности культуры Вас. -ьь. у. саХ-1«т>1ав по признаку кристаллообразования было установлено, что максимальное образование кристаллообразуюших вариантов происходит при воздействии этиленимином в.концентрации С,1% ' и.экспоэиции15 мин.'-Увеличение: экспозиции, - равно как и увеличение кошхентравди.т^водадо 'к резкому'падению количества кристаллообразующих вариантов. ■ - ■..

Влияние этиленимина на признак чувствительности к раэ-• ль^яым фагам./36, П2 и 23/ изучалось методом.отпечатков на.. ; ' двух штаммах Вас. г. gal3eri.ee АС-1 и 11-67/. В обеих. . . , / случаях наиболее результативным оказался выход мутантов, ус- • , тойчивых к фагу 23, обладающему более узким спектром литичес-

• кого действия. В то же время практически не увеличивается частота мутантов, устойчивых к фагам с широким спектром ли-тического действия /36 или П2/. ' ^'■'.ул'./г

.1]■ ;:„ Параллельно с проверкой признака устойчивости к различ- ,: ным фагам, вами проводилось изучение способности к спонтанной .-■-' репродукции вирулентного фага у мутантов, обработанных эти- "..■ ленимином и вариантов естественного рассева исходной культу-

• ры. Установлено, что более 50$ всех выделенных после обработ-. ки этиленимином мутантов штамма ХС-1 приобрели способность' к

спонтанному-выделению вирулентного фага, .тогда как для штам- ' ма 11-67 это свойство проявилось только у 12% исследованных . : культур. Это свидетельствует о том, что эффект мутагена во . многом зависит от генотипа бактерий. : .-*■

* Отсутствие, биохймической методики оценки инсектицидной г активности получаемых мутантов весьма затрудняет изучение из-• менчивости культуры Вас. т. в»11*г1а* по признаку виру':/ лентности для тест-объекта. Поставленные нами опыты по изучению 'влияния этиленимина на_инсектицидную активность данной¡V .''V : культуры убедительно доказали, что наиболее эффективной яв- : , ляется концентрация его 0,1% при экспозиции 15 мин. для обо-. их исследованных штаммов. : " ; " , -

■ . - Наибольшее различие в вариабельности обоих штаммов по • -

. ' признаку вирулентности наблюдалось в частоте плюс- и минус->'Д /-вариантов при экспозициях1 от 30 мин. и выле. Так, например, если для штамма ХС-1 при экспозиции 60 мин. количество плюс- . . ■ /вариантов составляло 3% и незначительно, отличалось от контро-. лл, то для штамма 11-67 при этой же экспозиции нам не'удалось." получить плюс-вариантов. Количество минус-вариантов.для штам- . ма ХС-1 колебалось незначительно при всех экспозициях, в то * ', • ' •время как у штамма 11-67 наблюдалось резкое увеличение количества минус-вариантов уже при экспозиции 30 мин./Таблица 4/. :

v . ■ ...'■■■;■ ' I ■'■' '" ■/ . Таблица 4.

- Изменчивость штаммов Вас." th. v. galleriae * ■ " по приз- ."

наку вирулентности для тест-насекомого при обработке эти-. "ленвмином в концентрации 0,1% и разных экспозициях.

Экспозиция* ■ .мин. • ■■:■ ЧАСТОТА мутантов' %

плюс-вариантов ! . минус-вариантов.•

'V '. . ..: ШТАММ XC-I

• 15' : 13,0+3,45 - ■ 15,5+3,16

.30 г .,-■-"■ ■ - 6,0+2,4 >'"■"" " : 22,2+3,47 "

45 "■'•".■'■■ ■■"■ 4,0+1,82 27,0+3,71 ' " V'V

60 - 3,0+1,7 . ■ 29,0+3,76 . ''Г."

Контроль 4,0+1,96 ■ 17,0+3,67 ' л

ШТАММ. , 11-67

15 ■ 14,0+2,45 : 12,0+2,98 -

" зо : - 4,0+1,6 • „ . 20,с+з,з-.; ■ .../

• 45 -^.'"Ч 2,0+1,4 . 32 ,с+з,б -

;60 ■ ~ ■ 0,0 \ ■ 36,0+3,46 • •

Контроль . ; 6,0+2,5 ■ : 15,0+3,46 ' ¿ *

V . • Нашими дальнейшими исследованиями было установлено, ■ что среднелетальная концентрация для биологического тест- . -объекта среди плюс-вариантов, полученных после обработки , -".>.-..--. г этиленимином была в 1,5-2 раза ниже средаелетальной'концен-..V . трации для тест/объекта' среди плюс-вариантов, выделенных из

~; естественного" рассева. Полученные данные позволяют сделать V * вывод о том, что этиленимин вызывает глубокие изменения .в ■ : '

генотипе бактерий, 'проявляющиеся в Снижении среднелетальной лл'; концентрации. • '-■' '• ".V , у-', к ■

• Изменчивость культуры Вас. -ы». V. £а11ег1»е • по приз-^ на^'. продуктивности изучалась путём.сравнения;значений ,тит-: ; ■ • ра спор и кристаллов в культуральной жадкостз при*выращива- ^ < ниж бактерий в жидкой кукурузно-хлюкозно2 сред о. Было • уста- новлено", что для штамма 11-67" выход высокопродуктивных вариантов с титром более 1,5 млрд/мл увеличивался в результате "

обработки этиленишшоы в 3-4 раза посравненвю о контроле -„'■ без обработки '/ таблица 5/. -

■ . ' . ■Таблица 5. ' '

Влияние этиленимана в концентрации 0,155 и разных экспозыи- .-.. ях на продуктивность штамма 11^67. ■-■' :

Экспозиция Среднее значение Максимальный. Выход высокопро-

титра в культу- титр кудьту- дуктивных вари-

мин. ральной жидко-. ральной-жид- антов %

сти шщп/ыл кости . "

15 1»71^р,15 ' 2,65 ' . 13,0+5,8 1 "

: 30 1,49+0,Т2 2,51 ■ 9,0+2,86 :

45 1,40+0,11 2,СV 8,0+2,71

60 1,39+0,11 .1,6 6,0±2.4

Контроль 1,23+0,13' 1,52 3,0+1,7

4; Селективное действие пенициллина яа культуру Вао. ГЬиг1а-. рКпв!» у. ед11«г!а* .

^ В опытах по изучению пенициллина в качестве цутагенно-■' X 1 го фактора ми применяли высоколетальную концентрацию этого антибиотика, равную 1000'ед/мя .среды. Выживаемость бактерий ' " Вас, «и г. в«И«г1лв при такой концентрации составляла ' ^ / 0,0015?. -

Устойчивость данной культуры к высокой концентрации : пенициллина объясняется способностью бактерий продуцировать":. \ ^ пенилиллиназу при ферментации в ходкой питательной среде /МПЕ/ " -Оценка большого количества штаммов по "этому признаку показа- V , ла, что практически все штаммы Вас. г.. в«П«г1а* обла- ; ■ дают конститутивной негндуцированной пенициллиназой.Добевле-• ние пенициллина в жидкую среду в количестве 10 ед/мл среды 'у -усиливало продуцирование фермента в 1,5 раза.. '... V " ■

. Максимальное накопление пенициллиназы у большинства; : штаммов наблюдалось. к 48 часам роста на КПЕ. . . . ;>

У пеницлллкноустойчиеых. мутантов не отмечали существен-. /"*..." 'у .

ной изменчивости ни по биохимический признакам, ни по приз- . накаы чувствительности к фагам 23, 36, П2.Во всех опытах ■ вариабельность штаммов после обработки -пенициллином: была равг нозначна контролю. Не отмечено также и индуцирующего . дейст---вия данного антибиотика на активность профага при однократ- • ной обработке. •• '.. - ■■/' ;->..

При изучении вариабельности штаммов по признаку вирулентности было установлено, что выход высокоактивных вариан- ^ тов был,даже выше, чем при обработке этиленимином-/таблица 6/. ';■ ч у ..; -'"■.■( ■ '.*-"'- V:-'.' ■ - . Таблица б. ■■..•

Изменчивость различных штаммов Вас. ги. т. £*11«с>1а« . по признаку вирулентности под воздействием этиленимина и пенициллина. •• ■ " ;'■

■ М У. Т -А Г Б н - V-; • 1 и л ЮС - варианты' % ■ МИ Н У С варианты " Среди ел етальная концентрация «ли/мл -"'у

И Т.А М М, 11-67 - ■ :-■ у"

Пенициллин. 20,3+3,6 12,0+1,37 . 42* - 57

Этиленимян .14,01+2,45 12,0+2,98 22: - 30

Контроль '' 6,0+2,05 ■ 15,0^3,46 46, - 60- •

Ш Т А М М хс-1

:Пенициллин ; ,24,3+4,8 • 10,0+3,7 38 - 45 .

•Эгиленимин 13,0+3,45 15,0^,16 ' : ! 20 - 28

. Контроль : ■: 4,0+1,96 17,0^3,67 : 40 - 55

ШТАММ 37-68

:ПеНИЦИЛЛИН- •21,7+3,8; 13,6+1,7 :': V 42; - 50 ,

Этилевимин 11,2+1,28 15,113,5 28 - 32.'.

Контроль 5, 4+1,96 12,3+1,38 • 42 - 54

; Из данных таблица 6 можно видеть, что значения средаелетаяь- ; кых концентраций, для биологического .тест-объекта у пеницал-линоуотойчивых"вариантов более.высокие, чем для вариантов," полученных после обработка этиленимином.-Эти данные.позволяют :сделать вывод о наличии у пенициллина характерных селективных свойств. Это выразилось в' отборе активных вариантов /до 20-

■. :■ '■"'," 15 ■ V -'

- 2552 /. Вместе с тем мутагенное действие пенициллина вира-' '.-■"; жено слабо, .что проявилось в.незначительной изменчивости вы- " деленных пеншиллиноустойчивы? мутантов по'биохимическим при-": : знакам и признаку фягоустойчивости. V-'■ к Нами была сделана попытка'найти коррелятивную зависи-• :'.. '..,.- мость между количеством продуцируемойпеницшитнаэы и инсек- >

тицидной активностью-вариантов.- В большинстве случаев те -'.•-' ■'■■"X штаммы, которые-продуцировали-большее количество пеницилли-- вазы, обладали и более, высокой, продуктивностью^ в вирулентно-. - -стью для тест-насекомого. Однако количественную корреляцию ; между;продуцированием пеницшшиназы и вирулентностью штаммов .-: установить не удалось;' ..„".'-■■■... ., - ■ ■ ' . ^ ' '

5. Ступенчатая обработка различных штаммов Вас. гйиг1пе1*п»1в

V. £»Иег1а.в , этилекамином и пенициллином.- ':- г'

'.■'■■. г ■ Проводя селекционную работу с микроорганизмами; иссле-. доватеяи обычно не ограничивается однократным воздействием " : мутагеном. Один из наиболее активных штаммов подвергают вто- \ ." ричной обработке тем же-мутагеном, либо другим, но в том ■ .. случае, когда различные мутагены оказывают.одинаковый эффект на обрабатываемую культур. Такие последовательные обработки, проводимые в несколько этапов, называют ступенчатой селекцией. В целом,раде работ указывался, что ступенчатые обработки ав-ляится более эффективным ^средством воздействия - на: мвкрэорга- - ; ; . ниэмы, чем однократвые обработки мутагеном /Еаклунова.1966;". : Гольдат и др.1967; Захаров, Квитко,1967; Алиханян,1968/. . . . с В связи с этим од изучали возможность'применения сту- "

* 'пенчатых обработок этиленимином и пенициллином в селекции активных штаммов Вас. ък. V." еаИвгхав . Необходимость поста®- . ленной задачи диктовалась ещё и тем, что при хранении на ско- ■ , пшенном агаре вариантов, полученных в результате естественного > } рассева или цутём обработки мутатенами, (¿ы^отмечали падение" V -У их вирулентности уже через 3 месяца. Инсектицидная активность' .' ■;" некоторых вариантов снижалась на 30—405?. В целях получения ус-" тойчивых вариантов,, сохранящих свои признаки в течение ряда' . поколений, мы провели серию экспериментов:по ступенчатой обра-„ ' .16 ' , :"':' ■ / .-■■- " - v '

AV

в •

Д-67

а. ЭИ

67 -37

6./ V в."

пенициллин \ 67/2Э-5 '

ЭИ

67/2Э-8 -

Л Д.

естественный рассев +'/ пенициллин

67/2ЭР-307

¡67/23Р-202|

.■К'

!

67/ЗЭР-8

JL

"Г

_L

В.

37-66

¡7?

пенициллин

37-Р4

wT

естественный".

рассев: ■' ч' _J_

37/Р4-508

ь*

пенициллин i

37/2Г-508

е. : ЭИ ■

г. !' эи

37/2ЭР-508

ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ' ШТАММОВ

Рис. I. Схема опытов по'комбинированной;обработке^штаммов , Bab. thoringiensi« этиленимином и пенидиллинсм.

ботке' этил евШганом в пенициллином трех штаммов Вас. th.r. - ^ , pallerl*« /рлс.Х/. Этилетплш применялся нами в концентра- -ши 0,£Е приэкспозипди 15 шш; Обработку, пенициллином проводили на ША • с добавлена ем антибиотика я количеств е 1000 ед/шi Среди, 1 - ' .■''. ■ • ' ;; . -

- А. Обработка р^яммя УП-Тт ■, - " V ■.'■<■.-'

• ' Вариант ХС/Э-233, полученный в результате однократнбй обработки этиленимином, вновь обработала этимже мутатёном /этап б,рио.1-А/. Таким образов, имеламесто двукратная об-' работка этиленимином, при которой вкснваемооть бактерий соо--тавляла 9 да, Параллельно вариант ХС/Э-233 высевали на МПА с ценищшлаом /этап в,рис.1-А/. Ляя каждой ступени обработки-: отбирали по 100 вариантов и оценивали их по признаку кристаллообразования в устойчивости лизогенных свойств. Варианты,* / ~ отобранные по признаку кристаллообразования как наиболее перн-. ^спективные, оценивали в дальнейшем ва биологическом тест- , ; объекте. \ ' ' •, '" J ■. v ."V'-1"

В результате навпсс опытрв онло установлено, что при двукратной обработке спор штамма 20-1 этиленимином выход высоко-, активных штаммов достиг 23,4£ /после первичной обработки-133/; число минус-вариантов составляло в опыте 7,05£ в в контроле-^ ? 10,0^. Один из вариантов, подученных после двукратной обработки этиленимином /вариант ХС/2Э-ЙЗЗ/, был заложен на дли- -тельное хранение в холодильнике при 4°С. В течение 6 месяцев хранения на скошенном агаре культура полностью сохраняла ■ свои ; свойства, в том числе и-вирулентность для теот-

насекомого. /.'■'.

В опытах с обработкой варианта ХС/Э-233 пенициллином выход высоковирулентных мутантов составил 27 при числе*- v "минус-вариантов только 3,0£. . ■ • • ..

Ва следующем этапе вариант ХС/2Э-880 обработали этиленимином еще один раз /этап г,рвс.1-А/. После трехкратной обра-' Сотки штамма ХС-1 произошло резкое падение числа шдао-вари-антов /до 4,0Í / и значительное увеличение.количества мтнус-' вариантов /до 22,05? /• Рассев этого хе штамма на среде о пенициллином /этап д,рис.1-А/ позволил выделить до20высо-18 : • < ■ "

коаятиьяых вариантов• при числе минус-вариантов6,®?,- Необ-* ; ходимо•отметить, что трехкратная обработка шташа 1С-1 эти- . л'Г-й". V л енимииом" вызвала уволученных цутантннх вариантов способу. - V яЛ-ность к освобождению вирулентных фагов при выращивании ;их.; • . • .•• на жидкой питательной среде. Таким образом, результатынаших " : ' исследований показали [нецелесообразность трехкратной обработ-.- .. ки | этиленвмином,. так как" это приводит к резкому сдвигу из- V-.;;. менчивости в. сторон/ образования неактивных вариантов',; обла-V, : дающих неустойчивыми лизогенными свойствами. ; ■■■ ■

Б.'Обработка штамма 11-67: : : ■-'■■.'-"-

- > „ Ступенчатая обработка штамма 11-67; проводилась нами'в . - V целях снижения средаелетальной концентрации спор и; кристал-•. лов этого штамма для'биологического1, тест-объекта. Отдельные ■г "■■У7варианты, полученные посдекомбинированной обработки мутаге-- ■. нами закладывались на длительное хранение и испытывали» ■■.через б н!12 месяцев. -'.: ./■^К'"-.'- ; : -'.."V. ; '„, '.После однократной обработки этиленимином штамма 11-67-. : • . /этап а,рис.1^£/ был выделен вариант 67-Э7. Его"среднеле-'• : ■ ; .1- тальная концентрация ^ для те^тобьекта составяяяа 32 млн/шг. . Варианты естественного рассева этого шт&мма давали • ■■ V : равное 52-^3"мля/мя. После вторичной обработки этиленими- : ■■'-.'-"*. ном /этап б,ряс.1-1/ были отобраны два,варианта: 67/2Э-5 и . .-..'• ..; . 6?/2Э~8Р Значения' сраднелетальных концентраций у этих вари- , \ . антов составляли соответственно 20,8 млн/ил и 18,2 (¿та/мл. •'.' ••• '■ ' Через 6 месяцев хранения в холодильнике на скошенном агаре

■ инсектицидная активность указанных вариантов не изменилась. ' г После хранения в течение12 м есяцев вирул ентно сть вариант а 67/2Э-5 снизилась до 46 млн/мл, а варианта 67/2Э-8 - до ; ■ / ! . ■'.'"■' 52,5' млн/мл, В пелях~восотаВовлёния утраченной вирулентное-^ . тимы провели Естественный, рассев этих вариантов, а затем : обработали жг пешщилЗгатцД этапн Г;И д, рис .1-Е/. После уха-'/' данных этапов обра&>ткиу- отдельных мутантов; варианта 67/2Э-5 -.• / 1^ант.202/-была доотш'нутаУсрёдв^етаиьная товцентрацйя,' /-у;.-равная 18 млц/мл. У штамма 67/23^8. такая обработка не приве-- '.-..• ла'к еннжешго изд. Поэтому этот штамм в.дальнейшем был об.. ■: ■ ; ~ " 19

работая эгиленямином в третий.раз, но с интервалом в.12 ые- ^V .сяцев /этап е, рис.1-$Л Обработка этиленимвном. после столь • ; длительного интервала во времена привела к тому, что у от-"'-; ' < дельных мутантов было достигнуто снижение среднёлетальной кон- ■ > центрации для тест-насекомого до 13-15 ихв/мл. Эти опыты по- • казала, что цутём комбинация таких обработок'можно быстро^вое-становить вирулентность у Лфоизводственнкх культур Вас.4' '■/:"

Б. Обработка штамма 37-68. - ■■

Вариант 37-Р4, полученный, врезультате обработки пени-цшеяином штамма 37-68, имелсредведетальную концентрацию у: тест-объекта 46 млн/мл. Этот вариант хранился в течение 12 месяцев. За указанный период хранения сто инсектицидная активность резко упала а значение увеличилось до 80 шш/ия«* ' Ш1 провели естественный рассев этой культуры /этап 6/', "а затем один из лучших вариантов, отобранных по признаку кристалл ;

*лообразования, обработали пенициллином /этап в, рис.1-В/. Вследствие этого, LC ^ для тест-объекта уменьшилась до . 58,5 млн/мл. Последняя обработка варианта 37/2Р-4 била проведена атиленимином. В результате примененной нами методики ' комбинированной обработки штамма 37-68 пенициллином » ети^'; " лениманом ерздделетальная; концентрация у ряда вариантов снизилась в 2 раза и достигла 20-25 ылн/шг." .

. 6Т Проверка в заводскихУсловиях экспериментальных штаммов. полученных путем еттпенчатой селекции. ■ :. ? • ■'■-.'j,

Экспериментальные варванты вггамма И-б?,?полученные путем ступенчатой обработки атшгеетмтом и nWnn¿jtbü!0M¿ были., -проверены заводской лабораторией селекции предприятия, выпускающего энтобактерин. Результаты этой'проверки показали,что 1 рекомендуемые нами штаммы в отличие от штаммов i ^получа&й« .. при естественном отборе, характержзовалиськюрфологической - . гомогенностью при рассеве на мясопептонном и;пептонном ara- ' -pax." Образуемые этими вариантами кристаллические включения отличались однородностью по форае и величине. Полученные v

- нами.экспериментальные штаммы по своим лизсгенным свойствам,' инсектицидности и продуктивности отвечали" требованиям,* предь-^ являемым^к производственным культурам. Инсектишцша;;"актив-ю ность экспериментальных штаммов, переданных для промышленно-. го производства энтобактерина, оказалась в. X, 25-1,5 ра:! с. выше по сравнению с исходным штаммом 11-й? и шт&\мо\:-о,гч'':о-г ном /таблица 6/. .■ Г : „.'.->''Л ■-' ; Л

; г: : • ;■"'.. ' -. ■•", "л- ■■ '"■■' ■;--'■' ' Таблица - С-"'-:>

.Оценка в заводских условиях экспериментальных штаммов Вас. •ЬЬиг1»в1»пя1в ..полученных путем ступенчатой : Ю *

.Название '' варианта ! Титр спор в куль-, • туральной жидко-. СТИ /ШГРД/МЛ / ' Репродукция вирулентного фага Инсектицидная 'активность4"''

/^мте/мл КА

Исходный. .1,78 :-..".' .. ОТСуТСТВ.> ■ 63,1 ■ 1.1

11-67

2ЭР-1 2,03 отсутств. • ■5Б;2 . .1,25

2Э?-100 ^. 1,92 отоутств. 44,6 1.5"

2ЭР-110 ,' - . -1,79 .. ;; отсутств. ' 43,5 '.- .1.59

2ЭР-120 > ■-:■ 1,88 отсутств. ' 44,61: - 1.5.

Эталон 69-3 "7" - - л. 1,85' .■: отсутств. ; 69,2 . - 1,0.

>Таким образом, результаты - заводских испытаний показали, ] что'; рекомендуемые нами экспериментальные штаммы обладает вы- : , сокими -производственными показателями/ позволяющими исполь- - *. .зовать их для промышленного-производства энтобактерина-3. - :у

ВЫВОДЫ

.. ~1._В'результате наших-исследований установлено, что инду-:цированный мутагенез может успешно примешггься' в'селекции; производственных штаммов Вас. едиг1пв1«а«1я г. с*11*г1а*. -.2. Использование вирулентного бактериофага в качеств ему-., тагенного; фактора увеличивало в 1,5 раза выход шюс-ьариан- -тов у штамма 55-1. Частота мутантов, устойчивых:одновременно к фагаи 64 и 65 возрастала более, чем'в 20 раз по сравне-:.~

нив ^естественной изменчивостью исходного штамма.

Умеренный бактериофаг является более специфичным мутагенным фактором. Он индуцирует появление мутантов, устойчивых . только.к фагу'64, не вызывая изменчивости других признаков.ис ходкого штамма 64-10. • ■ ■ ' -.■■.■'--■,

',"■-- 3, Характер возникновения фагоустойчивых мутантов при взаимодействии культуры-хозяина с умеренным и вирулентным бактериофагами различен. В первом случае имеет место лизогенизация .обрабатываемой культуры. При обработке вирулентным фагом.про-исходит образование комплекса фаг-клетка, относительно устойчивого в лабораторных экспериментах, но нестабильного в условиях производства. ■ . V " ■ - "-'

- 4. Установлена высокая эффективность этиленимина при ис- -пользовании его в качестве мутагена в селекции Вас. гь. г.. еа11*г1ве .Обработка этиленимином в концентрации 0,1? при "экспозиции 15 мин. увеличивает влход плюй-вариантов по при- -знаку вирулентности в 2,5-3 раза по сравнению с естественным рассевом исходной культуры.

5, Определение значений среднелетальных концентраций'для; ■ биологического тест-объекта среди пляс-вариантов, индуцированных этиленимином, и плюс-вариантов,[полученных в естест- • венном рассеве, показало, что у индуцированных вариантов Л 1X3^ в 1,5-2 раза ниже, чем у контрольных вариантов. * V 6. Индуцирующее действие этиленимина на активность профа-га оказалось различным для трех исследованных нами штаммов /ХС-1, 11-67 и 37-68/, что свидетельствует о зависимости му-тагеннаго эффекта этилинимина.от генотипа бактериального ттамма, используемого для обработки.

; 7. Предложенный нами метод предварительного отбора виру- - . лентных штаммов, на селективной среде, содержащей пенициллин в количестве 1000 ед/мл, позволяет увеличить эффектив- ..; ность отбора высокоактивных вариантов у "диких" штаммов.Вас. ЧЬ. у. ка11ег1ав в 5-6 раз по сравнению о обычно применяемым рассевом на МПА«-

8. Применение ступенчатой селекции для штаммов Вас.V.

, увеличивает продуктивность исходного штам- ■ ма в 1,5 раза, а инсектицидную активность в 1,5-2 раза по сравнений с раздельным использованием этнлениыинц: и пенициллина V Предлагаемая нами схема ступенчатой селекции состоит из следующих этапов: ■ '

а. рассев исходного штамма на ША с пенициллином;

б. бценка полученных мутантов по кристаллообразованию, инсектицидной активности и лизагенным свойствам;, '

в. . обработка наиболее активного варианта этиленимином в , ■ концентрации 0,1% при экспозиции 15 мин. ; . . :

г.1 оценка мутантов, полученных на-этапе в по основным про- -изводственным показателям. ' ~ " . V

. 9, Из коллекции экспериментальных штаммов Вас; Чь. т. е*1 ' 1*г1а* , полученных путем ступенчатой селекции , заводом-изготовителем принято 4 наиболее активных штамма для ■ промышленного производства энтобактерина-3. У -рекомендованных нами культур продуктивность была в 1,2*1,5 раза, а инсектицидная активность в 1,5 раза выше по сравнению с исходным штаммом. : ^

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах

1. "Применение искуственного отбора дай получения фагоус- -тойчивых штаммов Вас. c»r«ue v.g»ii«ri»» ■ ." Труды Всесо- ' юзного научно-исследовательского института защиты расте- -" у-ний,1968. т.31, стр,380-384. /совместно с Н.Л.Зоткиной/. ' •

2. '"Повышение вирулентности и фагоустойчивооти штаммов .■;...' культуры Вас. tburingi*nei8 ,r.gaÍl«ri««yTeM применения мутагенов." Тезисы докладов совещания, по вопросам получения*, высокопродуктивных и фагоустойчивых культур энтомопатог ен- ! них бактерий /14-16 октября 1969 г. в Москве/ стр.33-33.

3.'"Мутагенное действие этиленимйна на энтомоцатогенвые-кулатуры из рода Вас. thuringi«nei* т.е»1г«г1а^. Воллетень ВИЗР, 1971, JÉI8T стр.44-48. *.•

; 4. "."Повышение вирулентности энтомопатогенвой культур« Вас,. tburiiiei«n«i* v.eeiieria« под действием мутагенных факторов" . Тезисы докладов Всесоюзной научно-техничесйой конфе-_ ренции /26-29 октября 1971 г.,Ленинград/ стр.69-71.

РТП тип .ВИР sax. ДО тир. £00 28.3.73

Бесплатно