Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция точного исключения транспозонов и ее использование в системе краткосрочных бактериальных тестов по выявлению потенциальной канцерогенности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Индукция точного исключения транспозонов и ее использование в системе краткосрочных бактериальных тестов по выявлению потенциальной канцерогенности"

российская академия медицинских наук

научно-исследовательский ордена трудового красного знамени институт эпидемиологии ii микробиологии имени почетного академика п. ф. гамалеи

На правах рукописи

мирская Елена Ефимовна

ИНДУКЦИЯ ТОЧНОГО ИСКЛЮЧЕНИЯ ТРАНСПОЗОНОВ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СИСТЕМЕ КРАТКОСРОЧНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТОВ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ КАИЦЕРОГЕПНОСТИ

03.00.07 — микробиология 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Научпо-исследовательском ордена Трудового Красного Затмени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. Г. СКАВРОНОКАЯ,

доктор медицинских иаук И. В. АНДРЕЕВА Официальные оппоненты:

Ведущая организация — Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова.

на заседании Специализированного совета К 001.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

доктор медицинских наук,

профессор В. С. ЖУРКОВ,

доктор биологических наук, профессор А. Ф. МОРОЗ

Защита состоится «...55ГТГ.»

Автореферат разослан «

...........1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е. И. КОПТЕЛОВА

. ': - з -

Актуальность проблемы'.

Последние годы привнесла в микробиологическую науку новое направление исследований, в котором бактериальные клетки попользуются в качестве.экспериментальных моделей. С их помощью выявляется способность агентов внешней среды повреждать клеточный генетический материал, т.е. осуществлять генотоксическоо действие. Развитие этого направления обусловлено острой необходимостью улучшения экологической ситуации, в частности изъятия нз окружающей человека' среды канцерогенных агентов.

Для выявления веществ,-которым может быть свойственна канцерогенная актявност^ооздан ряд краткосрочных тест-систем, с использованием различных биологических объектов, презде всего бактерий. Наибольшее признание полечил мутационный салылонел-лезныД тест Эйлса. В последее время, однако, были получены данные, сввдетельствугаие об определенном снижении корреляции между результата!® бактериальных мутационных испытаний и данниш долгосрочных испытаний на кавдерогенность на животных. Полагают, что это связано отчасти с тем, что в тесге Эймса регистрируются точковые мутации, тогда как есть много данных, позволяющих считать, что в процессе онкогенеза существенную роль могут играть и другие геномные перестройки ( транспозиции, полигенные . мутации, ракомбпнациошше события я т.п.). В конце 80-х годов в научных кругах бия поставлен вопрос о необходимости разработки новых краткосрочных систем испытания на генотоксичность и более совершенных относительно способности предсказывать канце-рогениость. Б числе направлений научного поиска одним из основных признан полек новых проявлений генотоксичности,. которые ямеюг сеов специфику я могут быть ис подсованы. при постановке

краткосрочных тестов. К числу процессов, связанных со структурными перестройкам! генома, относится процесс точного исключения мобильных генетических элементов - транспозонов. Наблюдавшаяся в отдельных исследованиях, проведенных Алешкиным (1984), Бакай и Фонштейном (1983), индукция точного исключения транспозонов (сокращенно - ТИТ) может рассматриваться как одно из проявлений геногоксического действия индуцирующих ТИТ агентов. Точное исключение транспозонов вызывает реверсии инсерциЬн-ных мутаций, частоты которых, как и реверсий точковых мутаций, поддаются четкому учету. Сказанное определяет актуальность проблемы , решение которой может способствовать дальнейшему совершенствованию системы краткосрочных испытаний агентов окружающей человека среды на генотоксичность и потенциальную кан-церогенность, направленных на охрану здоровья людей.

Цель нашего исследования состояла в выяснении целесообразности и условий использования индукции точного исключения транспозонов в качестве показателя генотоксичности и потенциальной канцерогенное™ агентов окружающей среды.

Задачи исследования:

1. Конструирование бактериальной системы, позволяющей производить одновременную оценку способностей индуцировать точновые мутации и точное исключение транспозонов.

2. Получение сведений о процессах, вовлеченных в точное исключение транспозонов, отличающихся своеобразием от процессов, вовлеченных в точковый мутагенез. В частности, изучение влияния на индукцию точного исключения Тп10 генов uauDC , nucAB

и lcxA , необходимых для БОБ -мутагенеза.

3. Сравнительное изучение индукции точковых мутаций и точного исключения TriiO иод влиянием агентов различного механизма

.действия и с разной степенью канцерогенной активности, •i, Анализ дашшх о целью оценки целесообразное™ испольаот-ния феномена точного лскльчендя транспоэона дал выявления по тенцианышх канцерогенов.

Научная ноаязиз. Ьсследоваиа во5мо;шосгь использования точного исключения тпанспозшга в качестве специфического показателя генотоксичности и потенциальной нанцерогенности. Сконструирован специальный штат, несущий транспозон ТпЮ в гене синтеза треонина, позволяющий регистрировать два типа точковнх мутаций я индукцию точного исключения транспозонов. Б работе установлено, что индукция точного исключения ТпЮ зависит от функции генов 1ахА и usuDC", что свидетельствует о БОБ -зависимости этого процесса. Ноказщш, но, в отличие от стимулирующего действия на uicaDC-зависимую индукцию точковых мутаций, щщзмидв pKMIQI подавляет эффект генов umuDC относительно индукции ТИТ. Обнаружено, что точное исключение Тп10 индуцируется только активными SOS -индукторам. Выявлено геиоток-сическое действие экстрактов из выбросов коксохимического произ водства, заключающееся в индукции точкового мутагенеза и ТИТ.

Практическая ценность полученных результатов заключается в том, что тест на индукцию точного исключения ТпЮ может служить в качестве дополнения к традиционному тесту на индукции точковнх мутаций i Это испытание характеризует специфику дей -ствия мутагенов, что является важным душ совершенствования систем краткосрочного выявления потенциальных канцерогенов. Перспективность сконструированного штамма AG 2?б ( позволяющего в одномоментных экспериментах выявлять индукцию двух типов точковнх мутаций и точного исключения ТпЮ, продемонстрирована'в ¡«¡следовании ряда физических и химических агентов.

Полученные данные позволяет рекомендовать итамм AG27& в качестве тест-итамыа, выявляющего мутагенное и sos -индуцирующее действие агентов, к использованию d экологической практике выявления генотокспческах веществ и потенциальных канцерогенов.

. Апробация работы. Основные результаты по теме диссертации была доложены на Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы ге-ногоксической .оценки и побочных эффектов биологически активных веществ" в г.Ленинграде в 198Э г.; на Конференции молодых уче-

I

них КИ/Ш им,Н.Ф.Гамалеи в 1991 г.

Диссертационная работа апробирована

16 марта 1992 года на научной конференции Отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НШЭМ шл.Н.Ф.Галилеи РАМН.

По теме диссертации опубликованы 3 научных, работы.

Объем работы. Настоящая работа состоит из введения, обзора литературы, методической части,- результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 141 странице машинописного текста, включая 29 таблиц и I рисунок. Список литературы включает 230 названий. ,

Материалы и методы

Штаммы бактерий. Использовали различные генетически маркированные птаммы Salmonella typhimiriuii И E.coli , раз-ллчающ'еся генетическими маркерами, содержанием шшзшгд. Часть штягп.'ов била сконструирована автором, часть получека из ore- • чесгионннх и зарубежных источников.

Среда. В качестве полноценных питательных сред еспользс-рплп бульон Леянокоа (L - бульон), агар Леннокса (0,6/í или 1,2;.-). В качестве минимальной среды использовали минимальную срегу Дзнгса и I,2> агар "Difco" с добавлением среды Acer,.

Химические репктиглкд-мьгил-нлтро-ди^зрзйгуанлдин (МШГ) флрми Aldriçh Cheaical Company , 4-;пггрсШ1Н1УШН~ К - оксид (4-нхо) - фирмы DaiicJii Рите Cheiaicalo Co.,Ltd, MM-метансульфонат Oí.iC), аминокислоты - фирмы "Serva" , метпл-ыетансульфонат ('МО) - фирш "Herck-Schuhardfc " , ICR-191-(Тирмы "Flu-а" , I-шггрогшрен и афдатоксин Bj - йрш "Signa", фурагин, цииюфосфаи - отечественные коммерческие шарм.препараты, препарат с И госрегистрацшг 012074 (ДДДТДП) получал от д-ра ЛЛ.Фонытейна, оовол - or д-ра Г.А.Еелицкого, бецз-(а)шрен (Б(а)П) и 7,12гдииетил0ензантрацен (7Д2-ДЖА) -фирмы "Serva" . Этйонин, метионин, ¿ - и уз-нафхнлаш-ш, бензидин ц 3,3',5 .ё'-тетрааетилОзнзидпн, 2-аце1\шаш1шсмуорен (2-ААф) и 4-ААФ, шрен - фирмы ICI , Б -нитрозо - N -ме-тилмочевина (ЕМ) синтезирована в НИИ химфизики. Растворители: диметлсульфоксид (ДШО) Ошр.ш "Serva",. ¡этиловый спирт, дисг. вола, оливковое масло.

Трансакцию и конъюгацию проведали по стандартным методикам, описанным Дг.,Миллер ом ( 1972 ).

Иноерционнцй мутагенез осуществляли по методу Еотстешга (1980).

Индукция точкоэнх мутаций и точного искдючения транспо-зо'нов. УФ-ойлученюо подвергали нзвесь бактерий при постоянном перемешивании. Для определения жизнеспособности метки высевали на полноценные среды. Селекцию мутантов производили на минимальной среде, оодеркащей 0,7 мкг/ш гистидина или аргшшна (1,4 мкг/ш -.треонина). Химический мутагенез в жидкой среде осуществляли по методу, описянному Миллером (1972). Обработку darrepm'} непрямыми мутагенами проводили без пред-

- Б

инкубации по методу Amsc (1975) и о прединкубацяей - по методу ïahagi (1577), Достоверность полученных результатов обеспечивалась проведением каядого эксперимента не менее чем в трех повторностях, с использованием не менее трех чаоек для ¡МИШИ дозы.

I» Конструирование mais», позволяющего выявлять индукцию мутагенного эффекта а точного искдачешш TnIO •

Для проведения настоящей работы наш был сконструирован штамм, названный AG 2?'б . Схема получения данного штамма представлена на рис. I.

Результат» и обсуждение '

5А1535

илшТХ)" hia G46 bio-gai ubrB rfa

AG262

I

JP22 lnt" ■ транодокцяя

TA1535 thn iTnlO

AG276

unuJJC+' hisG46 uvr rfa arg-2 thruTnlO

F'.'c. I. Схема получения тесхерного штамма AG276.

" 'Э -

В качвсгйь ¿сходного i8T«.\5iü дяя вшшч&ш. Inlci öim uotio-it-зовш! ооздашцй ранее 2:таш AG262 > црвдот««шш:;цй соОий гибрид И.coli И S. typhi muri uro . liliMJ AG2t>2 П0С6Т МУТШЦМ uvr , rfu , иутшцда типа зимен» лар основании binG-'iö , ¿реш-¡:;П';Г!'Г—г.тутаида arg-2 и гены ишаЬС шыечлоЛ шлочкл. IUau-пие в составе гибридного атс>ша AG262 генов шаиЕС в,coli обуславливало четко ьцра^нкый мутагенез, при дейсгаых na rtsro ДЖ-поЕрекдазощзх scs-агентов.

Включение в гении шгаша AS262 транспозока ТпЮ обеспечило возможиоогь одномоментной ецешш &.Ъикт mv-jw* '-'ичко-вого иут+гиеза и точного шюшчешш ТпЮ поп дсЬдокш иодаого

S08 -индуктора - УФ-света- ч различных хшалвсих: «геи-гои. Это было. мЕно гак для исследований но нпявлеишо спещлЬикн про цесса индукции Tili, таг', и дая сравнения действия агентов бг'цо-сительно индукции точкових мутаций и точного исглючипт ТпЮ.

Проведенные па:лп гкопедшсято но сопоставлению процессов, задействовали»« в -гсчкрвон мутагенезе и ТИТ, kj сшшсь участия в mix генов umuDC ц их цлазыидных аналогов - генов юисАВ Для выяснения роли генов umuDC и ^ндукцпп точного псклдчашш TiiXO необходимо быяо создать пару ахяшов, различавшихся но состоят™ шаиВО генов, Сальмонеллы, как известно, пенсе чувствительны к дейстшю 80S -индукторов ( Bkavronakaya et ai, I&82; Sedgwick ц Goodwin , 1385), что связывают со сгрук-гурни-йункщюналгны^лч оглачняш еэ иаи генов, назгаиьнх Tonacci.i п Сбдхшп:о..1 ШОУ) генами шдаБТ , floатому первоначально ТпЮ бнл гклочен наш о опльмопеллезинй mram гисгеш Эпнса TAI535 lunuST с помощью векторного алга ¡TnlO, полученного по naeuyj Ълоiuilun, цуш1 цлноиош&р, Среди ыи/чеичи;:

TcR клопов йип охобршш лля даяыюйгзс исследований мутанты, зависшие от грнпгоГчиа, пурина, цпстепна я грсошша* ílx ипсер-шшшия и:н;рида была подтверждена трансдухаыоншм анализом. При ойлучишш УФ-светом из чегнрех ауксотроучш: мутантов был отобран треешт-зашсголый, который прп облучении оптимальной для танкового мутагенеза дозой 1,5 Дк/м2 давал максимальную частоту точного исключения ТпЮ, Этот штаг.®, названный AG271- или ВТ this «Тп1 Q-служил донором в траисдугада ТпЮ в гибридный шта-лтл AG262 uauSO+ . Траподукцня' осуществлялась с помощью мутант-ного itera P2Z int~no.Davie ( 198O ), что позволило избегать ллзоготэагош получаемого гаакга. Этот шташ, иазвашшй AG276, неоущкб, как и шаш AG271 , ТнЮ в гене синтеза треонина, являлся,в отличие от него. umuDC+. Наличие пары иташов, различающиеся rio umuDC генам,позволило изучить влияние генов шпиосна индукцию точного исключения ГиЮ при действия УФ-света и некоторых химпчеслдх агентов. Вместе с тем, получешю штата AG276, несущего две гочковых мутации различной природы (замены пар оснований и сдчмга рпкки считывания) и пнсерцнонную мутацию в thx-гене,позволило использовать его для оценки возможности непользовать пидукшв ТНГ в качестве показа геля геиогокепчноога ио-шп'гспгпс £генг0б л для ерпьления 8л5бктивности испытаний на ии-дугоуш ro'íKO!««: ыугахпй ч ТПТ в целях выявления геногохеичко-сти г; ИОГCíIGсильной кл.'гцсрогенностк.

¡isr.ee пю, что с лссле/.оъ'аицях но определению мутагенности но о^'-зк-онелк-ч:; ».чроко псиользусгоя шазшда pKI.II 01, ксоушя

кис AS - ;;погп гршдежннх генвв ueuCC , Что о б су лав— лП'1; о? с.с^бгооть ге^ 1зь"гь точкошЗ мутагена з ( Kafco,1977). Т- •■■ • tío ' *'.я ■"ч'-л/шя рЮС1 пп ;и!душ»:;з Г£!Т, en'! сила ík-i':' п 4 AG 276,

П, Зпкопнпь^прог:!. x.'ii>f;KPtfp.)3yyj!iaiO пи.чупгшд г о 41 íopii пс.клччыпш гранспозопов

jU.ii исследошшш згисоначс-ртюоп ii, rjip.iKít [шз.-и-лЮ. спонтанное и :iii.:i.yii;ijOKiUiiOü точное ТпЮ, 11 иопгк;lwrueiu-.;] их с 3!» сиоиернсстш генодичоской рл'уляиь. точконоги i¿г, низа, в часгнсег!!, влияния гопои unn'tíc и таз».*;.до "ILuOl на oúa ü-íííx процесса, muai Сила црот-дсна при: .не bcuj'o с. экспериментов с оСл.уч-Hiitoj nic0iic'ivy;:püi;;iüiin.: na..;U чки.пз i.m.,.¡-ВирОПЛЬНиМ SOS --;ШДУК1'0рСП - УФ-СЪсММ.

Как вздно из гаСд.1, состояние jciiob u«uuî m, 1"i:.;ú,í' h;í количество СТЮИ-ГШШЫ:; г'ОЧКОГШ': ..:.yí:!l::;4 i:<;K В ucciDU.i.:' Í . !1 i.¡nx, так к в MTO.ii:ix, соледа!Ги:; (ЛСЛ01.

I

Влияние генов ишЬС и нлазимНИ pKLIOl на точигидм путагеиез а сочное ьсюшчсиае ггхйшеиоаонг: Тп 10

■[50г,„ :_Ч;.сло pu.^-./rnirrnn / ча'Г.г; и чг;.._____

.------------------

УФ :_- pM.JQI ■ :___±_1Ы\111____

(ДгУг.!2): AG271 : А(*?/о ш:и1Х)4 : AG271 ; Лй^-'.'О aí-иаЛ'"1

.Hiüí 1'hrt líisT ;ííie+: l'iirf: Hiíj+ ; + : «n: : TiU'

0 14 4 18 3 4 '¿iL 5 j r-(

0 22 - 24 с 4J 5'JLi - 1377 ■¿Oí) G.)

I ') J o í 203 '¿■i loi 40 - - üj

I, ,!5 G'3 ao 14 140 1A£> 44 4 4 Ï

2 17 lo ill Iii Í" I-i'iu 4!j 'a ¿Ó .v>

4 3 [8 J 1<Д7 /, » í

:ТpKil'QI пкксе из влияла па чистоту спонтанных ре-игро;-г, вознкклтапс ч результате точного исключения ГпЮ, что существенно оглпчаог последнее от точкового мутагенеза. Следует отиогить; что эти подученные наш дяшше об отсутствии ВЛИ-wnn uiasMunt: па спонтанное точиле искяячвнпе ГпЮ ог-личаыоя г*г 'vim¡их, полученных Впишет (IS66), наблцдавига: увеличение •-•чсгогы pvr.epcaS нноерциошшх ыугпцкЯ щш наличии илазшди.Это ряс.:о~д"н:к: ыо«ет быть оказано с различней исследованных систем '' поол.'ок транспозона.

¿ссдздоишяя по УОн.илугаиш показали, что кинетика индукция ТУТ совпадает с кинетикой точкового мутагенеза. В UrauSTбактериях ( ¡вгадме AG271 ) УФ-пвдукцпгя слабо выражена, тогда как в и .nuic+бактериях она значительно выше.

Етболее интересные, данные получены при облучении бактерий, несушнх шазьшду pKi.lIOI. В отличие от точкового мутагенеза, «л.*1?ь»!да не повышает УФ-шодкцпо ТОТ. Более того, в UnuDC+ бак-гср:№ пгкзутегюе пя а гадин pKMIOl снимает эффект генов umuDC. Это р корне отличает процесс индукции Till от шщукцки точковш; !,n'tat'7)l, Создается впечатление, что в случае точного исключения ТпГ") на Л»гу деется Ш1тер»еренд«я иеяцу процессами, детерминируете тт>л итаю пдазмндой рШ01,

Ans ^кясиешш вопроса, связрло ли такое влияние пзаэмпды с пмтаг иисАВ , апя®зи!».а1 на гочковвй муглгенеэ, был нспользо-глн Walker (1978) гугант вдвзмплы pKMIOl - pG»12-

v г. ; rucifH l- ®ис опер one, которая льтает эту те зайду способ-

:;о. vv гз- тмком/.i ï.iyr.'u енез. Из tî; б л . 2 зкдао, что эха v-t'S' рдг. не уп;>я|п;«|5РГ 1Ш,г/шп; точковых аикМ К his-неза-j, г,- ,,;:,...ЛРГ Г}г»ут!я) л иииТС* бактериях. гто~ с- ■ тп г';;.'tv гочного :'сг\?л;ш:л inio плп?"л;'0:'?

j

pKLHOI nonio огя-гсги за счет активности генов oucA i.'

Т;:бллця' 2

Злиянче пллсгпд pK.ÍÍOI п pG7.'12 но сншггяптп! л УФ-яндудаловянтеИ точхсорыЛ мутагенез ч точное ясглюче»«;е ТпЮ в UmuDC4 ¡yrafj.ias

Доза УФ : (Дж/к2) : Число рс5в;отантов/ча1,,ку в шмигог

AG276 ; AG276/pKM101 • j AG276/pGW12.

Hio* : Thr^ : His+ ; Thr4" : His+:* Thr+

0 16 4 101 6 13 6

0,5 21(50) я 26 ÍIC0(55) 13 I9(Go) 42

1,5 106(58) III 3210(71) 25 186(42) 112

2,5 73(9) 102 29€3(Г,1) 27 121(4) 72

4,0 47(0,5) 51 1740(22) 8 20(0,2) 25

а В cnoöitax - '1 тйгцпгглх клеток.

Загнслшсть индукции точного псключеяля ТпЮ ог гепоз uauIG , абсолютно необходимых ;гля гндукщш мутацн:;, об.услов-легких SOS -с:;сте?.гои регуляции в б.~ктер:тльно!! кчетке доставляя вопрос об учястпп этой слстег.к в Т1ГГ. Кчочегали гегпш БОБ-слстеин ЯВЛЯЮТСЯ гены 1ехА и recA ( Walker ,1984), 1,71а-

• Ш1 в которых лишают клетку всех воз —-¡рдушбелгше: ^"Hriui:"'. ТпЮ, встроенкк". з ген спитезз цисгетш, Сел погидг.г и Б.coli зеигз к перенесен с пяпешь» тронедугллш в rsowtwJí L^xA r-v -ТГ'ПТ KP 195 • На р'то. 2 npc.-'cnnlem» ,»,!»:'ш-ч; по -к'У^:"- 1!-ГГ я L°-'A+ г LexA" (Запсргях при .те/lcrr*'"'. OOS -!:»»,t:?::r<v;cn -

у-;-, rv >гл г! г:,гр',?0"!:р"1л1'0"-".?г,г7 (Н?г;). Яз '.wc. г" -40, "10 *!<••

tí. coli lexfc* U EiMíiO ifcxál

IIpII .HüilUTbíJI yjM)l¡cta ( ï ) и EIÎ1 pOSOCfetlU-

г.шчевгиш ( ¿ )

агента индуцировали TiîT в miiise дикого тшет, но не }» ЪсзсАЧ мутанте . Тлглы образом, била уоганогоюрч лбе плюша и зчвкслпоот* точного киклвчешя Тni0 от SOS-сггогош регуляции в Пактериялг— но»! клетке.

Ш. Характеристика ;птаг.^гла AG27er.ait объекта для . . выявления генотокспчсского действия хгшчоептх соедднонн"

В исследованиях по оценке возможности использования теста на индукцкю точно*) исключения транспозонов для вмчглс-нпя ге-нотоксичносги химических соединении ш сравнили данные, полученные с использованием сконструированной нами системы,с данными по индукции точкопых мутаций. Всего нами были нспыт-'ш.чнц 23 химических вещества, среди которых были полученные из Центральной токсикологической лаборатории фиг^н ICI (Великобритания) известные канцерогены, а таете соединения, у.которых канцерогенная активность отсутствует пли не является доказанной. В результате экспериментов, проведенных на птамме AG276, определялась способность соединений индуцировать 2 типа точковых кутащш н-.ТЬТ. На основании ваалпза полученных данных вещества были подразделены на 4 группы ( си.табл.3).

В I группу вошли вещества, способные индуцпровугь как гочковые мутация, так и точное исключение ТпГО. Все ошх кэврсш» как сильные канцерогены и ыутагелы ( МсСагш ,1375; Вг

1081 ). Дозовне кривые показали, что "кинетика ппдупш Т!ГГ и точкового мутагенеза, вызываемой вег.ествгнлп зг°.и х-рупич, совпадали, уотя количественном отношении индук;"'"! ::*•;"?г>нгу:т 7пЮ была ji!:p:h::cm слабес, д'пуи1:""! Г'1ч:;;-;->':г ч,-'И;-'-гьг/оппс числа огнлрпгао? гад ерпнлсьн: г ■"<!■::•": ■> •.■ ч ; i'"

по плл-^н.лос^ д:!:т .а^стзин р-i с := г;т ■ г1 г: со:-. "■ ■ - у

И'Ч-О I, ДЛИ jCif.'U к .'■?) ■ • .....: " '

Таблица 3

Результата исштшля химических соединении на ыутагеиновгь и индувдш точного исключения TnIO б s.typhiiauriuaAG275

Испытуемое сое _ Число реьер'гантов/ : Данные лругях тестов

дмнение (дозы) 1ашку ■ : SOS- : Тест :Канцеро-

: АГ£+ : Hi s+ Э»ллса ; ген-'иость

i : 3 : 4 : 5 : 6 7

Группа I

I. 4-Ю.О (ыкг/мл) 0 2 8 83 5 98 20 555 + +

1.ШС Ср) 0" 4 6 12 + + +

о, 06 24 9 81

3". 3ivi0 {%) 0 I 5 34 3 29 9 2300 + +

4. fC.lvi (мкг/чашну^ О 00 3 118 4 ¿5 15 4000 + +

5. 'iypama ■ Ожг/ил) 0 1 4 146 62 18 270 нет дшшшс + нет данных

6. КНИГ (мкг/чашку) 0 10 4 42 5 40 12 10500 + + +

?. ICR-191 (акг/чашеу).^ 0 ,5 3 32 3 171 15 18 + + неопред.

Ь, Б(а)Н . (ыкг/чаьку) 0 10 3 19 5 30 20 24 + + +

у. 1-нлтрош-рен(мкг/ч.) 0 X 4 21 1 i'200 9 10 + + +

• (мкг/чашку) 0 10 2 25 4 65Ь 13 15 + t- +

п.даш (мкг/ш) 0 10 4 76 5 П96 20 1У lit'T данныг + нет " даняих

12.Асцлатск- 0 3 3 9 + + +

•син Иг п гс-.(ыкгД.) °'15 16 21 10

Таблица 3 (про,ноля.)

Группа П

1. Бензцдин О (ыкг/чавк£дооо

2. 2-Ш О (м1сг/чашз:у)100

8. Й-нафгкл- О шдш(мкг*/ч.^д

4. Азид натрия О (икг/чаишу) 5

5. ЦиклоФосго- О .

Группа 111

1.3,3^5,5-тег-

рамегыбензи-О дда (ккг/ч.)2(Х)0 2

2. «¿-иафтал- О

. амии(мжг/ч.)цд

3. 4-ААФ (шаг/ч.)

4. Метионин (мкг/ч.)

5. Эгиошк (мкг/ч.)

о

50 О

250

О 5

Груша 1У

I. Шгоен О

(мкг/ч.) 25

т 2 8 - + +

2 I 7

3 5 9 + + +

4 3 12 (слабый )

4 5 8 + + ' +

9 40 80 (слабый) -

2 2 13 - + неопред.

2 2 ПОО

5 2 15 - + +

3 2 811

2 2 II нет донных

2 I В • _-

4 3 12 + + огранич.

3 I 10 (слабый) (слабый)данные

2 2 12 нет данных + ч .

3 I 12 (слабый)

I 6 В - -

2 9 II

6 6 16 - - +

8 4 23

4 5 '..12 + неопред. неопред.

14 9 • -14

I

2

3

6

- Iö -

и О'рашад.

ßeiiiuCfDa, imiiceimue nauu ко II группе, не индударовали •í04:ioro !:сьушч01шя 'íxil'O, и'о ьызиьаш гащукцию точковых ыута-iilíí на iufsc.:e AG276 (озыд натрия, цшио^юсЛашд, ^-ыайтил-ашя), либо на имиие Эймса LWS (беьзадан и 2-ААФ).

Вещества, отнесенные к LI группе, не иадущрозалл'ни Ж, ни гочкового мутагенеза (некоторые из них являются крайне слабыми мутагенами). ^

Одно из испыганшх наш веществ - шзрен - мы не сочли возившим отиесгк к какой-либо из перечислениях групп. В наших исследованиях пцрен не оказывал мутагенного деЛсгвдя на штамм . AG276 ; в опытах со штаммом ТАЭь наш было выявлено очень слабое мутагенное деиегше гшрена, что совпадает с данными "iti-dagevic; и Zeigar ( 1985 ). Однако рядом других исследователей пирен признан не-иута геном ( McCarm , 1975) . Б нашх опытах при Чрезвычайно иизком мутагенном дойс-шш гшрена отмечена достаточно выраженная и воспроизводимая индукция ТИТ.

Вопрос о корреляции способности агентов вызывать ТИТ и ¡п: канцерогенной' активноегн требует дальнейших исследований. В настоящий момеял мошо .лишь отметить, что вещества, индуцирующее iai- точког'ый мутагенез, так и Ш , являйся кьнцеро-гемш для иботных. Зсо явучекизе идам вещества, не являющиеся какцерогенадц, практически не индуцирую® ли точковых ыута-ijiü, ы; ТИТ.

Применительно к исдальзовшю о«номспл индукции Ш для ьзяалешш геногоксических агентов ..засдутшзавг шлирпия следующая закономерность. Вещества, отпесощше нала к I группе, т,е. вызывайте индукцию кис точрових ыутаццД, гак tt T-i'í, являются ак-л.-впш.'л sos -иоду кадрами. Вещее газ, охш?с«юше ки П труп-

по, т.е. шщуцпрувние точкозкс муттщп, но не Т1ГГ, п!бо не индуцируют sos -систем?, либо являются очень слайяш sos -индукторами, мк например, 2-ААФ и ^-на^тилашн ( quillar-det ot al.,l982;Oda ot al., 1985¡ ven der Hude et al.,1488).

Вещества, относящиеся к Ш группе, не индуцирующие цл точ-ковых мутащп, mi T¡ü', не являются sos -индукторягп ntf даннп SOS -хромогеста . Пнрен по данным этого теста, яалястся SOS-индуктором. Таким образом, способность агентов индуцировать ТТГГ коррелирует .о их БОЗ-индуцпрующеЯ способностью. Это 'itoä'ct объясняться пншеприведешьп.эд данными, свздегсльсхвуюппмв о- топ» , что в точном исключении ТпЮ задеПствованн sos -пндуцнруеные процессы. Мутации не, как известно, возникают как под влиянием SOS -индукторов, так и при деиегвшт веществ, не обладающих способностью к SOS -индукции. В соответствия с этим, иутацпонпйм тестом выявляется более широкий круг геноток-сическнх соединений по сравнению с тестом на индукцию-точного исключения ТпЮ. Вместе с тем, одномоментное испнтанис агентов относительно TiíT и точкового мутагенеза имеет определенные пре-дмущества. Оно дает дополнительные сведения об испытуемых веществах, в частности, касающиеся механизм их try та гони ого действия, связанного или независимого от sos -шудукщш. Это обстоятельство имеет определенное значение, т.к. вияененче пеп- , бенностей механизмов действия мутагенов в сопоставлении с их канцерогенной активностью является одним из путей создания макенпальио элективных и прогностически пенных краткосрочных систем доя выявления генотокепчних ганперогенов(Ashby ,IS£g).

Псгшгание чистых хпшчеенпх соедине«»!/*, a ipizx emm-;; ouecett относительно додегам Т.ГГ г.озят пг;эвг\«п7>сл ojkcuwk-pí ко о ксп»тага-э;л на г-а^ттт. точкяяга iúví-ц:. П: :—«t¡0"' етог-

слушг, 1ЮУ.ШО проводеглого наш: ислитыиш 23 хишчееких агентов, исследование на гшо¡окоичносгь экстрактов из шбросов кокоохииического производства, содершц-ис во дшшш йязнко-зш-шчуского анализа, ряд канцерогенных углеводородов. Выявленная в &KI.4 исследованиях индукция как гочкови:! мутапий, гак и 'i'IiT, указывает на возможность успешного использования сконструированной сисге.л! в практике оценки загрязнения окружающей среди генотоксцчесшадц агеигаши

ВЫВОДЫ

1. Индуюш точного исключения Тп10 является боз- регулируемым процессом, свидетельством чего слугшт его зависимость от функция генов umuDC и 1охл .

2. Иядукщш точного исключения Тц10 вызывается менее широким кругом геногоксичеокизс агентов по сравнению с тгесгоы на индукцию точковых мутаций: реверсии ансерционных мутаций, связанные о точным исключением ГпЮ, вызываются только активными sos -индукторами.

Процесс индукции точного исключения Гп10 им,еет свою специфику:.в отличие от симулирующего действия на идщБС-зд-шоимую индукцию точковых мутаций, , плазмада pKMIOI подавляет аффект генов umuDC относительно индукции точного исключения ТпЮ, .

• 4. Испытание агентов относительно индукции точного исключения TnlO, дополняющее мутационный тест, характеризует особенности действия мутагенов как sos -индукторов, что являе?-оя существенным для совершенствования систем краткосрочного выявления геногаксичннх канцерогенов,

5. Сконструированный штамм AG276 , позволяющий, в одномоментных экспериментах выявлять индукцию точковых мутаций и точное исключение TnIO, может быть рекомендован как тест-штамм, определяющий мутагенное и sos -индуцирующее действие агентов.

СПИСОК ' '

опубликованных по теме диссертации работ

1. Aodreeva I.V., Rusina O.ïu., Mirskoya E.E., Bkavjron-okaya A.G. The effect of plaemid pKM101 on umuDC gene func- .• tion enhancing preciBe excision of transposons // Mutatioa йевеагсЬ. - 1990. - V.230,Ho.1. - P. 55-60.

2. Русина О.Ю., Мирская E.E., Андреева И .В. Система краткосрочного тестирования генотоксических агентов, основанная на индукция точного исключения гранспвзонов // Всес.симп. "Объем и методы- генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ". Тез. докладов. -Л. - 1989". -

С. 84-85.

3. Борисенко А.Е., Мирская Е.Е., Боряоенко Е.Г. Изменение мутагенной активности среды, содержащей айлатоксин Bp в результате жизнедеятельности дрожкей // Гигиена и санитария. -1990. - J5 12. - G. 45-47.

/У