Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль"

, <0 л \

Нл правах рукописи

РОМАНОВА Юлия Михайловна

НЕКУЛЬТИВИРУЕМОЕ СОСТОЯНИЕ У ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ

SALMONELLA TYPHIMURIUM: ФЕНОМЕН И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

Специальности: 03.00.07 — Микробиология.

03.00.15 — Генетика.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1997

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Гинцбург А. Л.

Официальные оппоненты: академик РАМН, профессор Скавроиская А. Г. доктор медицинских наук, профессор Быков А. С. доктор биологических наук, профессор Каменева С. В.

Ведущая организация —

Российский научно-исследовательский институт «МИКРОБ» Госкомитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ

Зашита состоится « ^^'» 1997 года

в //часов на заседании Диссертационного Совета Д 00к07.01. в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем медицинской микробиологии является проблема сохранения патогенных бактерий в окружающей среде. Теперь уже не вызывает сомнения, что многие патогенные бактерии способны размножаться не только п организме хозяина, но и в объектах внешней среды, а именно, п почве, воде, на растительных субстратах. (Сомов, Литвин 1988). 15 ходе эволюции у бактерий вырабатывались генетические системы, позволяющие им координирование перестраивать работу клетки для адаптации к условиям существования, качественно различающимся не отдельными субстратами, а всем комплексом биотических и абиотических факторов. Для спорообразующих бактерий уже в течение 40 лет известно, что резкое ограничение питательных веществ в среде обитания приводит к тому, что такие бактерии способны формировать покоящиеся формы - споры или цисты, способствующие сохранению бактерий в течение длительного времени до наступления благоприятных для размножения условий. Формирование спор - процесс перестройки бактериальной клетки, подверженный сложному генетическому контролю (Ыапуоос! 1989). В последние несколько лет обнаружено, что и грамотрицательные бактерии, в том числе возбудители многих массовых заболеваний людей, также способны к длительному переживанию неблагоприятных условий внешней среды в виде вегетативных клеток со значительно сниженной метаболической активностью и не обнаруживаемых традиционными методами лабораторного культивирования. Состояние бактерий, при котором они, оставаясь живыми, теряют способность к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста и размножения н соответствующих питательных средах, получило название "пекультивируемого" (НС) (Со1\\е11 1985). Бактерии, находящиеся в

некультивируемом состоянии называются "некультивируемыми формами" (НФ). Способность патогенных бактерий к переходу в НС имеет большое медицинское и эпидемиологическое значение, так как обеспечивает им возможность длительного существования во внешней среде вне организма хозяина при сохранении своего патогенного потенциала. Эндемичность

I

природных очагов многих сапронозных инфекций может зависеть от способности их возбудителей существовать в НС (Четина и др. 1992, 1993). В последнее время наблюдается значительное возрастание интереса к исследованию некультивируемого состояния и количество видов бактерий, для которых обнаруживается способность к формированию НФ, постоянно растет. Однако данные о молекулярно-генетических механизмах 'лого явления практически отсутствуют. Медицинское и эпидемиологическое значение феномена способности бактерий к переходу в НС послужило основанием для разработки принципиально нового направления исследования, связанного с пониманием природы адаптационной изменчивости, позволяющей патогенным бактериям сохраняться в объектах внешней среды. Таким направлением является выяснение молекулярно-генетических механизмов формирования НС у грамотрнцательных патогенных бактерий.

Цель работы - исследование феномена перехода в некультивируемое состояние у патогенных бактерий и идентификация генетической регуляторной системы, обеспечивающей этот процесс.

Модельным объектом для выполнения исследования выбраны бактерии Salmonella typhimurium, поскольку они являются типичными представителями патогенных бактерий, длительно существующих в окружающей среде, и при работе с ними возможно применение всех современных микробиологических и молекулярно-генетических методов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

о разработать по.хходы ц методы, позволяющие выявлять способность клеток

Salmonella typhimurium к переходу п некультивируемое состояние,

• изучить влияние различных факторов внешней среды и фазы роста культуры на динамику процесса перехода клеток сальмонелл в некультивируемое состояние,

• рачработать лабораторную модель для индукции некультивируемого состояния у сальмонелл,

• изучить участие в генетическом контроле механизма образования некультипируемых форм некоторых известных генов, контролирующих клеточные функции жизнеобеспечения,

• получить коллекцию мутантов с различными параметрами процесса образования некулынвируемых форм,

• идентифицировать гены, мутации в которых привели к изменениям параметров процесса образования некультипируемых форм,

• изучить экспрессию идентифицированных генов, участвующих в контроле образования некультипируемых форм в процессе перехода клеток в НС,

• изучить ультраструктуру клеток сальмонелл п некультивируемом состоянии

Научная повита работы.

а впервые показана способность бактерий Salmonella typhimurium к переходу в некультивируемое состояние,

и изучение влияния различных факторов среды и физиологического состояния бактериальной культуры на динамику процесса перехода в НС позволило разработать лабораторную модель индукции некультивируемого состояния у

патогенных бактерий с целью проведения генетических исследований и управления параметрами процесса перехода в НС,

■ впервые проведено системное исследование, показавшее, что процесс перехода в НС подвержен генетическому контролю,

■ впервые получена коллекция мутантов с измененными параметрами процесса перехода в НС,

■ впервые идентифицированы гены, участвующие в контроле механизма перехода в НС,

■ впервые показано взаимодействие генетических систем, контролирующих процесс индукции НС и активации генов пагогенности, так как один из идентифицированных генов входит в состав оперона, индуцирующегося в клетках сальмонелл на ранних стадиях инфекции,

■ выявлены аналогии в участии идентичных генов как в процессе спорообразования у бацилл, так и в процессе образования НФ у сальмонелл, что расширяет наши представления об эволюции бактерий,

■ впервые разработан методический подход для изучения активности генов в процессе перехода н существовании в НС

Практическая значимость работы.

■ Решение комплекса поставленных в работе задач направлено на выявление факторов внешней среды, вызывающих индукцию некульти воруемого состояния, и прогнозирование как временного анабиоза, так и активации патогенных бактерии во внешней среде. Возможность существования бактерий в НС должна учитываться микробиологами и эпидемиологами для решения актуальной задачи - эпидемиологического мониторинга за патогенными бактериями в объектах внешней среды до того, как они проникнут в чувствительную популяцию и вызовут заболевание.

п Разработанные п ходе выполнения исследования амплификационные тест-системы па оснопе ГИДР целесообразно использовать для идентификации сальмонелл как в целях медицинской диагностики, так и для выявления сальмонелл и их НФ в объектах окружающей среды и продуктах питания.

н Созданные в процессе работы аттенуированные штаммы сальмонелл рекомендованы для использования в качестве вакцинных при иммунизации сельско-хозяйственных животных. Один из полученных штаммов депонирован в ВГНКИ ветеринарных препаратов и защитен авторским свидетельством.

Аппрабация работы. Аппробация диссертации состоялась 23 декабря 1996 года на конференции отдела Генетики и Молекулярной биологии НИИЭМ им.II.Ф.Гамалеи.

Материалы диссертации были доложены: на Всесоюзной конференции "Ичмуно-биологические препараты нового поколения и методы их контроля (Суздаль 1988), на Всесоюзной конференции "Бактериальные плазмиды" (Нальчик 1990), на У1 конференции РФ "Новые направления биотехнологии (Г1ушино-на-Окс 1994), на конференциях института им.Роберта Коха (Всрнигсроде) и института медицинской микробиологии (Лейпциг) (Германия 1994), на конференции института экспериментальной микробиологии (Вюрцбург,Германия 1995), Научных чтениях, посвященных 90-лстшо со дня рождения В.Д. Тимакова (Москва 1995) , на совместном заседании проблемных комиссий "Медицинская микробиология" и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Москва 1995), на 1 научно-практической конференции "Применение метода ПЦР в диагностике инфекционных заболевании" (Сочи 1996), на УН Всероссийском Съезде общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва 1997).

В 1994-1995 гг. работа поддерживалась грантами Международного Научного Фонда и в 1995-1996 гг. - грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе 1 авторское свидетельство и 1 международный патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и включает разделы: "Введение", Обзор литературы" (4 главы), "Материалы и методы", "Собственные исследования (6 глав ), "Обсуждение" и "Выводы". Список литературы состоит из 160 работ отечественных и иностранных авторов. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками и 14 таблицами.

Основные результаш, представленные в диссертации, получены лично автором и сотрудниками лаборатории генной инженерии патогенных бактерий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН под руководством автора. Специфические ираймеры для проведения полимеразной цепной реакции (Г1ЦР) синтезированы сотрудником лаборатории Аляпкиной 10.С. Исследования ультраструктуры НФ сальмонелл выполнены совместно с ведущим научным сотрудником ВНИИ санитарии, гигиены и экологии Павловой И.Б. (сканирующая микроскопия) и с сотрудниками лаборатории анатомии микроорганизмов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Диденко JI.B. и Константиновой Н.Д. (трансмиссионный анализ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штаммы бактерий Salmonella typhiniurium и E.coli, взятые из коллекции лаборатории, любезно предоставленные другими

авторами по просьбе диссертанта и сконструированные автором в ходе работы. Для конструирования штаммов применяли методы а) спонтанного мутагенеза, б) химического мутагенеза с помощью мутагена нптрозогуанидина, в) конъюгации и г) транедукции с помощью фага Р22НТ, д) инсерционного мутагенеза с помощью транспозона TnPlioA.

Выращивание штаммов бактерий и бактериофагов, микроскопирование культур в люминесцентном микроскопе, определение антигенной структуры штаммов сальмонелл проводили общепризнанными методами.

Выделение геномной и плазмидной ДНК, РНК, рестрикцию ДНК пуклеазами, электрофорез в однонаправленном и пульсирующем полях, клонирование генов в плазмидиом векторе и обратную транскрипцию осуществляли в соответствии с описанными в руководствах но молекулярной биологии рекомендациями (Маниатис 1989, Давис 1990).

Полнмеразную цепную реакцию (ГИДР) осуществляли в соответствии с разработанной методикой (Аксенов и др. 1994).

11одбор специфических праймеров для проведения ПЦР осуществляли при использовании компьютерной программы "DNASIS" и синтезировали в лаборатории на генсиптезаторс ASM-I02U DNA Synthesizer Biosset LTD Со (Новосибирск). Для идентификации сальмонелл в НС использовали праймеры, выбранные' из последовательностей генов агаС и fox. Были использованы также праймеры, комплементарные последовательности гена let транспозона ТпЮ и позволяющие обнаруживать присутствие ТпЮ в клетках сальмонелл. Использовались также три пары праймеров к идентифицированному в ходе работы гену pqi.

Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сангер с соавг. (Sanger et al 1977) с использованием тяжелого фрагмента ДНК-полпмеразы I.

Полученные нуклеотидные последовательности ДНК анализировали с помощью программ DNAS1S и PC/GENE и сравнивали с банком для ДНК гомологии CDEM37PROT.

Ультраструктуру клеток сальмонелл при переходе в НС изучали методом сканирующей микроскопии в электронном микроскопе "Hitachi-800" со сканирующей приставкой "Н-8010" (Япония) и методом трансмиссионного микроскопического анализа в электронном микроскопе GEM-100B.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Лабораторная модель дли индукции н иыиилеиия иекультиинруемых форм у Salmonella typhimurium.

Выявление новой, неизвестной ранее формы существования бактерий в НС и эпидемиологическая значимость способности к переходу в это состояние побудили нас к разработке подходов для исследования генетического контроля этого процесса. В качестве объекта исследования были выбраны патогенные бактерии Salmonella typhimurium - возбудители обширной группы заболеваний, объединяемых понятием "сальмонеллезы". В жизненном цикле этих бактерий есть длительная сапрофитическая фаза существования и, но сравнению с другими патогенными бактериями, сальмонеллы хорошо изучены в генетическом аспекте и к ним применимы все используемые микробиологические, генегические и молекулярно-биологические методы исследования. В первую очередь, необходимо было выяснить, способны ли вообще бактерии этого вида к переходу в НС, и затем, в случае удачи разработать лабораторную модель для индукции некультивируемого состояния у сальмонелл. Это означало, чго надо было подобрать штамм и оптимальные факторы индукции процесса перехода в НС, позволяющие в лабораторных условиях быстро переводить нормальную культуру в состояние некультивируемости и выбрать адекватный метод для

тестирования этого состояния. Как известно из литературы, наиболее распространенными факторами, приводящими к образованию НФ являются недостаток питательных веществ или понижение температуры среды обитания (Oliver 1993). В качестве основного фактора индукции НС в разрабатываемой модели был выбран фактор голодания клеток по основным источникам питания. В качестве среды инкубации клеток для получения их ПФ использовали деионизованную и стерилизованную родниковую воды. При засеве, бактериальную суспензию штамма, выращенную в полноценной жидкой питательной среде при 37° С до стационарной или логарифмической фазы роста отмывали от бульона и вносили в воду до конечной концентрации от 1.105 до 1.107 кл/мл. Одним из наиболее важных для нас параметров лабораторной модели для индукции перехода клеток из вегетативного в некультивируемое состояние является период времени от засева культуры в поду до прекращения способности клеток к формированию колоний на плотной питательной среде. Проводя сравнительные исследования выживаемости сальмонелл, оцениваемой по способности клеток штамма TR-1 формировать колонии при высеве суспензии, инкубируемой в родниковой или деионизованной воде, на плотные питательные среды, было обнаружено, что период времени, в который клетки сохраняют эту способность заметно различается для двух испытываемых сред или "микрокосмов" и составляет, соответственно, 6 месяцев и 3-4 недели. В результате, в дальнейшей работе в качестве среды инкубации клеток использовали деионнзовашгую воду. Далее, выбранная среда инкубации была использована для изучения влияния следующих факторов внешней среды и состояния культуры на скорость потери клетками штамма TR-1 способности к формированию колоний при высеве суспензии на плотные среды: 1) температуры инкубации (4, 20 и 37°), освещенности (инкубация в темноте и на свету), состояния культуры в начале эксперимента (логарифмическая или стационарная фаза), количества засеваемых в опыт клеток (от 1.108 до 1.103 кл/мл). Проведенные

исследования позволили определить оптимальные условия динамики выживаемости клеток сальмонелл, определяемой по способности формировать колонии на плотной питательной среде. Культура штамма TR-1 должна быть взята в опыт в логарифмической фазе роста и исходной концентрации, равной 1.105 - 1.106 кл/мл. Клетки следует инкубировать в деионизованной воде, то ест ь, в условиях голодания rio основным источникам углерода, фосфора и азота, и при температуре 20° С и естественном освещении. При инкубации в таких условиях, клетки перестают формировать колонии при высеве на плотную среду через 18-21 сутки. Для того, чтобы показать, что после потери способности к формированию колоний, клетки остаются жизнеспособными, но некультивируемыми, определяли динамику их численности параллельно еще двумя методами - методом прямого микроскопирования в люминесцентном микроскопе с окрашнваним акридиновым оранжевым и полпмеразной цепной реакцией со специфическими разработанными праймерами к гену агаС сальмонелл. Как видно из рис.1, оценка численности клеток в Г1ЦР, в целом, совпадает с результатами их подсчета в образцах, окрашенных акридиновым оранжевым. Совпадение количества клеток в суспензии, подсчитываемого двумя сравниваемыми методами, свидетельствовало о том, что методом ПЦР определяется именно численность интактных бактерий, а не совокупность целых и разрушенных клеток S.typhimurium. В качестве дополнительного контроля были проведены эксперименты по определению стабильности ДНК в лизированных клетках исследуемых культур при инкубации их в условиях, аналогичных условиям инкубации целых клеток. Было показано, что лизаты, получеш!ые из культур с тигром 10ч кл/мл, переставали давать положительный результат в ПЦР после 5 суток инкубации, при этом за первые сутки инкубации количество ДНК в исследуемых пробах снижалось на порядок. При идентификации НФ сальмонелл мы получаем положительный ответ в ПЦР до пяти месяцев наблюдения. Так была доказана

а -

\

1 -..........\.........

I 1

О -I-*---

о 20 40 60 80 100 120 140 160

Рнс. 1. Количество клеток штамма ТК-1 5.1ур1шнипит, в зависимости от времени инкубации в стерильной деиоыизованной воде.

1 - количество колониеоб ратующих единиц (кое/мл),

2 - количество клеток по данным ПЦР,

3 - количество клеток по данным прямого микроскопирования с окрашиванием акридиновым оранжевым. По оси абсцисс - время инкубации (в сутках), по оси ординат - ^ кл/мл.

ы

{im • 4-5 иней делаются аысеви на чашки Петри для определении способности клегик формировав

колупни.

Рис. .2. Схематическое изображение лабораторной модели дли индукции образовании НФ клетками Salmonella typhimuriuni.

В сосуд с деионизованнои водой засеваются бактерии в логарифмической фате роста до конечной концентрации ог МО5 до 1.10 ь кл./мл.. Затем, in водной суспензии производятся высевы кулыуры на iijioinyio питательную среду с интервалом в 4-5 днем до тех пор, пока высеваемые клетки сохраняют способность образовывать колонии. В тог момент, когда при высеве 1 мл культуры на чашку Петри с питательной средой не вырастает ни одной колонии, образующиеся некулыивируемые формы тестируются в ПЦР в течение 4-5 месяцев в зависимости от условий эксперимента с интервалом времени равным одной неделе. ,

i г з ь -v i 2. z ч />

Рис.3. Тестирование количества клеток бактерий в пробе с помощью ПЦР.

Проба для проведения реакции взята из разведений культуры с концентрацией

равной. 1 - К)8, 2 - 107, 3- 1о\4 - 104, 5 - 103 кл/мл.

а) тест-система с праймерами,«га, б) тест-система с праймерами tox

Как видно из рисунка, последняя ясно различимая полоса в геле после проведения реакции наблюдается в а) там, где количество клеток в кулыуре равно 10s, а в б) там, где количество клеток равно 104. Но поскольку в пробу для проведения реакции берегся 10 мкл. культуры, то, чувствительность реакции в случае а) составляет 1000 кл, а в случае б) 100 клеток. Таким образом, зная чувствительность реакции для каждого из испытываемых штаммов, в любом опыте можно оценить количество клеток в суспензии, находящихся в некультивируемом состоянии

правомочность использования ПЦР для идентификации НФ в наших условиях опыта.

Таким образом, проведенные исследования позволили нам подобрать оптимальные условия для индукции НС у сальмонелл и согласно нашей модели, образование НФ и их существование в течение длительного времени - до 5-ти месяцев - тестируется в ПЦР после того, как клетки определенного штамма, засеянные в деионнзованную воду в стадии логарифмического роста в начальной концентрации от 1.105 до 1.106 кл/мл и инкубируемые при Т20° С и естественном освещении, перестают ■ формировать колонии на плотной питательной среде (рис. 2 ). Все дальнейшие эксперименты по выявлению способности клеток разных штаммов образовывать НФ проводились нами по одной и той же схеме, поэтому в подписях к рис.2 и 3 дано подробное описание хода эксперимента при идентификации НФ.

2.Необходимость синтеза белка для поддержания НС.

Для доказательства того, что клетки сальмонелл, инкубируемые в условиях голодания после прекращения способности форм1гровать колонии на агаре являются некультивирусмыми, но жизнеспособными, нами была проделана следующая серия опытов. Мы исходили из предположения о необходимости определенного уровня синтеза белка для поддержания этого физиологического состояния и поэтому инкубировали клетки, находящиеся в НС, с добавлением ингибитора - хлорамфеникола. Хлорамфеникол (Ст) использовали в концентрациях 100 и 200 мкг/мл, обычно подавляющих синтез белка в клетках, находящихся в вегетативном состоянии. Оказалось, что концентрация Ст, равная 100 мкг/мл не оказывала ингибирующего действия ни на вегетативные клетки сальмонелл ни на их НФ. Хлорамфеникол в концентрации 200 мкг/мл подавлял рост вегетативных клеток, а добавление ингибитора к суспензии некультивируемых форм

приводило к тому, что через 5 суток после добавления СМ мы не получали положительного ответа в 11ЦР в пробах такой суспензии в отличие ог культуры, в которую ингибитор не добавляли.

Таким образом, подавление синтеза белка в НФ сальмонелл приводило к тому, что положительный ответ в ПЦР сохранялся в такой суспензии примерно в те же сроки, в которые ДНК теряет свои матричные свойства в клеточных лизатах, то есть через 3-4 дня.

Следовательно, клетки, находящиеся в НС жизнеспособны, так как для поддержания этого состояния необходим синтез белка.

3. Рскулытшацни НФ бактерий .а)Рекультивация НФ при добавлении питательных веществ.

В определение феномена "некультивнруемого состояния" обязательно входит способность нскультивирусмых форм бактерий к возврату н нормальное вегетативное состояние, хотя в лабораторных условиях довольно трудно с достаточной степенью достоверности воспроизвести обратный переход из НС. Некультивируемым формам бактерий иногда требуется довольно долгое время для выхода из НС после прекращения действия фактора индукции - пониженной температуры или длительного отсутствия питательных веществ (Oliver 1993).

Мы провели серию экспериментов по способности к рекультивации клеток, находящихся в НС. Опыты по рекультивации начинали после того, как клетки переставали формировать колонии при высеве на плотные питательные среды и проводили в течение 3-4-х месяцев с недельным интервалом. Для этого, в среду инкубации или "микрокосмы", содержащие но данным микроскопирования и ПЦР НФ сальмонелл, добавляли жидкие обогащенные питательные среды. Полученную смесь инкубировали в

термостате при 37° С. Часть смеси предварительно прогревали в водяной бане при 43° С в течение 30 мин. Мы исходили из предположения о том, что подобный термошок может способствовать более эффективному оживлению. Было выявлено, что клетки штамма TR-1, инкубируемые в родниковой воде сохраняют способность к реверсии гораздо дольше, чем клетки, инкубируемые в деионизовашюй воде. НФ разных штаммов обладают различной способностью к рекультивации, а иногда одни и те же штаммы в разных опытах давали неоднозначные результаты, что вполне согласуется с данными литературы (Oliver 1993).

Надо отметить, что в случае рекультивации, рост бактерий в жидкой среде наблюдался через 2-3 суток инкубации. Колонии, вырастающие в результате рекультивации культуры НФ в жидкой среде после достаточно долгого пребывания в НС (например, после 2-х месяцев), проверяли в реакции агглютинации на стекле со специфическими сыворотками к О-антигену сальмонелл. Было показано, что клетки in таких первичных колоний проявляют очень слабую и замедленную реакцию агглютинации в отличие от клеток этих же штаммов, выросших т свежей бульонной культуры. Повторные 2-х- и 3-х- кратные пассажи колоний рекультивируемой культуры на полноценной среде приводили к восстановлению нормальной реакции агглютинации. Это говорило либо о том, что клеткам, находившимся длительное время в НС, требуется достаточно долгое время для полного восстановления всех функций жизнедеятельности, либо о том, что при добавлении жидкой питательной среды к суспешии НФ в ней начинает расти и размножаться "одна" клетка, сохранившаяся в вегетативном состоянии. Для того, чтобы решить этот вопрос, мы провели серию экспериментов по фильтрованию культур в вегетативном и некультивирусмом состояниях через фильтры "Millipore" разного диаметра. В табл. 1 представлены результаты определения присутствия клеток в вегетативной и некультивируемой формах

при определении их тигра путем высева па плотные среды и Г1ЦР, соответственно.

Табл. 1 Выявление клеток ХЛурЫпшпит методом Г1ЦР па фильтрах разных размеров и в фильтратах в зависимости от состоянии культуры.

Состояние клеток исследуемых штаммов Фильтр (размер) Положительный ответ в НЦР на фильтре в фильтрате

Свежевыращснная 0,45 1 1 + 1

культура в 1о§ фазе 0,30 1 +

0,22 | + 1

1 Свежевыращснная 1 0,45 Г г 1

культура в 0,30 +

стационарной фазе 1 1

0,22 + 1

3-х недельная 1 0,45 > +

голодающая 0,30 1 _ _____ +

культура 1___________ I _________

3-х месячная 0,45 г + г

голодающая 0,30 1_____________ +

культура 1___________ 1_____________

I 3-х месячная 0,45 \ 1

культура в НС 0,30 + +

0,22 1 + _

Г 6-ти месячная культура в НС 0,45 Т 1 0,30 0,22 | + т т 1 + 1 +

Примечание. Свежевыращенные культуры наряду с положительным ответом в ПЦР, естественно, дают положительные результаты и при высевах на плотные среды, культуры, голодающие в течение з-х недель - в зависимости от штамма - могут высеваться, а могут и не высеваться, культуры в НС -естественно не высеваются.

Как видно из таблицы, вегетативные клетки сальмонелл (первая и вторая строки) не проходят через фильтры с размером пор менее 0,45 мкм, а

клетки сальмонелл, инкубируемые в условиях голодания и индукции НС, начинают проходить и через фильтры с меньшими порами (3-6 строки), причем их способность проходить через фильтры разного размера зависит от времени пребывания в НС. Культуры, находящиеся в НС около 6 месяцев дают положительный ответ в ГИДР и при взятии пробы с фильтра с размером пор 0,22 мкм и из фильтрата. Лликвоты культур, взятых с фильтра и in фильтрата при наличие положительного ответа в Г1ЦР подвергали рекультивации в жидких средах, как описано выше и параллельно высевали на плотные питательные среды. Считали результат рекультивации положительным при наличие роста клеток из испытуемой аликвоты в жидкой среде и при отсутствии роста клеток, взятых из той же пробы, но высеянных на плотные питательные среды.

Таким образом, было показано, что в жидкой среде размножается не одна сохранившаяся в вегетативном состоянии клетка в культуре, а происходит восстановление способности к активному размножению, по крайней мере, в части популяции 11Ф (поскольку в высеве сконцентрированной на фильтре суспензии не обнаруживалось роста на плотных средах, что говорило о иекультивируемом состоянии клеток в данной суспензии). Кроме того, результаты фильтрования культур, приведенные в табл. 1, демонстрируют, что размер клеток по мере их перехода в НС, сильно уменьшается, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Oliver 1993).

б). Рекультивация НФ при заражении ими лабораторных животных.

Из данных литературы известно, что НФ некоторых видов бактерий сохраняют вирулентные свойства (McKay 1993). Поскольку чувствительные хозяева являются естественной средой обитания для патогенных бактерий, мы предположили, что пассаж НФ сальмонелл через организм лабораторных

животных явится и наилучшим способом их "оживления" или рекультивации. В этом случае, патогены попадают в условия, благоприятные для их активного деления, а именно: оптимальная температура, богатая и сбалансированная смесь ростовых субстратов. Мы вводили некультивируемые формы трех исходно вирулентных штаммов после их сгущения на миллипоровом фильтре с диаметром 0,22 микрона внутрибрюшинно беспородным мышам. Культуры находились в НС уже три месяца и высев 1 мл культуры из смыва с фильтра на плотную питательную среду не дал положительного результата, что свидетельствовало об отсутствии в суспензии клеток в вегетативном состоянии, способных к размножению. Введение мышам инокулята суспензии из смыва с фильтра привело в двух случаях - штаммы 147 и 415 - к гибели животных, а в одном -ЯА294 - к выделению культуры штамма из селезенки и печени животных. Во всех случаях штаммы были маркированы , что позволило легко отличить их от любого дикого штамма, способного вызвать заболевание. Поскольку в данном случае мы не мог ли точно оценить дозу заражения, довольно трудно оценить и 1Л350. Однако, приблизительная оценка • количества некультивируемых клеток методом ПЦР позволяет считать, что 1Л350 в случае НФ несколько выше, чем при заражении культивируемыми клетками тех же штаммов. Скорее всего, это может свидетельствовать о том, что в этом случае, также как и при рекультивации в жидкой питательной среде, восстановление способности к размножению происходит в части испытываемой популяции НФ. Одновременно проведенная рекультивация НФ указанных штаммов при добавлении жидкой питательной среды не привела в данном случае к положительному результату, что подтверждает предположение о том, что организм чувствительного хозяина является оптимальной средой для активации патогенных бактерий, попадающих в нею в некультивируемом состоянии.

Таким образом, была продемонстриропана способность НФ сальмонелл к рекультивации в жидкой среде и в организме чувствительного хозяина, а также сохранение НФ вирулентных штаммов своего патогенного потенциала.

4.Плиянис ряда известных мутаций на процесс образования НФ сальмонелл

Формирование НФ грамотрииательными бактериями - это второй после споруляции пример феномена дифференцировки па клеточном уровне и поэтому, приступая к шучению генетического контроля процесса перехода бактерий в НС, мы предполагали использовать некоторые известные нам из литературы данные о генетическом контроле процесса спорообразования в своих исследованиях. В процессе формирования НФ, как и в процессе спорообразования, задействованы многие системы жизнеобеспечения клетки. Поэтому, многие известные гены, принимающие участие в контроле работы этих систем, также могут оказывать влияние на эти процессы. Например, показано, что мутанты Bacillus subtilis с мутациями, нарушающими нормальный хемотаксис клеток, неспособны образовывать споры, а частичное ингибирование синтеза пуриновых пуклеотидов приводит, напротив, к массовой споруляции даже при наличие благоприятных пищевых условий (Harwood 1989).

В связи с этим, одной из задач нашего исследования была проверка влияния некоторых известных мутации на динамику процесса перехода клеток сальмонелл в некультивируемое состояние. Нами проведено сравнительное исследование по способности к переходу в НС клеток нзогенных пар штаммов, один из которых в паре служил контролем, а а другой, соответственно, имел мутацию в гене, влияние которого на транзицию в НС, мы изучали. Культуры всех испытываемых пар штаммов тестировали в условиях, разработанных нами для индукции

некультивируемого состояния. После того, как клетки испытываемых штаммов в разные периоды времени в зависимости от штамма, теряли способность образовывать колонии на плотной питательной среде, образцы культур в течение длительного времени тестировали в ПЦР с использованием различных специфических праймеров.

Было проверено влияние следующих генов сальмонелл на динамику процесса перехода мутан гных клеток в НС:

•генов mot, кодирующих подвижность,

•генов che, кодирующих хемотаксис,

•гена гроВ, кодирующего синтез бета-субъединицы РНК-полимеразы,

•гена rpoS, кодирующего сшпез альтернативной спгма-субьедмпицы РНК-полимеразы, активирующей работу стрессовых генов бактериальной клетки,

•генов guaA и ригЕ, кодирующих соответственно синтез гуанин- и аденинсинтетазы.

Кроме того, поскольку известно, что для всех сероваров сальмонелл характерно наличие в геноме определенных плазмид, называемых плазмидами вирулентности, был проверен характер поведения в отношении способности к формированию НФ у культур двух изогенных штаммов -содержащего типичную плазмиду вирулентности размером 60 Мд и его бесплазмидного варианта. В таблице 2 суммированы результаты этих исследований. Было выявлено:

1.) отсутствие влияния па процесс индукции НС (гены che и нлазмида вирулентности),

2.) влияние, выражающееся в значительно более быстром по времени переходе мутантных клеток в НС (гены mot, guaA, rpoS )

3.) неспособность к переходу мутантных клеток в НС (гены ригЕ, гроВ).

ГяГ)л.2 Влияние некоторых тпсстных мутаций на процесс перехода п НС

Мутация Влияние на процесс перехода в НС

Отсутствие илазмиды штулентности р8Т60 не влияет

пиП (подвижность) переход в НС индуцируется гораздо раньше, чем в контрольном штамме

сЬе (хемотаксис) не влияет

циа/1 (ситнсз гуапин-синтетазы) переход п НС индуцируется гораздо раньше, чем в контрольном штамме

ригЕ (синтез аденин-синтетазы) переход в НС не индуцируется

гроВ ф-субъеднпица РНК-полнмеразы) переход в НС не индуцируется

гроБ (ст8 Р НК-полнмеразы) переход в НС индуцируется гораздо раньше, чем в контрольном штамме

Таким образом, в этих экспериментах было показано, что процесс перехода сальмонелл подвержен генетическому контролю п это позволило приступить к разработке схемы выявления генов, участвующих в механизме контроля эюго процесса.

5.Полученис мутантов с нарушенной способностью к образопашпо НФ.

Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле процесса формирования НФ, был применен традиционный подход, используемый для выяснения генетического контроля любого процесса - получение мутантов, влияющих на этот процесс. Поскольку такой признак, как образование пекультивируемых форм, не является удобным для проведения селекции, для выделения мутантов необходима тотальная проверка большого количества

мутагенизированиых клонов на способность к образованию ПФ в условиях разработанной модели в сравнении с исходным контрольным штаммом - ТК-I. Для выделения мутантов был применен метод инсерционного мутагенеза, с использованием транспозона ТпР1шЛ в качестве мутагенного агеша (Малой, ВескиШ1 1985). Этот специально сконструированный транснозон, в кошром структурная часть гена, кодирующею щелочную фосфатазу (рИо.Л), интегрирована в иоследова1е;1ыюсть транспозона Тп5, широко используется в последнее время для слияния генов и изучения их экспрессии. Схема строения транспозона ТЫЧюА приведена па рис. 4а. Инсерция мою транспозона н ген, кодирующий грансмембрапный, першитзматичсскнй или внеклеточный белок, можо привести к появлению экзогенной фосфаппной активности, легко тестируемом в цветной реакции вокруг колоний, вырастающих па обычной ниппельной среде с добавлением субстрат для щелочной фосфашзы. Поскольку мы считали, что механизм перехода бактерий в НС, подобно другим адаптивным реакциям бактерий, должен быть подвержен мембрано-опосредоваппой регуляции Iепной активное!и, возможность получения мучацпй в генах, кодирующих белки такого шна представляла особый интерес.

Стратегия отбора мутантов была следующей:

• получение коллекции не менее чем из 1000 инсерционных клонов с внедрением ТпИюА,

• проверка инсерцнонпых клонов па ауксотрофность и исключение из дальнейшею анализа ауксо1рофпых мутантов,

• тотальная проверка полученных пеауксофофных клонов в разрабоишной лабораюрпой модели для индукции 11С (по 10-20 клонов в одну серию),

• выбор клонов с любыми отклонениями в динамике процесса перехода в НС по сравнению с контрольным штаммом,

• проверка клоноп с измененными параметрами процесса перехода в НС на среде с добавлением 5-бром-4-хлор-3-нндолил-фосфата - субстрата для щелочной фосфатазы.

Г? результате, после тотальной проверки почти 1 ООО иисерциошшх клонов по описанной схеме было отобрано 20 мутантов, которые по характеру поведения в лабораторной модели можно разделить на следующие фенотипичсскис группы (табл.3):

1. с укороченным периодом существования в вегетативном состоянии по сравнению с исходным штаммом и способные к образованию НФ;

2. с более длительным по сравнению с исходным штаммом периодом существования в вегетативном состоянии и также способные к образованию НФ;

3. не способные к образованию 11Ф;

4. с более длительным по сравнению с исходным штаммом периодом существования в НС.

Клетки мутанта PhoA-8 - представителя второй феногнпической группы - метаболизировалн экзогенно добавляемый субстрат для щелочной фосфатазы, что выражалось в появлении синего ореола вокруг колоний этого "мутанта на специальной среде. Это говорило о том, что транснозон в данном случае встроился в ген, кодирующий трансмембранныи или внеклеточный белок и таким образом было подтверждено наше предположение о возможном мембрано-опосредованном механизме контроля процесса образования НФ,

11осле разделения полученных мутантов на фенотипические группы, было проведено предварительное физическое картирование полученных

мутаций методом пульс-электрофореза геномной ДНК из мутаптных клопов. При обработке препаратов ДНК, выделенной из мутантов, рестрпктазами ХЬа! и БШ были хорошо заметны различия в профилях рестрикцпопных фрагментов у мутантов РКоА-8, РЬоА-19, и РЬоА-25 (в автореферате данные не представлены). Это означало, что транспозон ТпРИоА внедряется в разные области генома ЗЛурЫтилит л все полученные нами мутанты генетически различны.

Табл.3. Фенотипические характеристики мутантов с нарушенным

процессом формировании НФ.

Наименование Феиотиническаи Период Период

штамма группа высеваемости положительного

на плотной ответа в 1ЩР после

среде /су г/ утраты способности

к формированию

колоний /мсс/.

контроль 25 4

: РЬоА-4 3 | 25 1 0 1 1

Г РЬоА-6 2 60 7 2

| РЬоА-8* г _ г ___ г , 1

! РНоА-19 г _ 4 г л 1 4

| РЬоА-25 1 4 1 25 г

Примечание. Звездочкой отмечен мутант, инсерция транспозона в геном которого, привела к появлению экзогенной фосфатазной активности в его клетках. Скорость роста и Ь050 полученных мутантов не отличалась ог таковой исходного штамма. Сцепленносгь фенотипа с инсерцией транспозона была подтверждена перенесением мутации по маркеру транепозома в исходный штамм методом трансдукции фагом Р22.

6.Идентификации генов, контролирующих переход в некультииируемое

состояние.

Следующим этапом работы являлась идентификация генов, мутации в которых привели к нарушению процесса образования НФ. Для этого была

использована следующая последовательность экспериментов: 1) клонирование мутантных генов в плазмидном векторе с использованием маркера канамицинрезистентности, кодируемого транспозоном ТпРЬоА, в качестве селективного, при отборе клонов, несущих гибридные плазмиды, 2) затем, после выделения гибридных плазмид, определение нуклеотидной последовательности гена в пограничном районе, прилегающем к сайту инсерции транспозона.

Схема клонирования мутантных генов представлена на рис. 46. Возможный способ направленного выделения гена-мишени при клонировании - это использование рестриктазы ВатН1, один из сайтов для которой находится в пределах транспозона справа от гена кап, кодирующего канамицпнрезистентность, а второй -предположительный - уже за транспозоном, на хромосоме, в гене, в который произошла инсерция. Тогда, используя в качестве вектора для клоштрования плазмиду рВ1ие8Спр1 ИБК, имеющую один сайт рестрикции дзя ВаптШ и, высевая клетки после трансформации лигированной смесью рецнпиентного штамма НВ101 на чашки с добавлением канамищша, можно осуществить прямую селекцию гибридных клонов. Все мутантные гены были клонированы по указанной схеме. Размеры клонированных фрагментов следующие: для мутанта РЬоА-4 -12, для РЬоА-8 - 10, для РЬоА-19 - 7,7, и для РЬоА-25 - 14 т.п.н. Различные размеры клонированных фрагментов также как и проведенный нами ранее пульс-электрофорез геномной ДНК у мутантов подтверждают случайность событий интеграции транспозона ТпРЬоА в хромосому штамма ТК-1.

Для идентификации генов, инсерционные мутации в которых привели к нарушению процесса перехода бактерий в НС, было осуществлено сиквеиирование их фрагментов, граничащих с сайтом инсерции. Для этого был синтезирован ориентированный праймер ТпР1юА-1, комплементарный одному из концов транспозона (см. рис 46). Использование этого праймера

для сиквенирования позволяло прочитать последовательность искомого фрагмента в направлении от сайта внедрения. Для каждого из изучаемых мутантов были прочитаны последовательности по 200-220 ни., представленные в табл.4.

Табл.4. Нуклеотидныс последовательности фрагментов генов, мутации в которых вызывают нарушения процесса образования некультивируемых форм у Salmonella typhimuriuin.

Мутант

Нуклеотидная последовательность фрагментов

• PhoA-4

I TGTGTATAAGAGTCAG4

' GTTGTCCACC GCGCAAGATA CTACAACCGT TCACTGGCGT ACGGTAAATT TTTGGACAGG TCGTTGACGC CG

-I;

i PhoA-8 itgtgtataagagtcag l

' GCTATGTCCG GCGTAAAAAC AGTTTGCAGT GGACCTGGCG j | TTATTATTTA CCTCGATGAT GCTTTATCTG CCCGCCAATA

TTTCCGAT

ГйГоЛ-19 Гт gt gt ät äagägtcägI-

I I

' gcactaatgc ctggtgggg acacgcagcc

|1мшЛ-25 TfGTGfÄfÄÄGAGTCÄGl-i i

' ggtaacaaca ctgccgaatc aatattacaa aatgaattta I I ttctctnccc ttngaagacg

Примечание. Стрелкой показано место стыковки транспозона и гена, в который произошла инссрция, последовательность до стрелки - это последовательность транспозона до места инсерции, последовательность после стрелки - последовательность мутантного гена. N - неопределяемый нуклеотид.

Полученные последовательности сравнивали с банком данных о нуклеотидных последовательностях геномов E.coli и S.typhimurium CDEM37PROT.

Идентификация генов методом сравнения полученных последовательностей с банком данных позволила выявить следующее (рис. 5). Так, оказалось, что последовательность ДНК, определенная для мутаота PhoA-4, фенотиппчески характеризующегося отсутствием способности

•Л)

IS50L с ппедрешюм paiíon IS50K pIioA Тп5

b--1-I--

'рЬоЛ

"I_'--1_

кап трансиолаja

ь>

Транспозиция: л ген X па хромосоме Слияние гении: |

X' pIioA V k¡ui X'

жжш-t

Рис 4. Схема мним ранни транспогона Tn-PhoA в хромосомный ген и KVioiiiiponaiiiic )гою гена в м.тазмндиом векторе.

Л) Траиспозон Tni'hoA является производным транспозона Тп5 с районом phoA, колирующим щелочную фосфатазу E.coli без сигнальной последовательности и внедренным в левый IS50 элемент грапепоюна Инсертш транспоюна в ген "X" нарушают последовательность гена и выражаются в продукции гибридного белка в резулыате X-phoA слияния.

G) При использопашш рестрикгазы Пат! (I, один из сайюв для которой (В) лежит дистальнее гена кап в гранспозоне и другой - гипотетический (В) - выше по течению того тепа, с коюрым произошло слияние, можно клонировать фратмент искомого гена, прилежащий к одному тп концов слияния. Поперечной стрелкой показано положение последовательности сиквепапиошюго праймера F'hoA.

1J10 ' I 20 bOr ' ' 40 : SO CU ,

a) gtccaccccgcaanatactac/IACCCtCACTGCCGGTA-ccctaaattttntccacacjitr' 30

' j II III 1 I III IM : II I I

TTCCAcrnCTCCnTCtXTTtxn'CAATCTri^CACttiCAlxrATTAAArTCACCr^TOAAAT 500 54!) 550 SCO 570 500

70 M 90 UK) 110 120

t •{; rrr: ai •n<;t;a:cTt;TTCT(n-TTtx-<;cTn AcrcTGTt."; a rrAt; ac:cr,rc. acatt ar:r,c(; a

i1111iiii t ii urn mini i in ii j ii ii

("fi ttt» a ct :t :t : a t cc( >t (tt n n* ac tc a ctccc a n a a < a c;t; a a gt Ttn gct wk3T( ; a {,<*) C'X' GtO oro C.TC) 040

inn 140 150 ini I7D

- euittcccctrcactaaattaac—ccagccc;cctatwir;i;i:(;aatc aaaaaoaai; art 111! II III II I I I ill nil I I II 111 II

hot-----a an a a a a a t atcttc a a agcc - - attcci :c; aca actctk.'tl (1a at;rnt

G50 COO 670 f.flt) PPO 700

1П0 lit) 200 210 72Í)

\ т<:л(:сатшл<:тг.шастсссатастса(;аислгл:агсла гт

II lililllllllllllll II I , tccagatcaaactcfiaafiactctcac.'atcaccrctaataooaaafittaacfitaafitm i(- a •710 720 730 740 750 700

M Л) ,10

GCTATfiTCCra^TAAAAArACnTGCA'T I II II lllllli MINI МП11 AAart.'firillOtX'tX.'taiTTCTACrACCAAAOTj'TAfr.riiriaK'fiTAnAAAOAiaTrMTirTAOT 151.0 Ю-'!) 151)0 15''() 1 Pi К) icio

40 50 60 70 ПО «О

а;лснотг^гдгатташа(хт(х;агса71хтттат(:г1;(;ю;(;аатагттш:1-0а ПИ.II lililí II II llfllll! Mill II II lllllli III I CfiACACTOGCCCTCCTTCTAACUTCCATC ATGCTCT АТСТТСЮТТА А TAT ПТССССЛ 1СГО 1030 1040 1050 1 f.fiO I Г.70

jm ¡ i no 120 , MO Mo iv)

l TTATGATTACCí IACTTACTGGGCNCC AAA ATTCCGTCCA CC A TT( ;ТОГ.с: Tfifit "OTGA1 IT I III I II II III I 111:1111 II llllllll Mill lllll II III ТСА+ССТасасЛТТГАТТАгаТГОААСАТрСГСТССАССАТТСТСССТОХ^ГСАПС I «ico 'I 1СЭ0 1700 1710 Г20 1730

i ico" 170 i do 140 гоо

ггстстшGCGAlhxTCTTA TCCCCTCÜCGr.CGGTTATC- ТГСТС.ССАШ ттл TGC. I I llllllll II llllllll II IMiill III 1(11 IIIMIIMIIII иттАта;лсс(:ААцсс:тспАтсссстссстсспстслгстпс;п:;;гсАогАПАГоа 17í0 1750 1 1700 ' 177o 17u0 1790

¡'j 11 I/.II

210 j .j , ¡-'i tccxgact / 1

пи и i; ,

Г(;гл;ААС(;ттААА';лтоАтссз<;сАтсх^тасст^сттш;Ата'САААш;гАТ1;ачА 1CC0 mm ,.1820.1 18Л0 184'; 1ЯГ.0 •

' , io го no

( 1 ' л a í (,t( ¡tí "g ti ;т vi ;.'m л net; n л <; a'; m i л

• ' тип// mu i а ищи

CCTGI :апатс| с(;с;;псс^Т{я ^i;cTi^AATCTGra;- TCTI (;t;cAcw;cTfiAi;AAi A

И'»' I О.'0 low 1070 ЦЧШ 101(1

•ID 50 00

.'AiTCAl nidi ЛЛТД ¡ТСЛТТСШ.'ЛГГП; ГТ(!ТГЛ' HIM 111 И IIII И111111111 И 1111111111 "AiTLTTTt'ifiTAATATTfiATTCCOCiVjTCTTJTTAí oiacm Г|;г;;;АТ<;ШТ;ч-7ГС htn «sso 112.) ll.lj t tío uso

j aro г гт-и.;;;п «отигпттлттсла'стосстс i ai i ai (хш:ла.';«:л n и; ¡cat г

ИМ П70 JICO 11 fio 1ДП j?»,

б)

в) I

Рис.5. Гомология определенных нуклеотидных последовательностей с последовательностями генов E.coli и S.typhimuriuni, полученная в результате сравнения по программе PC/GENE.

Верхняя строчка - последовательности ' лгментов генов в мутантах PhoA-4 (а), i'hoA-8 (б), PhoA-25 (в),

Нижняя строчка - последовательности фрагментов генов ¡pf (а), pqi (б), glgC (в). Продольные штрихи указывают местоположение идентичных нуклеотидов в обеих последовательностях.

формировать НФ, на 86% совпадает с последовательностью одного из генов, недавно обнаруженного у сальмонелл оперона Ipf (long polar fimbriae), кодирующего новый, неизвестный ранее тип фимбрий (Baumler, Heffron 1995). Как известно, сальмонеллы обладают фимбриями различного типа, включая фимбрии I, 3, 4 типов и фимбрии, кодируемые плазмидами вирулентности. Доказательством того, что обнаруженная у S.typhimurium последовательность кодирует фимбриальную структуру, названную "длинные полярные пили", служит обнаружение пилен нового типа на афимбриалыюм мутанте F..coli после введения данной клонированной последовательности на соответствующем векторе (Baumler, Heflron 1995). Не исключено, что обнаруженные пили с неизвестной пока функцией могут играть некую сенсорную роль при попадании сальмонелл в неблагоприятные условия внешней среды или макрофаги хозяина при инфекции.

Последовательность, определенная для мутанта PhoA-8, характеризующегося увеличенным по сравнению с контролем периодом времени существования клеток в вегетативном состоянии, но сохраняющих способность образовывать НФ, на 90% идентична последовательности гена pqi (paraquat inducible), обнаруженного пока только для E.coli (Kon,.Roy 1995). Оказалось, что этот ген входит в состав оперона soxRS, имеющегося как в клетках E.coli гак и в клетках S.typhimurium. Интересно, что индукция этого оперона в бактериях обоих видов происходит при стрессовых ситуациях различного рола, а в клетках сальмонелл еще и при попадании их в макрофаги хозяина на ранних стадиях инфекции (Christman et al 1985). Клетки этого мутанта способны метаболизировать экзогенно добавляемый субстрат для щелочной фосфатазы и это свидетельствовало о том, что транспозоп TnPhoA в данном случае встроился в ген, кодирующий еекретируемый белок. Действительно, оказалось, что ген pqi, последовательности которого гомологична прочитанная нами последовательность фрагмента идентифицируемого гена в мутанте phoA-8,

кодирует белок с неизвестной еще даже у E.coli функцией, но обнаруживаемый в мембранной фракции (Kon, Roy 1995). Таким образом, идентификация гена, участвующего в контроле механизма образования НФ и индуцирующегося, по данным литературы, в клетках сальмонелл на ранних стадиях инфекции, служит основанием для предположешм о наличии общих сенсорных механизмов, индушфующих как активацию генов патогенности, так и переход в НС.

Мутация в штамме phoA—19 приводит к тому, что мутантные клетки очень быстро переходят в НС по сравнению с клетками исходного штамма. Такое поведение мутантных клеток дает основание предполагать, что в данном случае инсерция транспозона нарушила ген, кодирующий важную регуляторпую функцию, в результате чего не происходит активации генов, помогающих клетке переживать длительное голодание и они быстро переходят в НС. Фенотип этого мутанта похож на фенотип мутанта rpoS (см. табл.2 ), кодирующего альтернативную сигма-субъединицу РНК-полимеразы, участвующую в транскрипционной активации, по меньшей мере, 20-30-ти генов, продукты которых необходимы для длительного переживания бактериальными клетками различных стрессовых ситуаций (Hengge-Aronis 1993). Однако, нами не было найдено гомологии для последовательности гена PhoA-19 ни с последовательностью гена rpoS, ни с другими известными последовательностями в банке данных. Следовательно, можно предполагать существование и других, еще не обнаруженных, регуляторов генной активности.

Интересно, что г/илУ-зависимой регуляции активности подвержен и ген glgC, последовательности которого на 80% оказался гомологичен фрагмент гена в мутанте PhoA-25, фенотипически характеризующийся значительно более длительным периодом существования клеток в некультивируемом состоянии. Ген glgC (glycogen), кодирует синтез ADP-глюкозо-

гшрофосфорилазы, фермента, принимающего участие в синтезе гликогена -основного запасного вещества клетки (Leung, Preiss 1987).

Таким образом, идентифицировано три гена, участвующие в контроле образования НФ у сальмонелл и для одного из четырех генов не обнаружено гомологии в банке данных об известных последовательностях геномов энгеробактерий.

7. Изучение активности генов в процессе перехода в НС.

Одним из самых интересных вопросов является вопрос о регуляции активности идентифицированных генов в процессе перехода в НС. Однако, низкий уровень метаболизма в НФ бактерий, не позволяет рассчитывать на изучение активности идентифицированных генов путем обнаружения кодируемых ими белков. Поэтому, нами на примере мутанта phoA-8 был разработан методический подход для изучения экспрессии генов в процессе перехода и длительного пребывания бактерий в НС. Суть подхода состоит в том, что по мере инкубации клеток в условиях индукции их перехода в НС, из изучаемой культуры отбираются пробы, из которых выделяется препарат суммарной РНК. На суммарной клеточной РНК, выделяемой из клеток по ходу эксперимента, осуществляется избирательный синтез кДНК в реакции обратной транскрипции с помощью специфического для изучаемого гена праймера. Возможность транскрипции изучаемого гена в любой выбранный нами момент (другими словами, наличие в препарате суммарной РНК информационной РНК изучаемого гена) оценивается по выходу продукта ПЦР, которая также проводится со специфическими для этого гена праймерами. В качестве контроля чистоты препарата РНК, то есть отсутствия в нем ДНК, ПЦР необходимо проводить и на РНК, не прошедшей стадию обратной транскрипции. Для этого, нами была проведена предварительная

Протяженность гена рср Е.соН

200

400 500 600

800

1000

ншшг

Е. coli

754 951

фрагмент гена pqt S.typhimurium

pqil pqill pqilll

190 н

400 и

140 и

размер

амплифицируемого фрагмента Рис.6. Схема подбора - праймеров для изучения экспрессии гена в мутанте РЬоА-8.

12 3 Ч 5 6 ? 3 Э

." Vi'1 .'1 f 2 -V.; - ' 'г< 5

•..•I "Г* ^^ч'.-Х*.'-'.- Г. •• • '

" ' ' V ' ;/ ; 1 ; (■ - , - ... • ■ . •*' |

а)

б)

в)

Рис.7. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК штамма ТРИ в ПЦР с праймерами/79//, рч'1 II ирцИН.

а - праймеры pql /, б - рц! II, в - рц! III, г - (ох 1,3,6, 7, 9 - ДНК БДурЫтипит, 2,4, 8 - ДНК Е.соИ, 5 - ДНК фага X. Видно наличие четких специфических полос при использовании праймеров (ох, рц1 II и pqi III и отсутствие специфических полос при использовании праймеров рцI /.

работа по подбору специфических праймеров из последовательности гена pqi как для синтеза кДНК так и для проведения ПЦР. На рис.6 представлена схема подбора праймеров для проведения последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР и на рис.7 - продукты амплификации, полученные после ПЦР на клетках E.coli и S.typhimurium. Выбранные нами праймеры были обозначены pqil, pqill и pqilll, но наиболее четкий результат в ПЦР был получен при использовании праймеров pqilll (см. рис. 7). В этом случае выявлялся специфичный для сальмонелл продукт амплификации и синтезируемый фрагмент имел размер 140 нуклеотидов. После этого мы сравнили все три пары праймеров в ПЦР с исходной ДНК контрольного и мутант!юго штамма и с кДНК этих же культур, синтезированной после выделения их РНК и обратной транскрипции. Результаты ПЦР, проведенной на ДНК свежевыращенных культур исходного и мутантного phoA-8 штамма совпали с результатами ПЦР, проведенной на кДНК этих же штаммов после выделения РНК и реакции обратной транскрипции (табл. 5 ).

Таблица 5 Результаты ПЦР, проведенной на ДНК «сходного и

мутантного штамма и на кДНК тех же штаммов после реакции обратной транскрипции.

ДНК Используемые праймеры

pqil pqil I pqilll

TR-1 + + + i i

Г PhoA-8 + - + i i

кДНК

TR-1 + + + i

Г PhoA-8 + 1 - + i

Примечание. Знак "+" -положительный ответ в ПЦР, знак "-" - отрицательный ответ в ПЦР.

Из таблицы видно, что менее специфичные праймеры pq¡l дшот положительный отвег в ПЦР как на ДНК так и на кДНК исходного и

мутантного штаммов, тогда как праймеры pqi II дают положительный ответ только па клетках исходного штамма. Это объясняется тем, что последовательность гена, ограниченная этими праймерами в исходном штамме, в мутантном штамме нарушается за счет внедрения транспозона TnPhoA (см. рис ). Праймеры pqi III ограничивают небольшой фрагмент клонированного нами фрагмента гена за пределами последовательности транспозона и поэтому положительный ответ в ПЦР мы наблюдаем как с ДНК исходного так и мутантного штаммов.

Таким образом, совпадение результатов ПЦР, проведенной на кДНК исходного и мутантного штаммов с праймерами pqi II и pqilll свидетельствует о том, что такой способ определения экспрессии генов вполне правомочен при изучении их активности в процессе перехода в НС. Разработанный методический подход может быть использован для изучения активности других идентифицированных генов, а также для изучения активности любых других генов сальмонелл в процессе перехода клеток в НС.

8. Ультраструктура клеток сальмонелл при их переходе в НС.

Наряду с отсутствием данных о молекулярно-генетических механизмах процесса перехода клеток в некультивируемое состояние, в литературе практически отсутствуют данные о морфологии НФ. Сообщалось лишь о том, что клетки, переходящие в некультивируемое состояние уменьшаются в размерах. Так, для V.vulnificus было показано, что культивируемые клетки в стационарной фазе роста имеют размер около 1,5x0,7 мкм, тогда как некультивируемые клетки обладают преимущественно кокковидной формой с диаметром от 0,8 до 1,0 мкм (Novitsky, Monta 1978) . Стремление к приобретению сферической формы и уменьшению в размерах может являться

клеточной стратегией миниминизации потребностей в целях переживания неблагоприятных условиях и самосохранения.

В задачи нашего исследования входило электронно-микроскопическое исследование клеток сальмонелл в динамике перехода в НС. Совместно с Павловой И.Б. были приготовлены препараты исходного контрольного штамма и некоторых мутантов, находящихся в вегетативном и некультивируемом состояниях для сканирующей электронной микроскопии. На рис. 8 представлены клетки свежевыращенной бульонной культуры штамма ТЯ-1. Видно, что клетки имеют палочковидную форму, свойственную грамотрицателышм бактериям и, естественно, сальмонеллам. На рис. 9 представлены клетки того же контрольного штамма ТЯ-1, сконцентрированные из суспензии НФ на мнллипоровом фильтре, уже в течение полутора месяцев не высевающиеся па плотных питательных средах, то есть находящиеся в некультивируемом состоянии. Как видно на этих микрофотографиях, основная масса клеток также приобрела сферическую форму и размер клеток уменьшился. Для нас представляло большой интерес исследование препаратов некультивируемых форм штаммов мутанта Р1юА-19, клетки которого очень быстро по сравнению с клетками контрольного ш гамма переходят в НС и штамма С53, несущего мутацию гроЯ, клетки которого также через 2 недели становятся некультивируемыми, но по нашим данным, способны существовать в НС. На рис. 10 представлены микрофотографии некультивируемых форм мутанта Р1юА-19 и штамма С53, с мутацией гроБ, практически одинаковый период времени находящиеся в некультивируемом состоянии - две и одну неделю, соответственно. В обоих препаратах видны гетероморфные клетки, большая часть которых уже стремиться приобрести шарообразную форму. Наряду с шарообразными клетками присутствует и достаточное количество паточкообразных клеток, что свидетельствует о том, что процесс перехода в НС еще не окончательно завершился, так как период пребывания клеток в НС еще очень мал.

-.У'-У а-;.-У- УУУ

....... ^Ш^.и^Ъ^&Н^ ! "У уТС^^-^

......

44Л": г'Г^- -:

Щш Щ- У

Рис.8. Свсжсвыращенные клетки штамма Т1М в сканирующем электронном микроскопе при ув. 10000.

' >■■ 'У- .'' ^ ^"'^"''"-Г' ' ' «•'. у7-"-' -

1ГО

|УУ' / -л

ИШ •ЧУ/; У? . У

■-М

Рис. 9. Клетки штамма ТЯ-1, находящиеся в некультнвируемом

состоянии в сканирующем электронном микроскопе при ув. 10000.

1'нс.Ю НФ мутанта РЬо А 19 (а) н мутанта гроЯ (б) в сканирующем элект ронном микроскопе при ув.10000.

«

Таким образом, помимо сходства фенотипов этих мутантов, обнаруженного при изучении динамики процесса перехода их клеток в НС, получены данные и о сходстве ультраструктур клеток этих штаммов. Это еше раз свидетельствует о строгой генетической детерминированности процесса перехода в НС.

Исследование образцов препарата мутанта р1юА-4, клетки которого по нашим данным неспособны к переходу в НС и погибают по мерс потери ими способности к формированию колоний, показало, что в них отсутствуют клетки, характерные для гетероморфного роста. Видны лишь скопления нитевидных структур, на поверхности которых кое-где выявляются единичные мелкие клетки (в автореферате фото не приводится). . По морфологическим критериям, они напоминают "игловидные" структуры, наблюдаемые рядом авторов в популяциях клеток, но функция которых мало изучена (Прозоровский 1981).

Таким образом, получено визуальное подтверждение тем критериям, по которым мы, используя свои методы тестирования клеток в НС, говорим об их способности формировать или не формировать некультивпрусмые формы.

Морфология клеток при таком методе исследования напоминает клетки сферопластного или протопластного типа, однако для изучения субмолекулярной структуры необходимо применение метода трансмиссионной микроскопии. Трудность применения этого метода к некультивируемым формам сводится к тому, что необходимы большие объемы суспензии НФ для получения осадка культуры, достаточной для анализа плотности. Методика получения препаратов бактерий из суспензий с низкой концентрацией клеток, специально разработанная сотрудниками НИИЭМ им. Гамалеи Диденко Л.В. и Константиновой Н.Д., позволила нам провести исследования ультраструктуры НФ сальмонелл методом трансмиссионного анализа. В препарате НФ штамма ТЯ-1, полученном с

ТСГ"'

■О'-.

Т- т-*! - КЛ т»,-^

¿' Г ??,>

'v.

' ......

.....

р -г../

« 'л-

1А ^■■"■•О' • \ ■" ■ -, _ . ■

'Г-Н-.. ь ' . -"' , '.'

• ТТ»»:* " ■

Ч^Ч -.•С*

■У. : Г 'Л-,

Рис. 11. Ультратонкнн срез препарата НФ штамма ТЯ-1.

а)- ув. 35000, б)- ув. 50000.

г - глобулы БСА , остаточных белков м ПЭГ, пк - плотные клетки, ис - сферические клетки с измененной структурой, р - рибонуклеопротеид.

помощью разработанной методики, обнаруживается несколько типов клеток, различающихся по форме, размерам и степени сохранности структур (рис. 11). В препарате присутствуют мелкие круглые (кокковидные) клетки и овальные клетки, окруженные резко извилистой клеточной стенкой и имеющие довольно плотную цитоплазму. В некоторых клетках увеличено периплазматическое пространство и изменена структура цитоплазмы. Рибосомы и полирибосомы практически не выявляются, в большей или меньшей степени клетка заполнена конгломератами рибонуклеопротсида. Нити ДНК в таких клетках не выявляются, что говорит о том, что ДНК находится в составе нуклеопротеида и наилучшим способом защищена от внешних воздействий. Таким образом, с помощью разработанной методики получения препаратов бактерий из суспензии с низкой концентрацией клеток, показано изменение морфологии клеток сальмонелл при переходе и длительном существовании в НС.

_о_

Итак, изучение феномена некультивируемого состояния у сальмонелл, предпринятое в данной работе, и идентификация генов, принимающих участие в генетическом контроле этого процесса, позволят продолжить исследование механизмов взаимодействия генетических систем, контролирующих образование НФ и регуляцию экспрессии факторов патогенности, несомненно имеющих общие гены, кодирующие сенсорные или эффекторные белки, активирующие работу этих систем. На это указывает факт обнаружения гена, индукция которого происходит как при переходе сальмонелл в некультивируемое состояние, так и при попадании их в макрофаги макроорганизма на ранних стадиях инфекции. Некультивируемое состояние и патогенность -это адаптивные реакции бактерий, в основе которых лежит перестройка метаболизма микроорганизма, адекватная новым условиям существования. Главная роль в управлении такими процессами

принадлежит трансмембранным сенсорным белкам, улавливающим изменения в окружающей среде и передающим информацию генам, от активности которых зависит адаптация. Выявление механизмов и факторов индукции некультнвируемого состояния и выхода из него позволит прогнозировать как временный анабиоз так и активацию патогенных бактерий во внешней среде. Некультивируемое состояние является неотъемлемой частью экологии бактерий и изучение механизмов обратимого перехода в это состояние у возбудителей инфекционных заболеваний представляет не только научную, но и непосредственную практическую ценность.

ВЫВОДЫ.

1.Разработана модельная система, позволяющая индуцировать переход в некультивируемое состояние у патогенных бактерий, изучать различные параметры этого процесса и проводить генетические исследования. Система включает штамм, способный к быстрому переходу в некультивируемое состояние, оптимальные условия для индукции процесса и полимеразную цепную реакцию как адекватный метод тестирования бактерий, находящихся н этом состоянии. В разработанной модельной системе показана способность ЗлурЬтшпит к переходу и длительному существованию в пекультнвируемом состоянии.'

2.Определены факторы внешней среды и физиологического состояния культуры, позволяющие управлять параметрами процесса перехода Б ДурЫтигшт в некультивируемое состояние.

3.Показано, что для поддержания некультнвируемого состояния в клетках бактерий должен сохраняться остаточный уровень синтеза белка.

4.Г1оказана способность некультивнруемых форм к рекультивации в жидкой питательной среде и в организме чувствительных хозяев. На модели

внутрибрюшинного заражения лабораторных животных показано сохранение некультивируемыми формами вирулентных штаммов патогенного потенциала.

5.Выявлсно влияние ряда известных генов, кодирующих жизненно важные функции бактериальной клетки, такие как подвижность, хемотаксис, синтез пуриновых оснований, синтез бета- и сигма-субъединиц РНК-полимсразы на параметры процесса образования некультивируемых форм у йЛурЬшгшпшп.

6.При использовании разработанной модели и метода инсерционного мутагенеза получена коллекция мутантов 8.1урЫтигшгп, характеризующимися различными фенотипами в отношении способности к переходу в некультивируемое состояние.

7.Для идентификации мутантных генов осуществлено их клонирование и определение нуклеотидных последовательностей фрагментов мутантных генов, прилежащих к месту ннсерции транспозона.

8.Сравнсние нуклеотидных последовательностей фрагментов мутантных генов с банком данных о нуклеотидных последовательностях геномов энтсробактерий позволило идентифицировать три гена, участвующих в генетическом контроле процесса перехода сальмонелл в некультивируемое состояние. Один из генов - 1р/ - кодирует синтез не изв'естных ранее у ЗлурЬитшпит длинных полярных пилей. Второй ген - - входит в состав оперона, индуцирующегося в различных стрессовых для клеток кишечных палочек и сальмонелл условиях, а в клетках сальмонелл - и в макрофагах хозяина при инфекции. Третий ген - glgC - кодирует синтез фермента АГ)Р-глюкозо-гшрофосфорилазы, участвующего в синтезе основного запасного вещества клетки - гликогена.

9.Разработан методический подход на основе последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР для изучения активности

идентифицированных генов в процессе перехода п некультивируемое состояние.

М.При использовании методов сканирующей электронной микроскопии и трансмиссионного анализа показано изменение морфологии клеток при переходе в некультивируемое состояние: клетки приобретают сферическую кокковидпую форму, ДНК находится в наиболее защищенной от внешнего воздействия форме - в виде нуклеопротеида.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ÍIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яковлева О.Н., Романова Ю.М., Петровская В.Г. Влияние R-плазмид штаммов Salmonella typiiimurium различного происхождения на вирулентность сатьмонелл. //Журнал микробиологии. 1983.-N9. стр.40- 46.

2. Тарутина З.Е., Романова Ю.М., Степанова Л.К., Петровская В.Г. Картирование генетического детерминанта, контролирующего синтез К-аитигена сальмонелл. Сообщение I. Определение локализации детерминанта в опытах конъюгации. Журнал микробиологии. 1983. N.12. стр.27-29.

3. Романова Ю.М., Тарутина З.Е., Степанова Л.К., Белая Ю.Ф., Петровская В.Г. Картирование генетического детерминанта, контролирующего синтез К-ангпгена сальмонелл. Сообщение II. Изучение неподвижных мутантов Salmonella typhimurium. Журнат микробиологии. 1985.N2. стр.34-38.

4. Ьондаренко В.М., Романова Ю.М., Петровская В.Г. Актуальные вопросы генетики вирулентности сальмонелл. В кн. "Болезни сельско-хозяйственных ■животных." Алма-Ата 1986. стр.82-84.

5. Мегод получения бактериальных живых вакцин, не способных к распространению. Linde К., Bondarenko V.M., Randhagen В., Romanova Yu., Wonit/.ki Ch. Патент 231491 AI. ГДР. Заявл. 28.1 1.84. No. A61 k/269635. опубл. 02.01.86 МКИ A61 к39/02.

6. Бондаренко В.М., Романова Ю.М., Петровская В.Г. Генетические принципы конструирования живых вакцин. В сб. тезисов У съезда ВОГиС им.Н.И. Вавилова. 1987. том.5. стр. 79.

7. Штамм бактерий Salmonella typhimurium, используемый для изготовления живой сальмонеллезной вакцины. Бондаренко В.М. Романова Ю.М., Линде К., Рандхаген Б., Вонитски К. (ГДР) и Полоцкий Ю.Е. Авторское свид. N. 1389054 от 15.12.1987.

8. Бондаренко В.М., Романова Ю.М. Плазмиды вирулентности патогенных энтеробактерий. Микробиологический журнал. 1987. - том. 49. стр.?2-106.

9. Бондаренко В.М., Романова Ю.М. Конструирование живых вакцин для профилактики сальмонеллезной инфекции. В сб. "Иммуно-биологические препараты нового поколения и методы их контроля. Москва. 1988.стр.53-58.

10. Linde К., Dentchcv V., Bondarenko V.M., Marinova S., Randhagen В., Bratoeva M., Tsvetanov Y., Romanova Yu.M. Live Shigella flexneri 3a and Shigella sonnei I vaccine candidate strains with retained invasiveness but reduced intracellular multiplication. Vaccine. 1990.-vol.8. p. 25-29.

П."Сальмонеллезы животных и меры борьбы" Методические рекомендации. Бияшев Л.Б., Толысбаев Б.Т., Тулкибаев Л.А., Бондаренко В.М., Маракуша Б.И., Романова Ю.М. Алма-Ата 1991.

12.Романова Ю.М. Плазмиды вирулентности бактерий рода Shigella. //Молекул. генетика 1991. -N6. стр. 3-9.

13. Полоцкий Ю.Е., Бондаренко В.М., Линде К., Романова Ю.М., Смирнова Г.В., Свириденко В.Ф.Морфологическая оценка безвредности и протективной активности вакцинного штамма Salmonella typhimurium 274. Журнал микробиологии. 1992.N4. стр. 33-37.

14. Полоцкий Ю.Е., Ефремов В.Е., Бондаренко В.М., Кузьмин В.А., Смирнова Г.В., Романова Ю.М., Белов А.Г., Максимов П.Н. Защита от вирулентных сальмонелл групп В и Д после пероральной иммунизации цыплят гибридом Salmonella typhimurium и Salmonella dublin. //Журнал микробиологии 1992. - N 9-10. стр. 50-57.

15. Khmel I.A., Bondarenko V.M., Manokhina I.M., Basyuk Е.1., Metlitskaya A.Z., Lipasova V.A., Romanova Yu.M. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of В and С types.//FEMS Microbiol.Lett. 1993.-vol.l ll.p.269-274.

16. Хмель И.А., Манохина И.М., Бисгок Е.И., Метлицкая Ф.З., Липасова В.А., Романова Ю.М., Бондаренко В.М. Характеристика энтеробактерий, продуцирующих антибиотики широкого спектра действия - микроцины. //Генетика. 1993.-том.29. N.5. стр. 768-776.

17. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Есть ли сходство между процессами образования некультивируе.мых форм у грамотрицательных микроорганизмов и спор у бацилл'.'// Молекул.генетика. 1993. N6. стр. 34-37.

18. Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., Левина Г.А., Романова Ю.М. и др. Использование полимеразной цепной реакции для изучения перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние.// Молекул.генетика.

1994. N2, стр. 17-21.

19. Романова Ю.М., Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Идентификация патогенных бактерий в объектах окружающей среды с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). //Тезисы YI конференции РФ "Новые направления биотехнологии" г.Пущино. 1994.

20. Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., Левина Г.А., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л., Прозоровский C.B. Некультивируемые формы Salmonella typhimurium: применение метода ПЦР для изучения процесса их формирования в сапрофитической фазе. //В сб. "Патогенные бактерии в сообществах" Росагросервис Москва 1994. стр. 142-149.

21. Романова Ю.М., Терехов A.A., Гинцбург А.Л. Выделение и характеристика мутантов Salmonella typhimurium с нарушенным процессом образования некультивируемых форм.// Генетика. 1995. т.31. N8. С. 10731078.

22. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург АЛ. Изучение особенностей перехода в пекультшшруе.мон состояние штаммов S.typhimurium с мутациями, нарушающими синтез пуриновых оснований. //Молекул.генетика.

1995.-N1. стр. 26-28.

23. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Генетический кошроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий.// Журнал микробиологии. 1996.-N3. стр. 16-18.

24. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Использование ПЦР для идентификации патогенных энтеробактерий в некультивируемом состоянии. // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции "Применение метода ПЦР

для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения." Сочи 1996. стр. 123-125.

25. Романова Ю.М., Кириллов М.Ю., Терехов A.A., Гинцбург A.A. Идентификация генов, нарушающих процесс перехода в нскультивируемое состояние у Salmonella typhimurium. // Генетика 1996. том 32, N9. сгр. 11841190.

26. Диденко J1.B., Константинова Н.Д., Романова Ю.М., Левина Г.А., Алексеева Н.В. Новый метод для концентрирования бактериальных суспензий для трансмиссионного электронно-микроскопического анализа.// Молекул.генетика. 1996. N4. стр.35-39.

27. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург А.Л. Диагностика некультивируемых форм бактерии с помощью метода ПЦР.//В "Материалах YII Съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов" Москва 1997. том 1. стр. 393.

28. Гинцбург А.Л., Романова 10.М. Некультивирусмые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов в природе. //Журнал микробиологии 1997. -N3.