Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюция и распространение мобильных генетических элементов в геномах представителей отряда Lepidoptera

ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Эволюция и распространение мобильных генетических элементов в геномах представителей отряда Lepidoptera"

На правах рукописи

Сормачева Ирина Дмитриевна

ЭВОЛЮЦИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ В ГЕНОМАХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОТРЯДА ЬЕРГООРТЕИА

03.01.09 - математическая биология, биоинформатика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2014

005560183

Работа выполнена в лаборатории молекулярно - генетических систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Блинов Александр Геннадьевич Официальные оппоненты: Бажан Сергей Иванович

доктор биологических наук, доцент, заведующий теоретическим отделом, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), р.п. Кольцово, Новосибирская область.

Гусев Владимир Дмитриевич

кандидат технических наук, старший научный сотрудник, старший научный сотрудник лаборатории анализа данных, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт математики им. С.Л. Соболева Сибирского отделения Российской академии наук (ИМ СО РАН), г. Новосибирск.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук (ИОГен РАН), г. Москва.

Защита диссертации состоится « »

- .--201 Ь г. на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090 тел/факс: (383) 363-49-06 (1321); e-mail: dissov@bionet.nsc.ni. факс: (383)333-12-78

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН и на сайте института www.bionet.nsc.ru.

Автореферат разослан « S»G&teaSkjL. 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Мобильные генетические элементы (МГЭ) - последовательности ДНК, способные менять свою локализации) в геноме. МГЭ описаны практически для всех эукариотических организмов и могут составлять значительную фракцию их геномов.

МГЭ являются ключевыми факторами нестабильности геномов эукариот и участвуют в изменении структуры и размера геномов, нарушении функций генов и появлении новых функций. Активные исследования МГЭ показали, что с ними связано развитие системы поддержания продолжительности жизни клеток, формирование процесса У(0)1-рекомбинации, возникновение некоторых заболеваний человека, процесс старения, и многие другие свойства организмов-хозяев (Feschotte, Pritham, 2007; St. Laurent et al., 2010; Rostant et al., 2012; Kaer, Speek, 2013).

Благодаря способности к горизонтальному переносу, МГЭ могут участвовать в передаче генетической информации между репродуктивно изолированными и эволюционно удаленными видами. Особый интерес у исследователей горизонтального переноса вызывают МГЭ порядка non-LTR ретротранспозонов (класс I ретротранспозоны) и TIR ДНК транспозонов (класс II ДНК транспозоны). Горизонтальный перенос характерен для T1R ДНК транспозонов, на данные элементы приходится около 40% от всех случаев горизонтального переноса МГЭ, выявленных между геномами эукариот. Горизонтальный перенос non-LTR ретротранспозонов напротив чрезвычайно редкое явление, и наследование данной группы элементов происходит вертикально от родителей к потомкам. Изучение данных групп элементов позволит получить новые данные о разнообразии, особенностях распространения МГЭ и механизме горизонтального переноса.

Несмотря на актуальность проблемы изучения МГЭ, в картине происхождения, разнообразия и распространения МГЭ остается ряд нерешенных вопросов. Изучение данных вопросов осложняется тем, что в литературе накоплены данные о МГЭ, представленных в геномах модельных объектов, таких как Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana и Homo sapiens. Исследования особенностей МГЭ на новых «немодельных» объектах позволит получить дополнительную информацию об эволюции геномов хозяев и МГЭ в целом.

Отряд Lepidoptera (Чешуекрылые) - самый крупный отряд насекомых (Insecta), включающий в себя 47 суперсемейств, 124 семейства, 332 подсемейства и более 157000 видов (Kristensen, 2003; van Nieukerken et al., 2011). Представители данного отряда являются значимыми компонентами природных экосистем, оказывают влияние на деятельность человека и являются удобными

объектами для научных исследований. Большинство представителей отряда имеют сложный жизненный цикл, что может представлять особый интерес в связи с изучением механизма горизонтального переноса МГЭ. Исследования МГЭ из геномов представителей отряд Lepidoptera позволят получить информацию о распространении, разнообразии и эволюции МГЭ элементов в геномах насекомых и эволюции геномов хозяев.

В рамках данной работы было проведено исследование распространения, разнообразия и эволюции CRI non-LTR ретротранспозонов и mariner-like TIR ДНК транспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera с помощью биоинформатических и экспериментальных методик. Применение экспериментальных подходов позволило получить последовательности МГЭ представителей отряда, для которых к настоящему моменту не секвенированы полногеномные последовательности. Биоинформатический анализ позволил осуществить поиск МГЭ в секвенированном геноме Bombyx morí и проанализировать последовательности, полученные в результате биоинформатического и экспериментального поиска.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение распространения, разнообразия и эволюции CRI non-LTR ретротранспозонов и mariner-Wkc TIR ДНК транспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование разнообразия CRI non-LTR ретротранспозонов в геноме тутового шелкопряда Bombyx morí и геномах других представителей отряда Lepidoptera (Insecta).

2. Анализ эволюции CRI non-LTR ретротранспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera.

3. Исследование разнообразия mariner-\\ke TIR ДНК транспозонов в геноме тутового шелкопряда Bombyx morí и геномах других представителей отряда Lepidoptera и класса Insecta.

4. Анализ эволюции mariner- like TIR ДНК транспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera.

5. Выявление фактов возможного горизонтального переноса mariner-Vks TIR ДНК транспозонов и CRI non-LTR ретротранспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera.

6. Поиск и анализ химерных конструкций, содержащих mariner-\ike TIR ДНК транспозоны и CRI non-LTR ретротранспозоны, в геномах представителей отряда Lepidoptera.

Научная новизна. Впервые было нроведено исследование распространения, разнообразия и эволюции mariner-Mke TIR ДНК транспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera. Был выявлен новый mariner-Wke

ДНК транспозон BmmarY в геноме Bombyx morí. Подтвержден горизонтальный перенос CRIB non-LTR ретротранспозонов между бабочками семейства Lycaenidae и молями семейства Bombycidae. Продемонстрирован случай горизонтального переноса mariner-like ДНК транспозонов и выявлены химерные конструкты, содержащие mariner-like ДНК транспозоны со встройкой CRIB элементов.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенного исследования был обнаружен уникальный случай горизонтального переноса mariner-Yike ДНК транспозонов между представителями семейств Lycaenidae и Bombycidae. Был подтвержден горизонтальный перенос CRIB non-LTR ретротранспозонов между представителями семейств Lycaenidae и Bombycidae. Были обнаружены свидетельства совместного горизонтально переноса CRIB и mariner-like элементов и участия mariner-like элементов в горизонтальном переносе CRIB.

Результаты, полученные в рамках настоящего исследования, вносят вклад в понимание распространения, разнообразия и эволюции CRIB non-LTR ретротранспозонов и mariner-like ДНК транспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera. Полученные данные могут быть внедрены в образовательный процесс и использованы при разработке векторных конструкций для трансгенеза, основанных на МГЭ насекомых.

Положение, выносимое на защиту. Распространение Bmmarl-like, BmmarY-Wks ДНК транспозонов и CRIB non-LTR ретротранспозонов в геномах представителей семейств Lycaenidae и Bombycidae произошло в результате горизонтального переноса между представителями данных семейств.

Апробация результатов. Материалы диссертации докладывались на Международной Московской конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, Россия, 2011), на 6-ом Международном симпозиуме по Молекулярной Биологии Насекомых (Амстердам, Нидерланды, 2011), на 8-ой конференции Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (BGRS\SB' 12, Новосибирск, 2012).

Личный вклад автора. Основные результаты работы получены автором самостоятельно. Экспериментальный поиск CR1 non-LTR ретротранспозонов проводился совместно с к.б.н. Новиковой О.С. и Смышляевым Г.А. Биоинформатический анализ генома Bombyx mori осуществлялся в сотрудничестве с Новиковым A.C.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из которых 2 работы в рецензируемых отечественных журналах и 1 работа в рецензируемом зарубежном журнале.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений,

выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 137 страницах, содержит 30 рисунков и 3 таблицы. Библиографический указатель литературы включает 200 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологический материал 60 видов из 15 семейств и 8 суперсемейств отряда Lepidoptera был предоставлен доктором Ч. Миттером (Мэрилендский университет, США), к.б.н. О. Костериным (Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия), к.б.н. В. Дубатоловым (Институт систематики и экологии животных СО РАН, Россия) и доктором Евой Сливинской (Ягеллонский университет, Польша). Для экспериментального поиска и получения последовательностей CRI non-LTR ретротранспозонов, mariner-like ДНК транспозонов (MLE) и химерных элементов CR1B/MLE использовались методики ПЦР амплификации, электрофореза, клонирования и секвенирования. Результаты ПЦР амплификации CRI non-LTR ретротранспозонов и MLE ДНК транспозонов подтверждались методом дот-блот гибридизации. Для подтверждения результатов ПЦР амплификации CR1B/MLE элементов были созданы мини библиотеки клонов и проведен скрининг методом «colony lift assay» согласно Sambrook et al. (1989). Биоинформатический анализ последовательностей проводили с помощью программ: BLAST (Altschul et al., 1990), ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), ClustalW (Thompson et al., 1994), Vector NTI v.l 1.0 (Lu, Moriyama, 2004), UniPRO UGENE v. 1.12.3 (Okonechnikov et al., 2012), MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011) PhyML 3.0 (Guindon et al., 2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ

CRI non-LTR ретротранспозоны в геномах представителей отряда Lepidoptera

Предпосылкой к проведению настоящей работы является уникальный случай горизонтального переноса (ГП) элементов CRIB группы CRI non-LTR ретротранспозонов, выявленный при изучении разнообразия данных элементов в геномах бабочек рода Maculinea семейства Lycaenidae, и молей видов Bombyx mori и Oberthueria caeca семейства Bombycidae (Lepidoptera) (Novikova et al., 2007).

В настоящей работе было проведено исследование распространения и разнообразия CRI non-LTR ретротранспозонов в геномах 60 видов отряда Lepidoptera. В результате экспериментального поиска CRI non-LTR ретротранспозонов методом ПЦР амплификации было показано присутствие CRI элементов в геномах 55 из 60 исследованных видов. Анализ последовательностей обратной транскриптазы, полученных в результате ПЦР

амплификации, клонирования и секвенирования, показал, что 156 последовательности из 37 видов относятся к CRI non-LTR ретротранспозонам, а 162 последовательности относятся к T1Q, Jockey и RI non-LTR ретротранспозонам.

Результат филогенетического анализа последовательностей обратной транскриптазы CRI, T1Q, Jockey и RI non-LTR ретротранспозонов, полученных в настоящей работе и доступных в базе данных GenBank, представлен на рис. 1.

CR1 Еитаеив godarti CR1 Thecle betulee CR1 Naratbura japonice

*0 cR1 Symmachfa xypeto CR1 Theopa virglllus CR1 Catocydotis adalina CR1A Pseudoiucfa collina R1A Shijimaaoidaa divina CR1A Maculinea ssp. <

CR1B-16 Maculinaa arion CR1B-19 Maculinea aloon CR1B-12 Maculinaa nausittious CR1B-11 Maculinaa nausithous - CR1B-17 Maculinaa Maius CR1B-5 Oberthueria caeca CR1B-4 Oberthueria caeca ' CR1B-13 Maculinea aicon CR1B-17 Maculinaa arion CR1B-8 Ofcmrfhuoria caeca CR1B-2 Bombyx huttoni a CR1B-1 Bombyx huttoni v CR1B Bombyx mon Q

CR1B-3 Bombyx mandarina r CR1B-16 Maculinaa tatous

CR1 Meiitaea phoabe

_____ Bombyx mandat

Kendo Bombyx mort asimosj CR1-4 Bombyx mandarina CR1 -6 Bombyx mandarina ZENON Bomb) CR1 Bombyx m CR1 Perigonia ilus

«a CR1 Erinnyis al h CR1 Dovania poecila tntria dlapar CR1 PoWa nebufosa

frugiparda fpkcmm dalhrat s sylvata

cri-27 Araschma lavana

CR1-3 Lasiocmmpa quercus ' cr1-26 bmw theano ' CR1-15 Coanonympha glycarion CR1 AgroOs exdamaOonla CR1 Mylhlmnasp. CR1 Erinnyis e/to CR1 Araschnla levana CR1 Dovania poedla

CR1-S Oxytenis modestie CR1 Asthanldla tranavanaria

Рис. 1. Бескорневое филогенетическое древо,

реконструированное на основе последовательности обратной транскриптазы методом

объединения ближайших

соседей (NJ) в программе MEGA 5.0. Для оценки достоверности был использован бутстреп-тест (1000 репликаций). Значения коэффициентов поддержки бутстреп-теста менее 50% не показаны. Кластеры T1Q, Jockey и R1 представлены схематично. Бабочка голубого цвета обозначает бабочек голубянок семейства Lycaenidae, бабочка коричневого цвета - молей семейства Bombycidae.

Jockey

R1

Non-LTR ретротранспозоны, представленные в геномах насекомых отряда Lepidoptera. формируют пять крупных кластеров: T1Q; Jockey, RI, Aurivillius и Fabre. CRI non-LTR ретротранспозоны кластера Fabre широко представлены в геномах изученных видов отряда Lepidoptera. Данные элементы выявлены в

геномах 20 изученных видов из 11 семейств отряда, в том числе в геномах настоящих бабочек (семейств Lycaenidae, Riodinidae, Nymphalidae и Papilionidae) и молей (семейства Bombycidae). CRI non-LTR ретротранспозоны кластера Aurivillius характеризуются ограниченным распространением в геномах Lepidoptera (Рис. 1 ).

Филогения. реконструированная на основе последовательностей элементов T1Q, Jockey, RI и CRI, в основном согласуется с филогенией видов хозяев (Рис. 1). Эволюция данных элементов в геномах изученных видов происходила путем вертикального наследования. Исключение составляют элементы кластера F abre. Так, в подгруппе CRIB присутствует элементы исключительно из геномов двух семейств Lycaenidae (род Maculinea) и Bombycidae (рода Bombyx и Oberthuriá), которые кластеризуются в одну ветвь. Различие между последовательностями обратной транскриптазы CRIB элементов из геномов представителей Lycaenidae и Bombycidae составляет от 3.6% до 4.8%. Неравномерное распределение CRIB элементов, высокое сходство последовательностей из геномов эволюционно удаленных видов и несоответствие филогении данных элементов и филогении видов хозяев являются свидетельствами ГП CRIB между бабочками Lycaenidae и молями Bombycidae.

Для подтверждения неравномерности распространения CRIB элементов в геномах Lepidoptera была проведена дот-блот гибридизация проб, специфичных к элементу CRIB, с геномной ДНК 25 видов отряда Lepidoptera (Рис. 2).

CR1B 1. M. teleius 14 Р n&bulosa

ДНК 2. М. впоп 15. Mythimna sp.

500 Hr • 3-£ godartl 16. Р ¡tus

4- С. regula 17. Р. туорз

5. M. iamacíius 16. A. tau

100 иг . 6. A. levaría 19. О. modestia

1 2 3 4 5 6 7 8 9 to 11 12 13 7. и. phoeba 20. В. morí 500нг » * 8. В. ttiean 21. В. mandarina

9. О. scuida 22. С. gleucescens

10. Я stubbendaríii 23, О chromana 100 нг * 11. С. hyale 24 T btunnee

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 12. Drapana sp. 25 i quercus

13. L. dispar

Рис. 2. Результат дот-блот гибридизации образцов ДНК 25 видов бабочек и молей с пробами специфичными к элементу CRIB. Список использованных видов приведен справа, номера соответствуют номерам в таблице 3.1. В качестве зонда был использован I' -меченный фрагмент последовательности обратной транскриптазы CRIB элемента из M. teleius.

Результаты дот-блот гибридизации подтвердили результаты ПЦР амплификации и ограниченное распространение CRIB элементов в геномах изученных видов отряда Lepidoptera.

Для подтверждения ГП CRIB элементов между геномами бабочек Lycaenidae и молями Bombycidae был проведен «divergence-versus-age» анализ последовательностей обратной транскриптазы non-LTR ретротранспозонов, полученных в данной работе (Рис. 3).

1 3 6 10 30 60 100 ЗОО 600 1000 1200

(Optera.I txndoptera i л -эвомгя

tWwefi^Papaicma'Aw) -'00МТЭ

Время в Муа

Pec. 3. Результаты «divergence-versus-age» анализа non-LTR ретротранспозонов из геномов Lepidoptera. По оси Y отложены значения различий между аминокислотными последовательностями обратной транскриптазы из различных групп организмов, подсчитанные в программе MEGA По оси X отложено время дивергенции организмов-хозяев в Муа (Муа -million years ago - миллионы лет назад) (Gaunt, Miles, 2002; Douzery et al., 2004; Nazari et a!., 2007). Штрихпунктирная и сплошная линии представляют собой кривые скорости эволюции последовательностей МГЭ позвоночных и артропод, соответственно (согласно Malik et а!.. 1999).

Согласно результатам «divergence-versus-age» анализа элементы группы CRIB характеризуются низкой скоростью эволюции аминокислотных последовательностей обратной транскриптазы по сравнению с элементами R1, Jockey и T1Q, и контролем (Malik et al., 1999) (Рис. 3). Снижение скорости эволюции подтверждает ГП CRIB элементов между геномами бабочек Lycaenidae и молей Bombycidae.

ГП non-LTR ретротранспозонов является редким событием, механизм которого не установлен. Одним из возможных механизмов является перенос данных элементов в составе химерных конструкций, в случае которых последовательности non-LTR ретротранспозонов встроены в ДНК транспозоны. В настоящей работе было сделано предположение о том. что mariner-like TIR ДНК транспозоны (MLE) принимают участие в горизонтальном переносе CRIB non-LTR ретротранспозонов между представителями отряда Lepidoptera.

Для подтверждения данного факта был проведен биоинформатический поиск химерных конструкций типа CRIBIMLE в геноме В. mori. В результате поиска было обнаружено два локуса, содержащих элементы Bmmar-like (MLE) и BmCRIB (Рис. 4).

BmCRIB

BmCR1ß'Bmmar1 1273 n.o.

BmCRIB/Bmmare

2691 no

PiMb/1 iwiauKOi

Рис. 4. Структура химерных последовательностей BmCRJB/MLE из генома В. morí. Цифры внизу рисунка соответствуют позициям нуклеотидной последовательности MLE, цифры над рисунком соответствуют позициям нуклеотидной последовательности BmCRIB, стрелки указывают направление ориентации последовательности. Аббревиатура: п о - пары оснований, TIR - terminal inverted repeat (концевые инвертированные повторы), TSD - target site duplication (дупликация сайта - мишени)

Химерные конструкции представляют собой полноразмерный Вттаг-like MLE элемент, содержащий встройку нарушенного CRIB элемента, и могут являться результатом ГП данных элементов.

Mariner-like TIR ДНК транспозоны в геномах представителей отряда Lepidoptera

Для проверки гипотезы участия MLE TIR ДНК транспозонов в ГП CRIB элементов был проведен анализ распространения и разнообразия MLE ДНК элементов в геномах представителей класса Insecta и отряда Lepidoptera. Биоинформатический поиск и анализ последовательностей MLE из геномов Insecta, представленных в базе данных GenBank, показал присутствие элементов 13 подсемейств семейства mariner и по одному подсемейству семейств morí и Zudem {MLE). Разнообразие MLE элементов в геномах Lepidoptera ограничивается шестью подсемействами mariner (DTTMarCRI, cecropia, mauritiana, mellifera, vertumana, irritons) и семейством morí. Биоинформатический анализ генома В. mori позволил выявить 6 M LE (Вттаг 1-б), описанных ранее, и один новый элемент BmmarY.

Экспериментальный поиск MLE элементов в геномах 60 видов отряда Lepidoptera, проведенный с помощью ПЦР с праймерами, специфичными к центральной части гена транспозазы, выявил присутствие данных элементов в геномах 36 видов. Результат филогенетического анализа последовательностей транспозазы MLEs, полученных в рамках данной работы с помощью теоретических и экспериментальных методов, представлен на рис. 5. MLEs из геномов представителей отряда Lepidoptera, полученные в результате экспериментального поиска, распределяются между пятью кластерами MLE элементов: cecropia, mellifera, mauritiana, mori и vertumana (Рис. 5).

А)

ï

GS1

Macuiinea teleius Maculinea arion Bombyx mori23 [WGSI

Maculinea teleius2 Maculinea arion3 Maculinea nausithous4 Maculinea alcon4 Pseudolucia collina8 Bombyx huttonix _Bombyx mori4IWGS1 _

Scolitantides o non* Maculinea teleius2 Maculinea nausithous2 Maculinea arion3 Narathura japonica3 Brangas neora1 Emesis Iucinda3 Euselasia chrysippe7 Bombyx mori8 fWGS1 Quentalia chromana3 - o —tmauritiana Bombyx huttom Oberthueria caeca1 _Emolatia moore/1_I

Shijimaeoides d/v/na10 Pseudozlzeeria maha5 Pseudolucia collina4 Brangas neora8 Emesis Iucinda2 Euselasia chrysippe2 Bombyx mandarina3 Oberthueria caeca3 Quentalia chromana1

Б)

ГШ

\

Bombyx mcfi пмаОЗДЗ " Bombyx mon nscal2S37 Bombyx morí nsca(2829 Bombyx morí nscaf2681

лг mori nsca!2993

B)

Bmmarl Samôyx mon IM7917 ' Bombyx mori nscaf2822 " Bombyx morí nscaf3089 Bombyx mai necaf2860 Bombyx mort nscaf3058 ' Bombyx morí nsca!2847 'Bombyx mori nscaf2865 " Mtemari .3 Maculinea »Mus ' Manmaii .2 Maculinea arion «••Marmarl.l Macuitne.i arnn

Bombyx mandarína AB383018 Bombyx mandarína i\B363017 Bombyx mandarína AB363010 Somûy* mort nsoaG795 Bombyx mori nsonra î68 Bmmar6 Bombyx morí AF461149 Bombyx mori nsoaf2:'J6ë Bombyx morí (caffokMI B ' Bombyx mon nscaf2855 ' Bombyx morí nscal2930 Bombyx mon nscat2607 Bombyx morí n«caf3056

Pcomar8 Pseudolucia collina ' Pcomar27 Pseudolucia соШпа PcomarlO Pseudolucia cdllna ■ Pcomar9 Pseudolucia colima " Pcornar7 Paeudohioa collina " P com art 4 р*шььы* colima Pcomar22 Pseudolucia collina Pcomar2l Pseudoluca cotona

I-HetiothtS Vtnscans DQ174779

ico Г Bactrocera naohumeratis AF3484M H "f Teleops/s rubicunda EF035477 I IV" УЫворМз Qukxjuagvttata DQ197D25 H Bombyx mori raca?3097 Bombyx morí nscaf2970

_ ' Bombyx mon nacad071

,___ / 1001- MtemarY.1 Mac uiinea teleius

M ! / BmmarY Bombyx morí DQ443409

---« oc Bombyx mort п«саТЭ06Э

75 MalmarY.5 Macuiinea alcon MalmarY.6 Maculinea alcon MnamarY.4 Maculinea nausithous MalmarY.2 Maculinea alcon MnamarY.1 Maculinea nausithous МпатагУ.5мломло<ч nausithous MnamarY.3 Maculinea nausithous BhmarY.1 Bombvx huttoni MacTelmarY.2 Maculinea teleius MalmarY.1 Maculinea alcon MarmarY.1 Maculinea alcon MannarY.3 Maculinea arion MarmarY.2 Macuiinea arion

Рис. 5. Схематичное представление филогенетического древа, реконструированного на основе последовательностей транспозазы mariner-like элементов (MLEs). А) Иллюстрирует все подсемейства MLEs выявленные в геномах изученных видов отряда Lepidoptera. Число последовательностей, использованных в анализе, указано после названия вида. Б) и В) Детальные представления ветвей mori и vertumana. Бабочка голубого цвета обозначает бабочек голубянок семейства Lycaenidae, бабочка коричневого цвета - молей семейства Bombycidae. Аббревиатура: ГП - горизонтальный перенос; WGS - whole genome sequencing (полногеномное секвенирование).

Наиболее многочисленными являются кластеры mauritiana, cecropia и mellifera. Элементы данных кластеров распространены равномерно в геномах изученных видов. MLE элементы, по-видимому, эволюционировали в# геномах представителей отряда Lepidoptera путем вертикального наследования. Исключение составляют элементы кластеров vertumana и mori. Элементы кластеров mori (Bmmarl-like) и vertumana (BmmarY- like) представлены исключительно в геномах представителей родов Maculinea и Bombyx, и характеризуются высоким сходством последовательностей внутри кластеров при межвидовых и внутривидовых сравнениях (Рис. 5). Перечисленные факты

свидетельствуют о возможном горизонтальном переносе данных элементов между геномами представителей Lycaenidae и Bombycidae.

Сравнения последовательностей коротких фрагментов гена транспозазы недостаточно для достоверного разрешения эволюционных взаимоотношений MLE элементов из геномов Bombyx и Maculinea. Для подтверждения горизонтального переноса Bmmar-Yike было проанализировано разнообразие и распространение полноразмерных последовательностей элементов vertumana (BmmarY-like), morí {Bmmarl-like и Вттагб-like) и cecropia (ВттагЗ-like) в геномах представителей родов Maculinea, Bombyx и некоторых других групп отряда Lepidoptera (28 видов), с помощью ПЦР амплификации.

В результате ПЦР амплификации было показано, что полноразмерные копии элементов ВттагЗ-like распространены равномерно среди изученных видов. Распространение элементов Bmmarl-like, Вттагб-like и BmmarY-Uke среди представителей Lepidoptera ограничено родами Bombyx (Bombycidae) и Maculinea (Lycaenidae). Уровень сходства последовательностей BittmarY-like элементов из геномов Bombyx и Maculinea является высоким (96.6%) и соответствует уровню сходства последовательностей внутри данных родов. Аналогичные результаты получены для Bmmarl-like элементов: сходство последовательностей из геномов Bombyx и Maculinea составляет 92.3%. В случае ВттагЗ-like элементов сходство последовательностей из геномов Bombyx и Maculinea составляет 84.1%, а внутри родов уровень сходства составляет 90.1% и 93.9%, соответственно.

Результаты ПЦР амплификации, демонстрирующие неравномерное распространение Bmmarl-Yike и BmmarY-Yike элементов в геномах изученных видов, были подтверждены с помощью дот-блот гибридизации (Рис. 6).

Рис. 6. Результат дот-

инк 'И"7М' 1«.яе»5

ям иг * а г и. anón блот гибридизации образцов

9 3. Е godarfr

л с. regula ДНК 25 видов бабочек и молей с

100 нг • • 5 M. lamechus

12 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12 13 6. д. «гам пробами специфичными к

вдп ш « 7 M. pftoebe

• • а Е iimtv элементам Bmmarl-like и

9, О

«га нг . юряшнюаош ВттагУ-Чке. Список

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Mowpmaso. ИСПОЛЬЗОВаННЫХ ВИДОВ Приведен

13. L Лэрог

вттяп « р. „,ыыа справа, номера соответствуют

Я» мг * Ь • 15 иугмлпт «р.

w «ял« номерам в таблице 3.1. В

17 Р myops

loo иг . • ид»« качестве зонда был использован

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 19. о. modela

а], tí. morr 21. в. mandarína

Р " меченный фрагмент

■ с дшисescans последовательности обратной

• « 23 Q chrvmana

¡4 15 16 17 1S 19 20 21 22 23 24 25 24. IbramxM трЭНСкриПтаЗЫ CRIB элемента

25. L (fwsiws

из M. teleiits.

Филогенетический анализ полноразмерных Вттаг-Пке элементов и других полноразмерных М/,£, представленных в базе данных ОепВапк, выявил

несоответствие филогении, основанной на элементах Вттаг!-Нке и ВттагУ-Пке, и филогении видов хозяев (Рис. 7).

полных MLEs, с помощью метода максимального правдоподобия (ML - Maximum Likelihood) в программе PhyML 3 0. В качестве внешней группы были использованы последовательности MLEs подсемейств atlantis и mariner из геномов представителей подкласса кольчатых червей и подкласса ракообразных Для статистической оценки достоверности был использован бутстреп-тест (100 репликаций). Значения коэффициентов поддержки бутстреп-теста менее 50% не показаны Бабочка голубого цвета обозначает бабочек голубянок семейства Lycaenidae, бабочка коричневого цвета - молей семейства Bombycidae.

Для последовательностей данных элементов невозможно провести выделение отдельных ветвей, соответствующих различным родам и видам. Таким образом, Bmmarl-Yike и BmmarY- like не образуют ветвей на филогенетическом дереве, согласующихся с их видовой принадлежностью. Элементы ВттагЗ-like в кластере cecropia. напротив, образуют ветви согласно видовой принадлежности (Рис. 7).

Высокое сходство последовательностей Bmmarl-Yike и BmmarY-Uke элементов из геномов эволюционно удаленных видов (семейств Lycaenidae и Bombycidae), их неравномерное распространение в геномах изученных видов Lepidoptera и несоответствие филогении основанной на данных элементах и филогении видов хозяев являются признаками ГП Bmmarl-Yike и BmmarY-Wke элементов.

Для подтверждения ГП Bmmarl-Yike, и BmmarY-like элементов между бабочками Lycaenidae и молями Bombycidae было проведено сравнение числа синонимичных замен на синонимичный сайт (dS) для данных элементов. В случае если МГЭ попал в геном в результате вертикального наследования. dS в последовательностях МГЭ должна соответствовать dS ядерных генов геномов хозяев. Если МГЭ был перенесен в геном горизонтально, то значение dS его последовательности МГЭ должно быть значительно ниже, чем dS генов хозяина.

Для сравнительного анализа dS были использованы три группы последовательностей: последовательности ядерных генов (wg, EFla и НЗ), наследование которых происходило вертикально; последовательности BmmarY-like и Bmmarl-Yike элементов из геномов В. mori и Maculinea (М teleius, М nausithous, М. arion и М. alcon), для которых предполагается горизонтальный перенос и последовательности ВттагЗ-like элементов из геномов Bombyx mori и Maculinea (М. teleius, М. nausithous, М. arion и М. alcon), эволюция которых, по-видимому. происходила вертикально.

Рис. 8. Значения dS для mariner — like элементов Bmmarl, BmmarY и ВттагЗ, и ядерных генов фактора элонгации альфа (EFla), wingless (wg) и гистона НЗ (НЗ) в попарных сравнениях между В. mori и видами М. arion, М. nausithous, М. teleius, и М. alcon. Результаты точного теста Фишера: ***Р<0.001; **Р<0.01; *Р<0.05; NS - не достоверно (nonsignificant).

dS в случае BmmarY-like и Bmmarl-like элементов для всех исследованных пар была достоверно ниже значений dS ядерных генов. Полученные результаты подтверждают гипотезу о горизонтальном переносе BmmarY-like и Bmmarl-like элементов между геномами бабочек семейства Lycaenidae и молей семейства Bombycidae.

Совместный горизонтальный перенос CR1B non-LTR ретротранспозонов и mariner-like ДНК транспозонов

Процессы ГП CRIB non-LTR ретротранспозонов и BmmarY-like и Bmmarl-like MLE ДНК транспозонов могли произойти независимо. Однако ГП элементов из двух различных групп МГЭ между определенными группами организмов и наличие химерных конструкций CR1B/MLE в геноме В. morí свидетельствуют о совместном переносе данных элементов. В случае если MLE элементы принимали участие в ГП CRIB non-LTR ретротранспозонов между представителями отряда Lepidoptera, химерные конструкции аналогичные конструкциям, выявленным в геноме В. morí, должны присутствовать в геномах Maculinea.

Экспериментальный поиск химерных конструкций, содержащих последовательности Bmmar-like и СR /В элементов, в геномах представителей отряда Lepidoptera (М. teleius, М. arion, В. morí и В. mandarina.) проводился с помощью методик ПЦР амплификации и «colony lift assay». В результате поиска были выявлены фрагменты, содержащие последовательности как MLE, так и CRIB элементов. Две химерные последовательности CR1B/MLE были обнаружены в геноме М. teleius (MacCRlВ/MtemarY-l и MacCRIB/MtemarY-2) и одна в геноме М. arion (MacCRlB/MarmarY) (Рис. 9).

MacCRI B/MtemarY1

2070 п о. WecuS/íea w&ua

MacCRIBMtemarY.2

1620 n o. ""......

изсшпеа leimjs

u¡ 4(463486) 703

MacCRI B/MarmarY

1070 n o.

Macutoea arion

(—- MacCB1Я~

1113

3

142 »1

Рис. 9. Структурная организация химерных элементов СИШ/МЬЕ из геномов представителей рода МасиНпеа. Цифры внизу рисунка соответствуют позициям консенсусной последовательности MI.Es, цифры над рисунком соответствуют позициям консенсусной последовательности МасСЯ!В. Черные треугольники обозначают делегированные участки, стрелки указывают направление ориентации последовательности

Сравнительный анализ полученных последовательностей показал, что они значительно отличаются между собой и отличаются от химерных последовательностей, выявленных ранее в геноме В. morí. Анализ транслированных последовательностей полученных с помощью программы ORF Finder выявил один элемент MacCRlB/MtemarY-1 (JQ580972) в случае которого встройка CRIB элемента не нарушила рамку считывания ДНК транспозона. Данная структура, возможно, представляют собой химерную конструкцию, участвовавшую в горизонтальном переносе.

Таким образом, в результате работы был подтвержден факт горизонтального переноса CRIB non-LTR ретротранспозонов, Bmmarl-like и BmmarY-like ДНК транспозонов между геномами представителей эволюционно удаленных групп отряда Lepidoptera (Рис. 10).

А)

Б)

Л A i

/// ///

i'£

////

Lycaenidae

RlODINIDAE nymphali dae Papilionoidae Hesperioidea Geometroidea Drepanoidea Calliduloidea

I-Saturniidae

i-Bombycidae

_p-Sphinigidae

'-Lasiocampoidea i

- Lymantriidae

_ íilOCTUIDAE

4m

i i

химерный CR1B/MLE: •gfjpl ск;в )Л MLE и CR1B лакус:

•ЕШЙ-СИЖИЗ--J'.-üX—irs_HMD}-

n^RALOIDEA HI

ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЬ!

мгэ

ДРУГИЕ

ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ

ВЕКТОРНЫЕ

КОНСТРУКЦИИ

Рис. 10. (А) Распространение CRI non-LTR ретротранспозонов, MLE ДНК транспозонов и химерных элементов CR1BIMLE в геномах представителей отряда Lepidoptera. Филогения видов отряда представлена согласно Tree of Life Web Project (http://tolweb.org/). (Б) Предполагаемая структура конструкций, участвовавших в горизонтальном переносе и механизм горизонтального переноса Аббревиатура: МГЭ - мобильные генетические элементы, MLEs - mariner - like elements (mariner-like подобные элементы). Бабочка голубого цвета обозначает бабочек голубянок семейства Lycaenidae, бабочка коричневого цвета - молей семейства Bombycidae.

В геномах В. morí и геномах видов рода Maculinea обнаружены химерные конструкции, содержащие последовательности CRIB элементов, встроенные в последовательность MLE элементов. Вышеперечисленные результаты свидетельствуют о возможном участии ДНК транспозонов в ГП non-LTR ретротранспозонов. MLE элементы обладают высокой способностью к ГП. MLE могут перенести non-LTR ретротранспозон из одного сайта в другой, если non-LTR ретротранспозон встроен в последовательность MLE (химерный конструкт). MLE могут перенести участок ДНК между двумя MLE элементами (Рис. 10). Полученные данные, тем не менее, не позволяют полностью исключить возможность того, что ГП CRIB non-LTR ретротранспозонов между геномами представителей Bombycidae и Lycaenidae произошел независимо от перемещения MLE элементов.

Механизм ГП CRIB non-LTR ретротранспозонов и MLE ДНК транспозонов неизвестен. Для успешного горизонтального переноса ДНК транспозонов и non-LTR ретротранспозонов требуется наличие вектора и возможности взаимодействия генома донора с геномом реципиентом (Wallau et al., 2012). В роли переносчика мог выступать любой общий агент бабочек и молей: бактерия, внутриклеточный паразит, симбионт, вирус и т.д. Подобным вектором может являться микроспоридий Nosema bombycis, для которого показаны случаи горизонтального переноса ДНК транспозонов hAT и MITE между геномом Nosema bombycis и геномом В. mori (Zhang et al., 2013a; Zhang et al., 2013b). Потенциальным местом взаимодействия генома донора с геномом реципиентом может являться гнездо муравьев рода Myrmica. Одна из стадий жизненного цикла (стадия гусеницы) бабочек Maculinea протекает в муравьином гнезде, а моли семейства Bombycidae могут попасть в муравейник в качестве объекта питания. Таким образом, муравейник представителей рода Myrmica является идеальным местом для прямого контакта бабочек Maculinea и молей семейства Bombycidae и перекрестного заражения паразитами, . являющимися потенциальными векторами ГП.

Заключение

В ходе работы был проведен анализ распространения и разнообразия мобильных генетических элементов групп CR1 non-LTR ретротранспозонов и mariner- like TIR ДНК транспозонов в геномах представителей отряда Lepidoptera. Выявлен горизонтальный перенос CRIB non-LTR ретротранспозонов и BmmarY-like и Bmmarl-like MLE ДНК транспозонов между геномами представителей семейств Lycaenidae и Bombycidae. В геномах Bombyx mori, Maculinea teleius и Maculinea arion были выявлены химерные конструкты CR1B/MLE.

выводы

1. Проведен поиск non-LTR ретротранспозонов в геномах 60 видов отряда Lepidoptera и установлены их филогенетические взаимоотношения. Показано присутствие четырех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CRI, T1Q, Jockey и R1) в геномах представителей отряда Lepidoptera. Элементы группы CR1 представлены двумя кластерами Aurivillius и Fabre.

2. Подтвержден факт горизонтального переноса CRIB non-LTR ретротранспозонов между геномами представителей семейств Lycaenidae (род Maculined) и Bombycidae (рода ВотЪух и Oberthueria).

3. В геномах видов отряда Lepidoptera выявлено шесть подсемейств семейства mariner (DTTMarCRI, cecropia, mauritiana, mellifera, vertumana, irritans) и семейство mori mariner-Yike ДНК транспозонов. Установлены их филогенетические взаимоотношения.

4. В геноме ВотЪух mori обнаружен новый элемент BmmarY, принадлежащий к подсемейству vertumana mariner-Yike ДНК транспозонов.

5. Установлен факт горизонтального переноса BmmarY-like и Bmmarl-Wke ДНК транспозонов между геномами представителей семейств Lycaenidae (род Maculined) и Bombycidae (род Bombyx).

6. В геномах Bombyx mori, Maculinea teleius и Maculinea arion были выявлены химерные mariner-like ДНК транспозоны, содержащие встройки CRIB non-LTR ретротранспозонов. Данные конструкции могут являться результатом совместного горизонтального переноса CRIB non-LTR ретротранспозонов и mariner-Yike ДНК транспозонов, что свидетельствуют об участии mariner-Yike элементов в горизонтальном переносе CRIB элементов между видами отряда Lepidoptera.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сормачева И.Д., Новиков А.С., Блинов А.Г. Распространение и филогенетические взаимоотношения Tel-Mariner ДНК транспозонов в отряде Lepidoptera // Евразийский энтомологический журнал. 2010. Т. 9. № 3. С. 430432.

2. Sormacheva I., Novikov A., Blinov A. Vertical evolution and horizontal transmission of TcMmariner superfamily DNA transposons in Lepidopteran species // Proceedings of international Moscow conference on computational molecular biology - MCCMB' 11. 2011. Moscow. Russia. P. 349-3 50.

3. Sormacheva I., Novikov A., Blinov A. The evolution and diversity of Tcl/mariner superfamily DNA transposons in the genomes of Lepidoptera species // Proceedings of the Sixth International Symposium on Molecular Insect Science. 2011. Amsterdam, The Netherlands. P. 123.

4. Сормачева И.Д., Блинов А.Г. LTR-ретротранспозоны растений. Вавиловский журнал Генетики и Селекции. 2011. Т. 15. №2. С. 351-381.

5. Sormacheva L, Blinov A. The recurrent horizontal transfers of different transposable elements between Lepidoptera species // Proceedings of the eighth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2012. 2012. Novosibirsk, Russia. V. 1 P. 302.

6. Sormacheva I., Smyshlyaev G., Mayorov V., Blinov A., Novikov A., Novikova O. Vertical Evolution and Horizontal Transfer of CR1 Non-LTR Retrotransposons and Tel/mariner DNA Transposons in Lepidoptera Species // Mol. Biol. Evol. 2012. V. 29. P. 3685-3702.

Подписано к печати 29.10.2014 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 150

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10