Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИНДИКАЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИНДИКАЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ"



£

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА (ВАСХНИЛ)

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ (ВИЭВ)

На правах рукописи

Аспирант РАКОВСКАЯ Розалия Викторовна

ИНДИКАЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ •

(03.00.07 — микробиология)

| ■■__■>-"■'■'" Автореферат

1 диссертации на соискание ученой степени

"" . кандидата биоЛогических наук

Москва — 1975 ..

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА (ВАСХНИЛ)

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ (ВИЭВ)

На правах рукописи

Аспирант РАКОВСКАЯ Розалия Викторовна

ИНДИКАЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

(03.00.07 — микробиология)

Автореферат' диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 19?3

Работа выполнена в лаборатории по изучению болезней свиней Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (директор — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ Я. Р. Коваленко) и на кафедре микробиологии Винницкого медицинского института им. Н- И. Пирогова (ректор — доктор медицинских наук, профессор В. Д. Билык).

Материалы диссертации изложены на 121 стр. машинописного текста, из них: введение — 3, обзор литературы — 29, собственные исследования — 56, обсуждение— 11, выводы 'И практические предложения; — 3; иллюстрирована 4 схемами, 14 таблицами и 3 фотографиями.

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор П. Я. Притулин,

доктор медицинских наук, профессор Т. А. Лобова.

Официальные оппоненты:

Ь Ст. научный сотрудник лаборатории микробиологии Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии, доктор ветеринарных наук Полякова Ольга Андреевна-

2. Ст. научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории 43 курсов офицеров ветеринарной службы, кандидат биологических наук Кузьмин Николай Афанасьевич.

Ведущее учреждение — Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия имени К- И. Скрябина. ^

Автореферат разослан «V0» 0!С'1>иЦ>7Ь<Х ¡975 г.

Зашита диссертации состоится'^у г.

в 14 часов на заседании специализированного Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (109472, Москва, Ж-472, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

. Ученый секретарь Совета ВИЭВ, кандидат биологических наук В. В. Калугин,

► В инфекционной патологии человека и животных большой удельный вес занимают сальмоиеллезы. По данным Всемирной организации здравоохранения, они являются повсеместно распространенными инфекциями- Возросший интерес к проблеме сальмонеллезов можно объяснить реальным ростом количества очагов этих заболеваний у людей и животных и необходимостью более четкой организации обнаружения сальмонелл-

Взаимосвязь между сальмонеллезами человека и животных установлена многочисленными наблюдениями советских и зарубежных исследователей, (Н. 1>га£ег, 1957; И. В. Шур, 1970; А. М. Ахмедов, 1972; Ф. Е. Будагян, 1972; Р. ОаЫег, 1972),

В возникновении и распространении сальмонеллезных инфекций значительную роль играют объекты внешней среды (корма, вода, почва), обсемененные сальмонеллами, как место временного пребывания возбудителя и промежуточное звено, через которое осуществляется механизм передачи сальмонелл от источника инфекции здоровому восприимчивому организму.

, Своевременно и точно проведенная индикация сальмо-

нелл позволяет проследить путь миграции возбудителя и помогает определить характер и специфичность противоэпидемических, нротивоэпизоотнческих и лечебных мероприятий,

► направленных на ликвидацию сальмонеллезов.

Из-за трудоемкости, недостаточной эффективности и длительности сроков выполнения анализа, современные бактериологические методы индикации сальмонелл не удовлетворяют в полной мере запросам практики. Противоречивость и несовершенство методик исследования объектов внешней среды на наличие сальмонелл, вызваны в известной степени теми трудностями, которые возникают перед бактериологом в связи с наличием в изучаемых объектах большого количества сапрофитной микрофлоры. Поэтому разработка быстрых

и простых методов индикации сальмонелл является весьма актуальной проблемой.

Одним из новых и перспективных методов индикации сальмонелл в настоящее время является метод иммунофлюо-ресценцин, открытый в 1942 г. А. Н. Coons. В пашей стране этот метод изучается уже в течение 20 лет, однако широкое практическое применение его сдерживается трудоемкостью и длительностью получения строгоспецифичных флюоресцирующих сывороток.

Учитывая актуальность проблемы сальмонеллезов, как антропозоонозных заболеваний, широкое распространение бактерий этого рода в природе, а также большую важность индикации сальмонелл в объектах внешней среды, перед нами были поставлены следующие задачи:

1- Провести сравнительное изучение эффективности бактериологического и иммунофлюоресцентного методов индикации сальмонелл в некоторых объектах внешней среды;

2. Усовершенствовать метод флюоресцирующих антнтел для целей индикации сальмонелл;

3. Разработать метод индикации сальмонелл в комбикормах.

' СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Материалы » методы исследований

Исследования проводили с 1971 по 1975 гг. в лаборатории по изучению болезней свиней ВИЗВ, на кафедре микробиологии Винницкого медицинского института им. Н. И. Пн-рогова, на Винницком мясокомбинате и в свиноводческих хозяйствах Винницкой области.

Для сравнительного изучения бактериологического и иммунофлюоресцентного методов была проведена индикация сальмонелл в 144 искусственно обсемененных пробах комбикорма, мясо-костной муки и сточной жидкости. Для индикации сальмонелл в объектах внешней среды исследовали 67 проб комбикорма, 28 проб мясо-костной муки и 56 проб сточных жидкостей, отобранных на зав одах-изготовителях и в свиноводческих хозяйствах. Были исследованы 2390 проб мышц, лимфатических узлов, печени и селезенки от 478 туш вынужденно убитых свиней.

При исследовании бактериологическим методом руководствовались методиками, изложенными в ГОСТе 7269—54. Для метода нммунофлюоресценцин препараты обрабатывали прямым способом, используя флюоресцирующие сыворотки против S. typhi murium. S. enteritidis. S. cho-Ierae suis, приготовленные по общепринятым и усовершенствованной нами методикам-

Для искусственного обсеменения проб были избраны три типа сальмонелл (S'. typhi murium, S. enteritidis. S. cho-lerae suis), на том основании, что из всего многообразия серологических типов сальмонелл им принадлежит ведущее место в патологии животных и человека-

Обсеменение проводили следующим образом: 1 мл одно-миллнардной взвеси суточной культуры сальмонелл разводили в 9 мл физиологического раствора — получали взвесь 100 млн. бактерий в 1 мл. В последующих десятикратных разведениях получали следующие концентрации взвеси сальмонелл; 10 млн., 1 млн,, 100 тыс.,-10 тыс:: 1 тыс. и 100 микробных тел в ] мл. В навеску пробы 20,0 вносили по 1 мл соответствующих количеств сальмонелл-и тщательно перемеши-I вали. Было приготовлено 8 проб комбикорма, содержащих

от 50 млн. до 5 S, typhi murium в 1,0; 8 проб, содержащих S'. enteritidis, и 8 проб, содержащих культуру S. cholerae suis в таких же концентрациях. Аналогичным образом были приготовлены 24 пробы мясо-костной муки и 24 пробы сточной жидкости, содержащие от 50 млн. до 5 микробных тел трех типов сальмонелл в 1 г. Последовательность исследования проб бактериологическим и иммунофлюоресцентным методами изложена в схеме I-

При расчете процентов выделенных культур сальмонелл, полученные результаты находились в пределах доверительных интервалов, рассчитанных по методу, Фишера, с вероятностью 95.45%.

.. . 2- Усовершенствование метода иммунофлюоресценции______

Метод иммунофлюоресценции в последнее время все чаще находит применение для индикации и идентификации различных микроорганизмов. Этот метод ценён тем, что поЗёо-' ляет выявить микроорганизмы даже в смешанных культурах , и в препаратах, приготовленных непосредственно из объек-

тов внешней среды, содержащих большое количество сапрофитных микроорганизмов.

Результат лммунофлюоресцентного метода в значитель-I ной степени зависит от качества флюоресцирующих сыворо-,

ток, применяемых для обработки препаратов, поэтому получению высокоактивных и строгоспецифичных сывороток уделяется большое внимание.

Специфическим считается яркое свеченне периферии микробной клетки с почти темной центральной частью ее. Чтобы вызвать яркое специфическое свечение клетки, сыворотка должна, видимо, содержать набор если не всех, то многих антител, соответствующих разнообразным поверхностным детерминантам бактерии (антигена).

Схема 1.

Схема

индикация сальмонелл в объектах внешней среды бактериологическим н иммуыофлюоресцеитным методами.

При иммунизации животных-продуцентов цельными микробными клетками, очевидно, большая часть антител соответствует белкам протопласта, а не оболочки бактерии. Сыворотки, полученные при иммунизации оболочками бактерий, должны, по нашему мнению, наиболее интенсивно засвечивать строго специфические антигены.

Исходя из этих теоретических предпосылок, перед нам« была поставлена задача получить флюоресцирующие сыворотки путем иммунизации кроликов оболочками микробных клеток и сравнить их с сыворотками, полученными общепринятым способом иммунизации цельными микробными клетками.

Для получения препаратов клеточных стенок мы применили метод разрушения бактериальных культур ультразвуком.

Одномнллиардную (по оптическому стандарту мутности) взвесь суточной культуры S1. typhi murium в дистиллированной воде подвергли воздействию ультразвука мощностью 100 вт/смг, частотой 20 кГц в течение 5 минут, с последующим четырехкратным центрифугированием при 6000 об/мин- в течение 30 мин. и осторожным отмыванием дистиллированной водой-

Получениый осадок взвешивали в дистиллированной воде и получали гомогенный препарат оболочек сальмонелл, который представлял собой беловатую, слегка опалесцирую-щую жидкость.

Для получения иммунных сывороток, препаратом из оболочек S'. typhi murium иммунизировали 6 кроликов по методу Kuo Ching Vuan (1957). С этой целью, полученную взвесь ежедневно вводили под конъюнктиву левого и правого глаза животного поочередно.

Схема иммунизации кролнков;

Циклы

М инъекции

Количество вводимого оболочечного антигена

1

2 3

л ер ер ьго 2 дия

0,1 мл 0,1 мл 0,1 мл

И

5

6

лерерыв 2 дня

0,1 мл 0,1 мл 0,1 мл

8 9

0,2 мл 0,2 мл 0,2 «Л

Нами разработан ускоренный способ получения глобу-линовой фракции из сыворотки крови иммунизированных животных, Прототипом, послужил метод осаждения глобулинов сернокислым натрием, описанный Ю. Н. Зубжицким (1964).

Освобождение раствора глобулинов от осаждаемой соли проводили реакцией нейтрализации с СаСЬ.при этом сернокислый кальций выпадает и осадок. Схема получения глобулинов прилагается.

Пользуясь ускоренным способом, глобулины можно получить в течение 5—6 час. При этом выделение глобулинов можно проводить в любых бактериологических лабораториях, оснащенных простым оборудованием с помощью доступных реактивов.

Опыты на морских свинках и мышах показали, что полученный глобулин безвреден и удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к препаратам из сыворотки крови, предназначенным для парентерального введения.

Для получения флюоресцирующих сывороток, полученные глобулины, содержащие антитела против S. typhi murium, коиъюгировали изотиоцианатом флюоресцеина по общепринятой методике.

Специфичность полученных флюоресцирующих сывороток определяли путем обработки препаратов из культуры S'. typhi murium,

Контролем специфичности служили:

1. Препарат из S. enteritidis + флюоресцирующая сыворотка;

2. Препарат из S. cholerae suis + флюоресцирующая, сы-

воротка;

3. Препарат из Е. coli + флюоресцирующая сыворотка;

4. Препарат из S. typhi murium, + не меченая иммунная сы-

воротка + флюоресцирующая сыворотка-

При просмотре в люминесцентном микроскопе препаратов из S'. typhi murium, обработанных флюоресцирующей сывороткой, наблюдали четкое специфическое свечение типичных по морфологии клеток сальмонелл. При исследовании контрольных препаратов . светящихся клеток выявлено не было.'

Для проверки качества полученных флюоресцирующих сывороток было проведено сравнительное изучение ее параллельно с флюоресцирующей сывороткой, приготовленной по общепринятой методике. Для этой цели мазки из суточной культуры S, typhi murium после высушивания и фиксирования обрабатывали параллельно той и другой флюоресцирующей- сывороткой. В качестве контроля использовали препараты из других ссротипов сальмонелл и Е. coli. Сыворотки наносили в рабочем разведении.

Схема 2.

Схема выделения глобулинов

Сыворотка — 1 объем вода днстилл.—2 объема

2,46 И раствор

Ыа^Од— 3 объема

Смешивание постепенное при интенсивном перемешивании ведется при комнатной температуре. Смесь — 6 объемов содержит 1,23 М Иа^ЗО^ Оформление осадка — 2 часа при температуре 37°С. Центрифугирование — 20 нин. при 3600 об/мин.

Центр нфугат

уничтожают

Осадок глобулинов растворяют минимальным количеством дистиллированной воды

+

Равный объем 1,23 М раствора СаС1г

Ыа^Од + СаС1, 2ЫаС1 +1 Са504 1 Оформление осадка 2 час. при 37°С Центрифугирование 20 мин. при 3600 об/мнн.

Получают раствор глобулинов

Осадок уничтожают

При микроскопии препаратов нз культур S. typhi murium, обработанных флюоресцирующей сывороткой, полученной путем иммунизации оболочками сальмонелл, отмечается значительно более выраженное специфическое свечение клеток сальмонелл по сравнению с таковыми в контрольных препаратах. Флюоресцирующие антитела адсорбируются строго на поверхности микробных клеток.

3. Опыты по изучению сроков годности ... флюоресцирующих—сывороток -

До сих пор невыясненным остается вопрос о сроках сохранения активности флюоресцирующих сывороток.

Нами было проверено качество флюоресцирующих про-тивосальмонеллезных сывороток, приготовленных общепринятым методом в 1956 и 1967 годах П. И. Притулиным. Сыворотки консервированы мертиолатом и хранились в жидком состоянии запаянными в ампулы при температуре +4, +10-°.

Активность и специфичность сывороток проверяли на препаратах из нескольких штаммов гомологичных и гетеро-логичных культур.

Результаты проверки активности и специфичности сывороток представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы, флюоресцирующие сыворотки сохраняли свою специфичность в течение всего срока хранения (8—19 лет). Активность их при этом несколько снижалась. У сыворотки, хранившейся 19 лет, рабочий титр снизился наполовину (с 1 : 10 до 1 :5), а при хранении в течение 8 лет — с 1 : 16 до 1 : 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Индикация сальмонелл в искусственно обсемененных пробах

В пробах, искусственно обсемененных сальмонеллами по описанной методике, выявление сальмонелл проводили параллельно бактериологическим и иммунофлюоресцентным методами.

Результаты исследования предсгаалены в таблице 2.

Таблица 1

Результаты проверки активности и специфичности флюоресцирующих сывороток после длительного хранения

Серия и год Дата Препараты из гомологичной культуры, обработанные сывороткой в разведении Препараты из re-термогичной культуры

изготовления проверки 1:2 . 1:4 1:5 1:6 1:8 1:10 1:16 1:32 1:2 1 :4

I 1956 ++++ + -Ь + + + +++ + + + + + + + + + + + + + + — „ --

1956 ¡975 ++++ ++++ +++ + + + + + + — — — — —

II 1967 ++++ ++++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + — —

1967 1975 + +++ ++++ + + + + +++ + +++ + + + + + + — — —

III 1971 ++ + + ++++ + + + + + + + + + + + + + + + + +++ + + + + + — —

1971 1975 + + + + ++++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + — —

Таблица 2

Результаты исследования искусственно обсемененных проб

Объект исследования Кол-во проб Исследовано Выявлено сальмонелл

бактериологически методом иммуио-флюоресцен-цин бактерио-логически- иымуно-флюорес.

Комбикорм 48 24 24 19 18

Мяеоткостнаямука 43 24 ¡24 18 18

Сточная жидкость 48 24 24 18 18

Итого: 144 72 72 55 54

Применив в своих исследованиях приемы концентрирования сальмонелл (подращивание на жидких средах, с последующим центрифугированием и приготовлением препаратов из осадка) нам удавалось обнаруживать сальмонеллы в пробах, содержащих всего 500 и даже 50 микробных тел в 1 г.

Таблица 3

Индикация сальмонелл в искусственно обсемененных пробах комбикорма, мясо-костной муки н сточной жидкости

№ Характеристика проб: Результат исследования

проб содержат в 1 г бактериологически нммуно-флюорес.

Комбикорм

1—6 от 50 'МЛН. до 500 S. typhi murium + +

7 50 S. typhi murium + _

8 5 S. typhi murium — —

9—14 от 50 млн. до 500 S. enteritidis + +

15—16 от 50 до 5 S. enteritidis — —

17—22 от 50 алан, до- 500 S, cholerae suis + +

23—24 от 50 до 5 S. cholerae suis — —

Мясо-костная мука

1—« от 50 M ЛИ. до 500 S. typhi murium + T

7—8 от 50 до 5 S. typhi murium — —

9—14 от 50 мл«, до 500 S, enteritidis + +

15—16 от 50 до 5 S. enteritidis — —

17—22 от 50 МЛН. до 500 S, cholerae suis + +

23—24 от 50 до 5 S. cholerae suis — —

Сточная жидкость

1—6 от 50 МЛН.. до 500 S. typhi murium ' + +

7—8 от 50 до 5 S. typhi murium — —

9—14 от 50 МЛН. до 500 S. enteritidis + +

15—16 от 50 до 5 S. enteritidis — —

17—22 от 50 млн. до 500 S. cholerae suis + +

23 50 S. cholerae suis — +

24 5 . S. cholerae suis — —

1Î

Полученные Данные показали, что и м му но ф л юор ее цё нт-ный метод не уступает бактериологическому. В 98,2% случаев имело место совпадение результатов исследования. При этом следует иметь в виду, что одним из главных преимуществ метода является значительное сокращение сроков исследования, при этом не требуется накопления значительной массы антигена или выделения чистой культуры.

2* Индикация сальмонелл в пробах комбикормов,

мясо-костной муки и сточных жидкостей, отобранных на выпускающих предприятиях и в хозяйствах

Каждая из отобранных для исследования проб была разделена на 2 части, в одной из которых выявление сальмонелл проводили бактериологическим, а в другой — методом иммунофлюоресценшш. Результаты исследования показаны в таблице А-

При сравнении результатов бактериологического и имму-нофлюоресцентного исследования проб из объектов внешней среды на наличие сальмонелл видно, что бактериологическим методом сальмонеллы выявлены в 22 пробах из 151, а методом иммунофлюоресценшш в 19 пробах- Как выяснилось, несовпадение результатов исследования объясняется тем, что для метода иммунофлюоресценшш были использованы флюоресцирующие сыворотки только трех серотнпов сальмонелл. В то время, как в исследуемых пробах были выявлены бактериологически такие типы сальмонелл' как: S. anatum, S. pullorum, S. Newport и др. Индикация сальмонелл бактериологическим методом предусматривает выделение чистой культуры с последующей идентификацией выделенных микроорганизмов. Она основана на изучении морфологических, тивкториальных; культуралько- биохимических, серологических и биологических свойств, что' связано с затратой времени до нескольких суток.

Применение метода иммунофлюоресценции значительно упрощает методику исследования, сокращает время, необходимое; для получения результатов- При этом появляется возможность одновременной индикации и идентификации сальмонелл.

Индикация сальмонелл в комбикормах, мясо-костной муке и сточных жидкостях.

С а л ь м о н е л л и в ы Д е л е н ы

Подвергнуто исследованию Исследовано проб Метод исследования в Т О м 1 И с л е

всего % г I ц % а> ф тэ (/)'С % а л "о'З л* % прочие %

Комбикорма из кш Сшюрмовых заводов 39 бактериолопгч. 2 5,1 _ _ 1 2,6 __ _ 1 2,6

иммуиофлюор. 1 2,6 — - 1 2,6 — „ — —

Комбикорма ю свиноводческих хозяйств 28 балстериологич. 3 10,5 _, _ _ _ 2 7,0 1

тамунофлюор. 2 7.0 — — — — 2 , 7,0 —

Мяссияоспт мука 28 бактериадогич. 1 3,5 — — 1 3,5 — — — —

иашумофлюор. 1 3,5 — — 1 3,5 — ■ — — —

Сточные жидкости 56 бактериологич. 16 28,5 2 3,5 9 16,0 4 7,0 1 1,7

иммунофлюор. 15 9,9 2 3,5 9 16,0 4 7.0 — —

Ито1ч>: 151 бактфнологнч. 22 1 14,5 2 15 11 7,2 б 3,9 3 1,9

иммунофлюор. 19 12,5 2 1,3 1! 72 6 3,9 — —

3. Индикация сальмонелл в мышцах и внутренних органах свиней

Несмогря на то, что метод иммунофлюоресценции для индикации сальмонелл в органах и тканях животных был предложен еще в 1956 г. П. И. Притуликым, Н- А. Кузьминым, А. П. Ларионовым и Л. П. Залесским и принято наставление по его применению, однако в практике мясокомбинатов существует некоторый консерватизм. Для обоснования внедрения этого метода в практику мясокомбинатов нам потребовалось провести сравнительное изучение бактериологического и иммунофлюоресцентного методов индикации сальмонелл. Подобную работу следовало провести еще и потому, что требовалось испытание флюоресцирующих сывороток, приготовленных по разработанному нами методу.

Для сравнительной оценки бактериологического и иммунофлюоресцентного методов индикации сальмонелл в мясе и внутренних органах проведено исследование 2390 проб от 478 туш свиней, забитых па санитарной бойне с различными патологическими процессами. Результаты исследования приведены в таблице 5-

Как видно из представленных данных, при исследовании проб бактериологическим методом сальмонеллы выявлены в 145 случаях, в то время, как методом иммунофлюоресценции в 109 случаях.

При серологической идентификации культур сальмонелл, выявленных бактериологически, выделены такие типы сальмонелл. как S. cholerae suis, v. Kunzendorf, S. Newport, S'. anatum, S. puliorum, которые не могли быть выявлены методом иммунофлюоресценции, так как мы применяли флюоресцирующие сыворотки наиболее часто встречающихся типов сальмонелл — S. typhi murium, S\ enteritidis, S. cholerae suis.

Анализ полученных результатов показывает, что при исследовании проб методом иммунофлюоресценции при первичной микроскопии сальмонеллы выявлены в 96 пробах, а при исследовании этих же проб после подращивания в течение 6—8 час. — в 109 пробах.

Следует отметить, что при люминесцентной микроскопии препаратов из проб после подращивания отмечается наличие большого количества {иногда целые скопления) типичных по морфологии, довольно крупных, часто в стадии деления, клеток со специфическим свечением, в то время, как при первичной микроскопии клетки со специфическим свечением приходится отыскивать.

Сравнительные данные по индикации сальмонелл в мышцах и органах вынуждено убитых свиней бактериологическим и иммунофлюоресцентным методами

С а л ь м о « е л л и вы я в я е н ы

Исследо- всего бактериологическим методом методой нмму-нофлюорес-яенции тип ы с л м о н е л л

проб. А о'5 прочие

ваны всего % всего % Й % vi'c % <л Z % % .

Мышцы 478 М 2,3 9 1.6 i 05 3 0,6 5 1.0 2 0,4

Лимфоузлы 956 57 5.9 43 4,4 12 1,2 И 1,1 30 2,0 14 1,4

Печень 478 49 Wfi 36 7,5 4 0.8 9 1,8 : 23 4,8 13 2,7

Селезенки 478 28 М 23 4,8 5 1,0 4 0,8 14 2,9 5 1,0

Итого: 23» 145 6,0 109 4,1 22 0.9 27 1,1 62 2,5 34 1,4

Примечание: Прочие типы сальмонелл (S. anatum, S. pullorum, S, Newport и др.) выявлены только бактериологическим .метаном.

Таким образом, подращивание сальмонелл следует признать обязательным подготовительным этапом при проведении метода иммуиофлюоресценции.

Анализируя данные, полученные при сравнительной оценке бактериологического и нммунофлюоресцентного методов индикации сальмонелл объектах внешней среды, можно отметить высокую чувствительность и специфичность метода иммунофлюоресиеиции. Этот метод в сочетании с посевом проб в среды накопления или при накоплении сальмонелл в самих пробах, позволяет выявить сальмонеллы при обсеменении 500 микробных тел в 1 г через 6—18 час. от начала исследования.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и научно обоснован метод индикации сальмонелл в объектах внешней среды (комбикормах, мясо-костной муке и сточных жидкостях), включающий бактериологические и люминесцеитно-серологическис приемы.

2. Метод иммуиофлюоресценции, в разработанном нами варианте, по своей чувствительности не уступает классическому бактериологическому исследованию объектов внешней среды на наличие сальмонелл. Преимуществами его являются: одновременная индикация и идентификация сальмонелл, значительная экономия времени, позволяющая получить результат исследования в течение 16—18 чао, экономия питательных сред.

3. Разработанная схема индикации, включающая отбор проб, подготовку их к исследованию, накопление и концентрацию микробных тел и последовательность в дальнейшем нх изучении, облегчает и ускоряет обнаружение сальмонелл в объектах внешней среды.

4. Усовершенствован метод иммунофлюоресценции для индикации сальмонелл:

а) впервые получены гипериммунные кроличьи сыворотки к оболочечным антигенам сальмонелл, характеризующиеся более высокой специфичностью по сравнению с общепринятыми сыворотками;

б) для выделения глобулинов из иммунных сывороток применен метод высаливания сернокислым натрием с последующей нейтрализацией соли. Преимуществом его по сравнению с имеющимися методами являются: быстрота получения глобулинов (5—6 час.), большая концентрация аитнтел, получение глобулинов стерильными;

в) установлена длительность серологической активности флюоресцирующих сывороток при их хранении. Титр меченых сывороток при хранении в течение 8—-19 лет незначительно снижался, при этом их специфичность сохраняется.

5. Разработанные нами методы и схемы позволяют обнаружить сальмонеллы (S. typhi murium, S'. enter itidis, S. cholerae suis) в комбикормах, мясо-костной муке и сточных жидкостях при обсеменении 500 микробных тел в 1 г исследуемого объекта.

6. Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения индикации сальмонелл в объектах внешней среды для решения основных вопросов эпидемиологии и эпизоотологии, в целях успешной борьбы с сальмонеллезами животных и человека.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется ускоренный способ получения люми-нес пирующих сывороток, на изготовление которых идет всего 16—18 час., вместо 3—5 суток, затрачиваемых при получении их общепринятыми методами- При этом полученные меченые сыворотки не уступают по качеству изготовленным другими способами.

2. Для повышения специфичности флюоресцирующих сывороток рекомендуется иммунизация животных оболочками бактерий (сальмонелл).

3. Предложена схема ускоренной индикации сальмонелл в пробах из объектов внешней среды, позволяющая обнаружить сальмонеллы в течение 18 час. от начала исследования.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Влкяиие лереохлажае-ния молодняка ®о кр&мя лрадубойной выдержки «а обсеменение туш и органов. Изучпочпрст-жда ставняып сборник «Харчаваггромислс»исть», изд.«Техника», Киев, 1973, № 1, стр.41—42.

2. Применение метода иммунофлюсресченции для шндгасации сальмонелл. Реотублилэнский •м-е'жведомс теен« ы й сборник «Шимушологкя», изд. «Здсров'н», Киев, 1974, вьот. 7, стр. 126—128.

Ответственный за выпуск автореферата диссертации; заслуженный деятель -науки РСФСР, доктор биологических наук, профеоеор П. И. При- тулии.

Подписано к печати 16.09 1975 г. Фо|>.м;гг бумаги GOX90/, с, 1."i¡¡ст. !,25. Зак. 4734, Тир. 150. Бесплатно. Облтипадрафия, Винница, Киевская, 4,