Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое и иммуногисто- и цитохимическое изучение молекулы клеточной адгезии (N-CAM) в глиальных клетках

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое и иммуногисто- и цитохимическое изучение молекулы клеточной адгезии (N-CAM) в глиальных клетках"

дашропеэтсшш орда трудового кршюго знамени

ГОСУДАКЛВйШЙ ЖШЕРСИТЕГ т. SOQ-ЛШЧ ШССОЩКШШ УкТАШ с РОССИЕЙ

IIa пршчхг ¡/умякач

КРШЛ 2"рютз К-.квЛлог-.-а

¡зтюхишзсш к шшэгато- и дадаагкаок

ЙЗУЧШЕ КОЛКО KÍ/ЯОЧГОЙ AJETSSSÍ »i-OM В гж.у1ынх КШКАХ

ОЭ.ОС.С4 - бивхгагя

АВТОРЕФЕРАТ

' диссертации trm. сэкюеваг»4 утаяой сг-знаш ишшвдата бчологсрисхкх неук

Дизяроз'1?ро»сп » 199Ï

Р<?йот& Шйохиът иа ка$здре знофизкки » биохшии Днепропетров-¡.хс-то Ордена Трудового Крвоь&го Эмкам государственного утоерси-

■хечь ®!SH5t ЗСО-дквтяя воееебйюшша Украина с Россией.

йаучмлв рулзшгфтълы.

Офкухаяыаге эшюнез*®

- ДОКТОр биологических HfiJrK, профессор Бврззин В,А»

- доктор мадмцкксквх неук,

. Crnstio Г.Г.

- доктор &kojccj »«есккх наук, Гьиеиой £„И„

- доктор мгдщос;:ю; наук, про§.«сйор Барабой В.А.

- Mkwktj? бгэхиыии им. А.В. Пая-задан& АН УССР (г.Кхов)

состойте* *"/> ШШ ^М- Ш1 года а ¿Ь ча-

| и г i«»hwi ни—»iii ■ nfiM ■!—ич ■■ ~ «мапмввнмммв-м»

о)> иа заезданнн епекдошкзирсваяного соаота К 053.24.06 пс- прма%гадвнш учвкой стезеаа явчкздгта биологических иаук пра

Диопроавкрояском гогударетеэкком уихвзрзитегс по »дросу: 320625, г. Днгяролегровск, ГСП-10, пр. Гагарина, 72, укааврсктет, биолого -вколсгтее^хаЗ факуйьг-««, корв» ауд.407.

С диссертацией мзкда эзнмю&гдася в н^ущгой библиотеке Дгюпро-п&зраясжого гогунхзэрсктвтас Автореферат раззсхаи

* Р&ШРЯ' 1951 годе

Ученый еезрлтарь

спьцлализировашото еовета,

доцеи* J^" Черная В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТН

Актуальность /проблемы. Нейрональная молекула клеточной адгезии (ы-ОАМ), первоначально описанная как синоптический мембранный гликопротеин ^ из крысиного мозга / З^г^еизеп, 19ТМ/, обнаружена зо .всех клетках нейро®пи?елиального происхождения и синтезируется как нейронами, так и глиальными клеткаки ./МоЫе, 19*7; ДиГ1ьЬаи5ег,49Г6; &еппаг1т , ШЧ /. Ы-САМ из мозга крысы представлена тремя молекулярными формами 180, МО и 120хД, ¡оторые избирательно сшггезируются различными клеточными типами и на различных стадиях развития в результате альтернативного сплайсинга гена ы-Ш / ЩЬгог, 'Я&&; /.

Молекула клеточной адгезии ы—САМ опооредует взаимодействия между различными тига>:и клеток, такими как нейро:*-нейрон, кеЯрон-аотроцит и астроцит-астроцит, которые лека? в основе саяснейгих процессов вмбриогенеза и регенерация нервноЯ ткани /КеИкаи?г, 19Л5," МагПсп,-4986 /. (\l-CAM играет вакнуп роль в морфогенеге, выступая в роли регулятора норфогенетических событий» Она выполняет свов регуляторнув ро:ь посредством модуляции лохальксЯ кясточной поверхности, путем изменения синтеза и распределения молекул

САМ га клеточной поверхности, химической модификации, изме-нз!ия полярности внеклеточного домена н структура цитегтлазмати-чзского участка / £с!е1тап,-!Ш. Зги события а еду? к изменение ацгезивностн клеточных поверхностей, подзикнооти клеток„ что обеспечивает морфогенеткчеокке передвижения. Такие изменения положения клеточных коллективов - результат модуляции Н--САМ, фибронгктина (ГМ) ( адгезигной молекулы типа клетка-субстрат) и других игвестннх кн сегодняшний день адгезивных молекул» Дополняя действие М-САМ, Р!\! определяет пути клеточной миграции, регулирует митотические ответы, которые ведут К формирований зрелых структур / боуег, /» Взлинодейотаке етмк двух оистен ( Ы-САМ и РЫ) играет вакнуп роль в амбрисгзкезз / Зделаиаи, -19ЛЧ; ¿¿е^^лп,/• Последователи предполагав1? такяэ, что ли принадлежит соновная рель в клеточное двккенян в процеосе рэота и развития опухоли. Иместоя доказательства домишрупией роли фибронектика в миграции метастагируивдх клеток, отмечена корреляция мекду его присутствием и наяичиеи нетаотазов / См^р, {№0; Стоика, Ш^/. Малипмзацня нервных клеток вызывает количественные^ изменения и хкмичеокуя модификации ГЧ-САК / (гГеепЬег^, ',<¡14; &оуег,

/. Причины к механизм изменений М-САМ в опу.олеэых платках,

« •гайке их овоИ61гм й {золь при малигмизации клеток мозга остают-оя неизвестными.

Известно,, что у большинства раковых клеток еоть существенная общая чергаг они имеют- много черт, общих о эмбриональными клетками / Стоика, -1985 /« Это свойство касается как их морфологии, так и функции« Возможно, знание молекулярных основ эмбриогенеза даст ключ к потмакию процессов, яекащих в оонове появления и развития опухолей.

Сравнительное изучение экопреосии (\J-CAM и (важных мо{>-фогеиетичеохих регуляторов развития нервной сиотемы) в процессах онтогенеза и гене за опухоли мояет быть полезным в выяснении механизмов возникновения опухолей и их развития, а «акке в определении места Ы-САМ в этом процессе.

Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей экспрессии ГЧ-САМ глиальними клетками в норме и при онкогеиной яракоформации. В связи о этим задачи наотояней работы сводились в' следующему;

2о Выделить Ы-САМ из козга крысы и получить моноопецифиче-скую айтасыворотку к ¡Ч-САМ„

2. Определить содержание и полипептидный состав Ы-САМ в Красиных глиальных клетках о помовью иммунохимичесхих методов анализа.

3. Изучить распределение М-САМ на поверхности растущик*глиальных клеток и нейронов в культурах диссоциированных клеток гип-покампа крысы.

Провеоти количественный анализ Ы-САМ и фибронектина в экспериментальных перевиваемых внутримозговых и подкожных опухолях крысы в процессе их роста.

5. Охарактеризовать полипептидный состав и распределение И-САМ в трансформированных глиальных клетках.

Научная новизна и практическое значение,, Получена специфическая ангиоыворотка к М-САМ мозга крысы. Впервые охарактеризован полипептидный ооотав Ы-САМ в экспериментальных перевиваемых крысиных опухолях иейроэктодермального происхождения. Впервые похазано, что в процеосе роста крысиных глиом после их трансплантации в желудочек мозга происходят количественные изменения мембранного N1-САМ; наблюдаетоя отрицательная корреляция в характере изменения содержания мембранного Ы-САМ и клеточного фибронектина в онкоге-нэве. Показана уависимооть изменения концентрации М-САМ от степей глокачеотвенности опухоли. Выявлено присутствие молекул Ы-САМ

на свободной от контактов мембранной поверхности клеток 5-ти и 13-ти дневных культур диссоциированных клеток гнппокампа новорожденных крысят. Показано преобладание N-CAM на глиальных и нейрональных отростках по сравнению с поверхностью сомы. Проведен количественный анализ 2-х мерного распределения KJ-CAÍ4 на поверхности нервных клеток, растущих в культуре, о помощью ота-тистико-стереологического подхода с использованием спешбГзьной компьютерной программы. В период активного роста аксонов вдоль глиальных отростков обнаружено присутствие на поверхности гли-альных отростков скоплешй молекул ( кластеров) диаметром 100 им.

Полученные моноспецифические антисыворотки против KJ-CAM могут быть использованы в диагностике для количественного определения N-CAM при патологиях, связанных о нарушениями развития ЦНС ( например в пренатальной диагностике дефектов нервной трубки).

Апробация работы. Материалы диссертации доложена на Международном симпозиуме "Функции нейроглии" ( Тбилиси 1989 г.)& 20-й конференции ФЕБО ( Будапешт 1990 ); 15-ом Международном биохимическом конгрессе ( Иеруоалим, 1991 ); Европейском конгресое по биологии раэвити.я ( Иерусалим, 1991 ); 14-ом съезде Европейской нейронаучной аосоциации ( Лондон, 1991 ); итоговых на учтя .конференциях ДГУ 1990, 1991.

На защиту выносятся следующие положения

1. Количественная анализ N-CAM и FN в экспериментальная перевиваемых глиальных опухолях крысы а процессе их роота пооле трансплантации.

2. Оообеннооти полипептидкого состава N-CAM перевиваемых крысиных глиом и неврином.

3. Закономерности иммуногистохимичеокого распределения N-CAM в иооледуемых опухолях.

Особенности распределения N-CAM на поверхности диссоциированных клеток гиппокампа крысы в процессе их роота.

Струг -^ра и объем диссертационной работы. Лиооертация изложена на Ш отрамицах маиинопионого текста и состоит из введения, четырех глав ( обзор литература, матерталы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов исследования ), обцегс заключения, выводов. Лиооертация иллюстрирована 8 таблицами и 52 сунками. СПиоок литературы, содержит 176 наименований ил русском\ и иноотранных языках. . s

- ц _

МАТЕРИАЛЫ И METO® ИССВДЮАШ

Объектом исследования служил головной мозг половозрелых крыо линии Вкстар веоом 200 + 20 г, экспериментальные перевиваемые крысиные глиомы и невриномы„ мьпиные глиомы, культуры астроци-¥ арка к клеток головного мозга к рис , диссоциированные монослой-ные культуры клеток гиплокампа нозорохненных крысят и 6-ти дневные культура диссоциированных клеток спинного мозга крысы. Пере- ' зиваемае линии экспериментальных крысиных и мышиных опухолей получены о.ИоС. Халанским А» С» ( институт морфологии АНН СССР г. Москва )0 Культуры астроцитарных клеток головного мозга крыо любезно предоставлена с„н,с0 Козловой М.З. ( Всесовзний кардиологический центр г. Москва )„ Диссоциировании® монослойныв культуры клеток гиппокампа получены в лаборатории института физиологи!; им. Богомольца АН УССР» г. Киев ( эав.лаб. - д.б.н. Либо Г.Г.).

ИоходныВ материал гомогенизировали в 10-ти объемах 25 мМ трио-HCl буфера ( pH 7Л )„ содержащего 10 mMNcjNj, I мМ фенил-мет иксудьфонилфторид, центрифугировали при 100 000g , 60 мин при -й°Со Образовавшийся супернатант содеркая растворимую форму N-CAMo Белки мембранной фракции солвбилиэироваяи буфером.содержащим 2% тритон Х-100, 25 иН трис-HCI ( pH 1,4 ), I мМ фенил-метилоульфонилфторид, 10 KMNaNäB течении 12 «асов с поаяедув-иин центрифугированием ( 100 000g , 90 мин. ). Затем осадок . обрабатывали Ч М мочевиной ( 1:2„5 ) для экстракции клеточного FN. Выделение и очистку N-CAM головного мозга крыоы проводили по схеме, представленной на рио.Х» Выход специфического белка составил 4,93/6 при,56-кратной степени очистки/ча6\Л/-

Специфическую антисыаоротку к N-GAM получали путем иммунизации кролей очищенным препаратом N-CAM» Иммунизации проводили по методу Ьее^е.

Моноспецифичеокие антиоыворотки тестировали перекрестным иммуноэлектрофорезом и ракетным иммуноэлектрофорезом о промежуточной зоной ( сравнивая с моноспецифической анги-N-CAM анти-сивороткой, лобезко предоставленной лабораторией белка Копенгагенского Унивзрситета, Дания ). Полученная акгиоыворотка в 'иммунобле ■гилге реагировала с тремя молекулярными формами N-CAM ( 180, МО и 120 кДа ) из головного мозга крыоы. Количественный анализ N-CAM я FN проводили с помощью ракетного и ракетно-линейного иммуно-адектрсфбрезов. Еелок в пробах определяли методами Лоури и Бред-

форд с модификациями. Распределение М-САМ во фракциях после хроматографии контролировали слитным ракетным иммуноэлектрофорезом.

Гомогенат ткат в 25 мМ трио-НС1 ( рН7,4 )„ 10 м,М I 1мМ РМЭР (буфер А) (20 г + 100 мл) { ' центрифугирование, 30000$ «, 50 мин. Р + 100 мл буфера А *-

} центрифугирование, 30000^, 60 мин» ,

Р + 40 мл 2% раствора тритона Х-100 в буфере А ф центрифугирование, 30000 д „ 60 мин.

Я (мембранный экстракт) | хроматография на фежл-сефарозе элюат (2% тритон Х-100)

| хроматография на конканавалин А-сефарозе элюат (10? метил-глюкоза)

| хроматография на лизи»-сефарозе элюат (градиент КС1 0,1-0,25)

^ хроматограф я на гидроксилапатите элюат (К-фосфатный буфер, градиент ионной силы

| Я' 0,07-0,15) очищенный препарат

Рио.1. Схела выделедая и очистки (Ч-САМ головного мозга крыс

Таблица I. Очистка М-САЧ из головного мозга крыо

Этапы Объем Общий Кол-во Удельн. Степень Выход

очистки фракции мл белок мг Ы-САМ мг сожер*, мг/мг очисткк М-САМ Ы-САМ

гомогенат 40 692 10,15 0,015 1.0 100

мембранная фракция 40 256 6,12 0,023 1.5 60,44

хроматография на фекил-сефа розе 160 43 4.0 0,093 6.2 39,41

хроматого; 'ия на Кон А-сефарозе 60 5,8 1.2 0,201 13,6 И.В2

хроматография на лизин-сефарозе г 1.7 1.0 0,590 39„Э 9,65

хроматография ка гидроксилапатите г 0,6 0.5 0,833 55,5 4,93

\

-б-

Нолипептидный состав N-CAK в экспериментальных перевиваемых опухолях головного мозга кризы анализировали о псмояьв электрофореза в плоскости 7,5а ПААГ в присутствие ДСН по Дэммлн о поеледуедин иммуноблотингон*

Распределение NI-GAM в тхаки исследуемых крысиных опухолей определяли методом непрямого икмупофлуореоцзитнего окреаивания по Куке; в обычной модификации» .

Раапределзние М-САМ на поверхности диссоциированных клеток гиплояамля красы, культивируемый in vitro , изучали кммунозлектро-ниокикроохопичееккм методом, Локализация молекул N-CAM определялась характером размещения частичек коллоидного золота»

Для построения рекондаруирогениой мелели 2-х мерного распределения N-CÄM на мембранной поверхности нервных клеток попользовал и новый отаткстккв-отераологичеоккй метод, Разработанный и.о. Русаковым I.A. ( кафедра экспериментальной физики Д1У ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСШЕШ

Характеристика N-CAM в перевиваемых глиальнах опухолях головного мозга крыс.

Количественный анализ N-CÄM проводили на различных сроках развития перевиваемых крысиных глиом после их трансплантации в левый желудочек мозге крысы. Диаднзиров&ли содержание мембранное и растворимой форм N-CAM о использованием моноопецифичеокой антисыворотки ракетньм имкунозлеятрофорэзом. Иосдедования показали присутствие обеих форм N-CAM soex иооледуемых крыоиных глиомах независимо от пассана м времени шзн» животного. Количестве N-CAK в.опухолевой ткани было, как правиле, ниже, чем в головном мозге здоровой крысы ( 20 ккг N-GAH/мг белка ). В процессе роста опухоли пооле траноплантации отмечено изменение уровня мембранного N-CAM ( табл.2 )> Темпы роста глиом о различно! степенью злокачественности сильно отличались. Так, злокачественная глиоблаетока I0I/8 к 1% дню роста in vr'O достигала размеров Зб-?н дневной кизкозлокачественной аотроцитоны 10-20-4. Можно предположить, что процессы, протекающие в хороткоимвуяей глиоме I0I/8 в случае акапластичеокой аотроцитомы 10-20-4, растянуты во времени. С целью сравнения характере изменения экопресони N-CAM различными типами перевиваемых глиом промежутки времени после трансплантации глиомы пересчитывали относительно среднего nepiov»

*

Таблица 2.«

Содержание Ы-САМ м Шв граигчиакгкоугмкх ярнеядах глиомах.

И'.П опухоли, Срок Удельная ксккиг?иа!ия

пгга;м кассам N-<51!! М-САМ КЛЬХОЧ. р-ЮТВ.

глиабдастокз 10 г, 07^р, и 0,61+0,11 20,47+3,64 22,29+5,97

101/6 '(лат. п 285О~0„ЗЭ 0,81+0,14 105,67+6,67 17,63+5,69

'13 [МОД 14 12 1,4^0» Т9 о/7б[о,07 162,16+3«,9 10,46+2,43

сут.) 16 1,57^0,Г/ IG9.cil.35 18,93+1,10

17 2,55+0,24 0,85+0,14 г.с-,?е7гд5 19,73+1,9:2

19 0, (>2+0,03 61,65+1,?? 11,79^1,63

23 9,00* 0.60~ 20,40~ 33,73~

акапластичэ- 24 0,57+0,10 0,^0,25 49, 62+12,6 1б,Я»+1,57

о«сая аогро- 27 2.81" 0,45" 39,2?" 27.66

;с;т о«а 20 10,60+1942 0,'; 6+0,0 б 20,91+3,3? 12,76« 0,3«

10- 20-4 30 5Д1~ 43,49™ 35 Ло"

(лат. п зри од 31 :.09 0,50 46,00 10,50

35 оут.) 32 4,33+0,62 00сЛ+0,09 £2,02*0,03 с. 26+1, б?

3? о,ео<р(35 0,90+0,23 /1,00+10,0 20,33+1,Й9

аиа пластиче- 21 3,27+0,15 3+4,97 10,72+0,58

ская астро- а 4, 12+0,19 и5 0-^0,02 47,92+0,37 25.27+6,04

-кто,-л 15-47 •23 4,16+0,27 0,07+0,33 „ -

(лт, пор«од 28 15,66+2,03 2.01+0,04 13,26+2,50 5613+1,03

37 су?») .31 0,42 33э £3~* 15,35

32 0, Ьо 85-.80 „

36 1,02+0,аз 0,21+0,01 61,15+4,29 8,14*0/(9

(й 2,70+0,22 1,01+0,17 35,65+2.55 6,90+0,15

46 5,92+1,06 0,83+0,27 13,90+0,5'» -

50 1,9;+0,С4 0,76+0,04 - -

52 2,61*" 0,75~ 44,40 9,II

элоначеот. 23 16,15+1,30 1,55+0,31

глиоидастока Ж 4,30+0,69 0,81+0,13

П-9-2 (лат. 29 6,38+0,31 1,76+0,15

пэр*оз 33 3? 5,94+0,06 I,38*0.12

сут.) 35 42 5,05+0,35 >\ЗЯ+1,Р,0 I. он 0,05 0,95+0,01

ÍOO

t»

N-ÍAN

ад ifi и

M

4DO

m

N-CAM

4,6

Rio.2. Изменение содержания мембранного N-CÄM и клеточного FNb перевиваемых внутримозговых г ли омах в процеоов их роста поолв трансплантации относительно среднего латентного периода хизш хрыо, инфицированных э'.*ой глиомой (Т). № оси ординат - средние значения контент ранни М-САМ (М), вычисленные для 2-3 опухолей о одинаковым Г-^рюдом развития in vivo (в % от максимального уровня N-CAM, на-Лялдаеного для данной опухоли). Вертикальные линии - среднеквадратичные отклонен« от среднего значения; г - коэффициент коррех.Шии

с

инэ(51 крыс инфицированных данным видом опухоли. Анализ показал, что в период роста опухоли соответствующий ореднему латентному периоду уровень Ы-САМ был одинаковый для всех типов внутртмоэ-говых глиом и ооотавлял 1-4 мкг/мг белка ( такое же количество Ы-САМ синтезируют нормальные глиальнне клетки)( рис.2 ). Однако существуют отличия в характере изменения уровня И-САМ в зависимости от степени злокачественности опухоли.

Количество растворимой формы существенно не изменяется в процессе роста опухоли. В глиомах оно составляет 10* от общего уровня 1Ч-САМ ( табл.2 ). В нормальном мозге эта величина - менее 21. Повмгение растворимого деривата, очевидно, результат высокой активности протеолитических процессов в клетках опухоли.

Анализ полипепгидного ооотава мембранной Ы-САН в глиобла-стомах и анаплаотических аотроттомах показал наличие двух основных молекулярных форм Ы-САМ - 140 и 120 к Да, характерных для нормальных глиальных клеток ( рис. 3). В анапластичеохих аотро-цитомах на поздшх этапах развития обнаружены высокомолекулярные формы (М-САМ 180 и 160 к Да, встречающиеся в эмбриональной ткани.

т$

5Т

12 3 4 5 6 7 8 9 10 <1 12 43 14 46

А Б

Рио.З.Схема иммуноблотинга растворимой (четные номера) и мембранной фракций (нечетные номера) перевиваемых хрнсиных внутримозго-вых глиом (А) и подкожных неврином (Б) с моноспеаифичеокой анти-Ы-САМ-антисывороткой: 1,2-анапластическая астроцитома 10-20-4 (2б5ней); 3.4-глиобластома 101/В (145ней); 5,6-анапластичесхая астроцитома 15-47 (51лень); 7,В-глиома 11-9-2 (30 зней); неврино-ма НГУК: 9.10-Пдней; 11,12-15 дней; 13,14-23 дня; 15,16-50 дней. Цифрами указана молекулярная масса полипептидов, к Да.

-Юг

Так как предззотвеиникамц аотроцвтои явлкяис» зралиа аотрзшты мозга хрцоы, то появление высокоонадированкак форм возмогно, связано с модификацией [1-САМ в онкогеизэз и ванет к уканькснив адго-зивного ородства клеток.

Икиунзблотннг показал прнсутотвио во воох .исследуемых внутр;;-нозгоЕих глиомах шззомолакулярпых полипопгадеэ 76 и 57 ¡¡Да. Во&-моеко, ото протеолктичеакна фрдг^еети нолекуяи Ы-СА!*., отцепдя-взиеоя в результате возрастания прстеолиткчвокой автквнооти ь опухолевых клетках,

И м и у 11 ог п с? о х;; ни1: е о:: и с исследования позволили габлвдать харди-«ер распределения N-©11 а тзаим и солоду ошх гаиои и ок рукаь-лего кх головного мозга крыов. Б облаоти больсих пелуааряй наблвйалооь достаточно яркое диффузкоз свечение тка»ы мозга, что соответствует кмесцнися в литература даш;ь~1 /Ро4\огак', /, «¡"¡г-снапшеать сэечелшя опухолевой ткаш! бшл ¿шетпо нике, чем мозга, одюко четко виделяхи'оь отделыша клетки о флпореоцирусцвв измбранс;: п темным ядром. Характер раопрздеяення М-Ш в различных тыгих в^тршозгоаых опухолей б цеясм одинаков, ба некдочешхем неболшкх отличий. '

СУ—САМ в подкогаюперогиваеинх крнсглых кззеиноаах » мызкной

глиоме К б.

Дашам по колачсогзешюму спрзделокяв Ы-С/Ш в подкокногмро-Бйвасиах криаишХ наври помах и мшииоН глиоме "4 б представлены в таблице 3. Значительного повышения или поникения обдего уровня М-САМ ь оазис,шости от периода развития иэ обнар/кеяа. Однако в нроассоз роста пезршои г.оола трансплантации набдэдадось позц-иекие дола растворийой' Форш, которая на поздних атаках развития составляла 25-30% от общего количества М-САМ. Повшениз растворимой М-САН сопровождалось пониисниен содержания мембранной форма. Мокно предположить, что увеличение растворимой формы Ы-САН -следствие протеолкткчеокой деградаций мембранных форм К|-СА'< в процессе развития опухолевых клеток.

Акишз содеряания Ы-САК в мьвиных глиомах Н б показал отсутствие достовзриых измекзний эхспреосни различных форм Ы-САМ при развитии. Ингероо к этой опухоли объяснялся ее способность!) расти и подхояно, и в нутра мозга. Другие опухоли на обладали такими свойогвамм.

йммуноблоти^ показал, чго мембранная и р.зтвораиая фор^ь

с

Таблица 3.

Содераанна Ы-САМ и РЫа подкоянопаревиваемих опухолях.

Тип опухоли Срок Удельная концентрация (мкг/мг)

паосаи жиэич манор. паств. клеточ. рвота.

(оут) М-САМ Ы-САМ

невриноиа II 13,70+2,31 1,36+0,57 66,13+3,63 2,93+0,52

НГУК - I 12 11,39+2,06 1,80+0,14 66,37+9.95 3,15+0,14

13 11,02+1,21 1,51+0,12 98,99+3,76 2,654,00

14 13,09+2,71 1,23+0,25 32>87+3,81 2,71+0,62

15 11,98+1,40 1,71+0,16 - -

16 9,62+1,00 1,96+0,15 73,91+17,5 3,94+0,52

17 10,26+2,07 1,50+0,01 80,45+1,94 3.08+0,20

21 9,27+0,44 3,47+0,67 - -

23 6,39+0,35 3,45+0,40 137.00+27.7 2,^4+0,71

57 9.00* 3,04" 92.II" 3,04*"

невринома 10 8,37+0,51 1,19+0,11 41,48+2.44 3,34+0,31

НГУК - 2 13 6,12+0,48 95+0,04 46.93+5.61 5,19+0,65

15 6,25+1,20 1,42+0,29 29,30+4,77 7,80+1,02

17 5,62+1,14 1.45+0,15 105,66+12,2 3,94+0,53

20 7,94+0,63 2,63+0,42 146,19+5,40. 8,93+0,61

27 7,78+0^48 2,34+0.20 124,12+7,17 21,23+0,72

28 8,06+0,44 2,48+0,28 - -

30 7,80^0,10 3,74+0,17 92,95^3,46 10.02+0,76

глиома М 6 12 4,17+0,75 1,55+0,17 4.12+0,19 4,03+0.37

14 4,14+0,33 1.95+0,11 1,21+0,01 1,60+0,59

16 4,1%0,55 1,74+0,26 1,57+0,28 1,64+0,29

25 4,12+0,39 1,97+0,44 1,96+0,30 1,52+0,25

28 4,41+0,57 1,81+0,23 1,98+0,52 0,97+0,13

29 5,52" - -

31 5,31+0,60 2,16+0,20 1,36*0,25 1.54+0,24

33 3,40+0,13 2,09+0,15 21,64+0,56 1,92+0,16

35 5,16+0,44 1.92+0,45 16,92+0,86 •?,5йГ 0.27

36 ^ 69+0,40 ^,48+0,94 20,14+0,85 2.П5~0,5С

'4 4 5,34+0,14 4,03+0,73 4,89+1,56 0,54+0,03

53 3,90+0,10 5,49+0,55 15,99+4,01 -

N-CAM в подкожноперевиваемых опухолях представлены теми же полипептидами, что и в случае внутримозговых глиом С рио.Э.Б). Высокомолекулярные полипептиды 180 и 160 кДа идентифицированы не были.

Сравнительный анализ экспрессии N-CAM и фибронектина в исследуемых опухолях.

В экспериментальных перевиваемых опухолях наряд- с количественным анализом N-CAM проводили определение содержания другой адгезивной молекулы - фибронектина, отвечающей за адгезию типа клетка-субстрат.

Иммунохимический метод позволил определить концентрации растворимого и клеточного FN на различных этапах роста опухолей ¡и VÍV0 (табл.2,3). Отмечена отрицательная корреляция изменения синтеза мембранного N-CAM и клеточного FNb случае внутримозговых глиом (pic.2), но не подкожноперев-ааеиых крысиных неврлном и мы-виной глиомы М 6. Реципрокное изменение N-CAM и FN позволило ~ предположить существование различных этапов в генезе опухоли -этапов клеточной миграции, когда превалирует синтез фибронектина (адгезивной молекулы типа клетка-субстрат), и клеточной агрегации, когда преобладает синтез N-CAM (адгезивной молекулы типа клетка-клетка). Однако исследуемые перевиваемые глиомы иозга крысы не ме-тастазируте. Следовательно, отрицательная корреляция синтеза ЬЮАМ иРЫотражает инуо .функцию в гене-е глиальных опухолей мозга, помимо их роли в регуляции перемещений клеток и образовании клеточных агрегатов. Возможно, что такое изменение синтеза адгезивных молекул определяет новые формы регуляции экспрессии генов.

Топография N-CAM на поверхности диссоциированных клеток гиппокампа крысы культивируемых in vitro.'

В качестве модели, воспроизводящей основные этапы развития нервной системы использованы монослойные культуры диссоциированных клеток гиппокампа новорожденных крысят. Иммуноэлектронномикроско-гыческий анализ позволил сравнить особенности распределения N-CAM на поверхности тел и отростков нейронов и глиальных клеток в про-цеосе их роста и развития in vi tro. Изучали распределение молекул Н-САЧ на поверхности клеток свободной от контактов, распределение молекул N-CAM определялось характером размещения частичек коллоидного зо..ота (конъ^гат протеина А с коллоидным золотом лвбезно предоставлен д.б.н. Дуцикон, институт биохимии АН /СОР). Отмечена более высокое содершние N-CAM на поверхности нейронов по сравкз-

hwo с глиальными клетками ( в 8 раз ). Наблюдается более плотное скоплеже меток на специализированных участках нейрональной сомы, идентифицированных как конусы роста ( на одну метку приходится 59+10 нм мембранной поверхности конусов роста нейронов 5-ти дневных культур). Плотности распределения меток на нейрональной соме и отростках, представленных в этот период в основном дендритачи, существенно не отличаются (на 166+15 км сомальной поверхности и 188+20 нм поверхности отростков пр1ходится одна метка коллоидного золота). На 12 тень роста in vitro количество меток на поверхности крупных аксонов заметно выше, чем на соме (одна метка на 38+ 13 нм для аксолеммы и одна метка на J 02+17 ни в случае сомы).

Преобладание молекул N-CAM на поверхности отростков наблюдается и для глиальных клеток (з 2 раза). Из 12 день роста клеток э культуре количество меток на поверхности глиальных клеток несколько уменьшается, хотя плотность распределения их на отростках остается выше по сравнения с сомой.

Обработка гиппокампальных^ клеток в монослойной культуре ан-ти-FN-антителами показала присутствие меток лиоь на поверхности фибробластоподобных клеток з виде линейных агрегатов ("мостиков"), располагающихся фрагментарно вдоль поверхности фибробластов и их отростков.При сравнении 5-ти и 12-ти дневных культур существенных отличий в локализации FW-антигенных участков обнаружено не бия о.

Новый статистико-стереологический подход, разрабртанный н,о.

Русаковым 3.А. (кафедра экспериментальной физики ЛГУ), позволил на основе имечцихся одномерных профилей клеточной поверхности реконструировать схему 2-мерного распределения молекул N-CAM на клеточной мембране. Ш поверхности нейронов и глиальных клеток отмечено отсутствие хорошо организованных плотных кластеров, что по-видимому объясняется высоким содержанием отрицательно-заря*енИих полисиаловых кислот в эмбриональной форме N-CAM. Обращает на себя внимание присутствие групп молекул, в которых раостояния между метками изменяется в пределах от ¿5 до 100 нм, так называемых "псевдокластеров". Преобладание ореди бличаЗвих расстояний между метками интервалов от 25 до 100 нм отмечено в основном для нейрональной мембрана. Исключение составляет сомальная поверхность в 12-ти чневной культуре. В случае глиальной поверхности эта закономерность наблюдается лишь для глиальных отростков 5-ти дневных культур в перюд интенсивного роста аксонов вдоль глиальных отростков (доля интервалов Î5-I00 нм составляет На 12 день, ког-

у • •• V ' 'л'О / 1

• А« < I м

л" I ^ 2

• . • /.. ' • •

•. •

I* » • «

I* ? •_1

8

V; «- »

4

I

!•• V • . ' ' '»

. . • • . ч

• • .

• . • •••* » «

в

б

»

' \

• 1 • ' 1

..... .Т г

8 8

Рис. Реконструированная схема двумерного распределения молекул М'САМ на I кк|гповерхности сомы нейронов (1.6). конусов роста(2) отростко» нейронов (3.7), тела глиахьиых клеток 0»,8) и их отроот ков 5-ти (1-5) к 12-ти (6-9) дневных культур диссоциированных клв тех гиолокампа кры?ы, полученная с помоцьо от«тиотико-стереологм-чесхого анализа одномерных профилей мембранных поверхностей.

да роста аксонов, в основном, эаверпен, количество "псевдокластеров" уменьвается более, чем в 2 pasa (до 22í). Это подтверждает высказанное ранее предположение об участии N-CAM, наряду о N^-CAM в нейрои-глиальных взаимодействиях.

Особая организация молекул N-САН на свободной от контактов поверхности предполагает выполнение ими иной функции, помимо их роли в регуляции перемещений клеток и образовании межклеточных контактов.

ВЫВОДЫ

1. Получена и охарахтер»зозана моноспецифическая антиоыворот-на к гликопротеину клеточной адгезии /\J-CAM головного мозга крысы. Эта ангиоызоротка использована для проведения иммунохимических и иммуногисто- и цитохимических исследований.

2. Похазано присутствие N-CAM в исследуемых нормальных и трансформированных глиальных клетках в исследованиях In vivo и in viífO . з 5-ти и 12-ти дневных культурах диссоциированных клеток гиппокампа мозга новорожденных крыоыт, в 6-ти дневных культурах диссоциированных клеток спинного мозга красы, в культуре астроцит арных клеток, в культурах трансформированных глиальных клеток Гассе-рова узла крысы (НГУК), в мышиных глиомах, растущих ¡и vivo и in vitro в перевиваемых итаммах крысиных глиом и гаврином.

3. Выявлена отрицательная корреляция в характере изменения концентрации мембранного М-САМ (молекулы межклеточной адгезии) и клеточного FN (адгезивной молекула типа клетка-субстрат) в генезе виу?римозговых перевиваемых /крысиных глиом, но не подкожно перевиваемых неврином. Показаны отличия в характере изменения концентрации двух адгезивных молекул в глиомах с различной степенью злокачественности.

4. Помимо основных молекулярных форм N-CAM 140 и 120 кД, характерных для нормальных глиальных клеток, в низкозлокачественных внутримозговых перевиваемых анаплаотических астроцитомах 15-47 и 10-20-4 выявлены молекулярные формы N-CAM 180 и 160 кД.

5. С помощью иммуноэлектронномикроскопического метода показано присутствие молекул N-CAM на свободной от контактов мембранной поверхности клеток 5-ти и 12-ти дневных культур диссоциированных клеток гиппокампа новорожденных крысят. Показано преобладание молекул на поверхности отростков как глиальных клеток, так и нейронов. Выявлена тенденция глиальных отростков э перюд интенсивного роста аксонов (5 дней In yitro ) к формированию на мембране неплотных "псевдокластеров" диаметром до 100 им.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

«

1. Березин В.А,, Кривко И.М., Недзвецкий B.C., Халанский А.С, Экспрессия белков клеточкой адгезии ( -САМ) и промежуточных фи-лаыентов (Hffi) в перевиваемых крысиных глиома // Тез. докл. Мак-дукар. симпоз. "Функции найроглии". - Тбилиси, 1969. - С.39.

2. Berezin V.A., Pavlov V.A., Sedykh A.I., Kri'/ko I.U., Ba-lakina A.V., liedvod^va H.A. On possible neuroacdulatinp, function of cell adhesion molecule (N-CAM) in rats subjected to acute and chrouio alcohol intoxication// Abstr. 20th PEBS Meeting - Budapest, 1990. - August 19-24, P-Ho-652. - P. 33.

3. Krivko I.M., Khalansky A.S., Berezin V.A. T!eur>'.l cell adhe eion molecule in transplanted rat rlicmns// Abstr, 20th FFBS Meeting. - Budapest, 1990. - August 19-24, Р-Ио-055. - P.34.

4. Кривко И.М., Халанский A.C., Экспрессия нейроспецифичес i.o-го белка клеточной адгезии ( -САМ) е перевиваемых крысиных глиомах // Актуальные вопр. совр. гистопатологии: Сб. научн. трудов. -¡¿осква, 1990.

5. Pavlov V., Berezin V., Sedykh A., Krivlco I., Balakina A., Eudenko 0. Effect of alcohol intoxication on cholecystokinin/gast-rln - binding protein, H-CFM and ЯPAP in rat brain areas// Ab3tr. 5th World Congr. of Biol.Psych. - Florence, 1991. ~ June 9-14,

P-13-69.

6. Krivko I.M., Skibo Q.a., Rueakov D.A., Berezin V.A. H-CAM localization on tha surface of rat cultured hlpfvjcampal neural celli // Abstr. 15th Intern. Congr. of Biocheo. - Ieruaalcm, 1991. - August 4-8, P-591.

7. Krivko I., Rusakov D., Skibo 0., Savina S., Berezin V.

A comparative quantitative study of the layout of IT-GAM and fibro-nectins on the eurface of developing glial cells// Abstr. Europ. Dev. Biol. Congr. - Ierusalera, 1991. - August 11-16, P-045.

8. Rusakov I)., Skibo 0., Krivko 1., Berezovskaya 0., Bere-ein V. Surfaoe pattern of labelled molecules as a possible identifying feature of developing r rve cell plasmalemma// Abstr. 3nd Sorli Cong^ on Heuroscience. - Montreal, 1991. - August, 6-12.

9. Krivko I.M., Khalannk^ A.S., Berezin V.A. Influence of surrounding brain tissue upon the N-CAM expression in transplanted rat glioma cells// Abstr. 14th Ann. Meeting of the Europ. Heurosci-eno» Апвоа. - Cambridge, 1991. - September 8-12, P-4145 - P.268.

Ю. Берозин В.А., Кривко И.И., НедзвоцккЯ B.C.» Еэрхосгхое Д., Халанский A.G. Экспрессия нейроспецк.$ичеоких базяоэ кяэто^г-сой адгезии (Ю-САИ) и промвкуточшх филеывнтов (ГФ1Ш) з парвзюаакых згрм-сшых глиомах// 4утатоми нейроглни. - Тбялиси? &ецккароба, 1991.

ИШУШХИМИЧЕСКОЕ И ИШУНОГИСТО- И ЦИТОХШШЗШЕ ИЗУЧЕНИЕ М0ДЕ2ШН КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ N-CAH В ГЛИАЛШХ КЛЕШАХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на сонсгение ученой степени коодкката бкологичесагс* кпук

Пояпнсвно п печать Формат 60x04/16. Бумага тагаографсхая

Печать плоская. Усл.поч.л. Уч.-изд.я. I

Тграж 100 Заказ $24 Бесплатно

Издательство-ЛГУ, 320625, ГСП, г.Диепропотровся-Ю, пр.Гагарина„72. Ротапринт ДГУ, 320II0, г.Днепропетровск, ул.Казакова,, 4а

КРИВКО Ирина Михайловна