Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием"

На правахрукописи

Узденский Анатолий Борисович

КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯ НЕРВНЫХ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЛАЗЕРНЫМ МИКРООБЛУЧЕНИЕМ И ФОТОДИНАМИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Воронеж- 2004

Работа выполнена в Ростовском государственном университете Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Кольс О Р Доктор биологических наук, профессор Потапенко А Я Доктор биологических наук, профессор Кару Т Й

Ведущая организация

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино-на-Оке)

Защита диссертации состоится « ЦЩ » ноября 2004 В часов на заседании Диссертационного Совета Д 212 038 03 при Воронежском государственном университете (394006, Воронеж, Университетская пл, 1, конференцзал)

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Кандидат биологических

М Ю Грабович

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Видимый свет — важнейший фактор зарождения и существования жизни на Земле. Однако, механизмы биологического действия света на живые организмы пока далеки от полного понимания. В организме человека и животных кроме глаз постоянному действию света подвергается кожа и, в меньшей степени, подкожные мышцы, периферические нервные окончания и кровь. Традиционно считалось, что только ультрафиолетовое излучение может существенно воздействовать на непигментированные клетки животных, не содержащие специальных фоторецепторных молекул (Смит, Хэнеуолт, 1972; Конев, Волотовский, 1974; Владимиров, Потапенко; 1989). С появлением лазеров оказалось, что достаточно интенсивный видимый свет может значительно влиять на биологические ткани, вызывая в них широкую гамму эффектов: от стимуляции метаболических процессов до разрушения биологического материала. Это открыло широкие перспективы использования его в медицине, экспериментальной биологии и сельском хозяйстве (Гамалея, 1972; Плетнев, 1996; Скобелкин, 1989, Каш, 1998). Для решения этих проблем "необходимо всестороннее изучение биологического действия лазерного излучения на объекты разного уровня организации - от биомолекул до целого организма.

Чувствительность клеток и тканей к оптическому излучению может быть повышена с помощью специальных красителей-фотосенсибилизаторов (ФС). При освещении в присутствии кислорода они генерируют высокотоксичный синглетный кислород, повреждающий клетки. Основанный на этом эффекте метод фотодинамической терапии (ФДТ) применяется в онкологии для избирательного разрушения опухолей, селективно накапливающих • ФС (Dougherty et al., 1997; Hasan et al., 2000; Moan, Peng, 2003). Это яркий пример успешного использования биофизических явлений в практической медицине.

Изучение влияния света на нервные и глиальные клетки особенно актуально. Нервная система играет определяющую роль в реакциях организма на внешние воздействия, во взаимодействиях его с окружающей средой. Но имеющиеся в настоящее время сведения не позволяют составить целостное представление о динамике развития реакций нервных клеток на оптические

РОС НАЦИОНАЛЫ!АН I ^ ВИМадТПЕКА^ I

воздействия, об их зависимости от длины волны и интенсивности облучения, о тонких структурных изменениях и биохимических процессах, развертывающихся в облученных клетках, о фото динамической эффективности разных ФС и механизмах фотосенсибилизации. Особенно мало сведений о фотодинамическом (ФД) воздействии на глиальные клетки, несмотря на их многочисленность в нервной системе и преимущественно глиальное происхождение опухолей мозга. В последние годы показано, что нервные и глиальные клетки тесно взаимодействуют, обмениваясь молекулярными факторами (нейромедиаторами, пептидами, факторами роста), регулирующими их функциональное состояние и взаимно поддерживающими выживаемость. Выяснение реакций нервных и глиальных клеток на ФД воздействие и их взаимодействий расширит применение оптических методов в нейробиологии, нейрохирургии и нейроонкологии.

Использование биофизических методов, таких как лазерное микрооблучение и фотосенсибилизация, дает в руки биологов инструмент для направленного локального и бесконтактного воздействия на отдельные клетки, органеллы или биомолекулы (Гамалея, 1972; Узденский, 1982; Berns, 1974; Ito, 1983; Kesel, Luo, 2001). Этот подход полезен для изучения важных проблем нейрофизиологии, касающихся роли внутриклеточных структур в функционировании нейронов и в их смерти, способов нейропротекции, нейроглиальных взаимодействий при окислительном стрессе. Кроме того, детальное понимание клеточно-молекулярных механизмов лазерного и ФД воздействия на нервные и глиальные клетки позволяет углубить наши представления об общих фотобиологических механизмах повреждения клеток.

Актуальны и практические аспекты данной работы, связанные со тестированием ФС и отбором наиболее эффективных из них, выбором оптимальных режимов воздействия, а также с фармакологической коррекцией механизмов и результатов ФДТ.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы являлось комплексное биофизическое, электрофизиологическое, цитологическое, биохимическое и фармакологическое исследование клеточно-молекулярных механизмов лазерного и фотодинамического воздействия на нервные и глиальные клетки.

Основные задачи работы:

1) Изучить реакции изолированных нервных клеток на лазерное микрооблучение по биоэлектрическим, цитохимическим и электронно-микроскопическим показателям, их зависимость от режима облучения, длины волны и интенсивности; определить акцепторы и основные мишени излучения в клетках; получить информацию о роли основных биоэнергетических процессов и ионов кальция в реакции нейрона на облучение.

2) Изучить фотодинамическое воздействие различных ФС на изолированный нейрон, провести их сравнительную оценку и отобрать наиболее эффективные из них; исследовать связь между их физико-химическими свойствами и ФД эффективностью.

3) Изучить клеточно-молекулярные механизмы ФД воздействия на изолированную нервную клетку, исследовать участие в них биоэнергетических и сигнальных процессов и определить тип клеточной смерти фотосенсибилизированных нейронов.

4) Изучить ФД воздействие на глиальные клетки (ГК), участие сигнальных процессов в их ФД повреждении и определить основные механизмы их гибели.

5) Изучить возможность фармакологической модификации (усиления или ослабления) реакций нервных и глиальных клеток на ФД воздействие.

Научная новизна. Научная новизна проведенных исследований определяется следующими положениями, выдвинутыми на защиту -

1. Впервые детально исследована динамика реакции нервной клетки на лазерное микрооблучение. Показано, что она носит многофазный характер, в которой фазы учащения импульсации сменяются торможением, повторным учащением и резким необратимым прекращением, В видимом диапазоне (от 434 до 633 нм) наиболее эффективным было синее излучение с максимумом около 460 нм, соответствующим спектру поглощения флавинов. Наиболее сильные ультраструктурные изменения наблюдались в митохондриях (разрушение крист, просветление матрикса и набухание). Продемонстрировано, что, активация импульсации была связана с фотоповреждением плазматической мембраны (ПМ), а торможение — митохондрий. В торможении нейронной активности участвовали ионы

2. Впервые изучены реакции нервной клетки на ФД воздействие ряда фотосенсибилизаторов (порфиринов, хлоринов, фталоцианинов и др.). Нервные

клетки оказались весьма чувствительны к ФД воздействию: их активность изменялась и необратимо блокировалась при наномолярных, а иногда и субнаномолярных концентрациях ФС, на несколько порядков меньших, чем применяемые в ФДТ. Фазная динамика импульсного ответа зависела от вида и концентрации ФС. Разработан оригинальный способ сравнения ФД эффективности и отбора разных фотосенсибилизаторов на основе сопоставления концентрационных зависимостей их ФД действия на нервные клетки. Более эффективными были амфифильные сенсибилизаторы.

3. Впервые проведено комплексное исследование клеточно-молекулярных механизмов ФД действия на отдельную нервную клетку. Показано, что основными мишенями ФД воздействия являются плазматическая мембрана и внутриклеточные органеллы - митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР) и аппарат Гольджи (АГ). При высоких концентрациях ФС преобладает влияние на ПМ, вызывающее активацию и затем резкий блок нейронной активности. Повреждение ПМ и инактивация биоэнергетических ферментов (дегидрогеназ) ведут к некрозу нейрона.

При сравнительно низких концентрациях ФС импульсация нейронов постепенно тормозилась и необратимо прекращалась. В этом процессе участвуют ионы Са2+, а также процессы, ведущие к истощению АТФ. Нарушение целостности ПМ и ингибирование биоэнергетических процессов, характерное для некроза, происходило через 2-4 часа после ФД воздействия. Это, а также отсутствие характерной для апоптоза фрагментации ядер позволило определить механизм клеточной смерти как замедленный некроз. В фотоинактивации и некрозе нейронов важную роль играли процессы внутри- и межклеточной сигнализации с участием фосфатидилинозитол 3-киназы, протеинкиназы С, аденилатциклазы, тирозинкиназ и протеинфосфатаз.

4 Впервые изучено ФД воздействие на глиальные клетки. Разработан способ визуализации ядер глиоцитов путем флуорохромирования ядерного хроматина. Показано, что фотосенсибилизированные ГК погибали как в результате некроза, так и апоптоза. После ФД воздействия также увеличивалась плотность ГК вокруг гела нейрона. В реакцию глиальных клеток вовлечен аденилатциклазный, но не тирозинкиназный сигнальный путь.

5. В работе получены новые данные о возможности фармакологической модуляции ФД эффекта. Применение ингибиторов или активаторов биоэнергетических или сигнальных ферментов позволяет ослабить или усилить фотодинамическое повреждение нервных и глиальных клеток. Это дает основание для разработки методов усиления фотоповреждения патологически измененных клеток и защиты окружающих нормальных клеток.

Практическая значимость. Полученные данные о характере и механизме реакций нервных и глиальных клеток на лазерное и ФД воздействие могут использоваться в нейрохирургии при разработке тонких нейрохирургических операций с использованием лазеров и в нейроонкологии для ФДТ опухолей мозга. Они также должны учитываться офтальмологами при разработке методов лазерного и ФД воздействия на сетчатку глаза и гигиенистами при выработке нормативов лазерного воздействия на организм работающих (в частности, на периферические нервные элементы). В экспериментальной нейробиологии могут быть разработаны методы селективного и бесконтактного воздействия на отдельные группы клеток и даже индивидуальные клетки с целью изучения их роли в деятельности более крупных нервных центров или мозга в целом. Способ сравнительной оценки ФД эффективности сенсибилизаторов может быть использован при скрининге новых ФС и выборе наиболее перспективных из них. Данные о фармакологической модуляции эффектов лазерного или ФД воздействия могут быть использованы для усиления селективного фотоповреждения патологически измененных тканей и защиты окружающих нормальных клеток.

Материалы работы используются в учебном процессе при чтении лекций по фотобиологии и фотомедицине на кафедре биофизики и биокибернетики физфака Ростовского государственного университета.

Апробация работы. Результаты работы представлены более, чем на 50 всесоюзных, всероссийских и международных конференциях, съездах, симпозиумах и конгрессах, в том числе на: I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), II и III съездах биофизиков России (Москва, 1998; Воронеж, 2004), 3-М Европейском биофизическом конгрессе (Мюнхен, 2000); XII Всесоюзной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Москва, 1985); Международных конференциях по биомедицинской оптике (Будапешт, 1993;

Лос-Анджелес, 1993, 1994; Лилль, 1994; Сан Хосе, 1995; 1996; 1997; Вена, 1996; Сан-Ремо, 1997); 5-й и 9-й Международный конференциях «Лазеры в науках о жизни» (Минск, 1994; Вильнюс, 2002); 4-м и 5-м Конгрессах IBRO по нейронаукам (Киото, 1995, Иерусалим, 1999); 11, 12 и 13-й Международных конференциях по нейрокибернетике (Ростов, 1995; 1999; 2002); V, VI, и \Ш Международных конференциях по простым нервным системам (Москва, 1997; Пущино, 2000; Калининград, 2003); 4-й конференции Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (ШВМВ) (Эдинбург, 1996); Международном симпозиуме «Проблемы и тенденции фотобиохимии» (Москва, 1997); Международных симпозиумах по фотодинамической терапии (Вроцлав, 1995; 1997; Нант, 1998); I и II международных интернет-конференциях по фотобиологии (1997 и 2000; XVII съезде физиологов России (Ростов, 1998); 27, 29, 30, 31 и 32-м Съездах Американского общества фотобиологов (Вашингтон, 1999; Чикаго, 2001; Квебек, 2002; Балтимор, 2003; Сиэтл, 2004); 8, 9 и 10-м Съездах Европейского общества фотобиологов (Гранада, 1999; Лиллехаммер, 2001: Вена, 2003); 13 и 14-м Международных конгрессах по фотобиологии (Сан Франциско, 2000, Жежу, 2004); 10-й международной школе по физике лазеров (LPHYS'01, Москва, 2001); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), 6-й Европейской конференции по глиальным клеткам (Берлин, 2003); 3, 4 и 5-й Международных конференциях «Оптические технологии в биофизике и медицине» (Саратов, 2001, 2002, 2003).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, состоящих из нескольких разделов, заключения и списка цитируемой литературы из 725 наименований. Она содержит 336 страниц текста, 72 рисунков 41 таблиц.

2. Материалы и методы исследования

Объект исследования. Основная часть опытов проведена на медленно адаптирующихся нейронах (МРН) изолированных рецепторов растяжения речного рака Astacus leptodactilus. Они длительно поддерживают постоянный уровень импульсной активности. На этом стабильном фоне можно непрерывно регистрировать динамику реакции нейрона вплоть до его смерти.

Регистрация импульсной активности нейронов. Отпрепарированные рецепторы растяжения переносили в ванночку с физиологическим раствором ван Харревельда (mM: NaCl - 205; КС1 -5.4; NaHCO3 - 0.24; MgCl2 - 5.4; СаС12 -13.5; рН 7.2-7.4). Потенциалы действия (ПД) отводили внеклеточно от аксонов стеклянными присасывающимися электродами, усиливали и регистрировали их частоту самописцем. В начале опытов рецепторные мышцы растягивали так, что МРН генерировал ПД с частотой около 10-15 Гц. После 30-минутной контрольной регистрации частоты ПД нейроны облучали и регистрировали импульсные реакции. В опытах использовано более 4000 МРН.

Лазерное микрооблучение МРН В экспериментах использовали непрерывно излучающие гелий-неоновый лазер ЛГ-36 (632,8 нм), гелий-кадмиевые лазеры ЛГ-31 или ЛГ-70 (441,6 нм) или импульсно-периодический лазер на красителях Spectrolas-3 (434-600 нм; 15 не, 400 Гц). Лазерное излучение фокусировалось микроскопом на выбранный участок нейрона. Диаметр микролуча составлял 812 нм, а средняя интенсивность от 101 до 1,5* 104 Вт/см2. Длительность облучения была достаточно большой, чтобы выявить все изменения нейронной активности. Время жизни МРН Т измерялось от начала облучения до прекращения импульсации.

Фотодинамическое воздействие. В опытах по изучению ФД воздействия в ванночку добавляли ФС и после 30-минутной инкубации препараты облучали He-Ne лазером ЛГН-111 (632.8 нм; 0.3 Вт/см2). В опытах с гиперицином использовали оранжевый свет лампы накаливания со светофильтрами (560-680 нм, максимум при 600 нм, 100-200 мВт/см2), в опытах с рибофлавином -голубой свет (400-550 нм, максимум при 480 нм, 0,25 Вт/см2).'

Изучалось ФД действие 34 ФС следующих классов: / Порфирины: протопорфирин IX (Serva, FRG); производные гематопорфирина: Фотофрин II (предоставлен проф. J. Moan, Oslo, Norway); Фотогем, (МИТХТ, Москва; проф. А.Ф. Миронов); Фотосан-3, (G. Mueller von der Haegen, Seehof Laboratorium, FRG); производные дейтеропорфирина IX (ДП) (проф. Г.В. Пономарев, к.х.н. А.В.Решетников; ИБМХ РАМН, Москва): 4-(1-метил-2-ацетил-3-оксобутил) ДП (4АсАс); 2,4-ди(1-метил-2-асе1у1-3-оксобутил) ДП (2,4diAcAc); 4-(1-метил-3-оксобутил) ДП (4Ас); 2,4-ди(1-метил-3-оксобутил) ДП (2,4diAc); 4-(1-метил-3-гидроксибутил) ДП (4OHbu); 2,4-ди(1-метил-3-гидроксибутил) ДП (2,4diOHbu).

// Фтапоцианины (проф. Е.А. Лукьянец, НИОПИК, Москва): Фотосенс, сульфированный алюмофталоцианин (AIPcS„), Na соль (смесь производных с: п = 2, 3 или 4 в соотношении 15",50:35, среднее п = 3,1); окта-4,5-карбоксифталоцианин оксиалюминия (окта-А1); А1 окта(оксиэтокси-фосфинилметилфталоцианин) (PAlPc); Ди-, три- и тетрасульфированные фталоцианины цинка, ZnPcSn, Na соли (смеси, среднее п -2,13; 3,06 и 3,74). /// Хлорины, хлорин ец, Na соль (СЫ e¿)\ (проф. А.П. Лосев, ИМАФ АНБ, Минск); производные хлорина еДпроф. Г.В. Пономарев и к.х.н. А.В. Решетников, ИБМХ РАМН, Москва): ди^-метил-В-глюкаминовый комплекс хлорина еб (GA-Chl е«); Радахлорин (смесь 80% хлорина e<¡, 15 % пурпурина 5 и 5 % хлорина рцв форме ионного комплекса с N-метил-Б-глюкамином); ди-^метил-Б-глюкаминовые комплексы: 2-девинил-2-(1-метоксиэтил) хлорина еa, (DVME-Chl ец); 2-девинил-2-(1-этоксиэтил)хлорина (DVEE-Chl 2-девинил-2-(1-метил-2-ацетил-3-оксо)бутилхлорина e<¡, (DVMAOB-Chl е«); 2-девинил-2-(1-метил-3-оксо)бутилхлорина e¿, 2-девинил-2-(1-метил-3-гидроокси) бутилхлорина Фотодитазин (смесь 60% -глюкаминовых комплексов Chl

хлорина рб и пурпуринов 7 и 18). Производные хлорина (проф. А.Ф. Миронов, МИТХТ, Москва): хлорин р6, Na соль (СЫ р6); З-формил-3-девинилхлоринГре, Na соль (FDV-Chl pg); 13',15'- К-(3-гидрокси-пропилциклоимид) хлорин рв (НРС1-СЫ р6); а также л*ез[гетракис-(т-гидроксифенил)]-хлоринГ (тТНРС), (проф. J. Moan, Oslo, Norway).

IV. Другие фотосенсибилизаторы: гиперицин (Sigma-Aldrich); водорастворимый комплекс гиперицина с поливинилпирролидоном (Hyp-S) (H.G. Loew, Vienna, Austria);, метиленовый синий (Реахим, СССР), янус зеленый В (Merk, FRG), рибофлавин (Reanal, Венгрия); флуоресцеин натрия (Реахим, СССР); 2,4-динитрофенол (Реахим, СССР).

Структурные формулы, спектры и другие физико-химические свойства этих ФС приведены в диссертации. Спектры поглощения света ФС регистрировались на спектрофотометрах М-40 (Германия), DU-7 (Beckman, USA), СФ-2000-2 (Санкт-Петербург), или Perkin Elmer Lambda 40 UV/Vs (USA). Спектры флуоресценции и возбуждения Фотосенса регистрировали на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама (Санкт-Петербург), а гиперицина -Perkin Elmer LS 50В (USA). Данные о коэффициентах распределения для

ряда ФС в системе n-октанол/фосфатный буфер (рН 7.4) предоставлены А.В. Решетниковым (ИБМХ РАМН).

Фармакологическая модификация реакций нейронов на ФД воздействие. Субстраты, ингибиторы или активаторы различных биохимических процессов, добавляли в ванночку за 15 мин до облучения и изучали реакцию нейрона на лазерное или ФД воздействие. Их концентрации подбирали так, чтобы они сами не влияли на импульсную активность нейрона в течение 2-3 часов.

Цитохимическое изучение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ). На изучаемом этапе реакции нейрона на облучение физиологический раствор в ванночке быстро заменяли следующей инкубационной смесью: 1 мг/мл НТС, 50 мМ сукцината натрия, 5 мМ MgCl2,10 мМ №N3 на 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,2 (Лойда и др., 1982) и инкубировали 30 мин при 22-24 °С. Затем препарат промывали, фиксировали 2 % глутаральдегидом и заключали в глицерин-желатину. Препараты фотографировали и фотометрировали на микрофотометре ИФО-451 или фотометрической насадке ФМЭЛ-1, установленной на микроскопе Amplival.

МТТ-тест был адаптирован для изучения реакции МРН на ФД воздействие: сразу или через 4 часа после фотоинактивации нейроны инкубировались с 0,05 мг/мл (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий)бромидом (МТТ), затем быстро отмывались,

фиксировались глутаральдегидом, заключались в глицерин и быстро фотометрировались на фотонасадке ФМЭЛ-1.

Электронная микроскопия. Опыты проводилось совместно с д.б.н. Г.М. Федоренко. На разных стадиях импульсной реакции МРН на облучение препарат фиксировали 30 мин 2,5 % глютаральдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2), промывали, обрабатывали 1 час 1% OsO4 по Колфилду, контрастировали уранилацетатом и заключали в эпон. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме Tesla BS 590Л (Чехословакия). Просматривали и фотографировали препараты на электронном микроскопе ПЭМ-100 (СССР).

Флуоресцентная-микроскопия. Для исследования целостности клеточной мембраны использовали пропидиум-йодид (ПИ), который проникает в клетку только через поврежденную мембрану и флуоресцирует в ядре красным светом. Сразу после ФД инактивации нейрона ванночку добавляли 20 мкМ ПИ,

устанавливали препарат на флуоресцентный микроскоп Люмам ИЗ и каждые 10 минут по 1-3 с наблюдали за флуоресценцией, регистрируя время появления красной окраски ядер.

Для исследования морфологии клеточных ядер и определения апоптоза по их фрагментации препараты фиксировали глутаральдегидом и инкубировали с красителем Hoechst 33342, выявляющим ядерный хроматин. Для одновременного определения некроза и апоптоза применяли двойное флуорохромирование препаратов ПИ и Hoechst 33342, после которого препараты заключали в глицерин и просматривали на флуоресцентном микроскопе Люмам И-3, снабженном фотоаппаратом или цифровой фотокамерой Nikon Coolpix 995. При изучении фотоповреждений ГК общее число глиальных ядер или процент ядер, окрашенных ПИ, подсчитывались на стандартной площади 10000 мкм2. Фрагментированные апоптозные ядра ГК подсчитывались на проксимальном участке аксона длиной 2 мм. В некоторых опытах оценивался процент препаратов с массовым апоптозом глии (более 20 фрагментированных глиальных ядер на 2 мм длины аксона).

В опытах по изучению локализации гиперицина и других флуоресцентных зондов в культивируемых опухолевых клетках их флуорохромировали гиперицином (1 мкМ), LysoTracker (0,4 мкМ), выявляющим лизосомы, ERTracker (0,8 мкМ), выявляющим ЭР, или MitoTracker (0,8 мкМ), выявляющим митохондрии (все - Molecular Probes, USA). Затем клетки отмывали и изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan.

Определение ЛТФазной активности в гомогенатах мозга крыс с одинаковым содержанием белка и облученных аргоновым лазером (488 нм, 0,1 Вт/см2) в течение от 1 до 1000 с проводилось по методу М.Н. Кондрашевой и др (1965).

Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с использованием стандартных методов. (Владимирский, 1983).

3. Реакция механорецепторных нейронов рака на лазерное микрооблучение в видимой части спектра

Импульсация МРН была нечувствительна к лазерному облучению в красной области спектра (633 нм), но изменялась под влиянием синего излучения. В большинстве опытов реакции МРН на лазерное микрооблучение (441,6 нм) были

многофазными: после латентного периода (L) импульсация учащалась (фаза I), тормозилась (фаза II), снова учащалась (фаза III) и, достигнув относительно высокой частоты (30-50 Гц), резко и необратимо блокировалась (фаза IY) (Рис.1). Для количественного анализа мы характеризовали каждую i-ю фазу реакции параметрами: длительностью, t,, величиной изменений частоты ПД, Af„ и величиной учащения или торможения импульсации, v, (Рис.1 В).

При интенсивном облучении латентный период импульсной

реакции нейрона составлял несколько секунд, а при 10 Вт/см2 достигал 60-90 мин. Это свидетельствует о накоплении в клетке подпороговых изменений,

сначала не влияющих, но потом, через час и более, все равно изменяющих нейронную активность. В опытах с фракционированием микрооблучения предварительное короткое воздействие повышало чувствительность МРН к последующему продолжительному

воздействию. Оно сокращало латентный период и время жизни нейрона, а также усиливало изменения частоты импульсации в I и III фазах. Это также говорит о накоплении в клетке подпороговых изменений.

Импульсно-периодическое лазерное

микрооблучение с длинами волн от 434 до 500 нм (средняя интенсивность 1.25*103 Вт/см2) почти во всех экспериментах вызывало

импульсные реакции нейрона, состоящие

Рис.1. Типичные импульсные т тт ,

только из I и II фаз и оканчивающиеся

реакции механорецепторного *

нейрона рака на лазерное торможением импульсной активности (Рис1Б).

микрооблучение: (А) ВТВ-тип; /сап

(Б) ВТ тип- (В) Обозначения' Облучение в желто-красном диапазоне (580,

описывающие динамику реакции 600 или 633 нм) было не эффективно. Спектры нейрона.

действия для латентного периода L и параметров характеризующих фазу I реакции нейрона, имели особенно

острые пики с максимумами при 460 нм (Рис.2), характерными для флавиновых соединений. Следовательно, первичными акцепторами света в нейроне могли

быть флавины. Спектры действия для параметров II фазы и и V? были менее выражены и содержали дополнительный максимум при 488 нм. Возможно, другие хромофоры, например, каротиноиды, также участвовали в фототорможении импульсной активности в фазе II. Так как синяя спектральная область была наиболее эффективной, то в большинстве экспериментов мы изучали действие на нейрон излучения He-Cd лазера (441,6 нм).

Повышение интенсивности микрооблучения ускоряло изменения импульсной активности во всех фазах реакции нейрона. Зависимости кинетических параметров от интенсивности облучения / хорошо

аппроксимировались функцией Р = А* !к, где Р - изучаемый параметр реакции нейрона, А - константа. Величина к определялась методом наименьших квадратов. Параметры, описывающие разные фазы реакции нейрона на

непрерывное микрооблучение,

характеризовались величиной к < \. Это показывает, что реакция нейрона была обусловлена не только линейными фотохимическими

процессами, но и вторичными темновыми реакциями. Интересно, что скорости учащения импульсации и при импульсно-периодическом воздействии квадратично зависели от интенсивности микрооблучения: к = 2,1 и 1,9. Это говорит об участии двухфотонных процессов в изменении импульсации в этих фазах.

Ингибиторы биоэнергетических процессов: гликолиза (моноиодацетат) и окислительного фосфорилирования (азид натрия) сокращали латентный период Ь реакции нейрона и

Рис.2. Спектры действия: зависимость параметров, описывающих динамику импульсной реакции нейрона на лазерное микрооблучение от длины волны

уменьшали или устраняли фазу торможения II в большинстве экспериментов (Табл. 1). Поскольку оба они ингибировали производство АТФ, то устранение

фазы II в импульсном ответе могло быть связано с ингибированием синтеза АТФ в нейроне.

Таблица 1. Результаты фармакологической модификации импульсных реакций нейронов на лазерное микрооблучение цитоплазмы (441.6 нм, 103 Вт/см2)

Модификация Типы Латентный Фаза Фаза Фаза Время

реакции период I II III ЖИЗНИ

2,4-динитрофенол:

И-зона В или и Л ¡1 а и

С-зона ВТВ и А п и

ВТВ

Флуоресцеин ВТВ и П и 1Т и

Янус зеленый

Ы-зона В а 17 нет нет я

С-зона ВТВ и (1 17 17 и

Моноиодацетат В и нет нет и

Азид В и 11 нет нет у

1/3 [Са] В о А нет нет а

ЗГСа1 ВТ о и 17 нет 17

Ионол В о и Н.д. Н.д. П

Б-маннит ВТВ о о о о о

Иодид натрия ВТ о о 17 Н.д. Т!

<=> - нет достоверных изменений; 0 или А - достоверное уменьшение или увеличение параметра, описывающего соответствующую фазу реакции нейрона (р<0.05). Н.д. - нет данных.

Фотосенсибилизация МРН отрицательно заряженным флуоресцеином натрия, который не проникал в клетку и адсорбировался на ее поверхности, приводила к резкому учащению импульсации и уменьшению латентного периода Ь и времени жизни нейрона Т. При этом фаза торможения II была сильно редуцирована. Напротив, янус зеленый В, избирательно окрашивающий митохондрии, усиливал все фазы реакции, но особенно сильно - фазу II (Табл.1). Значит, фазы учащения импульсация I и III были связаны с лазерным воздействием на ПМ, а фаза торможения II - с фотоповреждением митохондрий.

Электронно-микроскопическое исследование (Федоренко, Узденский, 1986) показало, что лазерное микрооблучение (441.6 нм, 103 Вт/см2) особенно влияло на ультраструктуру митохондрий. Уже в I фазе реакции в облученном участке нейрона наблюдались набухшие митохондрии с просветленным матриксом и дезорганизованными кристами. В необлученных областях митохондрии были увеличены, имели умеренно плотный матрикс и развитые кристы. В фазе II облученный участок нейрона был заполнен сильно набухшими митохондриями с электронно-прозрачным матриксом и фрагментированными кристами. После блокирования импульсации (фаза IV) наблюдалось полное просветление матрикса митохондрий и исчезновение крист, но наружные митохондриальные мембраны не теряли целостность (Рис.ЗБ). В необлученных участках нейрона располагались крупные митохондрии с умеренно плотным матриксом и хорошо развитыми кристами. Это указывает на их высокую функциональную активность, направленную, вероятно, на компенсацию локальных повреждений. Существенных изменений ЭР и АГ не отмечено, но наблюдались выпячивания клеточного ядра в сторону облученного участка цитоплазмы. Вероятно, при локальном повреждении усиливался ядерно-цитоплазматический обмен/

А ЯН

Рис 3 Ультраструктура контрольного нейрона (А) и нейрона, подвергшегося лазерному микрооблучению (441 6 нм, 103 Вт/см2) в течение 30 мин (Б) х35000

Микрооблучение участка цитоплазмы в околоаксонной зоне локально инактивировало сукцинатдегидрогеназу и перераспределяло ее активность. Большую роль в выработке энергии начинала играть необлученная дендритная зона нейрона. Это выражалось в увеличении ее площади и повышении средней

активности СДГ. Инактивация флавопротеина СДГ синим лазерным излучением (441,6 нм, 101 Вт/см2) подтверждает то, что флавиновые соединения являются фоторецепторами синего света в непигментированных нейронах.

Опыты с антиоксидантом ионолом и перехватчиком ОН"-радикалов D-маннитом показали участие свободных радикалов, но не ОН'-радикалов в реакции нейрона на лазерное микрооблучение (Табл.1).

Как фотоповреждение митохондрий могло влиять на импульсную активность нейрона? Мы предположили, что из поврежденных митохондрий могли высвобождаться ионы Са2+, диффундировать к ПМ и модулировать биоэлектрические процессы. И действительно, 3-кратное увеличение [Са2+]0 ослабляло фазу активации импульсации I и усиливало фазу торможения II (Табл.1). При этом в большинстве опытов не происходило повторного учащения импульсации (фаза III). Напротив, 3-кратное уменьшение [Са2+]0 так повышало возбудимость нейрона, что учащение импульсации в фазе I было вдвое более

интенсивным, а фаза торможения необходим для появления фазы II.

Рис 4. Влияние излучения аргонового лазера (488 нм) на активность (Ма+-К+)-, Са2\ и №^г*-АТРаз в гомогенатах мозга крыс.

II отсутствовала. Следовательно, Са2+

Наши данные о высокой чувствительности АТФаз к синему лазерному излучению (488 нм, 0,1 Вт/см2) согласуются с этим предположением. Это излучение дозозависимо ингибировало (Ка+-К+)-АТФазу и, особенно, в

гомогенатах мозга крысы. (Ыа+-К+)-АТФаза находится в ПМ, а Са2+-АТФаза - в ПМ и ЭР. Дозы 0,1-1 Дж/см были достаточны для 2-

кратного уменьшения активности -АТФазы, а 10 и 100 Дж/см2 - полностью ингибировали этот фермент (Рис.4). Неспособность фотоповрежденной Са2+-АТФазы выкачивать Са2+ из цитозоля — еще один фактор повышения [Са2+],.

Итак, учащение импульсации в I фазе усиливалось при фотосенсибилизации плазмалеммы, ингибировании биоэнергетических процессов и уменьшении [Са2+]0. Напротив, I фаза ]

редуцировалась под влиянием антиоксидантов или при

увеличении [Са2+]0. Торможение нейронной активности в фазе II усиливалось при сенсибилизации митохондрий или поввшении [Са2+]0. Эта фаза уменьшалась или исчезала при ингиб; ^овании энергетического метаболизма; уменьшении [Са2+]0 или при микрооблучении ядра вместо цитоплазмы.

Механизм действия синего лазерного света на непигментированную нервную клетку (Рис.5) имеет не термическую, а фотохимическую природу, на что указывают продолжительные латентные периоды (минуты и десятки минут при низкой интенсивности) и отсутствие коагулированного материала на электронно-микроскопических фотографиях. «Флавиновые» спектры действия с максимумом при 460 нм, селективное повреждение внутренних митохондриальнык мембран, содержащих флавопротеины, фотоповреждение митохондриального флавопротеина СДГ свидетельствуют о флавиновой природе первичных фоторецепторов синего света в непигментированных нейронах и, возможно, в других клетках животных.

Синий свет инактивирует ионные каналы, насосы (Коркушко, Мачерет, 1982; Водолазкин и др., 1998) и другие мембранные белки. Это приводит к нарушению ионной проницаемости ПМ, падению мембранного потенциала, деполяризации и учащению импульсации. Одновременное фотоповреждение

митохондрий, в первую очередь, их внутренних мембран, вызывает локальное нарушение биоэнергетических процессов и, вероятно, высвобождение ионов которые могут

гиперполяризовать клетку,

открывая -зависимые

каналы (МеееИ, 1978), и тормозить импульсную

активность. Тормозные процессы какое-то время доминировали над возбудительными процессами, связанными с повреждением ПМ и ведущими к деполяризации и учащению импульсации. Это могло обусловливать появление фазы II в реакции нейрона.

Предполагаемый механизм реакции МРН на лазерное микрооблучение

Рис 5 Предполагаемый механизм реакции МРН на лазерное микрооблучение

Однако, после истощения запасов Ca" , повреждение ПМ снова преобладало, и импульсация снова активировалась (фаза III), пока не происходил деполяризационный блок (Ходоров, 1975). Механизм последующей смерти нейрона был вероятно некротическим, о чем свидетельствует повреждение ПМ и цитоплазматических органелл.

Мы предполагаем, что такая же последовательность событий может разворачиваться при воздействии синего лазерного облучения и в других непигментированных животных клетках. Поэтому полученные результаты могут иметь общебиологическое значение. Данные о характере реакции нейронов на лазерное облучение, о зависимости нейронной активности от длины волны, интенсивности, длительности, режима облучения (непрерывный или импульсно-периодический) могут найти применение в нейрохирургии для выбора оптимального режима лазерного воздействия с оперативными или терапевтическими целями. Возможность тонких операций по разрушению или функциональному выключению или бесконтактной стимуляции малых участков нервной ткани и даже отдельных нервных клеток представляет значительный интерес для экспериментальной нейрофизиологии.

4. Реакция механорецепторных нейронов рака на фотодинамическое действие разных фотосенсибилизаторов

Эффективность светового воздействия на биологические объекты можно существенно повысить, окрашивая их красителями-фотосенсибилизаторами, хорошо поглощающими видимый свет и генерирующими при освещении синглетный кислород ('Ог) и другие активные формы кислоорода (АФК), вызывающие окислительный стресс и смерть клеток. Поскольку многие ФС селективно накапливаются в опухолях, то метод ФДТ широко используется в онкологии. Для повышения его эффективности разрабатываются ФС с высоким поглощением света в красной области спектра, большим квантовым выходом 'О2, хорошим накоплением в клетках и низкой темновой токсичностью. Хотя ФДТ применяется для лечения опухолей мозга (xMuller, 1990; Kostron, 1996), реакции нервных клеток на ФД воздействие мало изучены. Для восполнения этого пробела нами исследовано ФД действие на МРН 34 новых и уже известных ФС.

Рис. 6 Примеры основных типов реакций нейронов на ФД воздействие (А) - В-тип, (Б) ВТВ-тип, (В) - ВТ-тип, (Г) - Т-тип, (Д) -ТВ-тип, (Е) - ТВТ-тип.

В концентрациях менее 10" М они практически не влияли на импульсную активность нейрона в темноте, но сильно повышали чувствительность МРН к излучению Не-№ лазера (633 нм). Динамика импульсного ответа нейрона на ФД воздействие была многофазной и напоминала реакцию нейрона на лазерное микрооблучение. Последовательность и число фаз возбуждения и торможения импульсации (рис.6) зависели от вида и концентрации ФС. При интенсивном ФД воздействии преобладали возбудительные реакции В- или ВТВ-типов, в которых прекращение импульсации происходило по типу деполяризационного блока, а при слабых, но продолжительных воздействиях - тормозные реакции Т-, ВТ- или ТВТ-типов, когда импульсация прекращалась в результате постепенного торможения. необратимое прекращение импульсации как

Мы рассматривали функциональный показатель развивающейся впоследствии смерти нейрона. Нашей рабочей гипотезой, как и в случае лазерного микрооблучения, было предположение, что фазы учащения импульсации связаны с фотоповреждением и деполяризацией ПМ, а торможения - опосредованы высвобождающимся из внутриклеточных депо, в основном, митохондрий и/или ЭР.

Эта гипотеза подтверждается в опытах по лазерному микрооблучению ядра или цитоплазмы в околоаксонной области тела (Ц-зона) нейрона в присутствии 2,4-динитрофенола. Влияние 2,4-динитрофенола, хорошо поглощающего синий свет (441,6 нм), было, вероятно, обусловлено не действием на окислительное фосфорилирование, а фотосенсибилизацией нейрона. Динитрофенол значительно усиливал вызванное микрооблучением учащение импульсации в I фазе. При микрооблучении цитоплазмы или ядра этот эффект был примерно

одинаковым. Но фаза торможения II, почти отсутствующая при облучении ядра, становилась весьма выраженной в реакции нейрона на облучение цитоплазмы, богатой митохондриями. (Рис.7).

Для характеристики ФС и сравнения их ФД эффективности мы исследовали зависимости времени жизни нейронов Т от концентрации сенсибилизаторов С, которые хорошо аппроксимировались функцией:

Т(С) = а*С\ или & Т(С) = + (1)

Параметры а и Ь определялись методом наименьших квадратов. О справедливости такой аппроксимации свидетельствуют высокие значения коэффициента корреляции Я (>0.8) и коэффициентов Стьюдента Д, и Фишера Г. Для учета того, что длина волны облучения 633 нм не соответствовала максимумам поглощения света разными ФС, мы вводили поправку учитывающую разницу молярных экстинкций в максимуме поглощения

и на волне 633 нм:

& Тт(С) = & Т633(С)-18к = 18а + ЫёС-18к, (2)

где - измеренные величины времени жизни МРН (от начала облучения

до прекращения активности), а ТЯ(С) — скорректированные величины для

предполагаемого облучения в пике поглощения света при На

линеаризованным графиках Т(С) (Рис.8) более эффективные ФС располагаются в левом нижнем углу. Коэффициент а зависит от интенсивности светового воздействия на клетку, т.е. от числа фотонов N поглощенный клеткой. N определяется как интенсивностью облучения, так и коэффициентом поглощения света клеткой, а последний -

Рис 7 Фотосенсибилизация нейрона к

молярной экстинкцией и числом молекул

лазерному микрооблучению с помощью

ФС в клетке или, точнее, в клеточных

оси абсцисс Стрелка указывает на начало облучения (А) Контроль, (Б) - облучение ядра нейрона, (В) цитоплазмы

количество

мишенях, повреждение который вызывает наблюдающийся эффект. Показатель степени Ь характеризует

элементарных повреждений, ведущих к инактивации нейрона при поглощении фотона одной молекулой ФС. Из химической кинетики, при Ь = 1 фотон, поглощенный одной молекулой приводит к одному элементарному

фотоповреждению, инактивирующему нейрон. При Ь — 1/2 — к двум, а при Ь - 2 для одного повреждения нужно поглощение фотонов двумя молекулами ФС.

Сравнивая три препарата на основе производных гематопорфирина: Фотогем, Фотофрин П и Фотосан-3, мы показали, что их ФД эффективность уменьшается в следующем ряду (Рис.8А): Фотогем > Фотофрин II > Фотосан-3. Фотосан-3 работал только при концентрациях более 500 нМ, а Фотогем и Фотофрин II - от 5 нМ до 10 мкМ. Показатели степени Ь = -0, 40 и -0,51 были близки к 1/2, что указывает на участие одной молекулы ФС в двух актах фотоповреждения, ведущих к нарушению нейронной активности.

Более эффективными были производные дейтеропорфирина IX (ПДП). Из них 4АсАс и 40№и инактивировали нейрон за время, не превышающее 2 часов, при концентрациях

Ю10 М, 2,4сМсАс - при С > 10"9 М, а 2,4-сЮНЪи - при С > 10"8 М (Рис.8А,

Табл.2). В целом, 4-монозамещенные ПДП были эффективней 2,4-дизамещенных; АсАс-производные были эффективней гидроксибутильных, а Ас-производные занимали промежуточное положение. От чего зависит ФД эффективность сенсибилизаторов? В таблице 2 представлены ряды ПДП в порядке возрастания их молярной экстинкции е при 633 нм, коэффициента распределения хроматографической подвижности в тонких слоях а также ФД эффективности, определенной в наших экспериментах (Рис.8А) и скорректированной на возможное облучение в максимуме поглощения ФС. Различия Е были небольшими (Табл.2). Поэтому большая эффективность ПДП была скорее связана со способностью проникать в клетку и сенсибилизировать ее структуры. Распределение ФС по ФД эффективности лучше коррелировало с распределением по коэффициенту распределения характеризующем, как липофильность, так и амфифильность веществ, чем по их хроматографической подвижности определяющейся только липофильностью (Табл.2). В клетках лучше накапливаются амфифильные вещества, легче пересекающие клеточные мембраны и способные не только входить в них, но и выходить в водную среду.

Но, по нашим данным, амфифильность ФС не должна быть слишком высокой: оптимальные значения Кр ~ 10-30.

Таблица 2. Распределение порфириновых фотосенсибилизаторов по физико-химическим свойствам и фотохимической эффективности

Свойства Распределение фотосенсибилизаторов

«¡зз*Ю*3, л/см*моль 2,4ЛАсАс < 2,4,с11Ас = РЬН г РП < 2,4сЮНЬи < 40НЬи £ 4Ас <4АсАс (2 2) (3 0) (3 0) (3 1) (3 7) (4 1) (4 2) (5 2)

Коэффициент распределения Кр РШ « 4 Ас = 2,4Й1Ас < 2,4<ЮНЬи а 2,4сЬАсАс < 4АсАс = 40НЬи (1 5) (9) (10) (17) (19) (28) (28)

Хроматографическая подвижность Яг 2,4(ЮНЬи <40НЬи<2,4с11АсАс = 2,4с11Ас < 4АсАс = 4Ас (0 05) (0 27) (045) (0 48) (0 54) (0 56)

7"(Х = 633 нм) РП < РШ £ 2 4сЮНЬи < 2;4ё1АсАс < 4Ас = 2,4&Ас < 40НЬи < 4АсАс

Т,скорректированное на к - е^Вцз РП < РШ з 2 4с1ЮНЬи < 2,4с11АсАс = 4Ас < 2,4ЛАс < 40НЬи < 4АсАс

Численные значения приведены в скобках.

Для ФДТ желательно использовать малые концентрации ФС, при которых ниже темновая токсичность и побочные эффекты. При этом для фотоповреждения клеток важна слабая зависимость ФД эффекта от концентрации ФС, когда показатель Ъ < 0,5. Для изученных ПДП (кроме 2,4-diOHbu) было Ь = 0,2-0,3. Это указывает на то, что одна молекула ФС, поглотившая фотон, могла вызвать 3-5 вторичных повреждений, сказывавшихся на импульсной активности, возможно, инициируя несколько цепочек свободнорадикального повреждения клеточных мембран.

Хлорины - перспективный класс ФС II поколения с интенсивным поглощением света в красной области спектра (Хщах ~ 640-670 нм; е ~ (1-9)*104 высоким квантовым выходом фотогенерации низкой темновой токсичностью и селективным накоплением в опухолях. Мы исследовали ФД действие на МРН ряда новых производных хлоринов еЛ и рв, а также — тТНРС, наиболее эффективного ФС из применяемых в ФДТ. Три карбоксильные группы делают хлорины амфифильными, растворимыми как в воде, так и

в биологических мембранах. Глюкаминовые производные хлорина е^ имеют гидрофильную углеводную группировку с одной стороны молекулы и гидрофобный хвост - с другой. Такое асимметричное распределение полярных

и неполярных групп в разных частях молекулы усиливает их амфифильность. Хлориновые ФС были весьма эффективными: они инактивировали нейроны при наномолярных концентрациях. Анализ зависимостей Т(С) показал, что в диапазоне от Ю-9 до 10"5 М хлорины располагались по ФД эффективности в следующем ряду (Рис.8Б):

DVEE-Chl e,< HPCI-Chl p6 < DVME-Chl e6 <DVMAOB-Chl e6< Chi e6< <Фотодитазин < FDV-Chlp6< GA-Chl ей<DVMHB-Chl e6< DVMOB-Chl e6<

< Chi Pf, < Радахлорин ~ mTHPC

Но для облучения не при 633 нм, как в наших опытах, а в максимумах поглощения ФС, этот ряд с учетом поправки (2) несколько изменится:

DVMAOB-Chl е„» DVME-Chl е6 < DVEE-Chl еб< Chi е6 < Фотодитазин < FDV-Chl р„ ~ GA-Chl e« < DVMOB-Chl еА < DVMHB-Chl ей <

< Chi р6 < mTHPC < Радахлорин

Широко известный ФС тТНРС наиболее эффективно инактивировал нейрон. Производные хлоринов еа и р6, кроме Радахлорина, были менее эффективны (Рис.8Б). Но, можно предполагать, что при облучении в максимуме поглощения (654 ни) Радахлорин может быть эффективней, чем тТНРС.

В наших опытах умеренно амфифильные DVMHB-Chl и DVMOB-Chl e« с Кря 14, были эффективней как более амфифильных ФС GA-Chl e«, DVEE-Chl e« и DVME-Chl e6 с Kp-1-2, так и более гидрофобного D V M A O B -ChJ = 53. Видимо, такие уровни амфифильности оптимально обеспечивают как проникновение ФС в клеточные мембраны, так и длительную задержку в них.

По величине Ъ хлориновые ФС различались сильней других ФС: показатель Ъ для большинства ФС варьировал от 0,4 до 1,3. Наиболее эффективными были тТНРС, Радахлорин, Фотодитазин, DVMOB-Chl e6, DVMHB-Chl е6 с более низкими величинами Ь от 0,36 до 0,46. Такие значения Ъ свидетельствуют, что одна молекула ФС участвует в 2-3 вторичных повреждениях, приводящих к инактивации нейрона. Менее эффективными в области малых концентраций были DVME-Chl е6 и DVMAOB-Chl ецс b ~ 1. В случае Chi еg было b= 1,83, т.е. для одного элементарного повреждения требовалось поглощение квантов двумя молекулами ФС. Следствие более крутой зависимости - узкий концентрационный интервал, в котором зарегистрирован эффект - от 0.03 до 0.5 мкМ. Применение малых концентраций выгодно для снижения темновой токсичности ФС. Но когда нужно быстро повредить клетки, лучше использовать большие концентрации ФС с крутой зависимостью Т(С), как у хлорина е«. Исследованный набор хлориновых производных достаточно разнообразен и позволяет выбрать ФС,

пригодные для решения как первой (тТНРС, Радахлорин, DVMOB-Chl e«, DVMHB-Chlee), так и второй задачи (хлорин ел).

Высокая молярная экстинкция Лталоцианинов (1,3-2,1-Ю5 М''см"') в

красном диапазоне спектра (X ~ 660-676 нм), большой квантовый выход 'Ог, фотостабильность и стабильность при хранении, возможность синтеза многочисленных производных с заданными свойствами, делают их многообещающими ФС. Для придания водорастворимости фталоцианины сульфируют, а образование комплексов с металлами (AL, Zn и др.) увеличивает их способность генерировать 'Ог при фотовозбуждении. В наших опытах сульфированные фталоцианины алюминия и цинка вызывали фотоинактивацию нейронов в широком диапазоне концентраций от 1 нм до 10 мкм и выше. Окта-А1 и PAlPc были менее эффективны и действовали на нейроны при концентрациях более 10-40 нМ (Рис.8В).

Все исследованные фталоцианины характеризовались примерно одинаковыми коэффициентами Ь, варьирующими в узких пределах от -0.325 до -0.364. То есть, одна фотовозбужденная молекула фталоцианина могла индуцировать порядка трех вторичных повреждений, ведущих к инактивации нейрона. Исследованные фталоцианины располагались по ФД эффективности в следующем ряду:

ZnPcS2> ZnPcS3 > ФотосенО ZnPcS4> PalPc

Но, если учесть разницу в поглощении света при 633 нм и в максимумах поглощения и ввести поправку (2), то при облучении нейронов светом с длиной волны А.™,, Фотосенс должен оказаться эффективней фталоцианинов цинка:

ФотосенО ZnPcS4> ZnPcS2 * PAlPc > ZnPcS3 Поэтому ФД действие Фотосенса подробней исследовано в наших опытах.

Гиперицин (Hyp) - природный полициклический хинон, выделенный из зверобоя Hypericum perforatum. Высокий коэффициент экстинкции вблизи 600 нм, квантовый выход порядка 0,7, низкая темновая токсичность,

селективное накопление в опухолях делают его перспективным ФС, а яркая флуоресценция позволяет использовать его для визуализации опухолей. Для преодоления гидрофобности и способности к агрегации в водных растворах недавно разработан водорастворимый препарат Hyp-S, в котором гиперицин связан водородными связями с цепями поливинилпирролидона.

Исследование спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения гиперицина в фосфатном буфере с сывороточным альбумином человека HSA (для предотвращения агрегации), или в суспензии клеток показало, что

интенсивный оранжевый свет (600 нм, 100 мВт/см2), соответствующим максимуму поглощения гиперицина, обесцвечивает его. Дозы, необходимые для его обесцвечивания, намного превышали дозы обесцвечивания других ФС, например, Фотофрина П или шГНРС и бвши сопоставимы с таковвши для алюмофталоцианинов. Высокая фотостабильность - несомненное достоинство гиперицина. Облучение снижало оба пика флуоресценции гиперицина в растворе HSA (608 и 648 нм) и сдвигало полосу 608 нм к 602 нм (Рис.9). При этом в области 470-580 нм появлялась широкая полоса, соответствующая накоплению продуктов фототрансформации гиперицина. При регистрации спектров возбуждения на длине волны 560 нм, соответствующей флуоресценции фотопродукта, после освещения появлялся спектр с максимумами при 243, 339, 387 и 477 нм, не регистрировавшийся для необлученного гиперицина. Он быш похож на спектры поглощения и возбуждения интактного гиперицина, т.е. фотопродукт не слишком отличался от гиперицина. В фототрансформации гиперицина не участвовали ни обышныщ, ни синглетный кислород, т.к. проведение эксперимента в бескислородной среде, через которую продували гелий, или в буфере с D2O вместо воды не влияло на образование фотопродукта. В суспензии клеток карциномы WDr фотообесцвечивание гиперицина и образование продуктов его фототрансформации происходило примерно так же, как в растворах альбумина.

Для изучения внутриклеточной локализации гиперицина мы сравнили его внутриклеточное распределение в культивируемых клетках глиобластомы D54Mg с локализацией флуоресцентный зондов, вытвляющих: митохондрии лизосомы Распределение

гиперицина бышо более сходно с распределением ERTracker, что свидетельствовало о его локализации в мембранах ЭР и АГ. В рецепторе растяжения рака гиперицин, как и Hyp-S, локализовался, в основном, в глиальных оболочках, а в нейроне его флуоресценция была существенно ниже. Это указывает на возможность избирательной ФД деструкции глиальной ткани и флуоресцентной визуализации глиом при нейрохирургических операциях.

В темноте гиперицин или Hyp-S при концентрациях до 20 или 4 мкМ, соответственно, не инактивировали МРН, т.е. были малотоксичны. ФД действие гиперицина или Hyp-S на нейрон вызывало торможение и необратимое прекращение импульсации нейрона. Нур-S был эффективней гиперицина (Рис.8,Г). Показатель Ь в обоих случаях не сильно отличался от 0,5, т.е. поглощение фотона молекулой гиперицина могло

индуцировать в среднем два вторичных повреждения, ведущих к инактивации нейрона.

Изучение ФД действия рибофлавина на нейрон представляет интерес, т.к. флавины являются эндогенными ФС, придающими фоточуствительность

непигментированным клеткам. Кроме того, они являются сенсибилизаторами I типа, генерирующими преимущественно супероксид-анион, 0\- (Schmidt, Butler, 1976). В опытах по ФД действию рибофлавина заметная инактивация

возбуждения (II) гиперицина (1 мкМ) в 1,5 нейрона отмечена только - при

мкМ растворе HSA, зарегистрированные ,

концентрации М. В момент

мВт/см ) с дозами от 30 до 570 Дж/см .

прекращения нейронной

активности,

4

Справа на рис I - те же спектры, чю и

вызванного ФД действием М

пика при 600 нм г , ,

рибофлавина, как и спустя 4 часа,

примерно у половины нейронов повреждалась ПМ и ПИ проникал в клетку. Активность СДГ в нейроне в этот момент не отличалась от контрольной и падала только через 4 часа. На протяжении первых 4 часов после ФД воздействия не наблюдалось существенных изменений морфологии и размеров

ядер нейронов,в частности, пикноза и фрагментации, характерных для апоптоза. Таким образом, фотосенсибилизация экзогенным рибофлавином может вызывать функциональную инактивацию и некроз нейронов. Но его ФД эффективность была намного ниже, чем сенсибилизаторов II типа, что, по нашим расчетам, было связано не столько с поглощением меньшего количества фотонов, сколько с меньшей токсичностью по сравнению с

Итак, импульсные ответы нейронов на ФД воздействие состояли из одной, двух или трех фаз активации или торможения импульсации в зависимости от вида и концентрации ФС. При больших концентрациях преобладали возбудительные ответы нейронов, а при малых - тормозные. Мы предполагаем, что разнонаправленные изменения нейронной активности связаны с ФД воздействием на разные клеточные мишени, а два пути необратимого прекращения нейронной активности - после резкой активации, либо в результате постепенного торможения импульсации, отражают разные механизмы развивающейся впоследствии смерти нейрона.

ФД эффективность сенсибилизаторов определяется их структурой и физико-химическими свойствами - молярной экстинкцией, способностью генерировать 'Ог и липофильностью/амфифильностью, определяющей, внутриклеточной локализацию. На примере дейтеропорфиринов и хлоринов показано, что наиболее эффективны амфифильные ФС с расположением гидрофобных и гидрофильных групп в разных частях молекулы. Они должны легко пресекать мембраны и проникать в клетку, т.к. гидрофобная часть молекулы позволяет им попасть в мембрану, а гидрофильная - выйти в водную среду. По нашим данным, коэффициент распределения характеризующий амфифильность ФС, должен быть не слишком малым, чтобы красители обладали определенной липофильностью, позволяющей им проникать в биомембраны, но и не слишком большим, чтобы они надолго не задерживались, а пересекали мембраны и проникали в клетки. Оптимальны значения

Также важно, что в концентрационных зависимостях показатель

степени Ь характеризует число молекул ФС, участвующих в элементарном акте, приводящем к инактивации нейрона. Более эффективными были ФС с малыми значениями Ь, когда одна молекула ФС могла отвечать за несколько элементарных повреждений, например, за инициацию нескольких цепочек

перекисного окисления липидов, разрушающих биомембраны. Оказалось, что разные классы ФС характеризуются определенными величинами Ь Так, для производных дейтеропорфиринов были характерны значения для

фталоцианинов - для производных хлорина Это указывало

на участие одной молекулы ФС в 3-5, 3 или 1-2 элементарных актах фотоинактивации нейронов. Для производных хлорина е6 был характерен разброс значений Ь от 0,43 до 1,83, что указывало на большее разнообразие механизмов из ФД действия.

Изолированные нейроны рака могут успешно применяться в качестве модельных объектов для изучения клеточных механизмов ФД эффекта, тестирования и сравнения новых ФС. Их импульсная активность весьма чувствительна к ФД воздействию и может служить индикатором фотоповреждения клетки. Необратимые нарушения функциональной активности нейронов наблюдались при концентрациях ФС, на 2-3 порядка меньше применяемых в ФДТ. Сопоставление зависимостей времени жизни нейронов от концентраций ФС позволило сравнивать ФД эффективность разных сенсибилизаторов. Этот метод можно использовать для тестирования новых ФС, перспективных для фотодинамической терапии.

5. Исследование клеточно-молекулярных механизмов фотодинамического действия Фотосенса на изолированный нейрон

Клеточно-молекулярные механизмы реакций нервных клеток, на ФД воздействие изучены нами на примере Фотосенса. Его достоинства включают высокое поглощение света в красной области (около 670 нм), эффективную генерацию 'О2, нетоксичность, фотостабильность и т.д.

В рецепторе растяжения рака после 30-минутной инкубации Фотосенс (105 М) локализовался преимущественно в глиальной оболочке. В теле нейрона его флуоресценция была слабее. Гранулярной флуоресценции, характерной для лизосомной локализации алюмофталоцианинов, мы не наблюдали.

При М Фотосенс инактивировал нейрон в темноте в среднем

за 2,5-5 часов. В концентрации ниже 105 М Фотосенс практически не влиял на импульсную активность МРН, т.е. был малотоксичен.

Основное внимание мы уделили двум режимам ФД воздействия Фотосенса. При 10'5 М наблюдались преимущественно В- или ВТВ-реакции нейрона, в которых после фазы активации происходил деполяризационный блок в среднем за 2,5±0,8 минуты. Более слабое воздействие (Ю-7 М) постепенно тормозило и необратимо прекращало нейронную активность в среднем за 21±1 мин. Мы рассматривали необратимое прекращение импульсации как показатель предстоящей смерти нейрона. Возбудительные реакции, оканчивающиеся деполяризационным блоком, типичны для повреждения нейронов разными факторами. При интенсивном ФД воздействии они связаны с окислительным повреждением биомембран, падением ионных градиентов и деполяризацией (Людковская, Бурмистров, 1971; Pooler, 1972; Specht, Rodgers, 1991; Kress, 1997). Механизмы тормозных процессов, преобладавших при низких концентрациях Фотосенса и последующей смерти нейрона были не

ясны. Поэтому мы сосредоточились на их изучении. Как и прежде, мы предполагали, что возбудительные фазы могли быть связаны с повреждением ПМ, а тормозные - с повреждением внутриклеточных органелл и нарушением гомеостаза Саг+.

В опытах по исследованию роли АФК в реакции нейрона на ФД воздействие 10"7 М Фотосенса перехватчики 'Ог DABCO и гомокарнозин защищали нейрон от ФД повреждения и увеличивали его время жизни (рис.10).

Следовательно, 'Ог участвует в фототорможении нейронной

активности. Прооксидантная смесь 10 мкМ RS04 и 800 мкМ аскорбата усиливала фототорможение

нейронной активности и почти вдвое сокращала время жизни нейрона, т.е. повышение уровня АФК усиливало последующее ФД воздействие.

В контрольных препаратах краситель Hoechst 33342, флуорохромирующий ядерный

Рис 10 Модификация реакции нейрона на ФД

действие 10' М антиоксидантами

Фотосенса про-

хроматин, выявлял крупные ядра нейронов с равномерно распределенными мелкими глыбками хроматина, четкой границей и круглым ядрышком. ФД воздействие вызывало сжатие тел и .дер нейронов. Динамика его развития зависела от интенсивности ФД воздействия. При Ю"5 М сразу после инактивации нейрона сжимались тела нейронов, а средняя площадь ядер увеличивалась примерно в 1,5 раза. Через 1-2 часа площадь ядра снижалась до контрольного уровня, а через 3-6 часов - снижалась. При Ю"7 М в первые 1-2 часа после инактивации нейрона средние площади тела и ядра нейрона не отличались от контроля, но через 3-6 часов происходило сжатие тел и ядер нейронов (Рис. 11 А). При этом усиливалась флуоресценция ядер, что говорило о более плотной упаковке хроматина. Но мы не наблюдали фрагментацию ядер нейронов или образование больших масс хроматина, характерных для апоптоза.

« &

ФД действие Фотосенса на площадь ядра нейрона

200г 150 • 100 • ! 30 ■

oL

гтттттп

1 1 1 8 Я Ü 9 so О s

Zf е Í А Zr в i A í

1 а 1 1 | 1 i 3 1 a

а ГЧ 9" м i с в e

Окрашивание ядер нейронов пропидиум-иодндом

J. «Ч

■ "

1 - Контроль г-0.1ч«МФС З-ЮшсМФС

Рис.11. Динамика морфологических изменений нейронов после ФД воздействия 0,1 или 10 мкМ, Фотосенса. А: Фотоиндуцированные изменения площади ядер через 1-2, 3-6 или >10 часов после ФД воздействия. Б. Среднее время ФД повреждения ПМ, оцениваемого по появлению флуоресценции ПИ в ядрах. * р<0.05; ** р<0.01.

При окраске препаратов ПИ, выявляющим некротические клетки с поврежденной ПМ, ядра контрольных нейронов приобретали красную флуоресценцию в среднем через 6,2+0.5 часов после изоляции (Рис.11Б). При ФД воздействии 10"5 М > Фотосенса ПМ повреждалась уже в ходе облучения, а при 10'7 М - только через 1,7+0.3 часов (Рис. 11Б). Это согласуется с тем, что основной мишенью ФД воздействия М Фотосенса была ПМ и нейроны погибали от некроза. Потеря целостности ПМ и некроз почти через 2 часа

после ФД воздействия М Фотосенса могли быть опосредованы

повреждением других клеточных структур.

Электронно-микроскопическое исследование, проведенное совместно с Г.М. Федоренко, выявило изменения ультраструктуры на разных фазах реакции нейронов на ФД воздействие 10'7 М Фотосенса. В ядрах контрольных нейронов наблюдались дисперсно-распределенные небольшие глыбки умеренно сконденсированного хроматина. Митохондрии имели умеренно плотный матрикс и хорошо выраженные кристы. В теле нейрона были рассеяны скопления зерен гликогена, являющегося значительным источником энергии. Часто они примыкали к митохондриям. Цистерны ЭР были небольшими, округлыми или вытянутыми. Комплексы Гольджи были представлены стопками из 3-5 плоских цистерн и округлых пузырьков. Уже после 5-минутноёо облучения, когда импульсная активность только начинала изменяться, отмечены изменения практически всех органелл. Ядерный хроматин выглядел более разреженным. Некоторые цистерны ЭР заметно набухали. Большинство митохондрий сохраняло нормальную структуру, но в некоторых наблюдались участки с просветленным матриксом и разрушенными кристами. Многие митохондрии были вытянутыми; часто наблюдались агрегаты из нескольких митохондрий. Отмечено большое число лизосом, рассеянных между митохондриями. Сразу после прекращения импульсации (О часов) ультраструктура нейронов была сильнее изменена и гетерогенна в пределах одной клетки. Ядерный хроматин был заметно разрежен, но содержал сравнительно крупные гранулы сконденсированного хроматина размером 2-4 мкМ. Многие цистерны ЭР значительно набухали, особенно, вблизи наружной мембраны. Митохондрии часто содержали электронно-светлые участки, в которых отсутствовали кристы и матрикс, хотя другая часть этих же митохондрий могла выглядеть нормально. Многие митохондриальные агрегаты распались и чаще наблюдались отдельные митохондрии. Гликогеновые гранулы и АГ практически не встречались. ПМ выглядела неповрежденной. Через / час после прекращения импульсации наблюдались ультраструктурные изменения, характерные для гибнущей некротической клетки. Практически все цистерны ЭР были вакуолизированы. Митохондрии набухали, они имели электронно-прозрачный матрикс и фрагментированные кристы. АГ и

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ \ ПИБЛИОТЕКА 33 СЯМЙК

гликогеновые гранулы отсутствовали. В цитоплазме были разбросаны мелкие лизосомы. Эти изменения были более однородны, чем на предыдущих этапах.

Таким образом, митохондрии, ЭР и АГ были наиболее чувствительны к фотосенсибилизации. Картина ультраструктурных изменений была характерна скорее для некроза, чем апоптоза. При апоптозе изменения сначала происходят в клеточном ядре при сохранных органеллах, а затем распространяются на всю клетку. При ФД действии Фотосенса более выраженные сдвиги наблюдались в органеллах. Развитие изменений продолжалось не только во время, но и после ФД воздействия.

Так как митохондрии - одна из важнейших мишеней ФД воздействия, то мы изучили влияние ФД действия Фотосенса на активность СДГ, связанной с внутренней митохондриальной мембраной. При ФД действии 10"7 М Фотосенса средняя активность СДГ в нейроне изменялась не сразу, а только через 4 часа после его инактивации. При 10"5 М СДГ ингибировалась в среднем на 35 %

Рис 12 ФД действие на активность дегидрогеназ в рецепторе растяжения рака А Ингибирование СДГ в теле нейрона Б и В Фотоиндуцированные изменения средней активности СДГ и суммарной дегидрогеназной активности сразу после облучения и через 4 часа *р<0 05, **р<0 01

сразу после прекращения импульсации и на 68 % через 4 часа (рис. 12). Динамика фотоингибирования СДГ коррелировала с динамикой падения суммарной дегидрогеназной активности, определяемой с помощью МТТ-теста (Рис.12). Фотоингибирование СДГ и снижение общей дегидрогеназной активности в теле нейрона должно приводить к падению синтеза АТФ и потере жизнеспособности клетки. Интересно, что при слабом ФД воздействии дегидрогеназы ингибировались не в ходе фотосенсибилизации, а спустя несколько часов, т.е. происходила не прямая, а опосредованная их инактивация.

Субстратно-ингибиторный анализ участия отдельных звеньев энергетического метаболизма в импульсной реакции МРН на ФД воздействие 10' М Фотосенса показал, что субстраты гликолиза (глюкоза) или цикла Кребса (сукцинат натрия или смесь пирувата и малата натрия) замедляли фототорможение импульсации и увеличивали время жизни нейрона. Напротив, ингибиторы гликолиза (моноиодацетат натрия или 2-дезокси-Б-глюкоза); цикла Кребса (малонат натрия); электронного транспорта (ротенон, антимицин А, амитал натрия или азид натрия) или разобщитель окислительного

фосфорилирования 2,4-динитрофенол сокращали время жизни нейрона (Рис.13). Поскольку все эти процессы являются разными звеньями синтеза АТФ в клетке, то именно недостаток АТФ был одной из причин фототорможения и последующего прекращения нейронной активности.

Ионы Са2+ играют важнейшую роль в управлении многочисленными клеточными функциями: от нейронной активности до некроза и апоптоза Для выяснения роли в ФД-индуцированном М

Фотосенса) торможении импульсной активности нейрона мы использовали ряд модуляторов путей поступления в

цитозоль или его вывода. Опыты показали, что фототорможение может быть связано с

Рис 13 Влияние субстратов или ингибиторов биоэнергетических

процессов на время жизни нейрона при ФД воздействии 10'7 М Фотосенса Опытные варианты заштрихованы

*р<0 05, **р<0 01.

повышением [Са2+],.

Действительно, разные пути повышения {Са2+], - 3-кратное повышение [Са2+]0 или Са21-ионофор иономицин, ведущие к проникновению - Са2+ в клетку; кофеин, агонист рианодиновых рецепторов ЭР, высвобождающий запасенный Са2+, • или тапсигаргин, блокирующий

Са2+-АТФазу,

Рис.14. Влияние модуляторов [Са2Ч, на время жизни закачивающую Са в ЭР, и

вызывающий длительное «р0,05;**р0,01;***р0,001 , повышение [Са2+]„ - ускоряли

фототорможение импульсации и инактивацию нейрона. Напротив, ионы Сс12+, блокирующие разные типы Са2+-каналов (но не верапамил, блокатор Са2+-каналов Ь-типа); дантролен, блокатор рианодиновых рецепторов, ингибирующий высвобождение из ЭР;

продолжительное действие кофеина или теофиллина (60-90 мин), опустошающее кальциевые депо, действовали противоположно и увеличивали время жизни фотосенсибилизированных нейронов (Рис. 14).

Ионы Са2+ контролируют различные сигнальные пути, управляющие жизнедеятельностью клетки и ее реакциями на внешние воздействия вплоть до процессов клеточной смерти. Поэтому мы изучили роль некоторых сигнальных путей в ФД-индуцированной смерти нейрона.

Протеинкиназа С (РКС) активируется ионами Са2+ и диацилглицеролом. С другой стороны, фосфорилируя -каналы плазматической мембраны, она регулирует кальциевый гомеостаз. Стимуляция РКС форболовым эфиром ТРА ускоряла ФД-индуцированное торможение импульсации и сокращала среднее время жизни нейрона, хотя по отдельности они не вызывали таких нарушений. Ингибиторы протеинкиназы С стауроспорин, гиперицин или челеритрин повышали время жизни нейронов и защищали их от ФД инактивации (Рис. 15). Наиболее эффективным был гиперицин. Известно, что ингибиторы РКС

индуцируют апоптоз, а свет усиливает их апоптогенную активность, но мы не наблюдали характерной для апоптоза фрагментации ядер нейронов, хотя на тех же препаратах встречались фрагментированные ядра глиальных клеток

Фосфатидтинозитол 3-киназа 3-киназа) регулирует клеточные ответы на стрессовые воздействия, выживаемость клетки и устойчивость к апоптозу. Ее ингибиторы вортманнин и LY294002 защищали нейрон от ФД-повреждения и увеличивали его время жизни (Рис. 16) Значит, PI 3-киназа участвует в ФД-инактивации нейрона.

Аденилатциклаза (АЦ) участвует в межклеточной сигнализации. В ответ на внеклеточные сигналы (гормоны,

нейромедиаторы и др.), приходящие на рецепторы, связанные с G-белками, она вырабатывает цАМФ, запускающий внутриклеточные сигнальные каскады. Ингибирование АЦ с помощью MDL-1330А ускоряло фототорможение и сокращало время жизни нейрона, а ее активация форсколином, наоборот, увеличивала время жизни. Следовательно, повышение производства цАМФ

аденилатциклазой участвует в защите нейрона от ФД инактивации. При ФД воздействии ингибирование АЦ с помощью MDL-12330A снижало процент

некротических нейронов. Однако, активация этого фермента форсколином не вызывала достоверных изменений (Табл 3) Как и в предыдущих исследованиях, мы не наблюдали характерной для апоптоза

Рис 15 Влияние модуляторов протеинкиназы С на время жизни нейрона при ФД воздействии 10'7 М Фотосенса Столбики, соответствующие опытным

вариантам, заштрихованы в отличие от контрольных, *р<0 05, **р<0 01, *»*р<0 001

Рис 16 Влияние ингибиторов РГЗ-киназы вортманнина или 1У-294002 на время жизни нейрона при ФД действии 10 7М Фотосенса С - контроль, Е - опыт **р<0 01,***р<0 001

фрагментации ядер нейронов ни при действии модуляторов АЦ, ни при фотосенсибилизации, ни при их совместном действии.

Таблица 3 Влияние модуляторов аденилатциклазы, тирозинкиназ и тирозинфосфатаз на время жизни нейрона и процент некротических нейронов, флуорохромированных пропидиум-иодвдэм через 6 часов после ФД действия 10"' М Фотосенса Число опытов приведено в скобках. Достоверные отличия: *)-р<0.05.

Модулятор Концентрация. мкМ Время жизни нейронов, мин Процент некротических нейронов

ФД воздействие ФД воздействие + модуляторы ФД воздействие ФД воздействие + модуляторы

МОЫ2330А 0.05 43±14 (12) 15±8(19)* 27.2±1 8 (12) 20.5±1.2 (14)**

Форсколин 10 43±14 (12) 37±11 (19) 27.2±1.8 (12) 37.3±3.7 (20)*

Генистеин 50 47±12 (18) 17±8 (26)* 34 7±3 5 (19) 27.8±3.9 (19)*

Ортованадат 500 60±8 (46) 46±10 (27) 26.7±3.0 (59) 39.6±4.2 (22)*

Каликулин А 0.02 60±8 (46) 56±12 (19) 26.7±3.0 (59) 39.3±4.0 (12)*

Тирозинкиназы воспринимают межклеточные сигналы, управляющие выживаемостью клеток. Их ингибитор генистеин ускорял фототорможение импульсации и уменьшал время жизни нейронов. Вместе с тем, ингибирование тирозинкиназ генистеином защищало нейрон от некроза (Табл.3).

Протеинфосфатазы дефосфорилируют белки, фосфорилированные протеинкиназами, прекращая их активацию и обрывая действие сигнального каскада. Каликулин А, ингибитор серин/треонин протеинфосфатаз замедлял фотоинактивацию нейрона, но не влиял на процент некротических нейронов с поврежденной ПМ (Табл. 3). Ортованадат натрия, ингибитор тирозинфосфатаз, продлевающий фосфорилированное состояние тирозинов в клеточных белках, действовал противоположно генистеину, увеличивая продолжительность жизни нейронов на 48 %. При этом наблюдалась тенденция к снижению процента некротических нейронов (Табл.3).

Механизм фотоповреждения нейронов при интенсивном ФДвоздействии.

При ФД действии 10"5 М Фотосенса преобладали возбудительные ответы нейронов с активацией и резким блокированием импульсации. Механизм ФД стимуляции импульсации нейронов в результате повреждения нейрональных мембран неплохо изучен в литературе. При высоких концентрациях ФС в клетках интенсивно генерируются 'Ог и другие АФК. Развивающееся перекисное окисление мембранных липидов и фотоповреждение белков

приводят к неспецифической утечке ионов, повреждению ионных каналов и насосов, . деполяризации, активации импульсации и, в итоге, к деполяризационному блоку (Людковская, Бурмистров, 1971; Pooler, 1972; Girotti, 1990; Valenzeno, Tarr, 1991; Specht, Rodgers, 1991; Kressetal., 1997).

В наших опытах при ФД действии 10"5 М Фотосенса ПМ повреждалась уже в процессе облучения нейрона и становилась проницаемой для довольно крупных молекул ПИ. В это же время ингибировались дегидрогеназы, что свидетельствовало нарушении синтеза АТФ. Это могло дополнительно снижать мембранный потенциал. Такой комплекс изменений свидетельствует о некрозе, развивающемся во время облучения в фотосенсибилизированном нейроне.

Динамика инактивации и гибели нейрона при низкоинтенсивном ФД воздействии Фотосенса (10"7 М) может быть представлена в виде следующей последовательности событий (рис.17). ФД воздействие вызывало генерацию !Ог и других АФК и запускало окислительные повреждения мембранных липидов и белков. Основными мишенями ФД воздействия были мембраны митохондрий, ЭР и, возможно, АГ. Фотоповреждение ПМ играло меньшую роль. Вследствие повреждения этих органелл запасенный Са2+ мог высвобождаться в цитозоль. Повышению также могло способствовать

его проникновение через создаваемые облучением дефекты в ПМ и фотоповреждение ПМ и ЭР. Основную роль в

индуцированном торможении и прекращении импульсации могло играть открытие Са2+-зависимых К+-каналов с последующей гиперполяризацией клетки выходящим К+-током (Meech, 1978) и повышение порога генерации ПД вследствие влияния Са2+ на воротный механизм №+-каналов (Hille, 1984).

Другим важным следствием фотоповреждения митохондрий может быть нарушение биоэнергетических процессов. В наших опытах фармакологические воздействия, ведущие к истощению АТФ, способствовали фототорможению и инактивации нейрона, а биоэнергетические субстраты защищали нейрон. Следовательно, АТФ необходим для поддержания импульсной активности в фотосенсибилизированном нейроне. О нарушении биоэнергетических процессов при ФД воздействии свидетельствуют изменения ультраструктуры митохондрий и исчезновение гранул гликогена.

По какому механизму гибли фотосенсибилизированные нейроны при низкоинтенсивной фотосенсибилизации? Апоптоз отличают первоначальные изменения клеточного ядра при сохранной структуре цитоплазмы. Мы не наблюдали характерной для апоптоза фрагментации ядер нейронов и более выраженными были изменения цитоплазматических органелл, происходившие уже в ходе ФД воздействия. Это свидетельствует о запуске некротических процессов. Через 2-4 часа после ФД воздействия становились явными такие признаки некроза, как истощение запасов гликогена, инактивация дегидрогеназ и нарушение проницаемости ПМ Поэтому, процесс гибели нейрона при ФД действии 107 М Фотосенса можно определить как замедленный некроз.

Реакции нейронов на ФД воздействие могут модулироваться различными процессами внутриклеточной и межклеточной сигнализации (Рис.17) с участием РКС, Р1 3-киназы, аденилатциклазы, тирозинкиназ и протеинфосфатаз Некоторые компоненты этих сигнальных путей участвуют в защите клетки от ФД повреждения, другие - усиливают процессы, ведущие к клеточной смерти. Так, активация РКС, как и повышение [Са2+]„ усиливала торможение импульсации и ускоряла гибель нейрона. Возможно, это было связано с фосфорилированием и активацией Са2+ -каналов протеинкиназой С. Ингибирование Р1 3-киназы или РКС, наоборот, защищало нейрон от фотоповреждения. Активация АЦ защищала нейроны от ФД повреждения, а ее ингибирование, наоборот, усиливало фотоинактивацию. В реакциях нейронов также участвовали процессы фосфорилирования и дефосфорилирования тирозинов в белках. Это говорит о сложной взаимосвязи сигнальных систем, участвующих в реакции клетки на стрессовые воздействия, связующим звеном которых могут быть ионы Са2+(Рис.17).

Биоэнергетические процессы, мембранные потенциалы и Са2+-сигнализация не являются специфической особенностью нервных клеток, это общие для всех тканей организма процессы и ФД воздействие может влиять на них не только в нейронах, но и в других типах клеток. Поэтому полученные данные могут иметь общебиологическое значение. Используя результаты наших исследований, мы можем рекомендовать применение некоторых фармакологических агентов для повышения эффективности ФД терапии.

Комбинируя ФД и фармакологическое воздействия можно как усилить гибель патологических клеток, так и защитить окружающие опухоль здоровые клетки.

Рис.17 Схема процессов, развивающихся в механорецепторном нейроне рака при ФД воздействии 10"7 М Фотосенса. Пунктирные линии — предполагаемые процессы. Штрих-пунктирные линии - сигнальные взаимодействия. Стрелка -активирующие процессы, поперечная черта - ингибирующие процессы. Т - ось времени.

6. Фотодинамическое воздействие на глиальные клетки

Участие ферментов межклеточной сигнализации: рецепторных тирозинкиназ и аденилатциклазы, модулируемой рецепторами, связанными с О-белками, в реакциях нейронов на ФД воздействие дает основание предполагать существенную роль сателлитных глиальных клеток, т.к. только от них нейроны могут получать молекулярные сигналы, направленные на поддержание выживаемости или изменение функционального состояния. Однако, ФД воздействие на ГК почти не изучено. Во многом это обусловлено специфической морфологией ГК, образующих многослойную оболочку вокруг нейронов, не позволяющей рассмотреть их цитоплазму в оптические микроскопы. Путем двойного флуорохромирования пропидиум-иодидом и Хехст-33342 мы визуализировали клеточные ядра живых, некротических и апоптозных ГК в рецепторе растяжения и изучили изменения их числа и морфологии под влиянием ФД воздействия.

Ядра нормальных ГК свежеотпрепарированного рецептора растяжения флуорохромировались НоесЬ:&-33342, но не ПИ, и флуоресцировали голубым цветом. В некротических клетках с поврежденной ПМ (в контроле их было около 10 %) ПИ проникал в ядра и придавал им красную флуоресценцию. Через 0,5 часа после ФД воздействия количество некротических ГК увеличивалось до 30 %, а через 8 часов - до 51 %. Число апоптозных клеток было незначительно на протяжении первых 4 часов после фотосенсибилизации, но резко увеличивалось до 42 % в последующие 4 часа. Через 8 часов после ФД воздействия также увеличивалась плотность ГК вокруг тел нейронов, что напоминало реактивный глиоз.

На ультраструктурном уровне в контрольных препаратах цитоплазма ГК содержала немногочисленные митохондрии, пузырьки, цистерны ЭР, рибосомы, микротрубочки. В овальных глиальных ядрах скопления сконденсированного хроматина, имевшего зернистую структуру, располагались вдоль ядерной оболочки. Уже 5-минутное ФД воздействие М Фотосенса, когда нейронная активность только начинала изменяться, вызывало изменения ультраструктуры ГК. Глиальные слои, непосредственно прилегающие к нейрону,' несколько набухали и их цитоплазма содержала электронно-прозрачные области, в которых практически отсутствовали органеллы. Цитоплазма слоев, не

контактирующих с нейроном, сохраняла структуру, но отдельные митохондрии были частично вакуолизированы. Сразу после фотоинактивации нейрона и прекращения облучения наблюдалось сжатие глиальных ядер с сильной конденсацией хроматина. Отмечались очаговые расширения ядерной оболочки. Через 1 час после прекращения облучения некоторые глиальные слои были сильно уплотнены, другие - расширены. В глиальных отростках наблюдались набухшие цистерны ЭР и митохондрии с дезорганизованными кристами. Многие глиальные ядра содержали сильно сконденсированный хроматин, представляющий собой одну большую глыбку. Флуорохромирование клеток с помощью Hoechst 33342 выявило кариопикноз большинства ГК. Этот процесс мог бы вести к апоптозу, и мы действительно наблюдали фрагментированные апоптозные ядра некоторых ГК. Но, как показало флуорохромирование ПИ, в большинстве клеток с пикнотическими ядрами все же развивался некроз, возможно, в результате повреждения ПМ и цитоплазматических органелл.

Таким образом, изменения в ГК развивались уже на ранних стадиях реакции нейрона, когда отмечались только небольшие изменения импульсной активности нейрона. Это согласуется с нашими данными о преимущественной локализации Фотосенса в глиальных оболочках вокруг нейрона.

Для выяснения роли нейроглиальных сигнальных взаимодействий в фотосенсибилизированном рецепторе растяжения рака мы модифицировали компоненты двух важнейших путей межклеточной сигнализации аденилатциклазного и тирозинкиназного. В контрольных препаратах содержалось 12 % некротических ГК, а апоптозные клетки отсутствовали. ФД воздействие М Фотосенса увеличивало число некротических и апоптозных ГК до 47 и 20 %, соответственно. Ингибирование АС с помощью MDL-12330A снижало до 36 % долю некротических ГК, появившихся после ФД воздействия,. Активация АС форсколином не влияла на процессы некроза, но устраняла апоптогенное действие фотосенсибилизации. Таким образом, ингибирование АС защищало глиальные клетки от некроза, а активация - от апоптоза. MDL-12330А проявлял тенденцию к снижению, а форсколин - к увеличению числа ГК вокруг тела нейрона, что свидетельствует об участии АЦ в фотоиндуцированном глиозе.

В отличие от нейронов, генистеин, ингибитор тирозинкиназ, не влиял на эти процессы в фотосенсибилизированных ГК. Ортованадат, ингибитор тирозинфосфатаз, снижал процент некротических ГК с поврежденной ПМ, но не влиял на апоптоз ГК. Оба ингибитора также не влияли на плотность ГК вокруг нейрона. То есть, нами не выявлено участие фосфотирозинов в апоптозе ГК. Возможно, при ФД действии Фотосенса на изолированный рецептор растяжения рака молекулярные сигналы такие как факторы роста, которые могли бы модулировать выживаемость глии, не передавались на ГК от сенсорных нейронов или других ГК. Вместе с тем, приведенные выше данные о влиянии генистеина и ортованадата на МРН говорят, что они могли передаваться от глии к нейрону. Другие сигналы, например, нейромедиаторы, распознаваемые рецепторами, связанными с в-белками, могли передаваться и восприниматься как нейронами, так и ГК.

Выводы

1. Микрооблучение изолированного механорецепторного нейрона речного рака сфокусированным лазерным излучением вызывает фазные изменения импульсной активности: учащение, торможение, повторное учащение и необратимый блок импульсной активности. Повышение интенсивности воздействия сокращает продолжительность отдельных фаз и ускоряет изменения частоты импульсации в этих фазах.

2. В видимом диапазоне наиболее эффективным является синий свет с максимумом около 460 нм, облучение в оранжево-красной части спектра не влияет на нейронную активность. При действии синего света в нейроне накапливаются подпороговые изменения, приводящие к изменению импульсной активности после длительного латентного периода (десятки минут) или при последующем более продолжительном облучении.

3. Эндогенными фоторецепторами синего лазерного излучения в непигментированных нейронах являются флавиновые соединения. Первичные мишени синего света в нейронах - плазматическая мембрана, повреждение которой ответственно за активацию импульсной активности, и митохондрии, в которых синее лазерное микрооблучение ингибирует сукцинатдегидрогеназу, вызывает набухание, просветление матрикса и дезорганизацию крист.

Фотоповреждение митохондрий ведет к выходу ионов кальция и торможению импульсной активности нейрона. Важным звеном фотоинактивации нейронов является фотоиндуцированное ингибирование и особенно

АТФазы.

4. Механорецепторный нейрон рака оказался весьма чувствительным к ФД воздействию различных фотосенсибилизаторов: производных гематопорфирина и дейтеропорфирина IX, хлоринов ец и шТИРС, А1 и /и фталоцианинов и гиперицина. Наномолярные, а в ряде случаев пикомолярные концентрации ФС необратимо инактивировали нейрон.

5. ФД воздействие при высоких концентрациях ФС вызывало учащение и резкое блокирование нейронной активности. Некроз наступал в ходе облучения. Слабое, но продолжительное ФД воздействие сравнительно небольших концентраций ФС вызывало постепенное торможение и необратимое прекращение импульсации. В этом случае явные признаки некроза (нарушение целостности плазматической мембраны и падение активности клеточных дегидрогеназ) наблюдались только через 2-4 часа после воздействия. ФД воздействие не вызывало фрагментации ядер нейронов, характерной для апоптоза.

6. Полученные концентрационные зависимости времени жизни нейронов позволяют сравнивать ФД эффективность разных сенсибилизаторов и выявлять наиболее эффективные из них. Более эффективны ФС, действие которых слабо зависит от концентрации.

7. ФД эффективность зависит от строения и физико-химических свойств ФС, особенно, от молярной экстинкции и амфифильности, оцениваемой по коэффициенту распределения К. Оптимальные значения Кр порядка 10-30. Амфифильные ФС с асимметричным распределением полярных и неполярных групп более эффективны.

8. Основными мишенями ФД воздействия Фотосенса являются плазматическая мембрана, повреждение которой вызывает учащение импульсации и внутриклеточные органеллы - митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Фотоповреждение этих органелл ведет к выходу ионов кальция в цитозоль и торможению нейронной активности.

9. В фотоинактивации и некрозе нейронов важную роль играют процессы внутри- и межклеточной сигнализации с участием протеинкиназы С, фосфатидилинозитол 3-киназы, аденилатциклазы, тирозинкиназ и протеинфосфатаз.

10. Фотосенсибилизированные глиальные клетки погибают как в результате некроза, так и апоптоза. ФД воздействие также увеличивает плотность глиальных клеток вокруг тела нейрона. В реакцию глиальных клеток вовлечен аденилатциклазный, но не тирозинкиназный сигнальный путь.

11. Применение ингибиторов или активаторов биоэнергетических или сигнальных ферментов и модуляторов уровня кальция в клетке позволяет ослабить или усилить фотодинамическое повреждение нервных и глиальных клеток. Это дает основание для разработки методов усиления фотоповреждения патологически измененных клеток и защиты окружающих нормальных клеток.

По результатам работы имеется более 120 публикаций, включая 47 статей и

более 70 тезисов докладов, основные из которых следующие:

1. Федоренко Г.М., Узденский А.Б. Исследование ультраструктурных и цитохимических изменений в нервной клетке при лазерном микрооблучении // Применение лазерных методов и средств в биологии и медицине. - Киев: Наукова Думка, 1981.-С. 124-126.

2. Узденский А.Б. О селективности и локальности лазерного микрооблучения клеток // Цитология.-1982. -Т.24.- С.1119-1132.

3. Федоренко Г.М., Узденский А.Б. Ультраструктурные изменения изолированного механорецепторного нейрона рака, вызванные микрооблучением гелий-кадмиевым лазером // Цитология.- 1986 - Т.28.- С.512-516.

4. Узденский А Б Инактивация сукцинатдегидрогеназы в изолированном механорецепторном нейроне рака сфокусированным синим лазерным излучением // Цитология. - 1987.- Т.29.- С.1392-1397.

5. Uzdensky A.B. Laser raicroinadiation of single nerve cell // Proc. SPIE.- I993.-Vol. 1882.-P.254-267.

6. Uzdensky A B. Laser microirradiation in investigation of integrative function of nerve cell. //Proc. SPIE.- 1994 - Vol 2083.- P.225-234.

7. Uzdensky A.B. Participation of some radical products in isolated nerve cell response to blue laser microirradiation //Proc. SPIE.- 1995.- Vol. 2323.- P.491 -499.

8. Uzdensky A.B Photodynamic nerve cell killing: dynamics of electrophysiological responses and photosensitizers comparison // Proc. SPIE.- 1997 - Vol.3191.-P.l30-139

9. Uzdensky A.B., Savransky V.V. Single neuron response to pulse-periodic laser microirradiation. Action spectra, and two-photon effect // J. Photochem. Photobiol. В Biol -1997.- Vol. 39.- P.224-228.

10. Uzdensky AB. Photodynamic nerve cell killing' electrophysiological criteria and photosensitizers comparison // Acta Bio-Opt. Inform. Med,- 1997,- Vol.3 -P. 21 -22 '

11 Uzdensky A B Isolated neuron response to blue laser mcroinadmtion phenomenology and possible mechanism // Internet I of Science Biol Chem -1997 -ЛЫ 3 -C46 -http //Www netsci-journal TOm/97v3/uzcfensky2/uzdens02 htm

12 Водолазкин Д И , Юзюк Ю И, Узденский А Б Ингибирование (Na+-K+)- и Са2+- АТФаз синим лазерным светом // Физико-химические основы функций белков и их комплексов -Воронеж Изд ВГУ, 1998 - С 57-60

13 Uzdensky А В Isolated nerve cell response to laser irradiation and photodynamic effect // From cell to brain Intra- and Inter-Cellular Communication - The Central Nervous System -Elsevier Science В V Amsterdam et al, 1998 - P 227-241

14 Узденский А Б, Миронов А Ф, Лосев А П Фотодинамическое действие хлоринов е6 и р6 на изолированную нервную клетку, индуцированное лазерным излучением // Ж Прикл Спектр -1999 -Т 66-С 250-255

15 Uzdensky А В , Mironov A F Photodynamic inactivation of the single crayfish nerve cell dynamics of electrophysiological responses and comparison of photosensitizers //Lasers Med Sci-1999-Vol 14-P 185-195

16 Uzdensky AB, Zhavoronkova A A, The main types of isolated neuron responses to

photodynamic effect of different photosensitizers // Photochem Photobiol-1999-Vol 69 -P81S 2+

17 Uzdensky А В , Dergacheva О Yu, Zhavoronkova A A The role of free radicals and Ca2+ in photodynamically-induced death ofisolated nerve cell //Photochem Photobiol -1999 - Vol 69 -P 81S-82S

18 Uzdensky А В , Zhavoronkova A A , Dergacheva О Y Firing inhibition processes in the response dynamics of isolated crayfish nerve cell to the photodynamic effect of sulphonated aluminum phthalocyanine participation of free radicals and Ca // Lasers Med Sci -2000 Vol 15-P 123-130

19 Узденский АБ, Жаворонкова А А, Миронов АФ, Кузьмин С Г Исследование фотодинамического действия новых фотосенсибилизаторов на изолированную нервную клетку//Изв РАН,сер биол -2000-№2-С230-238

20 Uzdensky А В , Ivanov А V, Reshetnikov А V, Ponomarev G V, Dergacheva О Yu, Zhavoronkova A A Photodynamic effect of deuteroporphynn IX derivatives on isolated nerve cell // Proc SPIE - 2000 - Vol 4059 -P 147-156

21 Uzdensky AB, Zhavoronkova A A, Dergacheva OYu, Derkacheva VM Photodynamic effect of different aluminum and zinc phthalocyamnes on isolated nerve cell // Proc SPIE -2000-Vol 4059-P 157-162

22 А В Uzdensky, V M Derkacheva , О Yu Dergacheva A A Zhavoronkova A single neuron response to photodynamic effects of vanous aluminum and zinc phthalocyamnes // Life Sci -2000 - Vol 68 - P 547-555

23 Uzdensky A, Zhavoronkova A, Kolosov M, Bragin D Photodynamic effect on isolated crayfish mechanoreceptor neuron and ghal cells // Eur J Biophysics - 2000 -Vol 29 -P 368

24 А В Uzdensky, О Yu Dergacheva, A A Zhavoronkova, A V Ivanov, A V, Reshetnikov, G V Ponomarev Photodynamic effect of deuteroporphynn IX and hematoporphynn derivatives on single neuron//Biochem Biophys Res Commun 2001 - Vol 281-P 1194-1199

25 Uzdensky AB, Ma L -W, lam V , Hjortland G О , Steen H В , Moan J Intracellular localization ofhypencin in human ghoblastoma and carcinoma cell lines // Laser Med Sci - 2001 - V 16 -P 276-283

26 Uzdensky А В , Bragin D F , Kolosov M S Zhavoronkova A A PDT effect of different photosensitizers on a single nerve cell Electrophysiological and Pharmacological Study // IEEE J of Select Topics Quant Electron-2001-Vol 7-P 989-995

27 Брагин Д E, Колосов М С , Узденский А Б О роли внутриклеточных сигнальных и биоэнергетических процессов в фотоиндуцированном торможении и инактивации

изолированного нейрона //Проблемы нейрокибернетики - Ростов-на-Дону Изд ООО ЦВВР.2002-Т2 -С251-255

28 Федоренко Г М , Брагин Д Е , Колосов М С , Вассель С Узденский А Б Динамика у чьтраструктурных изменений в изолированном механорецепторном нейроне при фотоиндуцированном окислительном стрессе // Проблемы нейрокибернетики - Ростов-на-Дону Изд 0 00 ЦВВР, 2002 - Т 2 -С 287-290

29 Biagin D Е, Kolosov M S, Uzdensky А В Role of protein kmase C in the response of an isolated neuron to photodynamic therapy // Proc SPIE - 2002 -Vol 4707 -P 300-308

30 Uzdensky AB, Iani V, Ma L -W , Moan J Photobleaching of hypencin bound to- human serum albumm, cultured adenocarcinoma cells and nude mice skin // Photochem Photobiol -2002 -Vol 76-P 320-328

31 Uzdensky AB, Bragin DE, Kolosov MS, Dergacheva О Yu, Fedorenko GM, Zhavoronkova A A Photodynamic inactivation of isolated crayfish mechanoreceptor neuron different death modes under different photosensitizer concentrations // Photochem Photobiol -2002 -Vol 76 -P 431-437

32 D E Bragin, M S Kolosov, А В Uzdensky Photodynamic inactivation of isolated crayfish neuron requires protein kinase C, PI 3-kmase and Ca2+ // J Photochem Photobiol, В Biol 2003-Vol 70 -P 99-105

33 Kolosov M S, Bragin D E, Kohany A, Uzdensky А В, Neuroghal relationships in the crayfish stretch receptor under photodynamic injury changes m the nuclear morphology// Proc SPIE - 2003 - Vol 5068 - P 450-457

34 Брагин Д E, Колосов М С, Узденский А Б Участие ряда сигнальных процессов в фотодинамической инактивации нейронов //Рецепция и внутриклеточная сигнализация Междунар Конф 16-18 июня 2003 -Пущино, 2003-С 138-141

35 Kolosov М S, Bragin D Е, Kohany A S, Uzdensky А В Photodynamic injury of isolated neuron and satellite glial cells morphological study // IEEE J Select Topics Quant Electron -2003-Vol 9-P 337-342

36 Uzdensky А В, Bragin D E, Kolosov M S, Kubin A, Loew H G, Moan J Photodynamic efect of hypencin and a water-soluble derivative on isolated crayfish neuron and surrounding glial cells //J Photochem Photobiol В Biol -2003 -Vol 72 -P 27-33

37 Kolosov M S , Bragin D E, Uzdensky А В Photodynamic damage of isolated crayfish stretch receptor neuron and satellite glial cells// Glia - 2003, Suppl 2 - P 26

38 Bragin D E, Kolosov M S , Uzdensky А В On the role of protein kinase C, PI 3-kmase and Ca2+ in single neuron response to photodynamic impact III Neurochem - 2003 -Vol 87, Suppl 1 - P 56

39 Bragin D E, Kolosov M S, Uzdensky А В Photodynamic injury of isolated neuron and satellite glial cells cell death and ghosis // J Neurochem - 2003 - Vol 87, Suppl 1 - P 57

40 Bragin D E , Kolosov M S , Uzdensky А В Signaling mechanisms involved in isolated crayfish mechanoreceptor neuron response to photodynamic impact // J Neurochem - 2004 Vol 88 Suppl 1 -p 83

41 Kolosov M S , Bragin D E , Dergacheva О Y , Vanzha О, Opanna I , Uzdensky А В On the role of adenylate cyclase, tyrosine kinase and tyrosme phosphatase in the response of nerve and glial cells to photodynamic impact // Proc SPIE 2004 - Vol 5474 - P 352-360

42 Uzdensky А В, DergachevaO Y , ZhavoronkovaA A, Reshetnikov A V , Ponomarev G V Photodynamic effect of novel chlorin e6 derivatives on a single nerve cell // Life Sci -2004 -Vol 74-P 2185-2197

Излапельство ООО «ЦВВР» Лицензия ЛР № 65-36 от 05 08 99 г Сдано в набор 27 09 04 г Подписано в печать 28 09 04 г Формат 60*84 1/ 16 Заказ № 533 Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Операшвная печать Тираж 100 экз Печ лист 2,0 Устпечл 2 0 Типография Издательско-полиграфический комплекс « Ьиос» РГ У 344091 г Ростов-на-Дону, ул Зорге, 28/2 корп 5 «В», тел 929-516 659-532 Лицензия на полиграфическую деятельность № 65-125 от 09 02 981

87 9 8

РНБ Русский фонд 2005-4

17497

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Узденский, Анатолий Борисович

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи работы.

1.3. Научная новина. Положения, выдвинутые на защиту.

1.4. Практическая значимость.

1.5. Апробация работы.:.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Химические реактивы.

2.2. Объект исследования.

2.3. Регистрация импульсной активности механорецепторного нейрона.

2.4. Лазерное микрооблучение нейрона.

2.5. Фотодинамическое воздействие.

2.6. Фотосенсибилизаторы.

2.7. Исследование физико-химических характеристик фотосенсибилизаторов.

2.8. Фармакологическая модификация реакции нейрона на фото динамическое воздействие.

2.9. Цитохимическое изучение активности сукцинатдегидрогеназы в микрооблученных нейронах.

2.10. Общая дегидрогеназная активность (МТТ-тест).

2.11. Исследование фотоиндуцированных ультраструктурных изменений в механорецепторном нейроне.

2.12. Флуоресцентно-микроскопические исследования.

2.13. Определение АТФазной активности в гомогенатах мозга крыс.

2.14. Статистическая обработка результатов.

3. ДЕЙСТВИЕ ВИДИМОГО СВЕТА НА НЕРВНЫЕ КЛЕТКИ.

3.1. Фотобиологические реакции нервных клеток. Обзор литературы.

3.1.1. Действие видимого света на пигментированные нейроны.

3.1.2. Действие видимого света на непигментированные нейроны.

3.1.2.1. Синяя и зеленая области спектра.

3.1.2.2. Красная область спектра.

3.1.3. Лазерное микрооблучение клеток.

3.2. Реакция механорецепторных нейронов рака на лазерное микрооблучение.

3.2.1. Динамика импульсной реакции нейрона.

3.2.2. Накопление необратимых фотоиндуцированных изменений в нейроне.

3.2.3. Спектры действия импульсной реакции нейрона на лазерное микрооблучение.

3.2.4. Зависимость реакции нейрона от интенсивности лазерного микрооблучения.

3.2.5. Микрооблучение фотосенсибилизированного нейрона.

3.2.6. Модификация импульсных ответов нейрона биоэнергетическими ингибиторами.

3.2.7. Ультраструктурные изменения в нейроне, подвергнутом лазерному микрооблучению.

3.2.8. Ингибирование сукцинатдегидрогеназы в нейроне, подвергнутом лазерному микрооблучению.

3.2.9. Модификация реакции нейрона на лазерное микрооблучение перехватчиками свободных радикалов.

3.2.10. Инактивация АТФаз в нервной ткани лазерным облучением.

3.2.11. Участие ионов Са2+ в реакции нейрона на лазерное микрооблучение.

3.3. Возможный механизм реакции непигментированного нейрона на синее лазерное микрооблучение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием"

7.2. Локализация Фотосенса. Морфология глиальных ядер. Некроз и апоптоз.280

7.3. ФД повреждение глиальных клеток, сенсибилизированных Фотосенсом.280

7.4. Ультраструктурные изменения в глиальных клетках, сенсибилизированных Фотосенсом.283

7.5. Участие процессов сигнальной трансдукции в ФД-индуцированном повреждении глиальных леток.287

7.6. Обсуждение. 288

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.296

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.299

СОКРАЩЕНИЯ

АГ - аппарат Гольджи

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

ВАРТА - 1,2-бис-(о-аминофенокси)-этан-Н,Ы,Ы\Ы>-тетраацетат

МРН - медленно адаптирующийся механорецепторный нейрон рака

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенйл тетразолия бромид

НТС - нитротетразолевый синий

ПВП - поливинилпирролидон

ПИ - пропидиум-иодид

ПД - потенциал действия

ПДП - производные протопорфирина IX

РРР- рецептор растяжения рака

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ТРА - 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат

ФД воздействие - фотодинамическое воздействие

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭР - эндоплазматический ретикулум

PBS - фосфатный буфер

DABCO - 1,4-diazabicyclo-[2,2,2]-octane

DMSO диметилсульфоксид

HSA - сывороточный альбумин человека

HpD - производное гематопорфирина

PI 3-киназа - фосфатидилинозитол 3-киназа

РКС - протеинкиназа С

PLC - фосфолипаза С

1. ВВЕДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Узденский, Анатолий Борисович

6.13. Выводы

1. Высокие концентрации Фотосенса (Ю-5 М и выше) вызывали учащение импульсной активности нейронов, заканчивающееся резким блокированием потенциалов действия. В ходе облучения нарушалась целостность плазматической мембраны, ингибировались клеточные дегидрогеназы, набухали ядра нейронов. Это приводило к некрозу клетки.

2. При меньшей концентрации Фотосенса (10"7 М) импульсация постепенно тормозилась и генерации спайков необратимо прекращалась. При этом целостность плазматической мембраны и активность дегидрогеназ нейрона сохранялась в течение 2-4 часов после прекращения импульсной активности. Ядра нейронов сжимались, но их фрагментации, характерной для апоптоза, не наблюдалось. Нейроны гибли в результате некроза, отсроченного на 2 часа.

3. Фотоиндуцированное торможение импульсной активности нейрона было связано с повышением концентрации кальция в цитозоле и ингибированием синтеза АТФ.

4. Протеинкиназа С, фосфатидилинозитол 3-киназа и протеинфосфатазы способствовали фотоиндуцированному торможению и прекращению импульсации нейрона, а аденилатциклаза и тирозинкиназы - препятствовали этим процессам, возможно, из-за негативного влияния на .уровень Са в фотосенсибилизированном нейроне.

5. Ингибирование аденилатциклазы или тирозинкиназ снижает, а ингибирование протеинфосфатаз усиливает некроз нейрона. Это предполагает, что сАМФ и фосфотирозины способствуют фотоиндуцированному нарушению целостности нейрональной мембраны и некрозу нейрона.

6. Фармакологические модуляторы, увеличивающих внутриклеточную концентрацию кальция, активаторы протеинкиназы С и ингибиторы продукции АТФ могут повышать эффективность ФДТ. Биоэнергетические субстраты; агенты, снижающие внутриклеточную концентрацию кальция, и ингибиторы протеинкиназы С или PI-3 киназы могут защищать нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от ФД воздействия. Полученные данные могут использоваться при разработке методов, повышающих эффективность фотодинамической терапии.

7. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ 7.1. Введение

Глиальные клетки - самые многочисленные в нервной системе. Их число на порядок превышает число нейронов. Многочисленные функции глиальных клеток и проблема нейроглиальных отношений давно находятся в центре внимания нейробиологии (Немечек и др., 1978; Николлс и др., 2003; Raivich et al., 1999; Barres and Barres, 2000; Baumann, Pham-Dinh, 2001). В последнее время интенсивно изучаются вопросы взаимодействия нейронов и глии при действии разных повреждающих факторов: травмы и аксотомии (Корр et al., 1997; Raivich et al., 1999), ишемии (Largo et al., 1996), лишении трофических факторов (Largo et al., 1996) и т.д. Показано, что все типы глиальных клеток - астроциты, микроглиоциты, олигодендроциты и шванновские клетки - участвуют в реакциях нейронов на повреждение. Они участвуют в удалении продуктов распада умирающих клеток, регулируют состав межклеточной среды, секретируют факторы роста, поддерживая выживаемость нейронов, репаративные и регенеративные процессы в них (Немечек и др., 1978, Николлс и др., 2003; Muller and Stoll, 1998; Raivich et al., 1999). При внешних повреждающих воздействиях одновременно с гибелью глиальных клеток происходит и их пролиферация - реактивный глиоз, направленный на замещение утраченных клеток и защиту поврежденных нейронов (Guenard et al., 1996; Bruce et al., 2000; Baumann, Pham-Dinh, 2001).

Найден ряд молекулярных сигналов, которыми обмениваются нервные и глиальные клетки для поддержания жизнедеятельности друг друга. Глиальные клетки секретируют трофические факторы, защищающие нейроны, такие как NGF, GDNF и др. (Корр et al., 1996; Skaper et al., 1998; Raivich et al., 1999; Barres and Barde, 2000). С другой стороны, нейроны секретируют нейрегулины, защищающие глиальные клетки и контролирующие их пролиферацию (Carraway, Burden, 1995; Grinspan et al., 1996; Корр et al., 1996; Rossner et al., 1997; Barres and Barde, 2000; Booth et al., 2000; Carratt et al., 2000). Эти процессы зависят от их электрической активности, например, активация аксонов может • индуцировааать олигодендроглиоз (Barres, Raff, 1998). Повреждение нервов вызывает гибель окружающих шванновских клеток (Grinspan et al., 1996; Корр et al., 1996). С другой стороны, селективная деструкция глиальных клеток фторцитратом приводит к подавлению нейрональных функций и гибели нейронов.(Largo et al., 1996). К такому же результату приводила абляция глиальных клеток с помощью направленного мутагенеза у развивающейся дрозофилы (Booth et al., 2000). Важный раздел этой проблемы -исследование нейроглиальных взаимодействий в процессе гибели клеток, вызванной окислительным стрессом, имеющим большое значение в патогенезе нейродегенаративных заболеваний, ишемического повреждения мозга (Kitamura et al., 1999; Love, 1999) и т.д.

В настоящее время изучаются перспективы применения фотодинамической терапии в нейроонкологии для лечения опухолей мозга, имеющих в большинстве случаев глиальное происхождение. Они обычно сильно инфильтрируют в окружающие нормальные ткани и практически не поддаются излечению. Хирургические методы, как правило, не дают хороших результатов из-за сложности визуализации опухоли и невозможности обширной резекции, широко захватывающей нормальные ткани. Глиомы устойчивы к химио- и радиотерапии. Поэтому ФДТ, позволяющая избирательно и локально воздействовать на опухолевую ткань, имеет несомненные преимущества (Muller, Wilson, 1990; Kostron et al., 1996; Popovic et al., 1996; Dougherty et al., 1998; Hasan et al., 2000; Goodell, Muller, 2001). Случаи полного излечения опухолей мозга с помощью разных методов лечения пока весьма редки. Поэтому увеличение продолжительности жизни до 30-61 недель после фотодинамической терапии по сравнению с 20 неделями после хирургии рассматривается как серьезный успех (Muller, Wilson, 1996). Особенно эффективно применение ФДТ в комбинации с другими способами воздействия на опухоль. Так, ФДТ после хирургической операции позволяет разрушить раковые клетки, оставшиеся в операционном ложе. Наилучший эффект был достигнут в комбинации «хирургия-ФДТ-радиотерапия»: более 2 лет у 50 % пациентов, больных глиобластомой, и более 8 лет в случае астроцитомы (Popovic et al., 1996). Кроме того, селективное накопление некоторых фотосенсибилизаторов раковыми клетками позволяет осуществить флуоресцентную визуализацию опухоли

Вследствие важности изучения механизмов ФД повреждения глиальных клеток для решения проблем нейроонкологии, ряд работ был посвящен изучению ФД воздействия на культивируемые опухолевые глиальные клетки (Gandola, Joshi, 1990; Joshi et al., 1994; Fanuel-Barret et al., 1997; РоПАЦк, Kawecki, 1997; Terzis et al., 1997; Deininger et al.; 2002; Jiang et al., 2002; Gupta et al., 2003; Wu et al., 2003) или сфероиды из клеток глиомы (Terzis et al., 1997; Hirschberg et al., 2002; Madsen et al., 2003). Однако, в ходе ФДТ могут повреждаться не только опухолевые, но и нормальные глиальные клетки, а также нейроны, располагающиеся в очаге повреждения. Идеальный вариант - селективное разрушение только перерожденных клеток с одновременной защитой нормальных. Для того, чтобы приблизиться к решению этой задачи, необходимо всестороннее изучение реакций нормальных клеток глии и нейронов на ФД воздействие, а также нейроглиальных взаимодействий, осуществляющихся с помощью межклеточных молекулярных сигналов. Фотодинамическое повреждение глиальных клеток в естественном окружении, где они взаимодействуют с нейронами и соседними глиальными клетками, пока не исследовано. Необходимо изучить как участие нейронов в повреждении и спасении клеток глии, так и роль глиальных клеток в повреждении и защите нейронов, подвергнутых действию фотоиндуцированного окислительного стресса.

Изучение глиальных клеток затруднено их особой морфологией: они формируют многослойную оболочку вокруг нейрона. Поэтому применение таких мощных методов, как цитохимия и флуоресцентная микроскопия, весьма ограничено. Электронная микроскопия позволяет детально изучить тонкую структуру клеток, но не живых, а фиксированных в определенный момент времени, что сильно ограничивает изучение клеточной динамики. Изучение клеток центральной нервной системы обычно дает усредненную картину, в которой трудно установить связь между биохимическими процессами и функциональным состоянием нейронов, поскольку нет методов регистрации функциональной активности и биохимических процессов в каждом нейроне и глиальной клетке. Это предствляет серьезные методические проблемы, не позволившие пока существенно продвинуться в исследованиях нейроглиальных взаимодействий.

Рецептор растяжения рака - простой и удобный препарат для изучения нейроглиальных взаимодействий. Он состоит всего из двух рецепторных нейронов, окруженных многослойной оболочкой из сателлитных глиальных клеток, подобных олигодендроцитам и шваннговским клеткам в центральной и периферической нервной системе позвоночных животных. Они окутывают тела и аксоны рецепторных нейронов, но не формируют плотных миелиновых оболочек (Машанский и др., 1974; Федоренко и др., 2002; Kolosov et al., 2003а,b). Путем двойного флуорохромирования пропидиум-иодидом и Хехст-33342 мы визуализировали клеточные ядра живых, некротических и апоптозных глиальных клеток и изучили изменения их числа и морфологии под влиянием ФД воздействия. Нами изучено ФД действие: Фотосенса на глиальные клетки в рецепторе растяжения рака (Kolosov et al., 2003а,b), а также с помощью ингибиторного анализа исследовано участие некоторых путей межклеточной и внутриклеточной сигнализации (аденилатциклаза, тирозинкиназы, протеин фосфатазы) в фотоповреждении клеток глии (Uzdensky et al., 2004).

7.2. Локализация Фотосенса. Морфология глиальных ядер. Некроз и апоптоз

Как описано выше, Фотосенс (10"5 М) локализовался преимущественно в глиальных оболочках рецептора растяжения рака (рис. 6.1) (Kolosov et al., 2003). Детали внутриклеточного распределения Фотосенса в цитоплазме глиальных клеток нельзя было рассмотреть из-за рулетоподобного строения этих клеток.

Двойное флуорохромирование рецептора растяжения рака пропидиум-иодидом и Hoechst-33342 показало, что ядра нормальных глиальных клеток свежеотпрепарированного рецептора (Рис. 7.1; см. также рис. 5.26; 6.4 и 6.14) были округлыми (вокруг тел нейронов) или вытянутыми (вокруг аксонов). Они флуорохромировались Hoechst-33342, но не ПИ, и флуоресцировали голубым цветом. Внутри они содержали 2-3 десятка более ярких гранул, соответствующих, очевидно, сконденсированному хроматину. В некротических клетках благодаря повреждению плазматической мембраны ПИ проникал в ядра и придавал им красную флуоресенцию (Рис.7.1 и 6.4 и 6.14). В апоптозных клетках ядра частично фрагментировались и приобретали характерный розетко-подобный вид (Рис. 7.1; 6.4 и 6.14). Иногда происходила полная фрагментация глиальных ядер (Рис. 7.1).

7.3. ФД повреждение глиальных клеток, сенсибилизированных Фотосенсом

Глиальные клетки оказались весьма чувствительными к ФД воздействию (Kolosov et al., 2003 a,b). В контрольных препаратах обычно встречалось порядка 10 % некротических глиальных клеток, у которых ядра флуорохромировались ПИ (Рис. 6.4, 7.1; Табл.7.1). Вероятно, они повреждались в ходе препаровки и выделения рецептора растяжения. В результате фотосенсибилизации количество некротических клеток возрастало до 30 % через 0,5 часа и до 51 % через 8 часов после воздействия (Табл.7.1). Апоптозные глиальные клетки с фрагментированными ядрами практически не были видны в контрольных препаратах (Рис. 7.1 А,С; Табл.6.1). После фотосенсибилизации некоторые глиальные ядра становились фрагментированными (Рис.7.1D), т.е. подвергались апоптозу. Число апоптозных клеток было незначительно на протяжении первых 4 часов после ФД воздействия, но резко увеличивалось до 42 % в последующие 4 часа (Табл.7.1). К этому времени (через 8 часов после ФД воздействия) также наблюдалось увеличение плотности глиальных клеток вокруг тел нейронов в рецепторах растяжения (Рис. 7.1В; Табл.7.1). Это

Рис.7.1. Ядра глиальных клеток в рецепторе растяжения речного рака. (А) и (С) -контрольные препараты; (В и D) - препараты, сенсибилизированные Фотосенсом (К)*7 М) и сфотографированные через 8 часов после ФДТ Двойное флуорохромировапие с помощью Hoechst 33342 и пропидиум-иодидом позволяет выявить ядра живых глиальных клеток голубого цвета со структурированной кариоплазмой, пикнотические сморщенные ядра со сконденсированным хроматином, ядра некротических клеток с поврежденной штазмалеммой и фрагментированные апоптозные ядра. (А и С) область тепа нейрона; (В и D) - участок аксона. Объектив 40х; масштабные отрезок - 40 мкм.

XJ2

Табл. 7.1. ФД действие 10"7 М Фотосенса на морфологию глиальных клеток в рецепторе растяжения рака

Характеристики глиальных клеток Условия эксперимента Время после ФД воздействия, час

0.5 4 8

Некроз, % Контроль 10±3 (И) 9±3 (7) 12±6 (6)

Опыт 30±7(11)' 38±7 (7)" 51±8(6)"

Количество апоптозных клеток® Контроль 0(6) 0,1±0,1 (7) 0,7±0,3 (6)

Опыт 0,5±0,5 (6) 1,1±0,7 (7) 42±11 (6)*'""#

Плотность глиальных клеток6 Контроль: вокруг тела нейрона 29±1 (6) 29±1 (6) 29±1 (6)

Опыт: вокруг тела нейрона 34±2 (12) 30±2 (12) 44±2 (7)"'$

Контроль: вокруг аксона 24±1 (6) 24±1 (6) 24±1 (6)

Опыт: вокруг аксона 24±2 (6) 27±2 (12) 27±3 (7)

Число опытов приведено в скобках. а) Число клеток на 2 мм длины аксона; б) Число клеток на 10000 мкм2. Достоверные отличия от контроля: *- р<0,05; ** - р<0,01; от препаратов, изученных через 0,5 и 4 часа после фотосенсибилизации: т - р<0,001; от плотности $ глиальных клеток вокруг аксона в те же моменты времени после ФД воздействия: р<0,05.

Z82> явление напоминает реактивный глиоз, или, применительно к шванновским клеткам, -шванноз (McMillan et al., 1994; Bruce et al., 2000).

7.4. Ультраструктурные изменения в глиальных клетках, сенсибилизированных Фотосенсом

Глиальные оболочки клетки вокруг МРН в рецепторе растяжения рака образуют до 20-30 слоев толщиной по 0.2-1 мкм (Рис.7.2) (Машанский и др., 1974; Федоренко и др., 2002). В контрольных препаратах цитоплазма глиальных клеток содержала немногочисленные небольшие митохондрии, пузырьки, цистерны эндоплазматического ретикулума, рибосомы, микротрубочки (Рис.7.2А). В крупных глиальных ядрах овальной формы скопления сконденсированного хроматина, имевшего зернистую структуру, располагались вдоль ядерной оболочки.

В препаратах, сенсибилизированных 10"7 М Фотосенса, уже после 5-минутного облучения, когда импульсная активность нейронов только начинала изменяться, отмечались изменения ультраструктуры глиальных клеток. Глиальные слои, непосредственно прилегающие к нейрону, несколько набухали. Цитоплазма некоторых из них содержала значительные электронно-прозрачные области, в которых практически отсутствовали органеллы (Рис.7.2Б). Цитоплазма глиальных слоев, не контактирующих с нейроном, сохраняла структуру (Рис.7.2В, см. также рис.6.7В), но отдельные митохондрии были частично вакуолизированы в результате повреждения их мембран. Сконденсированный хроматин имел гранулярную структуру (Рис.7.2 В).

Сразу после инактивации нейрона и прекращения облучения (0 час) происходило сжатие глиальных ядер. Значительную часть их площади занимал сильно сконденсированный хроматин, тонкая структура которого не просматривалась. Глиальные слои были уплотнены, но некоторые - расширены (Рис.7Г). В отдельных разрушенных глиальных клетках отмечены звездчатые кристаллоподобные структуры, возможно, образованные агрегированными фталоцианинами (Рис.7.2Г). Через 1 час после прекращения облучения наблюдались пикнотические глиальные ядра со сконденсированным хроматином, представляющим собой одну большую глыбку овальной формы с нарушенной ядерной оболочкой. Вероятно, это были апоптозные клетки. Некоторые глиальные слои были сильно уплотнены, другие, напротив, расширены. В глиальных отростках также наблюдались набухшие цистерны ЭР и митохондрии с дезорганизованными кристами (Рис 7.2Д). д

Рис.7.2. Ультраструктурные изменения глиальных клеток н рецепторе растяжения рака пол влиянием ФД действия 10"' М Фотосенса. А. Кон трольный препарат. R.R. 5-минутное ФД воздействие. Г. Сразу после прекращения импульсной активности. Д. Через I час после ФД воздействия. Увеличение 35000х,

Таким образом, изменения в глиальных клетках начинали развиваться уже на ранних стадиях реакции нейрона, через 5 мин после начала облучения, когда отмечались только небольшие изменения импульсной активности нейрона. Это соответствует нашим данным о преимущественной локализации Фотосенса в глиальных оболочках вокруг нейрона (Kolosov et al., 2003).

7.5. Участие процессов сигнальной трансдукции в ФД-индуцированном повреждении глиальных клеток

Межклеточные взаимодействия обеспечивают целостность тканей и органов и их устойчивость к внешним повреждающим воздействиям. Внутриклеточная и межклеточная молекулярная сигнализация играют важную роль как в нейроглиальных взаимоотношениях (Николлс и др., 2003; Huang, Reichardt, 2003), так и в реакциях клеток на фотодинамическое воздействие (Moor, 2000; Oleinick et al., 2002). Обмен трофическими факторами между нейронами и глией (нейротрофинами, нейрегулинами и др.) взаимно поддерживает их выживаемость (Carraway, Burden, 1995; Корр et al., 1997; Barres and Barde, 2000). Известно, что повреждение нервов вызывает смерть окружающих шванновских клеток (Корр et al., 1997; Grinspan et al., 1996)., а разрушение глии негативно сказывается на функционировании и выживаемости нейронов (Largo et al., 1996). В изолированном рецепторе растяжения сенсорные нейроны могут получать межклеточные молекулярные сигналы только от окружающей глии, а глиальные клетки - от нейронов или соседних глиальных клеток

Для выяснения роли нейроглиальных сигнальных взаимодействий в фотосенсибилизированном рецепторе растяжения рака мы модифицировали компоненты двух важнейших путей межклеточной сигнализации - рецепторов, связанных с G-белками и активирующих аденилатциклазу, и рецепторных тирозинкиназ/тирозинфосфатаз. В этих опытах контрольные препараты содержали 12 % некротических глиальных клеток (Табл. 7.2), а апоптозные клетки отсутствовали (Табл. 7.3). Ни активатор АЦ форсколин (Seamon and Daly, 1986), ни ее ингибитор MDL-12330A (Lippe and Ardizzone, 1991) не вызывали некроза или апоптоза глиальных клеток за 6 часов пребывания в темноте (Табл. 7.2 и 7.3).

ФД воздействие 10"7 М Фотосенса увеличивало число некротических и апоптозных клеток до 47 и 20 %, соответственно (Табл. 7.2 и 7.3). Ингибитор АЦ MDL-12330A достоверно снижал процент некротических глиальных клеток, появляющихся после фотосенсибюилизации, до 36 % (Табл. 7.2). Активация АЦ форсколином не влияла на процессы некроза, но устраняла апоптогенное действие фотосенсибилизации (Табл. 7.2 и 7.3). Таким образом, ингибирование аденилатциклазы защищало глиальные клетки от некроза, а активация этого фермента - от апоптоза. MDL-12330A проявлял тенденцию к снижению, а форсколин - к увеличению числа сателлитных глиальных клеток вокруг тела фотосенсибилизированного нейрона (Табл.7.4). Эти различия становились значимыми, при сравнении этих опытов между собой (43 против 37 %), что позволило сделать вывод об участии аденилатциклазы в фотоиндуцированном глиозе.

Ни генистеин, ингибитор тирозинкиназ (Akiyama et al., 1987; O'Dell et al., 1991), ни ортованадат натрия, ингибитор тирозинфосфатаз (Swarup et al., 1982; Lu et al., 2002), не влияли на некроз и апоптоз глиальных клеток в темноте (Табл. 7.2 и 7.3). В отличие от нейронов, генистеин также не влиял на эти процессы и в фотосенсибилизированных клетках (Табл. 7.2 и 7.3). Ортованадат достоверно снижал процент некротических глиальных клеток с поврежденной плазматической мембраной (Табл. 7.2). Оба ингибитора не изменяли плотность глиальных клеток вокруг сомы нейрона (Табл. 7.4).

7.6. Обсуждение

Фотосенсибилизированные глиальные клетки погибали как от некроза, так и от апоптоза. Как и в нейронах, эти процессы развивались со временем после ФД воздействия и были наиболее выражены через 8 часов после облучения препарата. Это говорит о триггерном, пусковом характере первичных повреждений клеток и их необратимости. Электронно-микроскопическое исследование показало, что структурные изменения глиальных клеток начинали появляться уже в первые минуты облучения и затем усиливались. Пикнотические изменения клеточных ядер появлялись в результате конденсации хроматина: сначала уплотнения, а потом объединения в одну плотную массу. Этот процесс мог вести к апоптозу, но, как показало флуорохромирование ПИ, во многих клетках с пикнотическими ядрами все же развивался некроз в результате повреждения плазматической мембраны и внутриклеточных органелл.

Процессы сигнальной трансдукции играли важную роль в ФД повреждении глиальных клеток. В отличие от изменений биоэлектрической активности фотосенсибилизированных нейронов, усиливавшихся при ингибировании аденилатциклазы, ингибирование АЦ с помощью MDL-12330A снижало процент некротических нейронов и глиальных клеток с поврежденной плазматической мембраной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенной работы показали, что нервные клетки сходным образом реагируют на лазерное облучение в присутствие и отсутствие экзогенных фотосенсибилизаторов. Продолжительное облучение в течение нескольких минут или десятков минут вызывало фазные изменения и необратимое прекращение нейронной активности. В случае неокрашенных клеток эндогенным рецептором синего света, наиболее эффективного в видимой области спектра, оказались флавиновые соединения, в частности, сукцинатдегидрогеназа цикла Кребса. Основными мишенями оптического воздействия оказались плазматическая мембрана и митохондрии, у которых особенно чувствительной к свету является внутренняя мембрана. В фотосенсибилизированных клетках отмечено также повреждение наружной митохондриальной мембраны, а также мембран эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. По нашим данным, фотоповреждение плазматической мембраны нейрона при лазерном микрооблучении или окраске высокими концентрациями фотосенсибилизаторов приводит к учащению и необратимому деполяризационному блокированию нейронной активности. При сравнительно низкой интенсивности лазерного света или при малых концентрациях фотосенсибилизаторов развивается торможение, приводящее к постепенному прекращению нейронной активности. Использование фармакологических модуляторов различных биохимических процессов показало, что за фототорможение нейронов может отвечать повышение уровня ионов кальция в цитозоле, а также нарушение биоэнергетических процессов. Различные пути внутриклеточной и межклеточной сигнализации, включая протеинкиназу С, фосфатидилинозитол 3-киназу, аденилатциклазу, тирозинкиназы и протеинфосфатазу участвуют в реакции нейронов на фотодинамическое воздействие. В результате оптического воздействия в клетках развивается некроз: непосредственно в ходе облучения при достаточно интенсивном воздействии или с задержкой - при сравнительно слабом.

Сателлитные глиальные клетки, окружающие нейроны, также оказались весьма чувствительными к фотодинамическому повреждению, вызывающему у них некроз или апоптоз.

Таким образом, можно сформулировать следующие выводы:

1. Микрооблучение изолированного механорецепторного нейрона речного рака сфокусированным лазерным излучением вызывает фазные изменения импульсной активности: учащение, торможение, повторное учащение и необратимый блок импульсной активности. Повышение интенсивности воздействия сокращает продолжительность отдельных фаз и ускоряет изменения частоты импульсации в этих фазах.

2. В видимом диапазоне наиболее эффективным является синий свет с максимумом около 460 нм, облучение в оранжево-красной части спектра не влияет на нейронную активность. При действии синего света в нейроне накапливаются подпороговые изменения, приводящие к изменению импульсной активности после длительного латентного периода (десятки минут) или при последующем более продолжительном облучении.

3. Эндогенными фоторецепторами синего лазерного излучения в непигментированных нейронах являются флавиновые соединения. Первичные мишени синего света в нейронах - плазматическая мембрана, повреждение которой ответственно за активацию импульсной активности, и митохондрии, в которых синее лазерное микрооблучение ингибирует сукцинатдегидрогеназу, вызывает набухание, просветление матрикса и дезорганизацию крист. Фотоповреждение митохондрий ведет к выходу ионов кальция и торможению импульсной активности нейрона. Важным звеном фотоинактивации нейронов является фотоиндуцированное ингибирование (Na+-K+)~ и особенно Са2+-АТФазы.

4. Механорецепторный нейрон рака оказался весьма чувствительным к ФД воздействию различных фотосенсибилизаторов: производных гематопорфирина и дейтеропорфирина IX, хлоринов вб и р6\ шТНРС, А1 и Zn фталоцианинов и гиперицина. Наномолярные, а в ряде случаев пикомолярные концентрации ФС необратимо инактивировали нейрон.

5. ФД воздействие при высоких концентрациях ФС вызывало учащение и резкое блокирование нейронной активности. Некроз наступал в ходе облучения. Слабое, но продолжительное ФД воздействие сравнительно небольших концентраций ФС вызывало постепенное торможение и необратимое прекращение импульсации. В этом случае явные признаки некроза (нарушение целостности плазматической мембраны и падение активности клеточных дегидрогеназ) наблюдались только через 2-4 часа после воздействия. ФД воздействие не вызывало фрагментации ядер нейронов, характерной для апоптоза.

6. Полученные концентрационные зависимости времени жизни нейронов позволяют сравнивать ФД эффективность разных сенсибилизаторов и выявлять наиболее эффективные из них. Более эффективны ФС, действие которых слабо зависит от концентрации.

7. ФД эффективность зависит от строения и физико-химических свойств ФС, особенно, от молярной экстинкции и амфифильности, оцениваемой по коэффициенту распределения Кр. Оптимальные значения Кр порядка 10-30. Амфифильные ФС с асимметричным распределением полярных и неполярных групп более эффективны.

8. Основными мишенями ФД воздействия Фотосенса являются плазматическая мембрана, повреждение которой вызывает учащение импульсации и внутриклеточные органеллы - митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Фотоповреждение этих органелл ведет к выходу ионов кальция в цитозоль и торможению нейронной активности.

9. В фотоинактивации и некрозе нейронов важную роль играют процессы внутри- и межклеточной сигнализации с участием протеинкиназы С, фосфатидилинозитол 3-киназы, аденилатциклазы, тирозинкиназ и протеинфосфатаз.

10. Фотосенсибилизированные глиальные клетки погибают как в результате некроза, так и апоптоза. ФД воздействие также увеличивает плотность глиальных клеток вокруг тела нейрона. В реакцию глиальных клеток вовлечен аденилатциклазный, но не тирозинкиназный сигнальный путь.

11. Применение ингибиторов или активаторов биоэнергетических или сигнальных ферментов и модуляторов уровня кальция в клетке позволяет ослабить или усилить фотодинамическое повреждение нервных и глиальных клеток. Это дает основание для разработки методов усиления фотоповреждения патологически измененных клеток и защиты окружающих нормальных клеток.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор благодарит всех, кто помогал ему в этой работе. В первую очередь, своих коллег, сотрудников и соавторов Жаворонкову А.А., Дергачеву О.Ю., Колосова М.С., Брагина Д.Е., Федоренко Г.М. , Савранского В.В., Гусатинского В.Н., Владимирского Б.М. Также коллег, предоставивших новые фотосенсибилизаторы: проф. Иванова А.В., проф. Миронова, канд. наук Решетникова А.В., проф. Пономарева Г.В., проф. Лосева А.П., канд. наук Кузьмина С.Г., проф. Лукьянца, проф. Моана И.

Особая благодарность моей жене Узденской В.Н. и моим учителям проф. Когану А.Б., проф. Бреслеру С.Е., а также тем, по чьим книгам я учился и кто был для меня примером - Волькенштейну М.В., Блюменфельду Л.А., Чернаскому Д.С. и многим другим.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Узденский, Анатолий Борисович, Воронеж

1. Аджимолаев Т.А., Зубкова С.М., и Лапрун И.Б. Структурные и функциональные изменения в нервных клетках при лазерном облучении // Инструменты и методы квантовой электроники в медицине. -Саратов: Изд. СГУ, 1976-С. 156-159.

2. Акоев Г.Н., Алексеев Н.П. Функциональная организация механорецепторов. -Л.:Наука, 1985.

3. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Программированная клеточная смерть (апоптоз) // Рос. Онк. Журн. -1996. -Т. 1. -С. 58-61.

4. Берне М.В., Китц М., Штрас К.Р., Бер-f Д., Петерст С., Бреннер С., Юммер-Вильсон М., Ли Ху Лине Лазерное микрооблучение клеток // Квант, электрон. -1978. -Т. 5. С. 2252—2258.

5. Безбородое В.А., Тарасов О.В. Влияние когерентного монохроматического облучения на биоэлектрическую активность рецепторов кожи // Вопр. Курортол. -1977. -Т. 4 С. 62-65.

6. Богданович У .Я., Каримов М.Г., Краснощекова Е.Е. Лазеры в травматологии и ортопедиию-Казань: Изд. Казанского университета, 1977.

7. Болдырев А.А., Волынская Е.А., Курелла Е.Г., Тюлина О.В. Устойчивость к окислению На+К+-АТФ-азы мозга // Физико-химические принципы функционирования белков и их комплексов Воронеж: Изд. ВГУ, 1995. -С. 27-29.

8. Брагин Д.Е. Исследование динамики и механизмов гибели механорецепторного нейрона речного рака при фотодинамическом воздействии // Воронеж.- Канд. Дисс. -2003,- 132 с.

9. Брагин Д.Е., Колосов М.С., Узденский А.Б. О роли внутриклеточных сигнальных и биоэнергетических процессов в фотоиндуцированном торможении и инактивации изолированного нейрона // Проблемы нейрокибернетики / Ростов-на-Дону, 2002.-Т.2. -С. 251-255.

10. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы -Л.:Наука,1987. -232 с.

11. Бурлакова Е.Б., Алексеенко А.В. и др. Биоантиоксиданты в радиационном поражении и злокачественном росте. -М.:Наука,1975.

12. Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., Сезина И.П. Реакции опухолей и органов опухоленосящих животных на введение синтетических антиоксидантов // Вопр. Мед. Химии. -1978. -Т. 24. -С. 368-371.

13. Бурмистров Ю.М., Людковская Р.Г., Шуранова Ж.П. Электрическая активность нейронов речного рака при витальной окраске метиленовым синим // Биофизика. -1969. -Т. 14.-С. 495-501.

14. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. -М.:Наука,1972. -252 с.

15. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.Н. Свободные радикалы в живых системах. -Москва:ВИНИТИ., 1991. 249 с.

16. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов -М.: Высшая школа, 1989. -199 с.

17. Владимирский Б.М. Математические методы в биологии. -Ростов: Изд.РГУ,1983.

18. Водолазкин Д.И. Юзюк, Узденский А.Б. Ингибирование (Na+-K+)- и Са2+-АТФ-аз синим светом лазера // Физико-химические принципы функционирования белков и их комплексов. Воронеж: Изд. ВГУ, 1998. -С. 57-60.

19. Гамалея Н.Ф. Лазеры в эксперименте и клинике -М.:Медицина,1972. -288 с.

20. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции -М.:Мир,1997. -624 с.

21. Гордеева А.В., Звягильская Р.А., Лабас Ю.А. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках // Биохимия. 2003. -Т. 68. -С. 1318-1322.

22. Гуринович Г.П., Зорина Т.Е., Аркатов Ю.М., Саржевская М.В., Черенкевич С.Н. Люминесцентно-спектроскопическое изучение распределения хлорина е6 и его производных в клетках HeLa // Цитология. -1989. -Т. 31. -С. 1058-1063.

23. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991. -543 с.

24. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс. -М.-МАИК Наука/Интерпериодика, 2001.-343 с.

25. Зиганшин А.У., Зинагшин Л.Е. Фармакология рецепторов АТФ.- М.:ГЭОТАР Медицина, 1999.-209 с.

26. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино: Электронное издательство Аналитическая микроскопия, 2003.

27. Зубкова С.М. Механизмы биологического эффекта гелий-неонового лазера // Биол. науки. -1978. -№. 7 -С.30-37.

28. Зубкова С.М., Попов В.И. Морфо-ф'ункциональное состояние клеток Пуркинье мозжечка новорожденных крыс после лазерного и ионизирующего облучения // Радиобиология и радиоэкология. -1993. -Т. 33. -С. 790-793.

29. Зубкова С.М. Соколова З.А. Состояние митохондрий и ядерного хроматина в нервных клетках мозга после лазерного облучения // Вопр. Мед. Хим. -1978. -Т. 3 -С. 326-330.

30. Иванов А.В., Решетников А.В., Дмитриев А.А., Градюшко А.Т., Швец В.И., Пономарев Г.В. Структурно-функциональные зависимости для некоторых порфириновых фотосенсибилизаторов // Всероссийский съезд фотобиологов. -Пущино. -1998. -С. 362-364.

31. Ильинский О.Б. Физиология сенсорных систем // Часть III. Физиология механорецепторов. -Л.: Наука, 1975 -560 с.

32. Инюшин В.М., Чекуров П.Р. Биостимуляция лучом лазера и биоплазма. -Алма-Ата, 1975. -119 с.

33. Карнаухов В.Н. Микроспектральные исследования гигантских нейронов большого прудовика // Свойства и функции макромолекул и макромолекулярных систем. -М.:Наука, 1969. С. 200-209.

34. Карнаухов В.Н. Спектральные методы исследования энергетики и регуляции в живой клетке // Биофизика живой клетки. -Пущино,1972. -Т. 3. -С. 100-117.

35. Карнаухов В.Н. Функции каротиноидов в клетках животных -М. :Наука,1973. -104 с.

36. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов в окислительном стрессе // Усп. Совр. Биол. -1993. -Т. 113. С. 456-470.

37. Ковальский Г.Б. Количественная гистохимия дегидрогеназ. Введение в количественную гистохимию ферментов -Под ред. Журавлевой Т. Б., Прочухановой Р. А. -М. : Медицина, 1978. -с. 58-114.

38. Коган А.Б., Машанский В.Ф., Федоренко Г.М., Загускин С.Л. Ультраструктура механорецепторного нейрона рака в состоянии покоя, ритмической импульсной активности и торможения, вызванных адекватным растяжением // Цитология. -1974. -Т.16. -С. 150.

39. Козловский В.Л. Регуляция кальциевого гомеостаза в нервных клетках // Усп. Физиол. Наук. -1995. -Т. 266. -С. 14-23.

40. Козырева Е.В., Митюшин В.М. О взаимосвязи структуры и функционального состояния митохондрий печени крыс // Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии. -М. '.Наука, 1971.- С. 113-119.41.