Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование динамики и механизмов гибели механорецепторного нейрона речного рака при фотодинамическом воздействии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Исследование динамики и механизмов гибели механорецепторного нейрона речного рака при фотодинамическом воздействии"
на правах рукописи
Брагин Денис Евгеньевич
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ И МЕХАНИЗМОВ ГИБЕЛИ МЕХАНОРЕЦЕПТОРНОГО НЕЙРОНА РЕЧНОГО РАКА ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
Специальность 03.00.02 - "Биофизика"
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Воронеж - 2003
Работа выполнена в научно-исследовательском институте нейрокибернетики им А.Б. Когана Ростовского государственного университета
Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент
Узденский Анатолий Борисович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Потапенко Александр Яковлевич
доктор биологических наук, профессор Ковалева Тамара Андреевна
Ведущая организация: Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН
Защита диссертации состоится «_» _ 2003 г. в _часов на
заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете
Адрес: 394693, Воронеж, Университетская площадь 1, Воронежский государственный университет
С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета
Автореферат разослан «_»_2003 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Фотодинамический эффект - гибель окрашенных фотосенсибилизаторами клеток, при освещении светом в присутствии кислорода. Он лежит в основе фотодинамической терапии, успешно применяемой в онкологии для избирательного разрушения злокачественных опухолей, селективно накапливающих фотосенсибилизаторы (Dougherty et al., 1998), в частности, для лечения некоторых опухолей мозга (Muller, 1990; Kostron, 1996). В экспериментальной нейрофизиологии фото динамический эффект используется для направленного разрушения определенных нейронов или групп клеток с целью выяснения их роли в функционировании разных нервных центров (Picaud et al., 1990; Yeoman et al., 1994). Однако, при фотодинамической терапии могут повреждаться и здоровые клетки, окружающие опухоль, в частности, периферические нервные элементы (Ji et al, 1992; Hebeda et al., 1998). Поэтому необходимо всестороннее комплексное исследование динамики повреждения нейрона и механизмов его смерти, конечной целью которого было бы максимальное разрушение злокачественных клеток и защита здоровых. Кроме того, детальное исследование влияния фотодинамического воздействия на нервные клетки может дать новую информацию об общебиологических механизмах фотосенсибилизации на клеточном уровне. Однако, исследованию фотодинамического эффекта на нервные клетки посвящены пока единичные работы (Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1990, Lilge et al., 2000; Kress et al., 1997), изучающие отдельные стороны реакции нейронов на фотосенсибилизацию и не позволяющие связать наблюдавшиеся изменения биоэлектрических процессов с происходящими при этом метаболическими реакциями.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - провести комплексное электрофизиологическое, биохимическое, цитологическое и фармакологическое исследование влияния фотодинамического воздействия на одиночную нервную клетку. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать динамику инактивации механорецепторного нейрона по показателям биоэлектрической активности при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
2. Оценить степень повреждения плазматической мембраны, изменения морфологии клеточных ядер и нарушений биоэнергетических процессов в нейронах при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
3. Изучить роль различных биоэнергетических процессов (гликолиз, цикл Кребса, окислительное фосфоршширование) и процессов внутриклеточной сигнализации (ионы Са2+, активность протеинкиназы С и фосфатидилинозитол 3-киназы) в динамике инактивации изолированных нейронов при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное электрофизиологическое, биохимическое, цитологическое и фармакологическое исследование влияния фотодинамического воздействия на одиночную нервную клетку. Показано, что фотосенсибилизация может инициировать различные механизмы клеточной гибели в зависимости от интенсивности воздействия. Изучена динамика изменений ядра, митохондрий и плазматической мембраны при фотодинамическом воздействии. Выявлено участие различных биоэнергетических процессов и процессов внутриклеточной сигнализации (ионы кальция, активность протеинкиназы С и фосфатидилинозитол 3-киназы) в фотоинактивации изолированных нейронов Показано, что фармакологическая модификация разных метаболических и сигнальных процессов повышает или понижает чувствительность нейрона к фотодинамическому воздействию.
'* ' Ч»*:.^ чч*^1»-»;.' 5 •
•** ал ■
Практическая ценность работы. Данные о характере реакций нервных клеток, динамике развертывания в них процессов повреждения, механизмов фотоповреждения и фотоиндуцированной гибели нейронов, зависимости эффективности воздействия от концентрации фотосенсибилизатора, а также о влиянии различных модуляторов на реакцию нервной клетки к ФД воздействию могут учитываться при разработке методов фотодинамической терапии опухолей мозга и других онкологических заболеваний. Применяя модулятор«, повышающие внутриклеточную конценграцию ионов Са2+, активаторы протеинкиназы С или ингибиторы продукции АТФ, можно усилить фотодинамическое повреждение опухолевых тканей. С другой стороны, применяя биоэнергетические субстраты, ингибиторы протеинкиназы С, фосфатидилинозитол 3-киназы или агенты, снижающие внутриклеточную концентрацию ионов Са2+, можно защитить здоровые клетки, окружающие патологическую ткань при фотодинамической терапии. Материалы работы используются в учебном процессе при чтении курса лекций по фотобиологии на кафедре биофизики физического факультета РГУ. Результаты работы использованы при выполнении грантов РФФИ № 02-04-48027 и 03-04-06101.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Фотодинамическое воздействие вызывает качественно различные импульсные ответы механорецепторного нейрона речного рака в зависимости от концентрации фотосенсибилизатора. При высокой концентрации Фотосенса (10"5 М) происходит учащение импульсной активности, заканчивающееся резким блоком генерации потенциалов действия. Фотосенсибилизация нейрона с меньшей концентрацией Фотосенса (10"7 М) вызывает торможение импульсной активности с последующим необратимым прекращением импульсации.
2. При фотодинамическом воздействии высокой концентрации Фотосенса (10"5 М) происходит повреждение плазматической мембраны и
биоэнергетических процессов в процессе облучения, что приводит к некрозу механорецепторного нейрона. При меньшей концентрации Фотосенса (10"7 М) активность ферментов биоэнергетики и целостность плазматической мембраны сохраняются в течение первых 2 часов после функциональной инактивации нейрона, но затем также развивается некроз.
3. В фото динамической инактивации нейрона участвуют ионы внутриклеточная сигнализация (протеинкиназа С и фосфатидшшнозитол 3-киназа) и биоэнергетические процессы. Применение модуляторов, увеличивающих концентрацию ионов Са2+, активаторов протеинкиназы С и ингибиторов продукции АТФ, может повышать эффективность ФДТ, в то время как применение биоэнергетических субстратов, агентов, снижающих концентрацию ионов Са2+, и ингибиторов протеинкиназы С и PI-3 киназы, может защищать нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от фотодинамического воздействия.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 17 международных конференциях; 3rd European Biophysical Congress "Eurobiophysics 2000" (Munich), VI и VII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Moscow-Pushchino, 2000, Kaliningrad -Svetlogorsk -Otradnoe, 2003), П1 съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), 29-31th Annual Meeting American Society for Photobiology (Chicago, 2001, Quebec, 2002, Baltimore, 2003), 9-10л Congress of European Society for Photobiology (LiHehammer, 2001, Vienna, 2003), 10th Annual International Laser Physics Workshop (Moscow, 2001), Saratov Fall Meeting -SFM'01-02 International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine Ш-IV (Saratov, 2001-2002), IX International Conference of Laser Applications in the Life Sciences (Vilnius, 2002), Юбилейной международной конференции по нейрокибернетике им А.Б. Когана (Ростов-на-Дону, 2002), 12th European
Bioenergetic Conference EBEC (Bordeaux, 2002), 7ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в реферируемых журналах, 9 статей в сборниках и 14 тезисов по материалам конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на
страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами, рисунками и фотографиями. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылки).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
В качестве фотосенсибилизатора служил сульфированный алюмофталоцианин Фотосенс (ФС) AlPcSn, где п=2, 3 или 4 (НИОПИК, Москва). Спектры его возбуждения и флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама. Спектр поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000-02.
Объектом исследования служил изолированный механорецепторный нейрон (МРН) речного рака Astacus leptodactilus. Этот классический нейрофизиологический объект детально и всесторонне изучен. Его достоинством является' способность длительно поддерживать постоянный уровень импульсной активности, что позволяет непрерывно регистрировать динамику клеточного ответа на фотодинамическое (ФД) воздействие от начальных, пороговых сдвигов до терминальных событий, ведущих к гибели клетки. Потенциалы действия (ПЦ) нейрона отводили внеклеточно присасывающимся электродом, усиливали усилителем УУ-90 и непрерывно
регистрировали их частоту частотомером МФУ-1. После 30-минутной контрольной регистрации частоты ПД добавляли Фотосенс в концентрации 10"7 или 10"5 М и через 30 мин облучали гелий-неоновым лазером ЛГН-111 (632.8 нм, 0.3 Вт/см2), продолжая непрерывно регистрировать динамику частоты ПД до необратимого прекращения импульсации. По частотограмме определяли время жизни нейрона от начала облучения до прекращения генерации спайков.
Для изучения участия ионов Саг+, систем внутриклеточной сигнализации и биоэнергетики клетки в реакции нейрона на низкоинтенсивное ФД воздействие за 15 мин~ до облучения добавлялись фармакологические агенты, модифицирующие эти процессы.
1) Модификаторы энергетического метаболизма: Субстрат гликолиза глюкоза (10 мМ); или субстраты цикла Кребса: сукцинат натрия (5 мМ) или смесь пирувата и малата натрия (2,5 мМ). Ингибиторы гликолиза моноиодацетат (0,2 мМ) или 2-дезокси-0-глюкоза (0,5 мМ); ингибитор цикла Кребса малонат натрия (5 мМ); ингибиторы электронного транспорта: азид натрия (0,5-1 мМ), ротенон (250 нМ), антимицин А (10 нМ) или амитал натрия (2,5 мМ); или разобщитель окислительного фосфориллирования 2,4-динитрофенол (0,2 мМ).
2) Модуляторы внутриклеточной концентрации ионов кальция: Са2+ ионофор иономицин (1 мкМ) или тапсигаргин, блокирующий Са2+-АТФазу, закачивающую Са2+ в депо (1 мкМ); хелатор ионов Са2+"ВАРТА (100 мкМ) или блокатор кальциевых каналов эндоплазматического ретикулума (ЭР) рианодин (1 мкМ).
3) Модуляторы активности протеинкиназы С (РКС): активатор 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТРА, 50-250 нМ); или ингибиторы гиперицин (1 мкМ), стауроспорин (10-60 нМ) или челеритрин (500 нМ).
4) Ингибиторы активности фосфатидилинозитол-З киназы (Р 13-киназы) вортманнин (10 нМ) и ЬУ294002 (1-20 мкМ).
Концентрации модификаторов подбирались так, чтобы они сами не влияли на импульсную активность нейрона в течение 2-3 часов. Контролем служили фотосенсибилизированные нейроны, не обработанные модификаторами.
Цитохимическое определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и общей дегидрогеназной активности (МТТ-тест) проводили по методам (Лойда и др. 1982), которые основаны на восстановлении солей тетразолия сукцинат-дегидрогеназным комплексом или клеточными дегидрогеназами, с образованием фиолетовых кристаллов формазана. Фотосенсибилизированные и контрольные нейроны фиксировали глютаральдегидом, заключали в глицерин и фотометрировали при помощи фотометрической насадки ФМЭЛ-1, установленной на микроскопе Amplival.
Флуоресцентно-микроскопические исследования локализации Фотосенса в механорецепорном нейроне, целостности плазматической мембраны и морфологии ядер нейронов проводили совместно с аспирантом физфака РГУ Колосовым М.С. на микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ, соединенным с цифровой камерой Nikon Coolpix 995. Для исследования целостности плазматической мембраны нейронов использовали пропидиум-йодид (ПИ), который проникает в клетку только через поврежденную мембрану. Сразу после фотоинактивации нейрона добавляли 20 мкМ ПИ и каждые 10 минут наблюдали за появлением красной флуоресценции в ядре.
Для исследования морфологии ядер нейроны фиксировались через 1-3, 4-6 и 10-20 часов после фотоиндуцированного прекращения импульсной активности, окрашивались красителем Hoechst 33342 (20 мкМ), селективно флуорохромирующим ядерный хроматин, и заключались в глицерин. Площадь ядер нейронов рассчитывали по формуле эллипса таЬ/4 с осями а-ab.
Исследование ультраструктурных изменений в механорецепторном нейроне проводилось совместно с профессором Федоренко Г.М.. Сразу после фотодинамической инактивации МРН фиксировали 2,5 % глютаральдегидом,
обрабатывали 1% ОвО^ контрастировали уранилацетатом, обезвоживали в этаноле и ацетоне и заключали в эпон. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме Теэк В Б 590А. Просматривали и фотографировали препараты на электронном микроскопе ПЭМ-100.
Статистический анализ результатов экспериментов проводился по С-критерию Стьюдента с использованием стандартных методов (Владимирский, 1983). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (М ± т).
Результаты исследований
Физико-химические характеристики и локализация Фотосенса в МРН
Спектр поглощения Фотосенса содержал полосу с максимумом 673 нм и два менее интенсивных пика при 348 и 605 нм. Спектр возбуждения практически совпадал со спектром поглощения. Максимум спектра флуоресценции, при ^0,6=345 нм, наблюдался при 684 нм.
Фотосенс флуорохромировал красным цветом преимущественно глиальную оболочку нейрона и, возможно, плазматическую мембрану нейрона. Слабая диффузная флуоресценция Фотосенса в области тела нейрона свидетельствовала о том, что часть фотосенсибилизатора проникала внутрь клетки и неспецифически сенсибилизировала разные клеточные структуры.
Электрофизиологическая реакция нейрона на фотосенсибилизацию
Ни лазерное облучение >,=632.8, ни Фотосенс<10"5моль/л по отдельности не вызывали достоверных изменений импульсной активности нейрона.
1
МРН оказались очень чувствительными к совместному действию лазерного облучения и Фотосенса, т.е. к ФД эффекту. Тип реакции нейрона зависел от концентрации фотосенсибилизатора. В большинстве опытов ФД воздействие Фотосенса 10"5 М вызывало учащение импульсации, затем резкий и необратимый ее срыв (Рис. 1А). Инактивация нейрона происходила в среднем за 2,5±0,8 минуты. ФД воздействие Фотосенса 10"7 М в большинстве опытов приводило к постепенному торможению импульсной активностй и ее необратимому прекращению в среднем за 21±1 мин (Рис. 1Б). Необратимое прекращение импульсации
рассматривалось нами как показатель функциональной смерти нейрона. Возбудительная реакция на воздействие, как в случае 10"5 М Фотосенса, часто наблюдается при повреждении нейронов разными факторами. Она связана с нарушением проницаемости
нейрональной мембраны, падением ионных градиентов, деполяризацией, учащением импульсации и, в конечном итоге, с деполяризационным блоком импульсной активности (Узденский, Миронов, 2000). Механизм тормозных процессов при ФД воздействии меньшей концешрации Фотосенса и механизм последующей смерти нейрона, был не ясен. Предполагалось, что в основе торможения лежит нарушение не только мембранных, но и других процессов, включая биоэнергетические и сигнальные реакции (№с1епвку е! а1, 2000).
а с о
ь о I-
и
т
30
1
30 0 30
Время, мин
Рис. 1. Реакция нейрона на фотодинамическое воздействие Фотосенса в концентрации; А) 10"5; Б) 10"7 моль/л
Об участии Ca*+ в реакции нейрона на ФД воздействие 1(Г7 М Фотосенса
Ионы Са2+ могли служить посредником ФД-индуцированного торможения импульсной активности нейрона (Uzdensly et al., 2000). Известно, что кальций может проникать в клетку через плазматическую мембрану и поступать в цитозоль из внутриклеточных депо: из ЭР или из поврежденных митохондрий (Carafoli, 1987; Pozzan et al., 1994). Кроме того, в клетке есть Са2+-АТФазы, закачивающие ионы Са2+ обратно в депо или выводящие его из клетки (Carafoli, 1987; Pozzan et al., 1994). В наших экспериментах факторы, ведущие к повышению [Ca2+]i: кальциевый ионофор иономицин, способствующий проникновению Са2+ в клетку, и тапсигаргин, блокирующий Са2+-АТФазу, а так же хелатор Са2+ - ВАРТА, усиливали фотоиндуцированное торможение импульсации и ускоряли гибель нейрона (Рис. 2А). Блокатор кальциевых каналов ЭР - рианодин оказался неэффективным в использованной концентрации (Рис. 2А). Эти данные показывают, что Са2+ участвует в фототорможении импульсной активности. Возможно, источником ионов кальция в цитозоле являлись фотоповрежденные Са2+-депонирующие органеллы - ЭР и митохондрии. Са2+ является важнейшим посредником в системе внутриклеточной сигнализации. Известно, что он гиперполяризует нейроны и ингибирует их импульсную активность (Meech, 1978), а также управляет многими метаболическими процессами и индуцирует смерть клеток (Nikotera et al., 1990; Trump and Berezesky, 1992). Концентрация ионов кальция в цитозоле регулируется различными сигнальными механизмами. Поэтому мы изучили участие некоторых процессов внутриклеточной сигнализации в реакции МРН на ФД воздействие.
A) модуляторами концентрации кальция в цитозоле
Б) активатором (ТРА) или ингибиторами протеинкиназы С
B) ингибиторами фосфатидилинозитол 3-киназы Г) субстратами и ингибиторами биоэнергетики
* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001_
Об участии протеинкиназы Си фосфатидилинозитол 3-киназы
Один из центральных участников системы внутриклеточной сигнализации - протеинкиназа С. Она активирует ионные каналы, запускает экспрессию разных генов, регулирует активность ферментов, участвующих в клеточном метаболизме, функциях цитоскелета, секреции и экзоцитозе (Tanaka and Nishizuka, 1994; Newton and Johnson, 1998). Есть данные об участии РКС в ФД-индуцированной гибели клеток (Al-Laith and Matthews, 1994; Polack and Kawecki 1997; Rasch et al., 1997). В наших опытах активация РКС форболовым эфиром ТРА усиливала фотоиндуцированное торможение импульсной активности нейрона и ускоряла его гибель (Рис. 2Б). Напротив, ингибирование РКС стауроспорином, челеритрином или гиперицином увеличивало время жизни нейрона (Рис. 2Б), защищая его от фотоповреждения. При активации РКС площадь ядер фотосенсибилизированных нейронов увеличивалась с 535+46 мкм2 до 1060±60 мкм2, что характерно для некротической смерти клеток. Ингибиторы РКС не влияли на размеры ядра. Известно, что ингибиторы РКС являются индукторами апоптоза (Jarvis et al., 1994, Fox, 1998), но характерной для апоптоза фрагментации ядер нейронов мы не наблюдали, в то время как фрагментированные ядра окружающих глиальных клеток встречались довольно часто. Таким образом, РКС участвует в реакции нейрона на ФД воздействие, усиливая его торможение и ускоряя инактивацию.
Фосфатидилинозитол 3-киназа регулирует реакции клеток на стрессовые воздействия, выживаемость клетки и устойчивость к апоптозу (Shimoke et al., 1999, Skaper et al., 1998). Ингибиторы PI 3-киназы вортманнин и LY294002 увеличивали время жизни нейрона, защищая его от фотоповреждения (Рис. 2В). Известно, что ингибирование PI 3-киназы усиливает процессы апоптоза (Skaper et al., 1998; Shimoke et al., 1999), однако после фотоинактивации нейронов при действии воршаннина или I-Y294002 мы не наблюдали кариопикноза и
фрагментации ядер. Таким образом, Р1 3-киваза не защищала нейрон от фотоиндуцированного повреждения, а участвовала в его смерти.
Об участии биоэнергетических процессов
Одной из мишеней ФД воздействия могли оказаться биоэнергетические процессы. Субстраты ферментов гликолиза или цикла Кребса (глюкоза, сукцинат натрия или смесь пирувата и маната натрия) замедляли фотоиндуцированное торможение импульсации и увеличивали время жизни нейронов в среднем в 1.6-2.4 раза (Рис. 2Г). Напротив, ингибиторы разных биоэнергетических процессов: гликолиза (моноиодацетат натрия, 2-дезокси-В-глюкоза), цикла Кребса (малонат натрия), электронного транспорта (ротенон, антимицин А, амитал или азид натрия) или же разобщитель окислительного фосфорилированигя (2,4-динитрофенол) увеличивали фоточувствительность нейрона, ускоряли фотоиндуцированное торможение импульсной активности и сокращали время жизни нейрона (Рис. 2Г). Поскольку все эти процессы являются разными звеньями процесса синтеза АТФ в клетке, то именно недостаток АТФ, который необходим для поддержания ионного баланса в поврежденной клетке, следует признать одной из причин фототорможения и последующего необратимого прекращения импульсации нейрона.
Исследование -активности сукцинатдегидрогеназы показало, что сразу после прекращения импульсной активности суммарная активность СДГ фотосенсибилизированных нейронов (10'7 М Фотосенса) не отличалась от контроля. Достоверное снижение активности СДГ на 40 % от контроля наблюдалось только через 4 часа после ФД инактивации. ФД воздействие большей концентрации Фотосенса (10'5 М) снижало активность СДГ сразу после инактивации. При этом через 4 часа наблюдалось дальнейшее снижение активности СДГ (Рис. ЗА). Таким образом, ФД воздействие инактивировало СДГ, что, очевидно, нарушало синтез АТФ. При этом степень ингибирования
фермента зависела от концентрации Фотосенса и от времени, прошедшего после инактивации нейрона.
Динамика ингибирования общей активности дегидрогеназ при ФД воздействии корреллировала с динамикой фотоиндуцированного ингибирования СДГ. Сразу после фотоинактивации нейрона (Фотосенс 10"' М) снижения общей дегидрогеназной активности не наблюдалось, но через 4 часа активность ферментов падала, что указывает на существенное нарушение деятельности биоэнергетических процессов. При воздействии большей концентрации Фотосенса (10"5 М) общая дегидрогеназная активность падала сразу после прекращения импульсации и дальше оставалась на этом уровне (Рис. 3 Б). Таким образом, ФД воздействие заметно снижало общую дегидрогеназную активность в теле нейрона, что должно было приводить к снижению синтеза АТФ и потере жизнеспособности МРО.
Динамика нарушения проницаемости плазматической мембраны
Ядра несенсибилизированных контрольных нейронов окрашивались
пропидиум-иодидом в среднем через 6,2+0,5 часов. При ФД воздействии 10"5 М Фотосенса окрашивание ядер нейронов происходило практически сразу, следовательно, мембрана повреждалась ещё во время облучения. При ФД воздействии меньшей концентрации Фотосенса (10"7 М) ядра нейронов окрашивались в среднем через 1,7+0,3 часа после прекращения импульсации (Рис. 4). Таким образом, при ФД воздействии 10'5 М Фотосенса повреждалась плазматическая
мембрана, что свидетельствовало о некрозе клетки. При ФД воздействии меньшей концентрации Фотосенса (10"7 М) повреждение цитоппазматической мембраны осуществлялось не сразу, а почти с двухчасовой задержкой и также вызывало некротическую смерть.
Рис. 4. Нарушение проницаемости плазматической мембраны нейрона при фотодинамическом воздействии Фотосенса
« - р<0,05, »* - р<0,01, «** - р<0,001
Динамика изменений морфологии ядра механорецепторном нейроне В контрольных препаратах, не подвергавшихся ФД воздействию и зафиксированных спустя 1-2 часа после генерации ПД с постоянной частотой, наблюдались крупные ядра (средняя площадь 720±110 мкм2) с равномерно распределенными мелкими глыбками хроматина, четкой границей и округлым ядрышком. ФД воздействие Фотосенса в концентрации 10"5 М вызывало набухание ядер сразу после инактивации нейрона, свидетельствующее о
некротических процессах, при воздействии меньшей концентрации Фотосенса (10"? М) отличий от контроля не наблюдалось. Однако, через 4-6 часов после фотоинактивации нейрона в обоих случаях происходило снижение средних площадей ядер нейронов до 540±50 мкм2 вследствие уплотнения хроматина. Со временем развивались деградация и лизис ядер нейронов, более интенсивные при ФД воздействии большей концентрации Фотосенса. Таким образом, при фотосенсибилизации Фотосенсом в концентрации 10'5 М происходило типичное для некроза набухание ядра сразу после инактивации нейрона, а ФД воздействие меньшей концентрации Фотосенса (10'7 М) вызывало сокращение размеров ядер нейронов, что могло быть признаком развития апоптозных процессов. Однако, фрагментации ядер нейронов, характерной для апоптоза, не наблюдалось.
Ультраструктурные изменения в механорецептороном нейроне
Исследование ультраструктурных изменений в механорецепторном нейроне проводилось совместно с профессором Федоренко Г.М. Сразу после прекращения импульсации фотосенсибилизированных нейронов набухали многие цистерны ЭР, а аппараты Гольджи в цитоплазме практически не наблюдались. Митохондрии были сильно набухшими, они содержали просветленный матрикс и отдельные фрагменты крист. Некоторые митохондрии не отличалась от контрольных, другие выглядели сконденсированными и содержали электронно-плотный матрикс. Многие митохондриальные агрегаты распались, и наблюдались большей частью отдельные митохондрии, но там, где митохондрии тесно прилегали друг к другу, видны были электронно-плотные межмитохондриальные контакты. На периферии нейрона можно было наблюдать миелиноподобные тела. Ядерный хроматин был более разрежен по сравнению с контрольными образцами, но содержал сравнительно крупные (до 2-3 мкм) скопления. Разрывов
плазматической мембраны не наблюдалось. Таким образом, электронно-микроскопическое исследование показало, что сразу после ФД воздействия Фотосенса (10"7 М) наибольшим изменениям подвергались эндоплазматический ретикулум и митохондрии. Повреждений плазматической мембраны фотосенсибилизированного нейрона не наблюдалось.
Предполагаемые механизмы ФД индуцированных изменений в нейроне
В наших экспериментах фотодинамическое воздействие Фотосенса (1СГ5 М) вызывало учащение импульсной активности, заканчивающееся резким блоком генерации потенциалов действия. ФД воздействие меньшей концентрации Фотосенса (10"7 М) вызывало торможение импульсации, ведущее к необратимому прекращению генерации спайков (Uzdensky et al. 2001,2002).
Результаты экспериментов (Uzdensky et al. 2001, 2002) и данные литературы позволяют предположить, что основной мишенью ФД воздействия высокой концентрации Фотосенса (10"5 М) была плазматическая мембрана нейрона. При этом в результате фотогенерации синглетного кислорода и других активных форм кислорода, последующего развития перекисного окисления липидов (Ochsner, 1997; Girotti, 1990; Packer et al., 1982), утечки ионов (Valenzeno and Tarr, 1991), повреждения ионных каналов (Pooler, 1972; VaJenzeno and Tarr, 1991; Specht, 1991; Starkus, 1993; Kress et al., 1997) и ионных насосов (Ташмухамедов, 1973; Kondo and Kasai, 1974,Болдырев и др., 1995; Водолазкин и др., 1998) могло происходить нарушение проницаемости плазматической мембраны нейрона, вызывающее деполяризацию (Бурмистров, 1969; Specht and Rogersj 1991; Kress et al., 1997), активацию импульсации и, в конечном итоге, деполяризационный блок импульсной активности (Ходоров, 1975). Как показали наши эксперименты, в это же время повреждались ферменты биоэнергетики, что, вероятно, приводило к истощению АТФ
(Uzdensky et ai. 2001, 2002). Нарушение биоэнергетических процессов и повреждение плазматической мембраны - факторы, ведущие к некрозу клеток (Luo and Kessel, 1996; Dellinger, 1997, Nicotera and Leist, 1997). Это позволяет предполагать, что в ходе интенсивного ФД воздействия развивался некроз нейрона (Uzdensky et al. 2001,2002).
При ФД воздействии Фотосенса в меньшей концентрации (10~7 М) наблюдалось торможение, ведущее к необратимому прекращению импульсации. При этом мембрана нейрона повреждалась через 1.7 часа, а биоэнергетические процессы ингибировались через 4 часа после функциональной инактивации нейрона (Uzdensky et al. 2001,2002).
В этом случае основными мишенями могли быть внутриклеточные органеллы - эндоплазматический ретакулум и митохондрии, что подтвердили данные электронной микроскопии (Uzdensky et al., 2002; Федоренко и др., 2002). При фотоповреждении этих органелл в цитозоль, согласно литературным источникам, могли высвобождаться ионы Са2+, которые, открывая Са2+-зависимые К+-каналы (Meech, 1978), могли гиперполяризовать клетку и, таким образом, тормозить импульсацию (Ильинский, 1975), а при дальнейшем повышении концентрации кальция вызывать смерть клеток (Nikotera et al., 1990; Trump and Berezesky, 1992). В наших экспериментах, повышение концентрации ионов кальция в цитозоле и ативация протеинкиназы С, которая могла открывать кальциевые каналы плазматической мембраны, усиливали торможение импульсации и ускоряли гибель нейрона. Снижение внутриклеточной концентрации кальция вследствие ингибирования Р13-киназы или протеинкиназы С, наоборот, защищало нейрон от фотоповреждения. Полученные данные свидетельствуют о сложной взаимосвязи различных сигнальных систем, участвующих в реакции клетки на стрессовые воздействия, связующим звеном которых могли быть ионы Са2+ (Bragin et al., 2002, 2003).
Для противодействия процессам фотоповреждения клеткам необходимо достаточное количество АТФ. Субстраты ферментов биоэнергетики защищали нейрон от фотоповреждения, а ингибиторы, напротив, увеличивали фоточувствительность нейрона и сокращали время его жизни. Поэтому, истощение АТФ, необходимого. для поддержания ионного баланса в поврежденной клетке, могло быть одной из причин фототорможения и инактивации нейрона.
Дальнейшее развитие перекисного фотоокисления липидов, вероятно, затрагивало функции ферментов энергетического метаболизма, нарушалась целостность плазматической мембраны, и клетки гибли также в результате некроза, но отсроченного на 2 часа (ЛгйепБку Л а1. 2001, 2002). Таким образом, слабое ФД воздействие Фотосенса вызывало торможение импульсной активности нейрона, замедленный некроз и затрагивало различные внутриклеточные процессы, включая механизмы внутриклеточной сигнализации, кальциевый гомеостаз и энергетический метаболизм.
ВЫВОДЫ
1. Импульсные ответы механорецепторного нейрона речного рака на фотодинамическое воздействие зависели от концентрации Фотосенса. При концентрации Фотосенса (10"5 М) происходило учащение импульсной активности, заканчивающееся резким блоком генерации потенциалов действия. При меньшей концентрации (10"7 М) импульсация постепенно тормозилась до необратимого прекращения генерации спайков.
2. Фотодинамическое воздействие Фотосенса в концентрации 10"5 М вызывало нарушение проницаемости плазматической мембраны, ингибирование клеточных дегидрогеназ и набухание ядер нейронов в ходе облучения, что приводило к некрозу клетки.
3. При фото динамическом воздействии Фотосенса в концентрации 10"7 М целостность плазматической мембраны и активность дегидрогеназ нейрона сохранялась в течение 1,7 часа после прекращения импульсной активности. При этом происходило сокращение размеров ядер нейронов, однако фрагментации ядер, характерной для апоптоза, не наблюдалось. Нейроны гибли также в результате некроза, но отсроченного как минимум на 2 часа.
4. Ингибирование синтеза АТФ и повышение концентрации кальция в цитозоле являлись причинами фотоиндуцированного торможения импульсной активности. В этих процессах принимали участие такие ферменты внутриклеточной сигнализации, как протеинкиназа С и фосфатидилинозитол-3 киназа.
5. Применение модуляторов, увеличивающих внутриклеточную концентрацию кальция, активаторов протеинкиназы С и ингибиторов продукции АТФ, может повышать эффективность ФДТ, в то время как биоэнергетические субстраты, агенты, снижающие внутриклеточную концентрацию кальция, и ингибиторы РКС и Р1-3 киназы могут защищать
нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от ФД воздействия. Полученные данные следует учитывать при разработке методов, повышающих эффективность фотодинамической терапии опухолей мозга и других онкологических заболеваний.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Узденскому Анатолию Борисовичу, профессору Федоренко Григорию Мефодиевичу и аспиранту физического факультета РГУ Колосову Михаилу Станиславовичу.
Работа поддержана грантами РФФИ № 02-04-48027 и 03-04-06101.
Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:
1. Uzdensky А. В., Zhavoronkova A. A., Kolosov М. S., Bragin D. Е. Photodynamic Effect on Isolated Crayfish Mechanoreceptor Neuron and Glial Cells// - Eur. J. Biophysics, 2000, v. 29, No 4-5, p. 368.
2. Uzdensky A., Zhavoronkova A., Dergacheva O., Kolosov M. and Bfagin D. Responses of the Single Mechanoreceptor Neuron and Surrounding Glial Cells to Photodynamic Killing// Abstr.l3th Int. Congr. Photobiol., San Francisco, 2000, p. 61.
3. Uzdensky A., Zhavoronkova A., Dergacheva O., Kolosov M., Bragin D. Death of Isolated Crayfish Mechanoreceptor Neuron and Surrounding Glial Cells Induced by Photodynamic Impact// VI East Europ. Conf. of Int. Soc. Invertebr. Neurobiol. Moscow, p. 128.
4. Брагин Д.Е. Исследование роли протеинкиназы С в реакции изолированного нейрона на фотодинамическое воздействие// Тр.асп. и соискат. Т. УП, Росгов-на-Дону, РГУ, 2001, стр. 66-67.
5. Uzdensky A.B. , Zhavoronkova A.A., Kolosov M.S., Bragin D.E. PDT-induced death of isolated neuronal and glial cells// Program and abstracts of 29th Annu. Meet, of Amer. Soc. for Photobiology, Chicago, Illinois 2001, p. 18.
6. Uzdensky A.B., Bragin D.E. Vasil'eva LA. Zhavoronkova A.A. Depletion of ATP and cytosolic Ca2+ accelerate PDT-induced firing inhibition and death of isolated nerve cell// Progr. and abstr. 29th Annu. Meet. Am.. Soc. Photobiol., Chicago, 2001, p. 38-39.
7. Uzdensky A.B., Zhavoronkova A.A., Kolosov M.S., Bragin D.E. Death of neuronal and glial cells under photosensitization// 9th Congr. Europ. Soc. Photobiol., Lillehammer, Norway, 2001 / Prog, and book of abstr., pp. 173-174.
8. Uzdensky A B., Bragin D.E. Vasil'eva I.A. Zhavoronkova A.A. Cytosolic calcium and impairment of bioenergetic processes accelerate photodynamic inactivation of isolated nerve cell// 9th Ccngr. Europ. Soc. .Photobiol., Lillehammer, Norway 2001 / Progr. and book of abstr., p. 173.
9. Брагин Д.Е., Дергачева О.Ю., Жаворонкова А А., Узденский А Б Роль биоэнергетических процессов и ионов кальция в фотодинамической инактивации изолированной нервной клетки// Ш съезд фотобиологов России. / Материалы съезда, Воронеж, 2001, с. 21-22.
10. Колосов М.С., Брагин Д.Е., Жаворонкова А. А., Узденский А.Б. Гибель нейронов и глиальных клеток при фотодинамическом действии Фотосенса// Ш съезд фотобиологов России / Материалы съезда, Воронеж, 2001, с. 97-98.
11. Uzdensky А.В. , Zhavoronkova A.A., Kolosov M.S., Bragin D.E. Vasil'eva I.A. Photodynamic effect of Photosens on a single nerve cell// 10th Annu. Int. Laser Physics Workshop Moscow, Russia, 2001 / Book of Abstracts, 163-169.
12. Uzdensky А. В., Zhavoronkova A. A., Kolosov M. S., Bragin D. E. Death of Isolated Neuron and Surrounding Glial Cells Induced by Photogenerated Singlet Oxygen// Advances in Gerontology, Vol. 6,2001, p. 71-72.
13. Uzdensky A.B., Bragin D.E., Kolosov M.S. Role of protein kinase С in photodynamic inactivation of isolated neuron// Progr. and abstr., 30th Annu. Meet. Am. Soc. Photobiol, Quebeck, 2002, p.30.
14. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A.B. On the role of protein kinase C, PI 3-kinase and Ca2+ in PDT effect on isolated neuron// IX Int. Conf. Laser Application in Life Sciences, Conf. Progr. and Digest. Vilnius, 2002, p.9.
15. Братин Д.Е., Колосов M.C., Узденский A.B. О роли внутриклеточных сигнальных и биоэнергетических процессов в фотоинду цированном торможении и инактивации изолированного нейрона// Проблемы нейрокиберн., Т. 2, Ростов-на-Дону, 2002, / под ред. Владимирского Б.М., стр 251-255.
16. Федоренко Г. М., Брагин Д. Е., Колосов М. С, Вассель С., Узденский
A.Б. Динамика ультраструктурных изменений в изолированном механорецепторном нейроне при фотоиндуцированном окислительном стрессе//Проблемы нейрокибернетики, Т. 2, Ростов-на-Дону, 2002, стр287-290.
17. Kadziauskas J., Sadauskaite A., Bragin D., Pimpe E., Kirveliene V., Juodka
B. On Mitochondrial Processes in Apoptotic Photosensitised Cells// Abstno of 12th Europ. Bioenergetics Conf. EBEC, Bordeaux, 2002, p. 152.
18. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A.B. Role of protein kinase С in the response of an isolated neuron to photodynamyc therapy// SPIE Proc., v. 4707, 2002, pp 300-308.
19. Uzdensky A.B., Bragin D.E., Kolosov M.S. and Zhavoronkova A.A. PDT effect of different photosensitizers on a single nerve cell: Electrophysiological and Pharmacological Study// IEEE JSTQE, 2001, v.7, N 6,989-995.
20. Uzdensky A., Bragin D., Kolosov M., Dergacheva O., Fedorenko G., Anna Zhavoronkova Photodynamic inactivation of isolated crayfish mechanoreceptor neuron// Photochemistry and Photobiology 76(4), 2002, pp 431-437.
21. Братин Д.Е. Исследование роли Р13-киназы и РКС в реакции изолированного нейрона на фотодинамическое воздействие//Труды асп. и соискат., Т. VIII, Ростов-на-Дону, РГУ, 2002, стр. 65-66.
22. Bragin D. Е., Kolosov M.S., Uzdensky А.В. Photodynamic inactivation of isolated crayfish neuron requires protein kinase C, PI 3-kinase and Ca2+// J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 70,2,99-105,2003.
23. Kolosov M.S., Bragin D.E., Kohany A., Uzdensky A.B. Photodynamic injury of isolated neuron and satellite glial cells: Morphological study// IEEE JSTQE (В печати).
24. Братин Д. E., Колосов M. С., Узденский А. Б. Участие сигнальных и биоэнергетических процессов в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие// 7я Пущинская школа-конференция молодых ученых: Биология -наука XXI века / Пушино, 2003, стр. 54-55.
25. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A.B. Signaling mechanisms involved in isolated crayfish mechanoreceptor neuron response to photodynamic impact// Proc. VII East Europ. Conf.e of Int. Soc. for Invertebr. Neurobiol., Kaliningrad, 2003, p.34.
26. Uzdensky А. В., Bragin D. E., Kolosov M. S. On the role of some signaling processes in photodynamic inactivation of isolated crayfish neuron// 10th Congr. Europ. Soc. for Photobiol., Vienna, Austria, 2003, p. 96.
27. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A.B. Photodynamic inactivation of isolated crayfish neuron requires protein kinase C, PI 3-kinase and Ca2+// 31th Annu. Meet, of Am. Soc.. Photobiol., Baltimore, 2003, p. 65.
Печать ризограф. Бумага офсетная. Гарниг/ра "Таймс*. Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч. - изд. л. Заказ № 267. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМИ ТОПИ ЦЕНТР" 344006, г. Ростов-на-Лону, Суворова, 19. тел. 47-34-88
i 1 7939
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брагин, Денис Евгеньевич
СОКРАЩЕНИЯ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 .Фотодинамический эффект.
1.2.Механизмы клеточной гибели.
1.3.Гибель клеток при фотодинамическом воздействии.
1 .4.Механизмы фотодинамического воздействия на нейроны.
2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.
2.1 .Химические реактивы.
2.2.Объект исследования.'.
2.3.Регистрация импульсной активности рецептора растяжения.
2.4.Фотодинамическое воздействие.
2.5.Исследование спектральных характеристик Фотосенса.
2.6.Фармакологическая модификация реакции нейрона на фотодинамическое воздействие.
2.7.Активность сукцинатдегидрогеназы.
2.8.Общая дегидрогеназная активность (МТТ-тест).
2.9.Флуоресцентно-микроскопические исследования.
2.9.1. Исследование локализации Фотосенса в рецепторе растяжения речного рака.
2.9.2. Исследование целостности плазматической мембраны нейронов.
2.9.3. Исследование морфологии ядер механорецепторного нейрона.
2.10. Исследование ультраструктурных изменений в механорецепторном нейроне.
2.11. Статистический анализ результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1 .Спектральные характеристики Фотосенса.
3.2.Локализация Фотосенса в механорецепторе речного рака.
3.3.Реакция нейрона на лазерное облучение и темновое действие Фотосенса.
3.4.Электрофизиологическая реакция нейрона на фотосенсибилизацию Фотосенсом.
3.5.06 участии Са2+ в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие.
3.6.06 участии протеинкиназы С в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие.
3.7.06 участии фосфатидилинозитол 3-киназы в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие.
3.8.06 участии биоэнергетических процессов в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие.
3.9.Фотоиндуцированное изменение активности СДГ в рецепторыых нейронах.
3.10. Влияние фотодинамического воздействия на общую активность дегидрогеназ в нейроне (МТТ-тест).
3.1 1. Динамика нарушения проницаемости плазматической мембраны.
3.12. Морфология ядра механорецепторного нейрона после ФД-индуцированного прекращения активности.
3.13. Ультраструктурные изменения рецептора растяжения при фотосенсибилизации Фотосенсом.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.-.
4.1 .Динамика гибели механорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии Фотосенса в концентрации 10° моль/л.
4.2. Динамика гибели механорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии Фотосенса в концентрации 10" моль/л.
ВЫВОДЫ.ПО
БЛАГОДАРНОСТИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование динамики и механизмов гибели механорецепторного нейрона речного рака при фотодинамическом воздействии"
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Фотодинамический эффект - гибель окрашенных фотосенсибилизаторами клеток, при освещении светом в присутствии кислорода. Он лежит в основе фотодинамической терапии, успешно применяемой в онкологии для избирательного разрушения злокачественных опухолей, селективно накапливающих фотосенсибилизаторы (Dougherty et al., 1998), в частности, для лечения некоторых опухолей мозга (Muller, 1990; Kostron, 1996). В экспериментальной нейрофизиологии фотодинамический эффект используется для направленного разрушения определенных нейронов или групп клеток с целью выяснения их роли в функционировании разных нервных центров (Picaud et al., 1990; Yeoman et al., 1994). Однако, при фотодинамической терапии могут повреждаться и здоровые клетки, окружающие опухоль, в частности, периферические нервные элементы (Ji et al., 1992; Hebeda et al., 1998). Поэтому необходимо всестороннее комплексное исследование динамики повреждения нейрона и механизмов его смерти, конечной целью которого было бы максимальное разрушение злокачественных клеток и защита здоровых. Кроме того, детальное исследование влияния фотодинамического воздействия на нервные клетки может дать новую информацию об общебиологических механизмах фотосенсибилизации на клеточном уровне. Однако исследованию фотодинамического эффекта на нервные клетки посвящены пока единичные работы (Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1992, Lilge et al., 2000; Kress et al., 1997), изучающие отдельные стороны реакции нейронов на фотосенсибилизацию и не позволяющие связать наблюдавшиеся изменения биоэлектрических процессов с происходящими при этом метаболическими реакциями.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы провести комплексное электрофизиологическое, биохимическое, цитологическое и фармакологическое исследование влияния фотодинамического воздействия на одиночную нервную клетку. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать динамику инактивации механорецепторного нейрона по показателям биоэлектрической активности при фотодинамическом воздействии сульфированного алюмофталоцианина Фотосенса.
2. Оценить степень повреждения плазматической мембраны, изменения морфологии клеточных ядер и нарушений биоэнергетических процессов в нейронах при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
3. Изучить роль различных биоэнергетических процессов (гликолиз, цикл Кребса, окислительное фосфориллирование) и процессов внутриклеточной сигнализации (ионы Са2+, активность протеинкиназы С и фосфатидилинозитол 3-киназы) в динамике инактивации изолированных нейронов при фотодинамическом воздействии Фотосенса.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведено комплексное электрофизиологическое, биохимическое, цитологическое и фармакологическое исследование влияния фотодинамического воздействия на одиночную нервную клетку. Показано, что фотосснсибилизация может инициировать различные механизмы клеточной гибели в зависимости от интенсивности воздействия. Изучена динамика изменений ядра, митохондрий и плазматической мембраны при фотодинамическом воздействии. Выявлено участие различных биоэнергетических процессов и процессов внутриклеточной сигнализации (ионы кальция, активность протеинкиназы С и фосфатидилинозитол 3-киназы) в фотоинактивации изолированных нейронов. Показано, что фармакологическая модификация разных метаболических и сигнальных процессов повышает или понижает чувствительность нейрона к фотодинамическому воздействию.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Данные о характере реакций нервных клеток, динамике развертывания в них процессов повреждения, механизмов фотоповреждения и фотоиндуцированной гибели нейронов, зависимости эффективности воздействия от концентрации фотосенсибилизатора, а также о влиянии различных модуляторов на реакцию нервной клетки к ФД воздействию могут учитываться при разработке методов фотодинамической терапии опухолей мозга и других онкологических заболеваний. Применяя модуляторы, повышающие внутриклеточную концентрацию ионов Са2+, активаторы протеинкиназы С или ингибиторы продукции АТФ можно усилить фотодинамическое повреждение опухолевых тканей. С другой стороны, применяя биоэнергетические субстраты, ингибиторы ' протеинкиназы С, фосфатидилинозитол 3-киназы или агенты, снижающие внутриклеточную
2+ концентрацию ионов Са , можно защитить здоровые клетки, окружающие патологическую ткань при фотодинамичсской терапии. Материалы работы используются в учебном процессе при чтении курса лекций по фотобиологии на кафедре биофизики физического факультета РГУ. Результаты работы использованы при выполнении грантов РФФИ № 02-04-48027 и 03-04-06101.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Фотодинамическое воздействие вызывает качественно различные импульсные ответы механорецепторного нейрона речного рака в зависимости от концентрации фотосенсибилизатора. При высокой концентрации сульфированного аюмофталоцианина Фотосенса (10° моль/л) происходит учащение импульсной активности, заканчивающееся резким блоком генерации потенциалов действия. Фотосенсибилизация нейрона с меньшей концентрацией Фотосенса (10" моль/л) вызывает торможение импульсной активности с последующим необратимым прекращением импульсации.
2. При фотодинамическом воздействии высокой концентрации Фотосенса (Ю-3 мол/л) происходит повреждение плазматической-мембраны и биоэнергетических процессов в процессе облучения, что приводит к некрозу мехапорецепторного нейрона. При меньшей концентрации Фотосенса (10~7 моль/л) активность дегидрогеназ и целостность плазматической мембраны сохраняются в течение первых 2 часов после функциональной инактивации нейрона, но затем также развивается некроз.
3. В фотодинамической инактивации нейрона участвуют ионы Са2+, внутриклеточная сигнализация (протеинкиназа С и фосфатидилинозитол 3-киназа) и биоэнергетические процессы. Применение модуляторов, увеличивающих концентрацию ионов Са2+, активаторов протеинкиназы С и ингибиторов продукции АТФ может повышать эффективность ФДТ, в то время как применение биоэнергетических субстратов, агентов, снижающих концентрацию ионов Са2+, и ингибиторов протеинкиназы С и PI-3 киназы может защищать нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от фотодинамического воздействия.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на 17 международных конференциях; 3rd European Biophysical Congress "Eurobiophysics 2000" (Munich), VI и VII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Moscow-Pushchino, 2000, Kaliningrad -Svetlogorsk -Otradnoe, 2003), III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), 29-31th Annual Meeting American Society for Photobiology (Chicago, 2001, Quebec, 2002, Baltimore, 2003), 9- 10th Congress of European Society for Photobiology (Lillehammer, 2001, Vienna, 2003), 10lh Annual International Laser Physics Workshop (Moscow, 2001), Saratov Fall Meeting -SFM'01-02 International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine III-IV (Saratov, 2001-2002), IX International Conference of Laser Applications in the Life Sciences (Vilnius, 2002), Юбилейной международной конференции по нейрокибернетике им А.Б. Когана (Ростов-на-Дону, 2002), 12th European Bioenergetic Conference EBEC (Bordeaux, 2002), 7ой Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в реферируемых журналах, 9 статей в сборниках и 14 тезисов по материалам конференций.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Брагин, Денис Евгеньевич
1. Импульсные ответы механорецепторного нейрона речного рака на фотодинамическое воздействие зависели от концентрации Фотосенса. При высокой концентрации Фотосеиса (10^^ моль/л), происходило учащение импульсной активности, заканчивающееся резким блоком генерации потенциалов действия. При меньшей концентрации (10' моль/л) импульсация постепенно тормозилась до необратимого прекращения генерации спайков.2. Фогодимамическое воздействие Фотосеиса в когщентрации 10'^ моль/л вьгзывало нарушение проницаемости плазматической мембраны, ингибирование клеточных дегидрогеназ и набухание ядер нейронов в ходе облучения, что приводило к некрозу клетки.3. При фотодинамическом воздействии Фотосегюа в концентрации
10" моль/л целостность плазматической мембраны и активность дегидрогеназ нейрона сохранялась в течение 1,7 часа после прекращения импульсной активности. При этом происходило сокращение размеров ядер нейронов, однако фрагме1ггации ядер, характерной для апопгоза, не наблюдалось. Нейроны гибли также в резу;п>га1е некроза, по отсроченного на, как минимум, 2 часа.4. Ингибирование синтеза АТФ и повышение концентрации кaJплдия в цитозоле являлись причинами фотоиндуцированного торможения импульсной активности. В этих процессах принимали участие такие ферменты внутриклеточной сигнализации как протеинкиназа С и фосфатидилинози10л-3 киназа.5. Применение модуляторов, увеличивающих внутриклеточную концентрацию кальция, активаторов протеиикиназы С и ингибиторов продукции АТФ может noBi,iuiaTb эффективность ФДТ, в то время как биоэнергетические субстраты, агенты, снижающие внутриклеточную концентрацию кальция, и ингибиторы РКС и PI-3 киназы могут защищать нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от ФД воздействия.Полученные данные следует учитывать при разработке методов, повышающих эффективность фотодинамической терапии опухолей мозга и других онкологических заболеваний.БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителе:) - Узденскому Анатолию Борисовичу, профессору Федоренко Григорию Мефодиевичу и аспиранту физического факу.чьгега РГУ Колосову Михаилу С'1анислаРА)вичу.Работа поддержана ]-ра1тгами РФФИ № 02-04-48027 и 03-04-061ОГ
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брагин, Денис Евгеньевич, Воронеж
1. Акоев Г.Н. Функциональная организация механорсцепторов / Г.Н. Акоев. -Л.: -Наука, 1985.
2. Барышников A.IO. Программированная клеточная смерть (апоптоз) / А.Ю.Барышников, Ю.В. Шишкин // Рос. Онк. Журн. -1996. -№ 1. 58-61.
3. Болдырев А.А. Устойчивость к окислению Ыа^,К^-АТФ-азы мозга / А.А. Болдырев, Е.А. Волынская, Е.Г. Курелла, О.В. Тюлина // Физико-химические принципы функционирования белков и их комплексов / изд. ВГУ. -Воронеж, 1995. 27-29.
4. Бурмистров. Электрическая активность нейронов речного рака при витальной окраске мегиленовым синим / Ю.М. Бурмистров, Р.Г. Людковская, Ж.П. Шураиова// Биофизика. -1969. -Т. 14. -С. 495-501.
5. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высшая школа. -1989. -199 с.
6. Владимиров К).А.Свободные радикалы в первичных фотобиологических процессах // Биол. Мембраны. -1998. -Т. 15, № 5. -С. 517-529.
7. Водолазкин Д.И. Ингибирование (Na^-K^)- и Са ^-АТФ-аз синим светом лазера / Д.И. Водолазкин, Юзюк, А.Б. Уздснский // Физико-химические принципы функционирования белков и их комплексов / изд. ВГУ. -Воронеж, 1998. -С. 57-60. 1 13
8. Досои F. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс -М.; Мир, 1991. -543 с.
9. Иванов А.В. Фотодинамическая терапия опухолей: пути повышения эффективности /А.В. Иванов// Медицинская физика. -1996. -№3. -С. 55-60,
10. Ильинский о.Б. Физиология сенсорных систем / О.Б. Ильинский // Часть 111. Физиология механорецепторов /Л.: Наука, 1975 -560 с.
11. Ковальский Г.Б. Количественная гистохимия дегидрогеназ. Введение в количественную гистохимию ферменюв / Г.Б. Ковальский; Под ред. Журавлевой Т. Б., Прочухановой Р. А. М.: Медицина, 1978. -с. 58-114.
12. Кондратиова М.Н. Молекулярные механизмы и регуляция энергетического метаболизма / М.Н. Копдрапюва; Под ред. Азарашвили Т.С, Пущино; НДБИ АН СССР, 1987 -С, 140-154,
13. KoTiCB С, В, Введение в молекулярную фотобиологию / В, Конев, И.Д, Волотовский -Минск: II, и Т. 1971.
14. Лагода Т.С, Оптимизация фотодинамической терапии саркомы Ml с использованием Фотосенса / ТС, Лагода, М,А. Каплан, Я.В. Кривошсев, Л.П. Жаворонков и М.Б. Бокова // Вопросы онкологии. -2000. -46 (3). C-327-33I.
15. Лойда 3,, Госсрау Р,, Шиблер Т, Гистохимия ферментов / 3. Лойда, Р. Госсрау, Т. ГПиблер -М.: 1982, 21 1-215.
16. Ленинджер А, Биохимия, Молекулярные основы структуры и функций KJic'iKH / А, Ленинджер -М.: Мир, 1985.-Г. 1-3.
17. Майоров В.Н. 11рижизнетн4ая микроск-опия нейрона / В.Н. Майоров -Л.: Наука, 1978 с.
18. Машанский В.Ф. Гистохимическое и электронно- микроскопическое изучение нейронно-глиальных отношений в рсдепторе растяжения речного рака/ В.Ф, Машанский, Л. Загускин, Г'.М. Федоренко // Цитология. -1974. Т. 16, -С.770-773.
19. Новиков B.C. Программированная клеточная 1ибель / B.C. Новиков -С.-Пб.: Наука, 1996.
20. Посудин Ю.И. Лазерная фотобиология / Ю.И. Посудин -Л.; Наука, 1989.
21. Ташмухамедов Б.А. Активный транспорт ионов в биологических мембранах животных клеток / Б.А. Ташмухамедов // Биология мембран; Под.ред, П.В. Сергеева/М.: Медипина, 1973 67-74.
22. Уздс!1ский А.Б. Влияние лазерного микрооблучения ' на изолированный механоренепторгн.1Й нейрон рака / А.Б. Узденский // Биол. науки. 1980. № 3 . 20-28.
23. Узденский А.Б. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в изолированном механорецепторном нейроне рака сфокусированным синим лазерным излучением /А.Б. Узденский //Цитология. -1987. -Т.29. -С.1392-7.
24. Узденский А.Б. Исследование фотодинамического действия новых фо'1"Осенсибилизаторов на изолированную нервную клетку / А.Б. Узденский, А.А. Жаворонкова, А.Ф. Миронов, Г. Кузьмин // Изв. РАН. сер. биол. -2000, № 2. -С. 230-238.
25. Уманский СР . Апоптоз; молекулярш_5!с и клеточные механизмы / С Р . Уманский//Мол. Биол-1996.-30.-3. 487-501,
26. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма / Л. Уэбб -М.: Мир, 1966. -862 с.
27. Федоренко Г. М., Узденский А. Б. Ультраструктурные изменения в изолированном механорецепторном нейроне, вызванные микрооблучением гелий-кадмиевым лазером / Г.М. Федоренко, А.Б. Узденский // Цитология -1986.-№28. -С. 512-518.
28. Хансон К. П. Аноигоз: современное состояние проблемы / К,П. Хансон // Изв. АН. -Сер.. биол. -1998. -№2, -С. 134-141.
29. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран / Б.И. Ходоров // М.; -Наука. 1975. -406 с.
30. Черницкий Е.А. Сенсибилизируемые фогоповреждения клеток / Н.А. Черницкий // Успехи современной биологии -1986. -вып. 1. -т. 101. 100-112.
31. Agrawal М. L. et al. Photodynannc therapy induces apoptosis in 1.5178Y mouse lymphoma cells // Cancer Res. 1991. -51, -P. 5993-5996.
32. Ahmad N, Feyes DK, Agarwal R, Mukhtar M. Photodynamic therapy results in induction of WAF1/C1P1/P21 leading to cell cycle arrest and apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998. -9; 95(12). P. 6977-6982.
33. Albina J.P., Reichner J.S. Role of nitric oxide m mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis // Cancer Metastasis Rev. 1998. -17(1). -P. 39-53.
34. Alexandrovicz J.С Muscle receptor organs in the abdomen of Homarus vulgaris and Palinurus vulgaris // Quart. J. Micr. Sci. "1951. -92 (2). -P. 163-199.
35. Al-Laith M., Matthews E.K. Calcium-dependent photodynamic action of di- and tetrasulphonated aluminium phthalocyamne on normal and tumor-derived rat pancreatic exocrine cells // Br. J. Cancer. -1994. -70. -P . 893-899.
36. Bal-Price A., Brown G.C. Nitric-oxidc-induced necrosis and apoptosis in PC12 cells mediated by mitochondria // J. Neurochem. 2000. -75(4). P. 1455-64.
37. Barker S.A., Lujan D., Wilson B.S. Multiple roles for PI 3-kinase in the regulation of PLC-y activity and Ca ^ mobilization in antigen-stimulated mast cells Hi. Leukoc. Biol. - 1999. -^65. -P . 321-329.
38. Bartschat DK., Rhodes ТЕ. PKC modulates Ca channels in isolated presynaptic nerve terminals of rat hippocampus // J. Neurochem. -1995. -64. -P. 2064-2072.
39. Beck T.P., Kirsh E.J., Chmura S.J., Kovar D.A., Chung Т., Rinker- Schaeffer C.W., Stadler W.M. In vitro evaluation of calphostin С as a novel agent for photodynaimc therapy of bladder cancer // Urology. -1999. 54. T\ 573-577.
40. Bcltran В., Mathur A., Duchcn M.R..^ :riisalimskY J.D., Moncada S. The effect of nitric oxide on cell respiration: A key to understanding its role in cell survival or death // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -2000. -19;97(26). -P.14602-7.
41. Ben-Hur E., Dubbclmann T.M. Cytoplasmic free calcium as a trigger mechanism m the response of cells to photoscnsitization II Photochem. Photobiol. -1993.-58. -P. 890-894.
42. Berg K. and Moan J. Lysosomes as photochemical targets // Int. J. Cancer. -1994. -59. R 814-822.
43. Berg K. and Moan J. Lysosomes and microtubulesas tcU'gets for photochemotherapy of cancer// Photocem. Photobiol, -1997. -65. -P . 403-409.
44. Bragm D.E., Kolosov M.S., Uzdensky Л.В. Role of protein kinase С in the response of an isolated neuron to photodynamic therapy // Proc. SPIE. -2002.-V. 4707,-P. 300-308.
45. Bragin D.E., Kolosov M.S., Uzdensky A. B. Photodynamic inactjvation of isolated crayfish neuron requires protein kinase C, PI 3-kinase and Ca^V/J.Photochem.Photobiol. B. Photobiol. -2003. -70. 2. -P . 99-105. 1 17
46. Brana С, Bcnham С , and Sundstrom L. A method for characterising cell death m vitro by combining propidium iodide s ta in ing with immunohistochemistry // Brain Res.Brain Res.Protoc. -2002. -10 (2). - P. 1 09-114.
47. Brunn G.J. et al. Direct inhibition of the signaling functions of the maiTiinalian target of rapamycin by the phosphoinositide 3-kinase inhibitors, wortmannin and LY294002 // EMBO J. -1996. -15. P. 5256-5267.
48. Carafoli E. Intracellular calcunii homeostasis//Ann. Rev. Biochem. - 1987.-56. P. 395-433.
49. Carre V, Jayat C, Granet R, Krausz P, Guilloton M. Chronology/ of the apoptotic events induced in the K562 cell line by photodynamic t rea tment with hematoporphyrin and monoglucosylporphyrin // Photochem Photobiol. —1999. -69(1).-P. 55-60,
50. Chao D.T. and Korsmeyer S.J, BCL-2 family: regulators of cell death // Annu Rev Immunol. -1998, 16, -P, 395-419,
51. Chatterjee S, R,, Srivastava T. S.,. Kamat J. P, and Devasagayam T. P. 1.ipid peroxidation induced by a novel porphyrin plus light in isolated mitochondria: possible implications m photodynamic therapy // Mol.Cell. Biochem. -1997.-166 (1-2).-P, 25-33.
52. Daniel M.D, and Hill J,S, A history of photodynamic the rapy // Aust. N.Z.J.Surg. -1991. - 61. -P. 340-348
53. Dellmger M. Apoptosis or necrosis following Photofrin photosensitization: influence of the incubation protocol // Photochem. Photobiol. -1997. -66.-P, 479-483,
54. Deshpande SS, Angkeow F^ , Huang J, Ozaki M, Irani K. Racl inhibits TNF-alpha-induced endothelial cell apoptosis: dual regulation by reactive oxygen species//FASEB J.-2000/-14(12). -P. 1705-14.
55. Dougherty Т., Gomer C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy // J. Natl. Cancer Inst. -1998.-90. -P. 889-903.
56. Duchen MR. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death// J. Physiol. -2000. -15;529. - P. 57-68.
57. Hvensen J.F. and Moan J. Photodynamic action and chromosomal damage: a comparison of haematoporphyrin derivative (HpD) and light with X-irradiation // Br. J. Cancer. -1982. -45(3). -P. 456-65.
58. Eyzaguirre, C. and Kuffler S.W. Processes of e.xcitation in the dendrites and in the soma of single isolated sensory nerve cells of lobster and crayfish // J. Gen. Physiol. -1955. 39. -P. 87-121.
59. Fedorenko, G.M., Gusatinsky, V.N., Kaminsky, 1.1., Kondratyeva, 1..A. and V.M. Kor/.ak, Changing of an isolated neuron ultrastructure during a prolonged impact of mediator// Neuroreport. -1995. 6. -P. 2325-2332.
60. Florey E., Florey I;:. Microanatomy of the abdominal stretch receptors of the crayfiish (Astacus fluviatilis, leptodactylis) // J.Gen.Physiol. 1955. -39 (1). -P. 69-85.
61. Frandsen A, Schousboe A. Dantrolene prevents glutamate cytotoxicity and Ca2+ release from intracellular stores m cultured cerebral cortical neurons // J. Neurochem. -1991.-56.-P. 1075-8. НУ
62. Fiikuda К, Yamamoto М. Acquisition of resistance to apoptosis and necrosis by Bcl-xL over-expression in rat hepatoma McA-RH8994 cells.// J Gastroenterol Hepatol. -1999. -14(7). -P . 682-90.
63. Geschcr. Modulators of signal transduction as cancer chemotherapeutic agents—novel mechanisms and toxicities // Toxicol. Lett. -1995. -82 . -P . 159-165.
64. Giacobini E.E., Chemical Studies of Individual Neurons / In: Neurosci. Res. Vol. II. Invertebrate nerve cell. // New York. Acad. Press. -1969. -P. 111-202.
65. Gibson SL, Hilf R. Photosensitization of mitochondrial cytochrome С oxidase by hematoporphyrin derivative and related porphyrins m Vitro and in Vivo // Cancer.• Res. 1983. 43. --P. 4 1 91 -4 197.
66. Girotti A. Pliotodynannc lipid peroxidation m biological systems // Photochem. Photobiol. -1990. - 5 1 . -P . 497-509.
67. Giulivi С ., Sarcansky M., Rosenfeld E., Boveris A. The photodynamic effckt of rose bengal on proteins of the mitochondrial inner membrane// Photochemistry and Fhotobiologi-i. 1990. -Vol.52. P. 754-751.
68. Gottlieb R.A. Mitochondria: execution central // FEBS Lett. -2000. - 29;482(l-2). P. 6-12.
69. Granville DJ, Carthy CM, Jiang II, Shore GC, McManus BM, Hunt DW. Rapid cytochrome с release, activation ofcaspases 3, 6, 7 and 8 followed by Bap31 cleavage in HeLa cells treated with photodynamic therapy // FEBS Lett. -1998.-16;437(l-2). P. 5-10.
70. Granville DJ, Jiang H, An MT, Levy JG, McManus BM, Hunt DV/. Bcl-2 overexpression blocks caspase activation and downstream apoptotic events instigated by photodynamic therapy // Br. J. Cancer. -1999. - 79(1). -P. 95-100.
71. Grapengiesser S., Encson M. Pain caused by photodynamic therapy of skin cancer// Clin Exp Dermatol. -2002. -27. -P. 493-497. !20
72. Haunstetter Д., Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease // Circ. Res. -1998. -15;82(1 1). -P . 1111-29.
73. He Jin, Olemick N. L. Cell death mechanisnuis vary with photodynamic therapy dose and photosensiti/.er // SPIE -1994. 237 1. P. 92-96.
74. He J, Whitacre CM, Xue LY, Berger NA, Oleinick NL. Protease activation and cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an integral part of apoptosis in response to photodynamic treatment // Cancer Res. - 1998. -1 ;58(5). P. 940-6.
75. Henderson B.W., Owczarczak В., Sweeny J., Gessner T. Effects of photodynamic treatment of platelets or endotcliat cells in vitro on platelet aggregation // Pholchem Photobiol,-1992.-56. P. 5 13-521.
76. Hortelano S, Dallaporta B, Zamzami N, Hirsch T, Susin SA, Marzo 1, Bosca L, Kroemer G. Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition// FEBS Lett. -1997. -30;410(2-3). -P . 373-7.
77. Housey GM.^ Johnson MD, Hsiao WL, O'Brian С A, Wcinstein IB. Structural and functional studies of protein kinase С // Adv. Exp. Med. Biol. -1988. -234. -P. 127-40.
78. Mubmert, A. Hermann, K. IJberriegler, B. Krammer. Role of calcium in photodynamically induced cell damage of human fibroblasts // Photochem. Photobiol. -1996. -64. -P . 211-215.
79. Jiang F., Cho K. K., Mikkelse Т., Tong L., Lew Y. S., Flochbaum N., Shargorodsky J., and Chop M. 'famoxifen increases photodynamic therapeutic response of IJ87 and U251n human glioma cells // J.Neurooncol. -2002.-56 (1). -P . 51-58,
80. Joyal J.L., Burks D.J., Pons S., Matter W.F., Vlahos C.J., White M.F., Sacks 13.B. Calmodulin activates phosphatidyhnositol .3-kinasc // J. Biol. Chem. -1997. 272. -28283-28186.
81. Joshi P.G., Josnik K., Mishra S., and NJoshi .B. Ca^' influx induced by photodynamic action in human cerebral glioma (U87 MG) cells: possible involvement of a calcium channel // Photochem. Photobiol. 1994. -60. -P.244-248.
82. Kabuyama Y., Flamaya M., Flomma Y. Wavelength specific activation of PI 3-kinase by UVB irradiation// FEBS Lett. -1998. -441. -P. 297-301.
83. Kagan V.L., Fabisiak J.P. , Shvedova A.A. , Tyurina Y.Y., Tyurin V.A. , Schor N.F. , Kawai K. Oxidative signaling pathway for externalization of plasma membrane phosphatidylserine during apoptosis -// FEBS Lett. -2000. -l4;477(l-2).-P.1-7.
84. Kerr J.F.R. Shrinkage necrosis; a distinct mode of cellular death // J. Pathol. 1971. -105. 1. -P. 13-20.
85. Kerr J.F.R. et al. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-rangemg ipmhcations in tissue kinetics // Br. J. Cancer -1972. -26. 1. -P. 257-293.
86. Kessel D, Luo Y, Deng Y, Chang CK, The role of subcellular localization in initiation of apoptosis by photodynaniic therapy // Photochem Photobiol. -1997. -65C3). -P. 422-6.
87. Kessel D., IAIO Y. Photodynaniic therapy: a mitochondrial inducer of apoptosis // Cell Death Differ. -1999. -6. -P. 28-35.
88. Kidd V.J. Proteolytic activities that mediate apoptosis // Anna Rev Physiol. -1998. -60. -P. 533-73.
89. Kirvelienc V, Prasmickaite F, Kad/iauskas J, Bonentt R, I^jelal В D, Juodka B. Post-exposure processes in Temoporfin-photosensitized cells in vitro: reliance on energy metabolism // Photcem. Photobiol. B: biology. 1997. 41. -P. 173-180.
90. Kostron FF, Obwegesert A., Jakober R. Photodynaniic therapy m neurosurgery//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. -1996. -36. P. 157-168.
91. Kowaltowski A.J., Castilho R.F., Vercesi A.F. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress // FEBS Lett. -2001. -20;495(l-2). -P . 12-5.
92. Kress M., Petersen M., Reech P.W. Methylene blue induces ongoing activity in rat cutaneous primary affercnts and depolarization of DRG neurons via photosensitive mechanism // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. -1997. -V.356.№5. P.619-25.
93. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis // Nat Med. -1997. -3(6), -P. 614-20.
94. Kroemer G., Dallaporta L ,^ Rcsclic-Fligon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis // Annu. Rev. Physiol. -1998. -60. -P. 619-42.
95. Kvam E, Stokke T, Moan J. The lengths of DNA fragments light- induced in the presence of a photosensitizer localized at the nuclear membrane of human cells// Biochim. Biophys. Acta. -1990. -24;1049(1). -P. 33-7.
96. Latt SA, Stetten G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazolc dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis // J. Histochem. Cytochem. 1 976. -24( 1). P. 24-33.
97. Luo Yu, and Kesscl D, Initiation of apoptosis versus necrosis by photodynamic therapy with chloroahmiinum phthalocyanine // Photochem, Photobiol. - 1996, -63. -P . 528-534.
98. Malham GM, Thomsen RJ, Finlay GJ, Baguley ВС. Subcellular distribution and photocytotoxicity of aluminium phthalocyanincs and haematoporphyrin derivative m cultured human melanoma cells // Br. J. Neurosurg. -1996. -10.-P. 51-57.
99. Mathews F.S., Cunane L. and Durley R.C. Flavin electron transfer proteins // Sribcell. Biochem. -2000. 35. -P. 29-72.
100. McPherson P.S. et al. The brain ryanodyne receptor: a caffeine- sensitive calcium release channel // Neuron. -1991. 7. -P. 17-25.
101. Meech, R.W. Calcium-dependent potassium activation in nervous tissues //Annu. Rev. Biophys. Bioeng. -1978. -7. -P. 1-18.
102. Moan J. and Christensen T. Photodynamic effects on human cells exposed to light in the presence ofhematoporphyrin. Localization of the active dye //Cancer Lett. 1981.-11(3). -P. 209-14.
103. Moan J., Berg K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen // Photochem Photobiol. -1991. -53(4). -P. 549-53.
104. Moan J, and Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental research. Photochem. Photobiol. -1992. -55. P. 931-948.
105. Modika-Napolitano J. S., Jogal J. L., Ara G., Oseroff A.R., Apnlle J. R. Mitochondrial toxicity of cationic photoscnsili/crs for piiotochemotherapy // Photohem. Photobiol. -1990. - 5 1 . -P. 497-509.
106. Moor A.C.H. Signalling pathways in cell death and survival after photodynamic therapy//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000. -57. -P. 1-13.
107. Muller P.J. and Wilson B.C. Photodynamic therapy of malignant brain tumors // Can. J. Neurol. Sci. -1990. -17. -P. 193-198.
108. Murant R.S., Gibson S.L., Hilf R. Photosensitizing effect of Photofrin II on the site-selected mitochondrial enzymes monoamine oxidase and adenylate cyclase // Cancer Res. -1987 -47. -P. 4323-4328.
109. Newton A.С and Johnson J.E. Protein kinase C: a paradigm for regulation of protein function by two membrane-targeting modules // Biochem. Biophys. Acta. -1998. -1376. P. 155-172.
110. Nikotera P., Bellomo G., Orrenuis S. J he role of calcium m cell killing // Chem. Res. Toxicol. -1990. - 3 . P. 484-494.
111. Nicotera P. and l.eisl M. Fnergy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells // Cell Death. Differ. -1997, 4. -P . 435-442.
112. Nicotera P, Leist M, Single B, Volbracht С Execution of apoptosis: converging or diverging pathways'^ // Biol Chem. -1999. -380(9). -P. 1035-40.
113. Noodt BB, Kvam E, Steen HB, Moan J. Primary DNA damage, HPRT mutation and cell inactivation photoinduced with various sensitizers in V79 cells // Photochem Photobiol. -1993. -58(4). -P. 541-7.
114. Noodt BB, Berg K, Stokke T, Peng Q, Nesland JM. Different apoptotic pathways are induced from various intracellular sites by tetraphenylpoфhyrins and light // Br J Cancer. -1999. -79( 1). -P. 72-81.
115. Norbery C , Nurse P. Animal cell cycles and their control // Annu. Rev. Biochem. -1992. 6. -P. 441-470.
116. Oberdanncr C.B, Kiesslich Т., Krammer В., and Plaetzer K. Glucose is required to maintain high ATP-levels for the energy-utilizing steps during PDT-mduced apoptosis // Photochem.Photobiol. -2002. -76 (6), - P. 695-703.
117. Olemick N., Varnes M.E., Clay M.E., and MMenegay.J. Interaction of phthalocyanine photodynamic treatment with ionophorcs and lysosomotropic agents // Proc. SPIE -1991. -1426. -P, 235-243.
118. Oleinick N.L., Evans Н.Ы. The pholobiology of photodynamic therapy: cellular targets and mechanisms // Radiat. Res. - 1998. - 1 50. -P. 146-156.
119. Olemick N.L., Morns R.L., Belichenko I. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how // Photochem. Photobiol. Sci. -2002. - 1 . -P. 1 -21.
120. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours // J Photochem Photobiol B. Biol, -1997. -39. -P. 1-18.
121. Packer L., Quintanilha AT., and Mehlhorn R.G. Free radical generation and damage of membranes b\' visible hght // Membranes in Tumor Growth. / Elsevier Biomedical Press. N. Y. -1982. -P.453-459.
122. Parness J, Palnikar SS. Identification of dantrolene binding sites in porcine skeletal muscle//J. Biol. Chem. -1995. -270. -P. 18465-18472.
123. Picaud S., Wunderer H., Franceschini N. Dye-induced photopermeabdization and photodegeneration; a lesion technique useful for neuronal tracing//.!. Neurosci. Mediods. 1990. 33. P. 101-112.
124. Plaetzer K., Kiesslich Т., Krammer В., and Hammerl P. Characterization of the cell death modes and the associated changes in cellular energy supply in response to AlPcS4-PDT // Photochem.Photobiol.Sci. -2002. -1 (3). -P. 172-177.
125. Polack I.F., Kavvecki S. The effect of calphostin C, a potent photodependent protein kinase С inhibitor, on the proliferation of glioma cells m vitro//J. Neurooncol. -1997. - 31 . -P. 255-266.
126. Pooler .IP. Photodynamic alteration of sodium current in lobster axon // Gen. Physiol. -1972. 60. -P. 367-87.
127. Pozzan T, Ruzutto R, Volpe P, Meldolessi .f Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores // Physiol. Rev. -1994. -V.74. P. 595-636.
128. Robb-Gaspers L.D., Rutter G.A., Burnett P., Hajnoczky G,, Denton R. M,, Thomas A.P. Coupling between cytosolic and mitochondrial calcium oscillations; role in the regulation of hepatic metabolism // Bioch. Biophys. Acta. -1998.-1366.-P.17-32.
129. Sahara S, Aoto M, Eguchi Y, Imamoto N, Yoneda Y, Tsujimoto Y. Acinus IS a caspasc-3-activated protem required For apoptotic chromatin condensation//Nature. -1999. -9;401(6749). -P. 168-73.
130. Salet C, Moreno G. Photosensitization of mitochondria. Molecular and cellular aspects // J. Photochem. and Photobiol. B. Biology. -1990. -V. 5. -P. 133-150.
131. Salet C., Moreno G. Primary effects oFphoto-induced singlet oxygen on mitochondrial bioenergetics // Trends in Photochem. and Photobiol. -1994. - 3 . -P. 169-174.
132. Salet C., Moreno G. and Ricchelli ¥. LifFect oF photodynamic action on respiration in nonphosphorylating mitochondria // Arch. Biochem. Biophys. -1998.-358.-P. 257-263.
133. Sastry PS, Kalluri Suba Rao Apoptosis and the Nervous System // Journal oFNeurochemistry. -2000. -Vol 74. № 1. -P. 1-20.
134. Schneckenburger H, Sailer R, Gschwend M.H. et al. Uptake, subcellular localization , and phototoxicity oF photosensitizing porphyrins // Proc. SPIE.-1996.-V.2625. -P.96.
135. Seki Т., Yokoshiki H., Sunagawa M., Nakamura M. and Sperelakis N. Angiotensin 11 stimulation of Ca^^-channel current in vascular smooth muscle cells is inhibited by lavendustin-A and LY 294002 // Pflugers Arch. -1999. -437. -P. 317-323.
136. Sharma RK, Jain V. Effects of 2-deoxy-D-glucose on the photosensitization-induced bioenergetic changes m Saccharomyces cerevisiae as observed by in vivo NMR spectroscopy // Ind. J. Biochem Biophys. -1994. -31(1). -P. 36-42. 12S
137. Shimoke К., Yamagishi S., Yamada M., Ikeuchi Т., Hatanaka H. Inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase activity elevates c-Jun N-terminal kinase in apoptosis of cultured cerebellar granule neurons // Brain Res. Dev. -1999. -112.-P. 245-253.
138. Sienkiewicz A., Graczyk A. Photodynamic therapy - photochemical and photobiological principles // Biocybernetics and biomedical engineering. -1991.-11. -P. 23-36.
139. Specht ICG. and Rogers М.Л. Plasma membrane depolarization and calcium influx during cell injury by photodynamic action // Biochem. Biophys. Acta. -1991. 1070. -P. 60-68.
140. Starkus JG, Rayncr MD, Fleig A, Ruben PC. Fast and slow inactivation of sodium channels: effects of photodynamic modification by methylene blue.// Biophys J. -1993. -65(2). d^ 715-26.
141. Stranadko E.F., Skobelkm O.K., Litvm G.D., Astrakhankina G.A. Photodynamic therapy of human malignant tumours: a comparative study between photohem and tetrasulfonated aluminum phthalocyanmc /7 Proc. SPIE. -1996. -V.2625.-P.440-445,
142. Tas J, Westerneng G. Fundamental aspects of the interaction of propidium diiodidc with nuclei acids studied in a model system of polyacrylamide films//J. Ilistochem. Cytochem. - 1981. -29(8). -P . 929-36.
143. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease//Science. -1995.-267. -P. 1456-1462.
144. Treiman M. et al. A tool commg of age: thapsigaigm as an inhibitor of sarco-cndopiasmatic reticulum C\r'-ATPases /7 'I'reuds Pharm. Sci. -1998. - 19. -P. 131-135.
145. Trump B.F., Berezesky I.K. The role of cytosolic calcium in cell injury, necrosis and apoptosis // Curr. Opin. Cell. Biol. 1992. -4. P. 227-232.
146. Trump B.F., and Berezesky I.K. The reactions of cells to lethal injury: oncosis and necrosis - the role of calcium // In When cells die. A comprehensive evaluation of apoptosis and programmed cell death / Willey-Liss. N. Y. -1998. -P. 57-96,
147. Uzdensky A. B. Laser microirradiation of single nerve cell // Proc. SPIE-1993. -1882. -P. 254-267. 1 л о
148. Uzdensky ЛВ, Kutko OYu, Pasikova NV. Single crayfish neuron as a new test-object for search and examination of PDT photosensitizers // Proc. SPIE. -1996.-2625. P. 512-8.
149. Uzdensky Л.В. Bioelectric changes in single neuron imder photodynamic effect; comparison of different photosensitizers // IEEE J. of Selected Topics in Quantum Electronics. -1996, -V.2. -P. 984-7.
150. Uzdensky A.B. Photodynamic nerve cell killing: dynamics of electrophysiological responses and photosensitizers comparison // Proc. SPIE. -1997. -V. 3191.-P. 1.30-139.
151. Uzdensky AB, Savransky VV, Single neuron response to pulse- periodic laser microirradiation. Action spectra, and two-photon effect // J. Photochem. Photobiol. B; Biol. -1997. -39. -P. 224-8.
152. Uzdensky A.B. and Mironov A.k. l^hotodynamic inactivation of the single crayfish nerve cell; dynamics of electrophysiological responses and comparison of photosensitizers // Easers Med. Sci. -1999, -14. -P. 185-195.
153. Uzdensky Anatoly, Bragin Denis, Kolosov Michail, Dergacheva Olga, Fedorenko Grigory, Zhavoronkova Anna, Photodynamic inactivation of isolated crayfish meehanoreceptor neuron // Photochemistry and Photobiology. -2002. -76(4).-P. 431-437. 13 1
154. Valcnzeno D.P. and Tarr M. Membrane photomodification and its use to study reactive oxygen effects // In Photochemistry and Photophysics / CRC Press. Boca Raton. -1991. -Vol. Vlll. P.137-191.
155. Varshney R., Jain V. Effects of calcium on phthalocyanme sensitized photohemolysis// Indian J. bxp. Biol. -1998. -36. -P. 152-156.
156. Wang-Bennett LT, Liebl DJ, Bennett GN. Targeted neuronal lesion induced by photosensitizing dyes // Brain. Res. -1990. -26;534( 1-2). -P. 122-8.
157. Wiersma C.A.G., Furshpan E., Florey E. ' Physiological and pharmacological observations on muscle organ о Г the crayfish, Cambarus clarkii Girard.//J. Exp. Biol. -1953. -V.30. -P. 136.
158. Wick A.N., Drury D.R., Nakda Ы.1., Wolfe J.B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucosc // J.Biol.Chem, -1957, -V. 224. -P. 963-969.
159. Willie A.N., Kerr J.F., Curnc A.R. Cell death. The significance of apoptosis.// Int..Rev. Cytol. -1980. -V.68. -P.25 1-306.
160. Xue L-Y., Qiu Y., lie J., Rung H-.I., Oleimck N.L. Etk/Bmx, a PH- domain containing tyrosine kinase, protects prostate cancer cells from apoptosis induced by photodynamic therapy or thapsigargin // Oncogene. -1999. -18. - P . 3391-3398.
161. Yeoman MS, Kemenes G, Benjamin PR, Elliott CJ. Modulatory role for the serotonergic cerebral giant cells in the feeding system of the snail, 1.ymnaea. If Photomactivation //J Neurophysiof -1994. -72(3). -P. 1372-82.
162. Yoimuschot G. Early increase in intracellular calcium during photodynamic permeabilization !l Free Rad, Biol. Med. -1991. - I I. -P. 307-317.
163. Yoshida Y, Dcreski MO, Garcia JH, Hetzel FW, Chopp M. Neuronal mjury after photoactivation of photofrm 11. // Am J PathoL -1992. -141(4). -P. 989-97.
164. Zamzami N, ICroemer G. Condensed matter in cell death // Nature. - 1999.-9;401(6749).-P. 127-8.
165. Zhou Z, Yang H, Zhang Z. Role of calcium in phototoxicity of 2- butylamino-2-demethoxy-hypocrellin A to human gastric cancer MGC-803 cells // Biochim Biophys Acta. -2003. -17;1593(2-3). -P. 191-200.
166. Zhuang S., Lynch M.C., Kochevar I.E. Activation of protein kinase С is required for protection of cells against apoptosis induced by singlet oxygen // FEBS Lett. -1998. -437. -P. 158-162.
-
Брагин, Денис Евгеньевич
-
кандидата биологических наук
-
Воронеж, 2003
-
ВАК 03.00.02
- Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием
- Фотодинамическое повреждение нервных и глиальных клеток: механизмы клеточной смерти и нейроглиальные взаимодействия
- Роль нейроглиальных взаимодействий и кальциевой сигнальной системы в реакциях нейронов и глиальных клеток речного рака на фотодинамическое воздействие
- Стимуляция роста и овогенеза у американских раков рода Procambarus при культивировании
- ИК лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями
