Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хордин и нейрохордины: структурные исследования, экспрессия при эмбриональном развитии и в клеточных культурах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Хордин и нейрохордины: структурные исследования, экспрессия при эмбриональном развитии и в клеточных культурах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биохимии им. А.Н. Баха

На правах рукописи УДК 577.122

ПРЕОБРАЖЕНСКИЙ Александр Анатольевич

ХОРДИН И НЕЙРОХОРДИНЫ: СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, ЭКСПРЕССИЯ ПРИ ЭМБРИОНАЛЬНОМ РАЗВИТИИ И В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1996

г Г Б СП' 1 С ФЕЗ 1-1.::

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, академик Национальной Академии наук Республики Армения, профессор А.А. Галоян Доктор химических наук, профессор А.П. Савицкий Доктор биологических наук С.М. Деев

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Кольцова РАН

Защита состоится "¿Ц" ', 1996 г. з 10 часов на

заседании специализированного совета Д 002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при 'Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071 Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке, биологической литературы РАН (Москва, Лен./некий пр., 33, корп. 1)

Диссертация разослана " Ц, " И 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В истории изучения высших эукариотических организмов можно выделить периоды, когда начинались исследования на каком-либо новом уровне: анатомо-морфологическом, клеточном, биохимическом, молекулярно-биологическом. В настоящее время "центр тяжести" работ по биологии развития смещается на уровень молекулярной биологии. В биохимических исследованиях развития весьма важным, на наш взгляд, является выделение специфических продуктов дифференцировки, их характеристика, определение времени экспрессии и типа экспрессирующих клеток. В большинстве случаев эти сведения создают фундамент для изучения механизмов генной регуляции этих продуктов, то есть для перехода на следующий, молекулярно-биологический уровень. Именно с этой точки зрения мы предлагаем рассматривать выполненный нами цикл исследований.

Объект исследования. Раннее эмбриональное развитие высших организмов укладывается в рамки единой классической с-;мы: дробление - бластула - гаструла - нейрула - органогенез. Если на первых трех стадиях развитие определяется функционированием относительно небольшого количества генов, то на стадии органогенеза их количество многократно возрастает. Наиболее удобными об1 актами для изучения этих фундаментальных процессов на всех уровнях являются зародыши земноводных (прежде всего, Хепорш 1ае\'Ь), а также осетровых рыб. Последние предоставляют уникальную возможнолсть для изучения дифференцировки хорды, поскольку у них, в отличие от высших позвоночных, хорда сохраняется во взрослом состоянии. Следовательно, идентифицировав и охарактеризовав продукты дифференцировки хорды взрослой особи, можно было бы проследить последовательность их появления в процессе развития. Подобный подход был использован нами на начальном этапе наших исследований, когда был . выявлен и охарактеризован

1

хордоспецифический гликопротеин хордии. Впоследствии мы обнаружили в нервной системе высших позвоночных группу иммунологически родственных хордину антигенов, которые были названы нейрохординами. Нами были изучены закономерности экспрессии нейрохординов у ряда видов земноводных, рыб, птиц и млекопитающих, включая человека, а также в основных типах нервных клеток в культуре.

Общая цель работы состояла в выявлении специфических продуктов дифференцировки, получении их биохимических характеристик и изучении закономерностей их экспрессии при эмбриональном развитии и дифференцировке клеток.

Научная новизна работы заключается в обнаружении хордоспецифического гликопротеина хордина, обнаружении в хордине высокоиммуногенного эпитопа (Р-эпитопа) и обнаружении у высших позвоночных группы эволюционно консервативных гликопротеинов -нейрохординов, в изучении свойств этих новых соединений и закономерностей их экспрессии.

Практическая значимость работы для дальнейших исследований состоит в обеспечении возможности перехода на молекулярно-биологический и клеточно-биологический уровни (клонирование генов, изучение их экспрессии с применением молекулярных зондов, изучение роли Р-эпитопа в межклеточных взаимодействиях). Значимость работы для медицинской практики состоит в возможности использования полученных нами моноклональиых антител против Р-эпитопа для дифференциальной диагностики внутричерепных опухолей человека.

Апробации. Материалы диссертации доложены на 3-й Конференции по молекулярному узнаванию Международного Союза биохимиков и молекулярных биологов (Сингапур, 1995); на 14-м Международной биохимическом конгрессе (Прага, 1988); на 5-й

.2

Всесоюзной конференции "Физиология и патология соединительной ткани" (Новосибирск, 1980). Они были доложены также на межлабораторном семинаре в Институте биологии развития (Нагоя, Япония, 1995); на межлабораторном семинаре в Главном, институте здоровья (Рим, 1995); на научных конференциях в Институте биохимии РАН (Москва, 1993, 1991, 1983), на научном семинаре в Институте белка РАН (Пущино, 1990), на межлабораторном семинаре в Институте биологии развития РАН (Москва, 1989), на научной конференции ГНТП "Приоритетные направления генетики" (Москва, 1994); на научной конференции ГНТП "Геном человека" (Москва, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, из них 14 в международных изданиях.

Структура работы. Работа изложена в виде 12 глав, сгрупппированнных в 2 части, с 9 рисунками, 7 таблицами, на 41 странице.

СОДЕРЖАНИЕ РАБО.ТЫ.

Часть -I.

ХОРДИН КАК МАРКЕР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ХОРДЫ

Глава 1. Выявление и общая характеристика хордмиа.

Объектом наших исследований на начальном этапе служила хорда белуги (Huso huso), представителя семейства осетровых (Acipenseridae). До начала настоящей работы не было гарантии, что мы сможем найти в хорде органоспецифические вещества. Однако, поскольку хорда является достаточно древним органом в эволюции позвоночных животных, мы надеялись с применением иммунохимических методов найти в ней специфический антиген или антигены. Стратегия поиска состояла' в следующем. На гомогенат сердцевинной части хорды белуги была получена кроличья поликлональная сыворотка. Затем она была истощена экстрактами

3

других органов: печени или семенника. Истощенную противохордовую сыворотку тестировали с экстрактами различных органов и тканей: хорды, печени, лочки, селезенки, мышцы, семенника, яичника, мозга, пилорической железы, кишки, кожи, хряща, икры. В качестве методов тестирования был использован ракетно-линейный

иммуноэлектрофорез. Было установлено, что одна из полос иммунопреципитации, образуемых истощенной сывороткой с экстрактом хорды, не искажается никакими тканевыми экстрактами, внесенными в лунки, кроме экстракта самой хорды. Антиген хорды, дающий эту полосу иммунопреципитации, был назван хордииом. Дальнейшая задача состояла в очистке хордина и его характеристике. На начальном этапе этой работы возникли трудности, связанные с такими свойствами хордина как его полидисперсность, низкое значение изоэлектрической точки, невозможность покрасить хордин в геле кумасси или серебром. С применением метода ракетно-линейного электрофореза мы показали, что хордин чувствителен к действию трипсина и папаина. Этот результат свидетельствовал о наличии в составе хордина белковой компоненты. Очистка хордина была проведена в два этапа. На первом этапе с применением хроматографии на DEAE-сефадексе и SP-сефадексе (рН 2,1) был получен препарат хордина свободный от других антигенов, но, возможно, содержащий некоторое количество примесей, на которые не имелось антител в полученной сыворотке. После мечения этого препарата in vitro радиоактивным иодом метка обнаруживалась только в дуге преципитации, соответствующей хордину (двумерный иммуноэлектрофорез). Окончательная очистка хордина была проведена с использованием колонки с иммобилизованными моноклональными антителами.

Глава 2. Получение моиокловальных антятел против хордина н их характеристика. Препаративное получение очищенного хордина и его

анализ.

Для получения гибридом мыши, продуцирующих антитела против хордина, был использован метод Köhler and Milstein (1975). Перед получением гибридом мышей несколько раз иммунизировали гомогенатом сердцевины хорды. Скрининг культуральной жидкости на наличие секретируемых антител проводили методом твердофазного радиоиммунологического анализа с использованием меченых иодом-125 антител кролика против С-участка каппа-цепи иммуноглобулинов мыши. Из-за несорбируемости хордина на планшетах была использована следующая система: пластик - очищенные поликлональные антитела кролика против хордина - хордин -мышиные антитела (культуральная жидкость) - иод-меченый хордин. По сорбции на плашках радиоактивной метки судили о наличии ' антител, продуцируемых данным клоном гибридом. При скрининге таким методом было выявлено 9- позитивных клонов, которые продуцировали антитела, обозначенные нами как Ат1 - Ат9. Далее мы провели проверку этих клонов иммунопреципитацией меченого хордина в двойной системе антител: гибридомный супернзтант -меченый хордин - неиммунная мышиная сыворотка (для получения преципитата) - сыворотка кролика против глобулинов мыши. Было установлено, что в данной системе хордин осаждается антителами Ат2 -, Ат9, а антитела Ат1 его не осаждают и, вероятно, были отобраны на примесный компонент в препарате хордина. Далее были получены препаративные количества моноклональных антител в асцитной жидкости, после чего была проведена их очистка на колонке с DEAE-целлюлозой. Из 8 полученных антител 7 принадлежали к классу IgM и только одни антитела (Ат5) - оказались IgG3. С антителами Ат5 была проведена большая часть дальнейщих исследований.

5

Для очистки хордина была применена иммуноаффинная хроматография на колонке с иммобилизованными антителами Ат5.. Иммобилизацию антител. на матриксе проводили через цепи олигосахаридов, чем обеспечивалась желаемая ориентация антител и, как результат, более высокий выход очищаемого антигена. Для этого обработанные периодатом антетела инкубировали с активированным носителем полигидразид-солозой (Биотон, Ленинград). Последней стадией очистки хордина была хроматография на колонке с гелем TSK Toyopearl HW-60. Полученный препарат хордина обладал следующими свойствами: молекулярный вес около 100 кДа по данным гель-хроматографии, изоэлектричесхая точка около 2, полидисперсное распределение при SDS-электрофорезс в полиакрнламидном геле. Такие свойства характерны для кислых гликопротеинов. Действительно, в составе хордина были выявлены углеводы,

составляющие около 60% от веса молекулы (Таблица 1). Среди

i

аминокислот хордина превалируют полярные аминокислоты треонин, серин, глицин, аспарагин и глутамин (или аспарагиновая и глугаминовая кислоты); углеводный компонент представлен маннозой, фукозой, галактозой, галактозамином и глюкозамином. Обработки хордина тремя специфическими эндогликозидазами, расщепляющими углеводные цепи протеогликанов: хондроитиназой ABC, гепаритиназой и кепатаназой, не сказались ни на антигенности хордина, ни на его поведении при гель-хроматографии. Эти данные и превращение 75% галактозамина в галаетозаминит при обработке хордина щелочным NaBH4 позволяют отнести его к гликопротеинам, содержащим О-гликозидные углевод-пептидные связи между остатками N-ацетилгалактозамина и р-оксиаминокислотами. В хордине, возможно, присутствует N-гликозиламидная углевод-пептидная связь, .ак как после действия щелочного LiBH4 был идентифицирован глюкозаминит.

6

Таблица 1. Аминокислотный и углеводный состав хордипа.

Компонент Число остатков Компонент Число остатков

на 100 на 100

аминокислотных аминокислотных

остатков остатков

Asx 11 Phe 3

Thr 10 Lys 4

Ser 13 His 1

Glx 15 Arg не определяли

Pro 6

Gly 13 GlcN 15

Ala 10 GalN 6

Val 4 Man 14

Ue+Leu 7 Fuc 7

Tyr 3 Gal 52

Чтобы определить, реагируют ли моноклональные антитела против хордина с одним и тем же эпитопом в его молекуле и пи с разными эпитопами, мы провели серию экспериментов но совместному и раздельному "титрованию" пар антител. В этих опытах использовали ту же систему тестирования, что и при скрининге культуральных жидкостей гибридом. При этом определяли, выз-вет ли присутствие возрастающего количества вторых моноклональныч антител в смеси увеличение связывания радиоактивной метки на планшетах. Было проведено тестирование пар: Ат2-Ат9, Ат2-Ат4, АтЗ-Ат4, АтЗ-Ат7, АтЗ-Ат8, Ат4-Ат7, Ат5-Ат6, Ат6-Ат9, Ат7-Ат9, Ат8-Ат9. Уровень насыщения меткой для двух антител никогда не превышал уровеня насыщения в присутствии индивидуальных антител. Следовательно, антитела Ат2 - Ат9 были направлены на идентичные или перекрывающиеся эпитеты хордийа (или в крайнем случае, на очень близко расположенные его эпитопы). Поскольку 8 из 8

7

моноклональных антител против хордина оказались направленными, скорее всего, на один и тот же эпитоп его молекулы, данный эпитоп, по-видимому, представляет собой высоко иммуногенную химическую группировку. Мы назвали эту группировку Р-эпитопом. Было показано также, что моноклональные антитела Ат5 способны к осаждению хордина в полосе иммунопреципитации в реакции иммунодиффузии в геле по Оухтерлони. Такой результат свидетельствовует в пользу множественности Р-эпитопа в хордине. На основании этих данных можно предположить, что Р-эпитоп имеет, скорее всего, углеводную природу.

Глава 3. Изучение экспрессии хордина в эмбриональном развитии.

Для определение биосинтеза хордина в зародышах белуги и стерляди (Ааретег гиЛепш) были использованы методы радиоиммунологического анализа (РИА) и иммуногистохимии: В разработанном нами жидкофазном РИА с двойной системой антител была использована поликлональная кроличья антисываротка и [1251) хордин. Чувствительность данной модификации метода была весьма высокой: 1 нг/мл. Использование данного метода для определения хордина в экстрактах из зародышей белуги показало, что кривая вытеснения экстрактами с- разных стадий разьития имеет двухфазный характер. На первой фазе, продолжающейся со стадии 32 по Детлаф и Гинзбург (органогенез) до выклева, наблюдается медленный подъем кривой, сменяющийся резким подъемом после выклева. Как выяснилось позже мз данных иммуногистохимических исследований с применением моноклональных антител Ат5, в ткани центральной нервной системы зародышей есть антиген, перекрестно реагирующий с этими антителами, и его экспрессия регистрируется иммуногистохимически со стадии 33. Интенсивность иммунного окрашивания нервной ткани на срезах была существенно меньше

' 8

интенсивности окрашивания хорды. Антиген нервной ткани осетровых рыб давал одну полосу при иммуноблотинге с моноклональными антителами Ат5 и был назван нейрохордином, учитывая его иммунологическое сродство к хордину и локализацию. Однако у осетровых рыб этот антиген подробно не изучался. Иммуногистохимическая реакция антител Ат5 с тканью хорды выявляется, начиная со стадии 35 (начало выклева). Таким образом, момент резкого подъема кривой графика РИА, начиная с выклева, совпадающий с выявлением Ат5-иммунореактивности в хорде на гистологических срезах, вероятно, должен быть принят за начало биосинтеза хордина в зародышах.

Глава 4. Выделение коллагена II типа из хорды и изучение его экспрессия в эмбриогенезе.

Для того, чтобы оценить, как соотносится во времени экспрессия хордина с появлением других продуктов дифференцировки, мы выбрали коллаген II типа, который был выявлен в хорде взрослых особей осетровых рыб (Miller and Mathews, 1974). Следует заметить, что коллаген II типа не относится к хордоспецифическим белкам, однако первым органом зародыша, где он синтезируется при эмбриональном развитии, является хорда (Von der Mark et al., 1976). Процедура выделения коллагена II типа состояла из следующих этапов:

Экстракция хорды 4 М гуанидинхлоридом -» отмывка от гуанидинхлорида -» обработка кусочков ткани папаином. -» отмывка и инактивация папаина иодуксусной кислотой 3 последовательных экстракции коллагена 0.45 М NaCl ~> осаждение коллагена диализом против NaH2P04 растворение осадка в 0,5 М уксусной кислоте осаждение 5% раствором NaCl 4-кратная экстракция осадка 0,5 М уксусной кислотой осаадение 5% NaCl -* 3-кратная экстракция 0,45

9

ХОрДИМ

I

Н-1-1-—1-1-1-1-1-----

N стадий: 16 20 24 20 32 ЗВ 40 44

эмбриогенез предпичинки молодь

Рис. 1. Экспрессия* в эмбриогенезе осетровых рыб хордина, нейрохордина и коллагена II типа. На временной оси обозначены стадии развития зародышей и предлйчинок по Детлаф и Гинзбург (1954), возраст' молоди указан в месяцах.

М ЫаС1 -» осаждение 20% раствором ЫаС1.

Полученный препарат коллагена был гомогенен при электрофорезе в ПААГ в. присутствии БОЭ и лри хроматографии на СМ-целлголозе и обладал хроматографическими и электрофоретическими свойствами, характерными для коллагена II типа. Была получена куриная сыворотка против данного препарата коллагена, дающая с ним одну полосу преципитации в реакции Оухтерлони. С данной сывороткой и коллагеном, меченным [1251], была отработана методика жмдкофазного РИА на коллаген II типа в экстрактах зародышей белуги, чувствительность которых составляла 20 нг/мл. Этим методом мы показали, что коллаген II типа выявляется,

10

начиная с первой стадии органогенеза (стадия 24). На следующих стадиях развития мы наблюдали нарастание количества синтезированного коллагена.

Полученные данные позволяют утверждать, что коллаген II типа является одним из наиболее ранних маркеров дифференцировки хорды, а ордин вляется более поздним ее продуктом. Хордин появляется на стадии, когда видимая морфологическая дифференцировка органа уже завершена. Вероятно, появление хордина непосредственно перед выклевом связано с необходимостью усиления опорной функции хорды при плавании зародышей. Приведенная на Рис.1 схема суммирует данные иммунохимических и иммуногистохимических исследований по экспрессии изучавшихся антигенов в эмбриональном развитии осетровых рыб; хордина и коллагена в хорде и нейрохордина в нервной ткани.

Часть П.

НЕЙРОХОРДИНЫ КАК МАРКЕРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Глава 5. Р-эпитоп является характерным компонентом нервной ткани позвоночных животных.

Ранее мы предположили, что в построении Р-эпитопа хордина участвует углеводный компонент. ' Была проведена серия экспериментов, в которых мы пытались вытеснить меченый хордин из комплексов с поликлональными и моноклональными антителами различными гликопрогеинами, а также поли-, олиго- и моносахаридами: фетуином, трансферрином, овомукоидом, авидином, рибонуклеазой В, а-кислым гликопротеином, кональбумином, тлреоглобулинами, муцинами, гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатом, гепарансульфатом, кератансульфатом,

11

галакганом, арабогалактаном, лактозой, раффинозой, Ь-фукозой, О-галактозой, О-маннозой, а-метил-Р-галактозидом, р-метил-р-галакгозидом, Р-глюкозамином, Р-галактозамином. Ни в одном случае мы не наблюдали достоверного вытеснения при использовании 1000-кратных весовых избытков перечисленных выше соединений. Эти результаты привели нас к выводу что Р-эпитоп хордина представляет собой уникальную химическую группировку, которая, вероятно, присутствует в очень ограниченном количестве гликопротеинов. В связи с этим представляло интерес провести скрининг тканей высших позвоночных, включая человека, на наличие в них соединений, несущих этот эпитоп. Исследования проводились двумя методами: иммунохимическим (скрининг экстрактов из тканей конкурентным вытеснением меченого хордина из комплексов с антителами) и иммуногйстохимическим. Поскольку поликлональные

противохординовые сыворотки содержат, вероятнее всего, значительную часть антител, направленных на Р-эпитоп, скрининг проводили с применением как поликлональной сыворотки, так и моноклональных антител. В Таблице 2 приведены результаты иммунохимического скрининга нормальных и опухолевых тканей человека и тканей кролика.

Приведенные здесь данные, а таю::е результаты изучения имм^ногистохимического распределения антигенов, содержащих Р-эпитоп, в эмбриональных тканях рыб, курицы и человека (см. Главу 6) позволили нам сделать вывод о том, что Р-эпитоп является характерным компснентом нервной ткани позвоночных.

Глава б. Экспрессия Р-эпитопа лри эмбриональном развитии человека и высших позвоночных и в опухолях мозга глиального проксхождс шя.

При изучении экспрессии антигенов при эмбриональном развитии иммуногистохимический метод дает весьма ценную

12

\

Таблица 2. Ингибирование связывания меченого хордина с поликлональными и моноклональными антителами тканевыми экстрактами

Ткань

Инг. Ткань

Инг.

поликлональные

человек: мозг: ,

больш.полушария серое! вещество белое* вещество мышцы: гладкие поперечнополосатые молочная железа гинекомастия (м) щитов ндная

железа

1

слизистая

I

кишечника

межпозвонковый

диск

плод человека,

24 нед^:

мозг |

печен^

легкое;

почка |

мышца

сердц^

трахея

аорта

коленный сустав опухоли: олигодендро-глиома

невринома менингиома эпецдимома аденома гипофиза +++ аденокарцинома +++ молочной железы +++ глиобластомы (2) папиллярный рак меланома хордома (2) аденокарциноиы желудка (2) нейрофиброма шетиоцитома ткани кролика: мозг печень легкое

почки ** ' "

селезенка пульпозные ядра

+++

антитела Ат5: мозг кролика хордомы (2) эмбриональные ткани человека: мозг почка сердце легкое печень +++ коленный сустав

+++

+++

+++

"инг", ингибирование;" нг/мл'хордина;"+", 0,1

+++", эквивалентно 10-100 ■1 нг/мл.

+

+

информацию. В настоящей главе будут суммированы результаты экспериментов по определению Р-эпитопа на гистологических срезах. В этих исследованиях применялся как непрямой метод Кунса, где результат регистрируется по иммунофлюоресценции, так и иммунопероксидазный метод.

Для эмбрионов человека в возрасте 6-9 недель было характерно широкое распространение Р-эпитопа в головном и спинном мозге, в периферических нервах и нервных ганглиях, в том числе черепно-мозговых, спинальных, симпатических ганглиях, в скоплениях нервных клеток около дорсальной аорты и в стенке кишки. Сильная реакция проявлялась у 7-недельных эмбрионов в эпителии слухового пузыря. В сетчатке плода ' 12-ти недель развития наблюдалось равномерное распределение Р-эпитопа (в отличие от других видов). В центральной области сетчатки одинаково сильная реакция обнаруживалась ках в волокнах зрительного нерва и формирующегося внутреннего плексиморфноГо слоя, так и в контурах ганглиозных клеток и других нейронов сетчатки. В хорде б-недельного эмбриона человека была обнаружена слабая специфическая реакция ее клеток на Р-эпитоп, тогда как у 7- и 9-недельных эмбрионов она была отрицательной. Эти данные свидительствуют о низком и временном характере экспрессии Р-эпитопа в хорде человека.

У куриных эмбрионов Р-эпитоп также имеет широкое распространение в нервной ткани. Сильная специфическая реакция, особенно у зародышей на 5- и 10-е сутки инкубации, обнаруживалась во всем головном мозге, в ганглиях и нервах периферической нервной системы. В хорде экспрессия Р-эпитопа на исследованных сроках развития не была обнаружена. В головном и спинном мозге Р-эпитоп локализуется, как и у других видов животных, в червных волокнах и вдоль границ клеточных тел. У Ю-суточных зародышей специфическое свечение обнаружено также в хориоидном сплетении

14

IV-желудочка мозга. В сетчатке в поздние сроки развития (15 суток) наряду с локализацией Р-эпитопа в наружном и внутреннем плексиморфныХ слоях, а также в нервных волокнах зрительного нерва, слабая специфическая реакция выявлялась в наружной пограничной мембране и в клеточных телах у значительной части нейронов внутреннего ядерного слоя. На Рпс.2 представлено распределение Р-эпитопа на поперечных срезах эмбрионов человека и курицы. У испанского тритона (Pleurodeles .waltl) основными местами экспрессии Р-эпитопа являются нервная ткань, а также аденогипофиз. В хорде у зародышей и личинок Р-эпитоп не был выявлен. В нервной ткани, как и у осетровых ' рыб, Р-эпитоп широко распространен в

Рис.2. Локализация Р-эпитопа в тканях эмбрионов человека и курицы. Непрямое иммунопероксидазное окрашивание. А: поперечный срез 6-недельного эмбриона человека; Б: поперечный срез 5-дневного эмбриона курицы на уровне туловища. 5с, спинной мозг, с!гн, спинальный ганглий, п, хорда.

головном и спинном мозге. Наиболее сильная позитивная реакция локализовалась в нервных волокнах. Отчетливая реакция, но меньшей интенсивности обнаруживалась в контурах клеточных тел нейронов у личинок разных стадий развития (стадии 38, 44). Аналогичная реакция клеточных контуров наблюдалась в нейроэпителии. В сетчатке -тритонов распределение Р-эпитопа отличается выраженной стратификацией. У личинок и молодых тритонов специфическая реакция локализовалась в наружном плексиморфном слое и в волокнах зрительного нерва. Наряду с эгам Р-эпитоп обнаружен также в наружной пограничной мембране. Особенностью распределения Р-эпитопа в нервной ткали у тритона является ограниченная экспрессия его в периферической нервной системе. У личинок перед метаморфозом (стадии развития 52, 55) в спинальных и черепно-мозговых ганглиях лишь небольшая часть клеток и нервных волокон проявляла специфическую реакцию. У тритонов яркая специфическая реакция на Р-эпитоп проявлялась также в ткани аденогипофиза. Данные по экспрессии Р-эпитопа в эмбриональных тканях трех видов суммированы в Таблице 3. .

Таблица 3. Экспрессия Р-эпитопа в тканях

эмбрионов человека и курицы, эмбрионов и личинок испанского тритона.

Ткань Интенсивность окрашивания

Человек Курица Тритон

ЦНС ++4- +++ +++ .,

пне +++ +++ +

Хорда V - • -

Аденогипофиз - - +++

Обозначения: "+++", сильное иммунное окрашивание; "+", слабое; "+,-" слабое транзитор-ное, "-" отсутствие окрашивания.

Одной из задач наших иммуногистохимических исследований был скрининг опухолей мозга человека на экспрессию Р-эпитопа. Иммунное Ькрашивание тканей проводили непрямым

иммунопероксидазным методом. Экспрессия Р-эпитопа была выявлена во всех исследованных глиапьных опухолях кроме одной (Таблица 4). Напротив, ни в одной из менингиом Р-эпитоп не экспрессировался.

Таблица 4. Экспрессия Р-эпитопа в опухолях глиального

происхождения

Опухоли Положительная

реакция к общему

числу случаев

Олигодендроглиомы 3(4)

Смешанные астроцитомы 2(2)

Астроцитомы 2(2)

Мениншомы 0(4)

Глава 7. Экспрессия Р-зшггопа в культурах нервных клеток.

Для определения типов нервных клеток, экспрессирующих Р-эпитоп, весьма ценную информацию могут дать эксперименты с клеточными культурами. В работе были использованы культуры клеток неонатального мозга крысы (культуры олигодендроцитов, астрочитов и микроглии) и эмбрионального мозга человека (культуры астроцитов и нейронов). Клетки обрабатывали, как правило, смесью антител Ат5 и других антител, специфичных по отношению к известным клеточным маркерам. Эти антитела выявляли парой вторых специфических антител, меченых флюоресцеином либо родамином (двойное флюоресцентное мечение).

С культурами олигодендроцитов крысы использовали следующие антитела к дифференцировочным маркерам: поликлональные антитела против нестина - маркера очень ранних стадий дифференцировки нервных клеток; моноклональные антитела

17

ЬВ1 против ганглиозида ОБЗ - также раннего маркера дифференцировки нервных клеток, но прекращающего экспрессию в глиальной линии несколько позже; моноклональные антитела 04, реагирующие с сульфатидом, являющимся маркером одной из поздних стадий дифференцировки олигодендроцитов; поликлональные антитела против галактоцереброзида - маркера терминальной дифференцировки олигодендроцитов.

Было установлено, что в культурах олигодевдроглии мозга крысы Р-эпигоп экспрессируется совместно с нестином и ганглиозидом ООЗ, то есть на очень ранних стадиях дифференцировки олигодендроцитов. Морфологически большинство таких клеток являются моно- и биполярными. Если в культурах присутствовали более дифференцированные клетки, Р-эпитоп никогда не экспрессировался совместно с сульфатидом и галактоцереброзидом. Таким образом, для культур олигодендроглии Р-эпитоп является маркером весьма ранних стадий дифференцировки клеток. С культурами астроцитов крысы использовали поликлональныю сыворотку против глиального фибриллярного кислого белка (ОРАР), являющегося специфическим маркером астроцитов. В этих культурах, содержащих астроциты 1 и 2 типа, Р-эпитоп экспрессируют только звездчатые астроциты 2 типа, в то врем» как плоские астроциты 1 типа его не экспрессируют. Клетки микроглии, изолированные из смешанных первичных культур, Р-эпитоп не экспрессируют. Приведенные результаты говорят о том, что только клетки линии 0-2А макроглии экспрессируют Р-эпитоп.

В опытах с культурами астроцитов из эмбрионального мозга человека, где в качестве маркера также использовали антитела против ОРАР, было установлено, что лишь небольшая часть плоских астроцитов экспрессирует Р-эпитоп. В культурах эмбрионального мозга человека, обогащенных нейронами, Р-эпитоп экспрессировали

18

практически все клетки с морфологическими чертами нейронов, причем сильная экспрессия наблюдалась как в телах клеток, так и в отростках. В параллельной чашке Петри большая часть клеток окрашивалась антителами против нейрофиламентов, то есть большинство клеток этой культуры действительно были нейронами.

Таким образом, в культурах клеток мозга Р-эпитоп экспрессируется нейронами и клетками глиальной линии 0-2А. В экспериментах с культурами клеток было также показано, что Р-эпитоп локализован в основном, на клеточной поверхности. Эти данные согласуются с локализацией Р-эпитопа вблизи границ клеток на гистологических срезах. В Таблице 5 сведены данные о типах клеток, экспрессирующих Р-эпитоп, полученные иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методами.

Глава 8. Характеристика иейрохордниов - антнгенов-мишеней для

аитнтел Ат5. ^

Параллельно с . иммунохимическими и

иммуногистохимическими исследованиями проводилась биохимическая характеристика молекул, несущих Р-эпитоп. Изучались главным образом антигены, экстрагируемые физиологическим раствором (ФРФ) или буферными растворами близкого состава ("растворимые антигены"). В случае мозга эмбрионов человека было показано, что спектр антигенов, экстрагируемых ФРФ, сходен со спектром антигенов, экстрагируемых 5% тритоном Х-100. Гель-хроМатография экстрактов из эмбрионального мозга человека, мозга курицы и испанского тритона на носителе ТБК Тоуореаг1 НУ/-65 в денатурирующих условиях (в присутствии БОБ) показала, что у высших позвоночных Р-антигены дают гетерогенное распределение в области соединений высокого молекулярного веса. Для обозначения антигенов нервной ткани высших позвоночных, несущих Р-эпитоп, мы

19

Таблица 5. Типы клеток, экспрессирующих Р-эпитоп, идентифицированные на гистологических срезах и в культуре.

Виды На срезах Клетки В культуре

Осетровые Хордоциты Нейроны головного мозга Нейроны спинного мозга Нейроны сетчатки Клетки адено-гипофиза -

Тритон 1 Нейроны головного мозга Нейроны . Сетчатки , Клетки адено-гипофиза

Курица Нейроны сетчатки

Крыса Олигодендроциты Астроциты 2-го типа

Человек Клетки Пуркинье Нейроны головного мозга Астроциты (плоские)

Все виды Нейроэпителий

использовали термин нейрохордины. При электрофорезе в ПЛАТ в присутствии БОБ экстрактов из эмбрионального мозга человека большая часть* нейрохординов не входила в разделяющий гель либо распределялась вблизи его границы. Чтобы получить разделение смеси всех экстрагируемых из ткани нейрохординов, мы разработали метод электрофореза в геле агарозы в присутствии Электрофорез

проводился в горизонтальном геле агарозы (3%) под слоем буфера, содержащего БОБ. При этом в гель входят и разделяются компоненты с молекулярным весом до 1 млн Да и, возможно, более. Калибровочная кривая, построенная с белками известного молекулярного веса, выглядит так же, как в случае ББЗ электрофореза в ПААГ (Рнс.З). С применением данного метода удалось разрешить весь спектр нейрохординов человека и других высших позвоночных (Рис.4). Мы Идентифицировали в головном мозге человека 9 высокомолекулярных антигенов, несущих Р-эпитоп. Самые медленно мигрирующие нейрохордины составляют группу А, которая. часто видна как одна диффузная полоса; в некоторых случаях она разрешается в виде трех полос (А1, А2, АЗ) либо двух полос (А1 и АЗ). По данным электрофореза в агарозе в присутствии БОБ средний молекулярный вес нейрохординов группы А составляет 770 кДа. Далее с 1едуют нейрохордины В1 (560 кДа), В2 (480 кДа), ВЗ (400 кДа), С1 (320 кДа), С2 (250 кДа) и Б (115 кДа). В дальнейших исследованиях мы оценили молекулярные веса компонентов ВЗ - Б в 6%-ном полиакриламидном геле. В ПААГ были получены более низкие значения молекулярных весов: около 230 кДа для ВЗ, 160 кДа для компонентов С1 и С2, которые в ПААГ распределяются чаще всего в виде одной диффузной полосы, и 90 кДа для компонента О. Причина таких различий состоит, вероятно, в разном поведении белков-маркеров и белковых гликоконъюгатов, каковыми являются нейрохордины (см. ниже), в гелях полиакрил амида и агарозы. Молекулярные веса и другие

21

-Т

б :

1 г з

I.

в

20

40

Рис.3 (слева). Калибровка электрофореза в геле агарозы в присутствии БОБ. По оси ординат отложены десятичные логарифмы молекулярных весов, по оси абсцисс - расстояние в мм. Белки-маркеры (Закрытые кружки): I, моноклональные антитела Ат8, 1вМ (900 кДа); 2, тироглобулин (670); 3, апоферритин (450); 4, субъединицы ферритина (225); моноклональные антитела Ат5, (160); лактатдегидрогеназа (140); БСА (67); субъединицы ЛДГ (35). Нейрохордины обозначены открытыми кружками.

Рис.4 (справа). Электрофорез в геле агарозы в присутствии БОБ. А: окраска кумасси. 1, тироглобулин, апоферритин, БСА; 2, Ат5 (1бО). Б: иммунное окрашивание блотов. 1, мозг взрослого человека, серое вещество; 2, то же, белое вещество; эмбриональный мозг человека (40 нед.).

характеристики нейрохординов человека представлены в Таблице 7 (Глава 12). При помощи электрофореза в агарозе в присутствии БОБ были также охарактеризованы нейрохордины мозга крысы, мыши и курицы. В каждом из этих видов выявлялись нейрохордины групп А, В и С, но не выявлялся нейрохордин Р. Этот результат говорит об эволюционной консервативности нейрохординов первых трех групп.

В . следующей серии экспериментов мы подвергали

исчерпывающему многосуточному перевару проназой экстракты мозга человека и курицы и экстракт хорды белуги. После инкубации антигенную активность тестировали По вытеснению интактного меченого хордина из комплексов с антителами Ат5. Было установлено, что во всех случаях антигенная активность Р-эпитопа хотя и уменьшается на один порядок и более, но не исчезает полностью. В проназных гидролизатах антигенной активностью обладают фрагменты с молекулярным весом около 3 кДа, которые, вероятно, являются гликопептидами. Учитывая высокое содержание углеводов в составе хордина (а также их наличие в нейрохордине D, как будет показано ниже), этот результат свидетельствует в пользу того, что антигенная активность Р-эпитопа связана, скорее всего, с углеводным компонентом в составе этих молекул.

Глава 9. Препаративное выделепие пейрохорднпов мозга человека и их фосфорилнроваппе in vitro.

Для выделения препарата нейрохординов был использован тот же иммуносорбент с моноклоналъными антителами Ат5, что и для выделения хордина. Процедура очистки включала следующие основные этапы: получение гомогената ткани мозга в ФРФ, центрифугирование его при 30000 g, пропускание супернатанта через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой при 0,2 М NaCl и элюцйя 0,6 М NaCl, иммуноаффинная хроматография. Полученный суммарный препарат нейрохординов содержал те же компоненты, которые обнаруживаются в экстрактах, однако был несколько обогащен нейрохордином D. В ряде случаев нейрохордин D отделяли гель-хроматографией на колонке с носителем Toyopearí HW-60. Такой препарат получил название "препарат ABC".

Фосфорилирование является одной из наиболее распространенных модификаций белков, приводящей в ряде случаев к изменению их биологической активности. Мы использовали

23

суммарный препарат нейрохординов мозга взрослого человека в качестве субстрата для двух протеинкнназ казеинового типа: казеиновой киназы первого типа (СК 1) и второго типа (СК 2). Оба этих фермента обладают способностью к фосфорилированию in vivo и in vitro широкого спектра субстратов из разных тканей, включая ткань мозга. После инкубации нейрохординов в присутствии меченой АТФ с каждой из протеинкнназ образцы анализировали в полиакриламидном геле по Лэмли либо в геле агарозы в присутствии SDS, после чего делали радиоавтографию. На Piicj5A представлен результат анализа в ПААГ. Можно видеть, что в случае СК 1 меченый материал распределяется вблизи границ концентрирующего и разделяющего гелей, а в случае СК 2 каких-либо продуктов фофорилирования не регистрируется. При электрофорезе в агарозе выявляется фосфорилирование нейрохординов А и ВЗ (Рнс.5Б). Уровень включения радиоактивного фосфата в индивидуальные пептиды был равен 7,6 M фосфата на 1 M белка для нейрохордина А и 2 М/М для ВЗ. Анализ фосфорилированных аминокислот в препарате показал, что СК 1 фосфорилирует исключительно остатки серина (Рис.5В). Измерение активности двух выбранных протеинкнназ на казеине в присутствии суммарного препарата нейрохординов показало, что препарат нейрохординов не влиял на активность СК 1 в концентрации 150 мкг/мл, но ингибировал активность СК 2 на 50% при концентрации 50 мкг/мл. Учитывая тот факт, что в наших экспериментах СК 2 ' тестировали в присутствии 10-20 мкг/мл нейрохординов, незначительное ингибирование активности фермента препаратом белка не может быть причиной полного отсутствия фосфорилирования его индивидуальных компонентов.

Выборочное фосфорилирование двух нейрохординов в смеси свидетельствует об их структурных отличиях от остальных, скорее всего, на уровне первичной структуры. Интересно заметить, что за

24

с. а ■

kDa

900670450160«

67-

Start

A B2

•вз

С2

P-0-Thr P-0-Tyr

P-0-Ser

I 2

I 2

Рис.5. Фосфорилирование нейрохординов мозга человека. А: электрофорез в ПААГ (радиоавтография). 1, фосфорилирование СК 1; 2, СК 2. Стрелками показаны верхние границы концентрирующего и разделяющего гелей. Б: электоофорез нейрохординов в агарозе. 1, фосфорилирование СК 1; 2, нейрохордины-маркеры экстракта эмбрионального мозга (иммунное окрашивание). В: высоковольтный электрофорез продуктов гидролиза фосфорилированных нейрохординов.

исключением таких модельных субстратов как фосвитин и казеин, нейрохордин А является наиболее эффективным белковым субстратом, известным для СК 1. Наличие множественных сайтов для фосфорилирования СК 1 может быть указанием на их 'возможную модификацию этим ферментом /л vivo.

Глава 10. Иммунологическое сродство нейрохордииов А, В, С и глнального кислого фибриллярного белка (GFAP). Экспрессия GFAP в эмбриогенезе человека.

После выделения очищенного препарата нейрохординов мы получили на него кроличью поликлональную антисыворотку. Такая сыворотка должна была содержать антитела на участки молекул белка, не подвергшиеся посттрансляционным модификациям. С помощью этой сыворотки можно было надеяться отобрать из экспрессирующей кДНК библиотеки мозга клоны, содержащие кДНК нейрохординов. В работе использовали кДНК библиотеку мозга человека, полученную в векторе Lambda ZAP (Stratagene). При скрининге было отобрано 7 позитивных клонов, которые были реклонированы в плазмиду pBluescript. Размеры кДНК-вставок варьировали от 0,5 до 3 кВ. Нозерн-блот анализ и обработка плазмид рестриктазами показали, что кДНК-вставки этих клонов частично перекрываются между собой. Секвенирование концевых последовательностей вставок дало неожиданный результат: все они были идентичны последовательностям кДНК глиального кислого фибриллярного белка (GFAP) - белка промежуточных филаментов астроцитов. Однако GFAP достоверно отличается от нейрохординов по электрофоретической подвижности (Мг около 50 кДа). Одна из вставок (клон 4, размер 1,5 кВ) была изучена наиболее детально. Саузерн-блотинг с геномной ДНК'показал, что вставка клона 4 гибридизуется с такими же рестриктами EcoRI и Hindlll, что и кДНК GFAP. Нозерн-блотинг выявил один вид мРНК, совпадающий по подвижности с мРНК GFAP (3 kB). Вестерн-блот анализ показал, что индуцируемый в клетках E.coli в присутствии изопропилтиогалактозида пептид имеет ожидаемый размер (около 50 кДа). Секвенирование концевых последовательностей вставки показано, что клон 4 содержит участок кДНК GFAP, перекрывающий почти всю кодирующую область мРНК и часть нетранслируем ой

26

области после терминирующего кодона. Иммунизировав кроликов экспрессированным в E.coli фрагментом GFAP, заключенным в полосе полиакриламидного геля, мы получили антисыворотку, которая реагировала на блоте с мажорными нейрохординами препарата: А, В2 и С2. Из этого следует, что эти три нейрохордина и GFAP имеют общий белковый эпитоп или эпитопы. Причиной того, что при скрининге не были отобраны клоны, содержащие кДНК нейрохординов, является, по всей вероятности, количественное преобладание в кДНК-библиотеке клонов, содержащих вставки кДНК GFAP. Это весьма вероятно, поскольку мРНК GFAP является одной из мажорных мРНК мозга.

Получив клон с участком кДНК GFAP, мы определили момент начала экспрессии гена GFAP при эмбриональном развитии человека. Для этого был проведен нозерн-блот анализ препаратов мРНК, полученных из головного и спинного мозга эмбрионов на ряде стадий развития (Рнс.б).

Рис.6. Экспрессия гена GFAP в головном и спинном мозге эмбрионов человека (нозерн-блот анализ). 1, спинной мозг, 8 нед.; 2, головной мозг, 7 нед.; 3, головной мозг, 9 цед.; 4, головной мозг, 12 нед.; 5 и б, головной мозг, 24 нед.; 7, головной мозг взрослого человека (47 лет). Время экспозиции рентгеновской пленки: 7 дней для электрофореграмм 1-5 и 15 час. для 6 и 7.

Как видно из результата эксперимента, мРНК GFAP впервые регистрируется в спинном мозге на стадии 8 недель, а в головном мозге - 9 недель эмбрионального развития. В дальнейшем наблюдается резкое увеличение количества этой мРНК.

Глава 11. Экспрессия пейрохордица й в эмбриогенезе человека.

Доказательство его происхождения из мнелш-ассоциироваипого гликопротеипа.

Как было показано ранее, нейрохордин О был выявлен нами только в экстракте мозга человека. Мы проанализировали возрастные изменения содержания иейрохордина О в головном мозге посредством электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблотингом. Как видно из Рис.7, этот белок не выявляется в эмбрионах до 40 недель включительно, но регистрируется в возрасте 1,5 лет и старше.

1 2 3 4 5 6 7 в 9 '

Рис.7. Экспрессия нейрохордина Б в мозге человека. 1, 40 нед., эмбрион; 2, 1,5 года; 3, 63 года, серое вещество; 4, то же, белое вещество; 5, 58 лет; 6, 47 лет, серое вещество; 7, то же, белое вещество; 8, то же, продолгоавтый мозг; 9, очищенный нейрохордин Р.

Нейрохордин Б был препаративно выделен из суммарного препарата нейрохординов головного мозга взрослого человека с примененеим электрофореза в геле агарозы в присутствии БББ и электроэлюции. Полученный белок был гомогенен по данным электрофореза в ПААГ. Как показал углеводный анализ, белок содержал галактозу, маннозу, фукозу, глюкозамин и галактозамин, а также изменял электрофоретическую подвижность' под действием нейраминидазы, что свидетельствовало о присутствии в его составе сиаловых кислот. Для получения первичной последовательности пептидов был проведен гидролиз белка эндопротеиназой АБр-Н, после чего смесь разделили на установке НРЬС. Было выделено и отсеквенировано 4 пептида нейрохордина Р. Результат анализа

28

OMgp (Jungalwala, 1994; Martini and Schachner, 1995). На сегодняшний день известно также несколько растворимых гликоконъюгатов-носителей эпитопа HNK-1: протеогликаны 6В4 и астрохондрин у крысы и цитотактин и цитотактин-связывающий протеогликан у кур (Oohira et al., 1994). В головном мозге человека среди растворимых белков были найдены два высокомолекулярных полипептида, несущих эпитоп HNK-1 (150 и 225 кДа), однако дальнейшая их характеристика не проводилась (Marton and Stefanson, 1984; Mikol et al., 1988). Возможно, эти полипептиды идентичны каким-либо нейрохординам из групп В и С. В мембранах периферической нервной системы крысы были обнаружены два гликолипида, с которыми реагируют антитела HNK-1. Только в этом случае, а также для. ряда синтетических субстратов доказано, что эпитопы, узнаваемые антителами HNK-1, содержат 3-сульфоглюкуроновую кислоту. Установлено, что наличие 3-сульфоглюкуроновой кислоты в составе вышеупомянутых гликолипидов и синтетических гаптенов необходимо для узнавания их антителами HNK-I. В настоящее время установлено, что эпитоп HNK-1 участвует в обеспечении адгезии клеток нервной системы, хотя молекулы, взаимодействующие с ним in vivo, не идентифицированы.

Нам представляется весьма вероятным, что выявленный нами в составе хордина Р-эпитоп также участвует в адгезии клеток хорды. Появление хордина коррелирует с выклевом личинок осетровых рыб и их переходом к активному плаванию, для чего, несомненно, требуется увеличение упругости хорды, выполняющей у осетровых опорную функцию.

Возможно, что в нервной ткани молекулы, несущие Р-эпитоп, являются средством усиления адгезии клеток, так как они появляются несколько позже молекул адгезии N-CAM и ряда других. Данные о свойствах нейрохординов человека с учетом их возможной функции представлены в Таблице 7. Дальнейшее изучение идентифицированных

33

Таблица 7. Некоторые характеристики гликопротеинов, несущих Р-эпитоп: хордина хорды осетровых и нейрохординов головного мозга человека.

Гликопротеин Объект Мол. вес., kDa Другие характеристики Возможная функция

хордин хорда осетровых рыб . 100* 60% углеводов, 40% аминокислот Адгезия клеток

нейрохордин D мозг человека 90** (115***) Белок, производный от MAG Адгезивная функция при миелинизации

нейрохордин С2 \ - и 160*» (250*»*) Адгезия клеток

нейрохордин С1 U- - 160** (320***)

неирохордин ВЗ и 230**(400***) Фосфорилируется in vitro СК1 V

нейрохордин В2 480*** * «г

нейрохордин В1 560***

нейрохордины AI-A3 и 850-690*** Фосфорилируются in vitro CK1

! ■ • ' • *, по данным ДЕль^пчзтагрзфш: электрофорез в ПААГ; ***, электрофорез в агарозе.

нам» нейрохординов, возможно, приведет к лучшему пониманию механизмов взаимодействия нервных клеток.

выводу

Í. В хорде осетровых рыб обнаружен тканеспецифический антиген хордан. Хордин препаративно выделен при помощи аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными моноклональными антителами. Показано, что он является гликопротеином с молекулярным весом около 100 кДа, содержащим 60% углеводов.

2. В составе хорд и на идентифицирован высокоиммуногенный зпитоп, названный Р-эпитопом. Изучено распределение Р-эпитопа в тканях представителей осетровых рыб, земноводных, птиц и млекопитающих, включая человека.

а). Проведены иммуногистохимические исследования по локализации Р-эпитопа в тканях разных видов. У осетровых рыб и испанского тритона Р-эпитоп экспрессируется в центральной и периферической нервной системе и в аденогипофизе. У человека и курицы Р-эпитоп экспрессируется, в основном, в центральной и периферической нервной системе. Таким образом, Р-эпитоп является характерным компонентом ткани нервной системы всех исследованных видов позвоночных животных. Изучена динамика появления Р-эпитопа в эмбриогенезе у разных видов.

б). Проведены иммулоцитохимические исследования экспрессии Р-эпитопа культивируемыми нервными клетками мозга человека и крысы. Показано, что Р-эпитоп экспрессируется в культуре нейронами, олигодендроцитами. на ранних стадиях их дифференцировки и частью астроцитов.

в). Па основании совокупности полученных данных построена схема экспрессии Р-эпитопа клетками нервной системы in vivo.

35

3. С помощью разработанного метода - электрофореза в агарозном геле в присутствии додецидсульфата натрия - идентифицированы и охарактеризованы антигены-мишени для моноклональных антител Ат5, получившие название нейрохординов.

я). В ткани головного мозга человека идентифицировано 9 нейрохординов с молекулярными весами от 115 до 850 кДа по данным электрофореза в агарозе.

б). Несколько высокомолекулярных нейрохординов, которые могут быть отнесены к группам А, В и С, присутствуют также в нервной ткани птиц и млекопитающих, что дает право говорить об их эволюционной консервативности.

в). При помощи аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными моноклональными антителами был препаративно выделен суммарный препарат нейрохординов человека. Показано, что два нейрохордина этого препарата: А и ВЗ могут быть фосфорилированы in vitro казеиновой киназой 1 типа (CK 1).

4. Изучена динамика экспрессии при эмбриональном развитии для нескольких индивидуальных белков-маркеров дифференцировки: хордина и коллагена II типа у осетровых рыб, а также нейрохордина D и глиального фибриллярного кислого белка у человека.

5. Показана сходная иммунологическая специфичность полученных нами моноклональных антител Ат5 и моноклональных антител HNK-1, узнающих углеводные эпитопы, в состав которых входит 3-сульфоглюкуроновая кислота. Это свидетельствует о вероятном присутствии 3-сульфоглюкуроновой кислоты в составе хордина и нейрохординов и о возможной роли этих гликоконъюгатов в усилении адгезии клеток в процессе дифференцировки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Преображенский А.А., Воронина А.С., Калиберда Е.Н. и Вовк Т.С. (1995) Онтогенетическая экспрессия нейрохордина D - специфического гликопротеина мозга человека. Биохимия 60, 1841-1846.

2. Преображенский А.А. (1995) Сколько белков можно обозначить термином "хордин"? Биохимия, 60, 1740-1741.

3. Voronina A.S. and Preobrazhensky А.А. (1994) Developmental expression of glial fibrillary acidic protein gene in human embryos. Neurosci. Letters 174, 198-200.

4. Preobrazhensky A.A. (1993) Electrophoresis of neurochordins, a family of high molecular weight neural tissue glycoproteins, on horizontal submerged agarose gels in the presence of dodecyl sulfate. Analyt. Biochem. 209, 315317.

5. Elizarov S.M. and Preobrazhensky A.A. (1993) Phosphorylation of two human neurochordins by mammalian casein kinase 1. Molec. Brain Res. 19, 310-312.

6. Preobrazhensky A.A., Khalansky A.S., and Kozlova M.V. (1991) Neurochordins of higher vertebrates: similarities in P-epitope-bearing polypeptide composition and astudy of P-epitope expression in cultured neural tissue cells. Neurosci. Letters, 133, 284-286.

7. Preobrazhensky A.A., Rodionova A.I., Yaroshevich E.Yu., and Feshenko S.P. (1990) Human neurochordins: identification of several P-epitope-bearing polypeptides and a study of their ontogenetic expression. FEBS Letters 277 19-22.

8. Preobrazhensky A.A., Rodionova A.I., and Barabanov V.M. (1989) P-epitope iS characteristic for the neural tissue of vertebrates. Molec. Reprod. Devel. 1, 182-192.

9. Преображенский A.A., Лихошерстов Jl.M., Сенченкова C.H. и Родионова А.И. (1989) Структура хордина: характеристика белкового и углеводного компонентов и их роль в антигенности. Биохимия 54, 1235-1246.

10. Барабанов В.М. и Преображенский А.А. (1989) Иммуногистохимическое исследование тканевой специфичности Р5-эпитопа хордина и его появления в онтогенезе у осетровых. Онтогенез 20, 263-272.

11. Преображенский А.А., Родионова А.И. и Касумова С.Ю. (1988) Идентификация в хордине и иммунологически родственном антигене мозга человека устойчивых к протеолизу фрагментов, несущих антигенные детерминанты Р-группы. Биохимия 53, 1850-1857.

12. Преображенский А.А., Родионова А.И. и Андреева Е.Г. (1988) Изучение тканевой специфичности хордина. Биохимия 53, 377-383.

13. Преображенский А.А. и Трахт И.Н. (1988) Радиоиммунологическое определение хордина и противохординовых антител. В кн.: Новые методы практической биохимии. М, Наука, с. 112-116.

38

14. Preobrazhensky A.A., Rodionova AI., TrakhC Í.N., and Rufcosuev V.S. (1987) Monoclonal antibodies against chordin. Use in structural and immunohistochemical studies. FEBS Letters 224, 23-28.

35. Preobrazhensky A.A. and Glinka A.V. (1985) Quantitation of chordin in developing Huso huso embryos and larvae by radioimmunoassay. FEBS Letters 191, 82-86.

16. Преображенский A.A. и Глинка A.B. (1985) Обнаружение хордин-специфических антигенных детерминант в производных хорды у высших позвоночных. Доклады АН СССР 284, 1489-1491.

17. Глинка A.B. и Преображенский A.A. (1984) Изменение содержания хордина в ходе эмбрионального развития белуги. Биохимия 49, 14631469.

18. Преображенский A.A., Глинка A.B. и Родионова А.И. (1984) Хордин как маркер дифференцировки. Обнаружение в клетках хорды белуги, изучение свойств и очистка. Онтогенез 15, 415-419.

19. Преображенский A.A. и Глинка A.B. (1983) Изучение биосинтеза коллагена в раннем эмбриогенезе белуги. Биохимия 48, 305-312.

20. Глинка A.B. и Преображенский A.A. (1982) Коллаген как маркер дифференцировки. Выделение из хорды белуги и характеристика. Онтогенез 13, 274-280.

»'* *

21. Preobrazhensky A.A. and Elizarov S.M. (1995) Phosphorylation of two human brain neurochordins by mammalian casein kinase I. 3rd IUMBM Conference on Molecular Recognition, Singapore, Mon P-15.

22. Халанский A.C., Калинчук В.У., Козлова M.B., Кондакова Л.И., Слепко Н.Г. и Преображенский А.А. (1991) Клеточная локализация Р-эпитоп.. нейрохордина - перспективного маркера нервной ткани. В сб.: Актуальные аспекты современной гисто- и цитопатологии, 109- 112. РАМН, М.

23. Preobrazhensky А.А. and Rodionova A. I. (1990) Neurochordin is a new glycoprotein of the brain. Purification from human brain and characterization. 8th General Meeting , of European Society for Neurochemistry, Leipzig, P23.6.

24. Preobrazhensky A.A., Rodionova A.I., and Barabanov V.M. (1988.', Chordin P-epitope is a marker of neural tissue in the species from Acipenseridae to man. 14th International Congress of Biochemistry, Prague, WE: 040.

25. Preobrazhensky A.A. (1988) Chordin shares a common epitope with an antigen from human brain. 16th International Symposium on the Chemistry of Natural Products, Kyoto, PA 99.

26. Preobrazhensky A.A. and Rodionova АЛ. (1987) A monoclonal antibody to chordin: use in structural studies. 4th International Conference on Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products, Budapest, P.91, A-83.

27. Preobrazhensky A.A. and Glinka A.V. (1985) Chordin antigenic determinants in human and rabbit nucleus pulposus. International Symposium 011 Organic Chemistry of Medicinal Natural Products (1UPAC) Shanghai, China, D-38.

28. Preobrazhensky A.A. and Glinka A.V. (1984) Chordin: a new protein specific for notochord cells. IUPAC 14th International Symposium on the Chemistry of Natural Products, Poznan, Poland, Ab.II, 633.

29. Глинка A.B. и Преображенский A.A. (1980) Коллаген хорды белуги. V Всесоюзная конференция "Физиология и патология соединительной ткани. Новосибирск, Т. 1, 178-179.